Simultane Registrierung neuronaler Aktivität im …Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover Simultane Registrierung neuronaler Aktivität im enterischen

Aus dem Physiologischen Institutder Tierärztlichen Hochschule Hannover

Simultane Registrierung neuronaler Aktivitätim enterischen Nervensystem des Dickdarms von

Maus, Meerschweinchen sowie des Menschen mit Hilfeder Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT)

I N A U G U R A L-D I S S E R T A T I O Nzur Erlangung des Grades einer

D O C T O R I N D E R V E T E R I N Ä R M E D I Z I N(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt vonSaskia Elisabeth Christiane Peters

aus Siegburg

Hannover 2001

Angefertigt im Rahmen des Aufbaustudiumsan der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Gefördert durch die Studienstiftung des deutschen Volkesund die Deutsche Forschungsgemeinschaft

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. M. Schemann

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. M. Schemann2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. A. Tipold

Tag der mündlichen Prüfung: 26. November 2001

Gefördert durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes währendder Dauer der Dissertation.

Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen des SFB 280‚Gastrointestinale Barriere‘, Teilprojekt A10.

...HOMINES ENIM SUNT HAC LEGE GENERATI, QUI TUERENTURILLUM GLOBUM, QUEM IN HOC TEMPLO MEDIUM VIDES, QUAE TERRADICITUR, HISQUE ANIMUS DATUS EST EX ILLIS SEMPITERNIS IGNIBUS,QUAE SIDERA ET STELLAS VOCATIS, QUAE GLOBOSAE ET ROTUNDAE,DIVINIS ANIMATAE MENTIBUS, CIRCOS SUOS ORBESQUE CONFICIUNTCELERITATE MIRABILI. ...[CIC., REP 6, 15: SOMNIUM SCIPIONIS]

(...Denn die Menschen sind unter dem Gesetz geschaffen, daß sie jenenErde genannten Ball, den Du in der Mitte dieses Tempels siehst, schützensollen und es ist ihnen der Geist aus jenen ewigen Feuern gespendet, die ihrHimmelsbilder und Sterne nennt, die, rund zusammengeballt, mit göttlichemGeist beseelt, ihre Kreise und runden Bahnen mit wunderbarer Schnelligkeitdurchlaufen. ...)

Meinen Elternzur Freude und als Dank

Ergebnisse dieser Arbeit sind bereits vorab veröffentlicht worden:

Originalarbeiten

NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (1999):Multisite optical recording of excitability in the enteric nervous system.Neurogastroenterol. Motil. 11 (5), 393-402.

Vortragsabstracts und Kongressberichte

NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (1999):Optical recording of excitability in the enteric nervous system.Gastroenterology, 116, A1050.

NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (1999):Multisite optical recording of excitability in the enteric nervous system.In: Falk Symposium No. 112, Freiburg, 21. – 22. Juni 1999.

NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (1999):Multisite optical recording of excitability in the enteric nervous system.In: Fifth IBRO World Congress of Neuroscience, Jerusalem 11. – 15. July 1999.

PETERS, S., M. NEUNLIST, u. M. SCHEMANN (1999):Multisite optical recordings of excitability in the enteric nervous system of rodents andhuman.Neurogastroenterol. Motil. 11 (5), 280.

SCHEMANN, M., S. PETERS, u. K. KAMM (2000):Optical recording from enteric neurones using voltage sensitive dyes.Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical, 82, 4.

SCHEMANN, M., S. PETERS, u. S. BISCHOFF (2000):Optical recordings of excitability in the human enteric nervous system.Pflügers Arch., 439, R338.

SCHEMANN, M. (2000):Optical recording from enteric neurones using voltage-sensitive dyes.ISAN, International Society of Autonomic neuroscience, London 17.-21. July 2000.

PETERS, S., M. NEUNLIST, S.C. BISCHOFF, M. SCHEMANN (2000):Optical recordings of excitability in the human enteric nervous system.Gastroenterology, 118, A185.

SCHEMANN, M. (2001):Transmission in the Human Enteric Nervous SystemBrain-Gut 2001, Oxford 11. – 15. July 2001

Buchkapitel:

NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (2000):Simultaneous multisite optical recording of excitability in the enteric nervous systemusing voltage sensitive dye.In: H.-J. Krammer u. M.V. Singer (Eds.): Neurogastroenterology - From the Basics to theClinics.Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, S. 163-174.

INHALTSVERZEICHNIS

Verzeichnis der Abkürzungen............................................................................... I

Glossar ausgewählter Begriffe...............................................................................III

1 EINLEITUNG....................................................................................................17

2 GRUNDLAGEN................................................................................................ 202.1 Das enterische Nervensystem........................................................................... 20

2.1.1 Einführung................................................................................................202.1.2 Bau und Struktur...................................................................................... 212.1.3 Aufgabe und Funktion..............................................................................222.1.4 Neurotransmitter.......................................................................................232.1.5 Neuro-neuronale synaptische Aktivität und elektrisches Verhalten........ 272.1.6 Techniken und Methoden zur Untersuchung des ENS............................ 34

2.2 Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT)........................................ 352.2.1 Einführung................................................................................................352.2.2 Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe...............................................36

2.2.2.1 Bedeutung und Anwendung..............................................................362.2.2.2 Potentialsensitive Styrylfarbstoffe: Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPS sowie Di-8-ANEPPQ............................................... 372.2.2.3 Mechanismus der Spannungssensitivität...........................................40

2.2.3 Meßtechnologie zur Detektion optischer Änderungen.............................41

3 UNTERSUCHUNGSGUT UND METHODIK...............................................423.1 Untersuchtes Darmgewebe............................................................................... 42

3.1.1 Maus und Meerschweinchen.................................................................... 423.1.2 Darmgewebe des Menschen.....................................................................43

3.2 Präparation........................................................................................................453.2.1 Darmgewebe von Maus und Meerschweinchen.......................................453.2.2 Humangewebe.......................................................................................... 46

3.3 Montage in die Versuchskammer..................................................................... 473.4 Apparatur der Fluoreszenzmeßtechnik und Versuchsaufbau der Fluoreszenzmessung.........................................................................................49

3.4.1 Lichtquelle, elektronischer Verschluß, Mikroskop, Filterblock und Objektive........................................................................................... 493.4.2 Glasfasergekoppeltes Photodioden-Array................................................523.4.3 Verstärker, Multiplexer und AD-Wandler............................................... 533.4.4 Hardware zur Datenerfassung, Datensicherung und Software NeuroPlexTM..............................................................................553.4.5 Schwarzweißkamera, Videobild...............................................................56

3.5 Ortsauflösung und Zeitauflösung..................................................................... 563.6 Protokoll des Meßzyklus.................................................................................. 603.7 Positionsstabilität und Gewebeimmobilisation................................................ 603.8 Einfluß verschiedener Faktoren auf das Signal-Rausch-Verhältnis................. 613.9 Anfärbung enterischer Neurone mit Fluoreszenzfarbstoffen........................... 63

3.9.1 Anwendung potentiometrischer Farbstoffe.............................................. 633.9.1.1 Phototoxizität.................................................................................... 633.9.1.2 Ausbleichen.......................................................................................643.9.1.3 Spannungssensitivität........................................................................65

3.9.2 Vorversuche..............................................................................................653.9.2.1 Protokoll zur enzymatischen Vorbehandlung und Färbung mit Di-8-ANEPPS in Anlehnung an OBAID et al. (1992)..................... 663.9.2.2 Variation des Protokolls zur enzymatischen Vorbehandlung........... 663.9.2.3 Färbeprotokoll mit extrazellulärer Applikation von Di-8-ANEPPS an frisch präpariertem Gewebe......................................................... 663.9.2.4 Einsatz von Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ bei Maus und Meerschweinchen..............................................................................68

3.9.3 Hauptversuche.......................................................................................... 683.9.3.1 Ansetzen des Farbstoffes Di-8-ANEPPS.......................................... 683.9.3.2 Färbung des enterischen Nervensystems.......................................... 69

3.10 Stimulation enterischer Neurone.................................................................... 703.11 Neuropharmakologische Untersuchung......................................................... 723.12 Datenanalyse, Auswertung der optischen Signale und Statistik.....................733.13 Signal-Raum-Zeitstruktur-Analyse............................................................... 753.14 Immunhistochemie......................................................................................... 78

3.14.1 Präinkubation..........................................................................................783.14.2 Primäre Antikörper.................................................................................793.14.3 Sekundäre Antikörper.............................................................................803.14.4 Immunfluoreszenzmikroskop und Auswertung..................................... 81

4 ERGEBNISSE....................................................................................................834.1 MSORT: Etablierung der Färbemethode und Vorversuche............................. 83

4.1.1 Enzymatisch vorbehandeltes Gewebe...................................................... 834.1.2 Frisch präpariertes Gewebe...................................................................... 84

4.1.2.1 ‚Systemische‘ Färbung......................................................................844.1.2.2 ‚Lokale‘ Färbung...............................................................................85

4.1.3 Tauglichkeit der angewendeten Färbemethoden für frisches Gewebe.....864.1.3.1 Vor- und Nachteile der ‚systemischen‘ Färbung.............................. 864.1.3.2 Vor- und Nachteile der ‚lokalen‘ Färbung........................................ 87

4.1.4 Färbecharakteristik und Eignung von Di-8-ANEPPS sowie seiner Derivate Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ........................................... 87

4.1.4.1 Humangewebe...................................................................................884.1.4.2 Gewebe der Maus..............................................................................894.1.4.3 Gewebe des Meerschweinchens........................................................92

4.2 Validierung optischer Signale neuronaler Herkunft.........................................934.2.1 Chemische Stimulation.............................................................................934.2.2 Elektrische Stimulation............................................................................ 97

4.2.2.1 Interganglionäre Nervenstränge........................................................ 974.2.2.2 Überschwellige und unterschwellige schnelle erregende postsynaptische Potentiale (f EPSP) sowie Nervenfaserpotentiale...98

4.2.2.3 Langsame erregende postsynaptische Potentiale (s EPSP)...............1024.2.3 Immunhistochemie................................................................................... 103

4.3 MSORT: Hauptversuche.................................................................................. 1054.3.1 Optische Registrierung von Nervenzellaktivität am Darmnervensystem des Menschen........................................................................................... 105

4.3.1.1 Vorkommen von schnellen erregenden postsynaptischen Potentialen (f EPSP) nach Stimulation interganglionärer Nervenstränge........... 1054.3.1.2 Untersuchung auf das Vorkommen von langsamen erregenden postsynaptischen Potentialen (s EPSP)............................................. 1144.3.1.3 Vorkommen von nicht experimentell induzierter Aktivität („Spontanaktivität“) und Eigenschaften dieser Nervenzellen...........1174.3.1.4 Vorkommen einer andauernden Stimulus-induzierten Aktivitätsentladung, „late onset spike discharge“............................ 1264.3.1.5 Erregungsverteilung innerhalb enterischer Ganglien nach oraler bzw. analer Stimulation interganglionärer Nervenstränge........................ 1294.3.1.6 Aktivität von interganglionären Nervensträngen.............................. 1334.3.1.7 S/N-Verhältnis, relative Änderung der Fluoreszenz, durchschnittliche Belichtungszeit und Reproduzierbarkeit................................. 133

4.3.2 Optische Registrierung von Nervenzellaktivität im Plexus submucosus der Maus................................................................................................... 135

4.3.2.1. Reproduzierbarkeit und S/N-Verhältnis............................................138

5 DISKUSSION.....................................................................................................1405.1 Einsatz der spannungssensitiven Farbstoffe Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ im enterischen Nervensystem........................................ 1415.2 Vorteile und Limitationen der MSORT............................................................1455.3 Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen am Humandarm.............. 1505.4 Ausblick sowie möglicher Einsatz der optischen Methode am ENS............... 159

6 ZUSAMMENFASSUNG...................................................................................161

SUMMARY........................................................................................................164

7 LITERATURVERZEICHNIS......................................................................... 167

8 ANHANG...........................................................................................................1958.1 Spezifikationen der Meßapparatur....................................................................1958.2 Protokolle und Lösungen für die Vitalerhaltung der Gewebe..........................1978.3 Protokolle und Lösungen für die Multi-Site Optical Recording Technique.... 1988.4 Protokolle und Lösungen der Pharmaka für neuropharmakologische Untersuchungen................................................................................................ 1998.5 Protokolle und Lösungen für die Immunhistochemie...................................... 2028.6 Tabellenanhang.................................................................................................203

DANKSAGUNG..................................................................................................... 205

I

Verzeichnis der Abkürzungen

AH “after-hyperpolarisation“, NachhyperpolarisationATP AdenosintriphosphatA/W Ampere/WattAC Wechselstrom, “Alternative Current“ACh AcetylcholinAD-Wandler Analog-Digital-WandlerAMCA 7-Amino-4-Methylcumarin-3-AcetatAMPA a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isooxazolproprionic acidANEPPS Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinum-Propyl-SulfatANEPPQ Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinum-Propyl-Quaternatas. ascendensBNC “Bayonet Nut Connector“, Steckverbindung für KoaxialkabelCCD “Charge Coupled Device“ChAT Cholin-Acetyl-TransferaseCO2 KohlendioxidCy 2 CarbocyaninCy 3 CarboxymethylindocyaninCy 5 IndodicarbocyaninDAP “Data Acquisition Processor“dB Dezibeldes. descendensDMSO DimethylsulfoxidDNA DesoxyribonukleinsäureDTAF Dichlorotriazinyl AminofluorescinENS Enterisches NervensystemF Fluoreszenzf EPSP “fast excitatory postsynaptic potential“, schnelles erregendes

postsynaptisches PotentialGABA Gamma-Aminobuttersäure oder γ-AminobuttersäureGOhm Gigaohm5-HT 5-Hydroxytryptamin, SerotoninIDL “Interactive Data Language“, interaktive Programmiersprache

Verzeichnis der Abkürzungen II

IgG Immunglobulin GIPSP “inhibitory postsynaptic potential“, hemmendes postsynaptisches

PotentialkPa kiloPascalm männlichmAChR muskarinerger Acetylcholin-RezeptorM. MusculusMB MegabyteMSORT “Multi-Site Optical Recording Technique“MW “molecular weight“, MolekulargewichtN.A. numerische AperturnAChR nikotinerger Acetylcholin-Rezeptornm NanometerNPY Neuropeptid YNO StickoxidNSE Neuronenspezifische EnolaseO2 SauerstoffpA PicoamperePBS phosphatgepufferte KochsalzlösungpF PicofahrenheitPmy Plexus myentericusPsm Plexus submucosusRAM “Random Access Memory“, ArbeitsspeicherRMS “Root-Mean-Square“S synaptischs EPSP “slow excitatory postsynaptic potential“, langsames erregendes

postsynaptisches Potentialsig. sigmoideumSP Substanz Ptrans. transversumTTX TetrodotoxinVIP vasoaktives intestinales Polypeptidw weiblichZNS Zentralnervensystem

III

Glossar ausgewählter Begriffe

Aktionspotential Reizantwort einer Nervenzelle; Änderung der Ionenleitfähigkeit

und des Membranpotentials; es besteht aus einer

Depolarisations- und einer Repolarisationsphase

amphiphil Molekül mit einer lösungsmittelphilen und einer –phoben

Gruppe

Antagonist Pharmakon, das an einen Rezeptor bindet und dadurch

dessen Aktivierung verhindert

antidrom gegenläufig hier: Erregungsleitung entgegen der natürlichen

Leitungsrichtung

Axon Nervenzellfortsatz zwischen Nervenzellkörper (Soma) und

Synapsen, dient der Erregungsleitung vom Nervenzellkörper

zur Synapse

bipolar Nervenzelle mit einem Dendriten und einem Axon

cholinerg auf die Wirkung des Acetylcholins bezogen

Dendrit rezeptiver Fortsatz einer Nervenzelle, der Erregung zum

Zellkörper leitet

Depolarisation Abnahme des negativen Ruhemembranpotentials einer

Nervenzelle

Dunkelstrom Strom, der nach völligem Lichtabschluß in den Photozellen

fließt

extrinsisch äußerlich; hier: sympathische und parasympathische

Innervation

∆F/F Die relative Fluoreszenzänderung wird bei Darstellung der

Meßamplitude optischer Daten in Relation zur Hintergrund-

fluoreszenz dargestellt.

Zumeist erfolgt die Angabe in Prozent.

freie Radikale stark reaktionsfähige Atomgruppe mit einem ungepaarten

Elektron

Ganglion Anhäufung von Ganglienzellen, d. h. Nervenzellen

IV Glossar ausgewählter Begriffe

Hochpass Filter, der nur Schwingungen oberhalb einer gewünschten

Frequenz durchläßt (Gegensatz: Tiefpass)

hydrophil wasseranziehend

hydrophob wasserabstoßend

intrinsisch innerlich; hier: eigentliches Darmnervensystem

Manipulator Apparat zur präzisen Plazierung von feinen Instrumenten

multiaxonal Nervenzelle mit vielen Axonen

multidendritisch Nervenzelle mit vielen Dendriten

murin zur Maus gehörend

Neuron Nervenzelle mit ihren Fortsätzen (Dendriten und Axone);

Funktionseinheit des Nervensystems

Neurotransmitter chemische Überträgersubstanzen, die an den Synapsen einer

Nervenzelle ausgeschüttet werden und Erregungsimpulse

übertragen

nitrerg auf die Wirkung von Stickoxid bezogen

numerische Apertur Wert für die Auflösung eines Objektivs; abgekürzt N.A.

orthodrom Erregungsausbreitung, die der physiologischen

Leitungsrichtung entspricht

Photoisomerisierung durch Lichteinwirkung hervorgerufene Veränderung der

räumlichen Anordung bzw. Struktur eines Moleküls bei

unveränderter Summenformel

Quantenausbeute Verhältnis zwischen der Anzahl emittierter Elektronen und

einfallender Photonen

Rauschen Rauschen ist eine statistische Störung, die die Größe von

informationsübertragenden Signalen nach unten begrenzt.

Repolarisation Wiederherstellung des negativen Ruhemembranpotentials

nach der Depolarisation

Rippeleigenschaft Welligkeitsanteil; Verhältnis von Gleichstromanteil zu

Wechselstromanteil; für Netzgeräte Siebschaltung

V Glossar ausgewählter Begriffe

Synapse Axonendigung, an der auf einen Erregungsimpuls

(Aktionspotential) hin Neurotransmitter freigesetzt werden

Tiefpass Filter, der nur Schwingungen unterhalb einer gewünschten

Frequenz durchläßt, darüberliegende dagegen sperrt

Tracing Methode zur Markierung von bestimmten Populationen von

Nervenzellen oder neuronalen Strukturen mit

Fluoreszenzfarbstoffen

vagal den Nervus vagus betreffend

Zellsoma Körper einer Nervenzelle

17

1 Einleitung

Die neuronale Kontrolle gastrointestinaler Funktionen erfolgt weitgehend autonom

über ein darmeigenes Nervensystem. Dieses aus Millionen von Nervenzellen

bestehende enterische Nervensystem verfügt über ein breites Repertoire von

synaptischen Interaktionen. Kenntnisse über nervale Verschaltungen im enterischen

Nervensystem (ENS) gewinnen zunehmend an Bedeutung, da klinisch beobachtete

gastrointestinale Fehlfunktionen in Zusammenhang mit Störungen innerhalb des

ENS gebracht werden. Voraussetzung für das Verständnis physiologischer

Regulationsmechanismen auf neuronaler Ebene und deren Störungen unter

pathophysiologischen Bedingungen ist die Erfassung komplexer Verschaltungen

von mehreren Neuronen.

Auf Einzelzellebene sind verschiedene Nervenzellgruppen in

unterschiedlichen Regionen des Gastrointestinaltrakts identifiziert und

elektrophysiologisch sowie neurochemisch charakterisiert worden. Die Frage, wie

Nervenzellen im ENS miteinander kommunizieren und wie das komplexe Netz von

Neuronen seine Funktion ausführt, ist jedoch bisher nicht beantwortet. Unter diesem

Gesichtspunkt ist es von Interesse, eine seit einiger Zeit entwickelte optische

Meßtechnik zur Registrierung der Signalausbreitung mittels spannungssensitiver

Farbstoffe („Multi-Site Optical Recording Technique“, MSORT) am enterischen

Nervensystem anzuwenden, die es erlaubt, auf Einzelzellebene mehrere Neurone

gleichzeitig zu untersuchen. Am enzymatisch behandelten Dünndarm konnte 1992

prinzipiell die Anwendbarkeit dieser Methode am ENS des Meerschweinchens

gezeigt werden (OBAID et al. 1992). Bislang fehlen Untersuchungen über die

Anwendung am Dickdarm und am frischen, nicht enzymatisch behandelten Gewebe

des ENS. Im Hinblick auf speziesspezifische Unterschiede ist die Etablierung dieser

Technik auch an anderen Spezies erforderlich. Aufgrund der klinischen Relevanz

und einer hohen Prävalenz gastrointestinaler Funktionsstörungen besteht nicht nur

ein besonderes Interesse, das humane ENS selbst zu untersuchen. Die Etablierung

der optischen Technik auch am ENS der Maus, bietet die Möglichkeit, zukünftig

18 Einleitung

unter pathophysiologischen Gesichtspunkten vergleichende Untersuchungen an

„knock-out“-Tiermodellen zu ermöglichen.

Der eigenen Arbeit lagen folgende Zielsetzungen zugrunde:

1. Etablierung der „Multi-Site Optical Recording Technique“ am ENS des Kolon von

Maus und Meerschweinchen sowie des humanen Kolon und Rektum.

2. Neuropharmakologische Charakterisierung der optischen Signale und

Bestimmung des Potentials der optischen Methode sowie Kombination der

MSORT mit bisherigen immunhistochemischen Techniken zur Identifizierung

neuronaler Transmitter.

3. Anwendung der MSORT am ENS von Mensch und Maus, um mit Hilfe von

neuropharmakologischen Untersuchungen neuronale Erregungsmuster zu

identifizieren und beteiligte Neurotransmitter zu charakterisieren.

19

20

2 Grundlagen

2.1 Das enterische Nervensystem

2.1.1 Einführung

Seit über hundert Jahren ist die Existenz zweier Nervengeflechte im

Magen-Darm-Kanal bekannt. MEISSNER beschrieb 1857 einen zwischen Mukosa

und Zirkulärmuskulatur gelegenen Plexus. Einige Jahre später konnte

AUERBACH (1862) die Existenz eines weiteren Plexus, der sich zwischen Zirkulär-

und Longitudinalmuskulatur befindet, nachweisen. Bis Anfang des 20. Jahrhunderts

wurde dieses aus einer Vielzahl von Neuronen bestehende Netzwerk als ein

„diffuses parasympathisches Ganglion“ angesehen, von dem man annahm, daß es

allein durch Steuerung von extrinsischen präganglionären Nervenfasern

gastrointestinale Funktionen über postganglionäre Motoneurone aufrecht erhielt.

LANGLEY erkannte die Komplexität und Eigenständigkeit des Darmnervensystems

und prägte 1921 den Begriff des „enteric nervous system“ (ENS), um dieses

enterische Nervensystem vom sympathischen und parasympathischen

Nervensystem abzugrenzen. Heute gilt das ENS neben dem Sympathikus und

Parasympathikus als eigenständiges Nervensystem, welches mit schätzungsweise

bis zu hundert Millionen Nervenzellen wesentliche Aufgaben des

Gastrointestinaltraktes autonom reguliert und koordiniert. Es ist Gegenstand

zahlreicher Forschungen auf dem Gebiet der Neurogastroenterologie (WOOD et al.

1999). Da zunehmend eine Beteiligung des ENS auch bei gastrointestinalen

Dysfunktionen und Malfunktionen sowohl in der Tiermedizin als auch in der

Humanmedizin diskutiert wird, sind Kenntnisse über physiologische

Regulationsmechanismen innerhalb des enterischen Nervensystems immer mehr

von grundlegender Bedeutung sowie die Entwicklung und Etablierung neuer

Techniken zu seiner Erforschung.

Das enterische Nervensystem (ENS) 21

2.1.2 Bau und Struktur

Das enterische Nervensystem liegt in der Wand des Gastrointestinaltrakts und

erstreckt sich vom Ösophagus bis zum M. sphincter ani internus, dem inneren

Schließmuskel des Analkanals. Es besteht aus Nervenzellen, die in Ganglien

variierender Größe organisiert sind, und aus interganglionären Nervensträngen, in

denen Nervenzellfortsätze verlaufen. Über sie stehen die Nervenzellen miteinander

in Kontakt. Dieses neuronale Netz formt in erster Linie zwei Plexus, den luminalen,

inneren Plexus submucosus (MEISSNER 1857) und den äußeren, serosaseitigen

Plexus myentericus (AUERBACH 1864). Der Plexus submucosus, der in der

gleichnamigen Tela zwischen Mukosa und Zirkulärmuskulatur liegt, ist nur im Darm

prominent. In der Tunica muscularis befindet sich zwischen Zirkulär- und

Longitudinalmuskulatur der Plexus myentericus. Beim Menschen und bei großen

Säugetieren untergliedert sich der Plexus submucosus weiter in zwei bzw. drei

Abschnitte, in einen luminalen Meissner-Plexus und einen äußeren Plexus

Schabadasch (PEARSON 1994; SCHABADASCH 1930; SCHEUERMANN et al.

1987; STACH 1977). Beim Menschen existiert zwischen diesen beiden Plexus ein

dritter, intermediärer Plexus (DHATT u. BUCHAN 1994; HOYLE u. BURNSTOCK

1989; IBBA-MANNESCHI et al. 1995).

Mit einer Gesamtzahl von mehreren Millionen intrinsischer Neurone ist von

der Größenordnung her die Anzahl der Neurone im Gastrointestinaltrakt etwa mit

der des Rückenmarks vergleichbar (FURNESS u. COSTA 1980;

KARAOSMANOGLU et al. 1996). Demgegenüber steht mit einigen Tausend eine

vergleichsweise geringe Zahl extrinsischer sympathischer und parasympathischer

Fasern, die den Magen-Darm-Kanal innervieren und in ihrer Innervationsdichte stark

regionale Unterschiede aufweisen. Die strukturelle Verflechtung des ENS mit

Effektorsystemen, wie beispielsweise Muskulatur und Mukosa sowie die

Verknüpfung mit extrinsischen Fasern, deuten auf integrative Fähigkeiten dieses

Nervensystems hin.

22 Grundlagen

2.1.3 Aufgabe und Funktion

Eine der wichtigsten Aufgaben des enterischen Nervensystems und ein

wesentliches Merkmal des Magen-Darm-Kanals ist der oral-anal gerichtete

Transport der Nahrung. Verursacht wird der Weitertransport eines im Darm

befindlichen Bolus durch eine Kontraktion oral und Relaxation der Muskulatur anal

des Bolus. Dieser schon 1899 von BAYLISS und STARLING als „law of the

intestine“ beschriebene peristaltische Reflex kann sowohl durch mechanische

Reizung von Muskulatur und Mukosa als auch durch luminal verabreichte

chemische Stimuli ausgelöst werden (BAYLISS u. STARLING 1899; MAGNUS

1904). Die Tatsache, daß diese intestinale Propulsion selbst an isolierten

Darmsegmenten gerichtet erfolgt (LANGLEY u. MAGNUS 1905; LANGLEY 1921),

verdeutlicht die Fähigkeit des ENS zur autonomen Steuerung koordinierter

Mechanismen und überzeugte LANGLEY (1921) von der Eigenständigkeit des ENS.

Neben der Steuerung der Peristaltik wird das ENS heute auch für die

Kontrolle der Sekretion (DIENER u. RUMMEL 1990; GREENWOOD u. DAVISON

1987; KIRKEGAARD et al. 1984; NEUNLIST et al. 1998), der Mikrozirkulation der

Magen-Darm-Schleimhaut (NEILD et al. 1990; VANNER u. SURPRENANT 1996),

sowie für die Regulation des Ionentransportes (BIJLSMA et al. 1996; MEYER et al.

1997) und die Modulation von Immunreaktionen (FRIELING et al. 1994; WOOD

1991) verantwortlich gemacht. Dabei steuern nach bisherigem Kenntnisstand der

Plexus submucosus und der Plexus myentericus unterschiedliche Funktionen. So

werden dem luminalen Plexus submucosus überwiegend die Regulation

sekretorischer Funktionen, dem Plexus myentericus Steuerung der Motorik

zugeschrieben (TIMMERMANS et al. 1997). Extrinsische Nervenfasern des

Sympathikus und Parasympathikus üben mehr eine modulierende Funktion aus.

Aktuelle Konzepte betrachten das ENS als ein integratives System

bestehend aus drei verschiedenen Neuronentypen, die Schaltkreise zur adaptiven

Aktivitätsmodulation bilden: primär afferente Neuronen kodieren die Information

verschiedener chemischer und mechanischer Stimuli und leiten diese entweder

direkt oder über Interneurone an Motoneurone weiter, die die Effektorsysteme wie


Muskulatur, Mukosa, Blutgefäße oder das Immunsystem innervieren (FURNESS

2000; WOOD 1994).

Diese komplexen Funktionsmechanismen prägten im anglo-amerikanischen

Raum den Begriff des „minibrain in gut“ oder „enteric minibrain“, ein kleines Gehirn

im Darm (WOOD 1991). In der Tat besitzt das enterische Nervensystem strukturell

und funktionell dem Gehirn ähnliche Charakteristika, die sich unter anderem auch in

einer breiten Anzahl verschiedener Neurotransmitter und Neuromodulatoren

darstellen und die die Grundlage für eine breite Palette informationsvermittelnder

hemmender und aktivierender neuronaler Mechanismen bilden. Einen großen

Vorteil für Studien neuronaler Netzwerke bietet das ENS verglichen mit dem

Zentralnervensystem (ZNS) durch seine verhältnismäßig überschaubare Zellzahl,

seine Nähe zu den Effektorsystemen und seine überwiegende Zweidimensionalität.

2.1.4 Neurotransmitter

Von etwa 25 verschiedenen Substanzen nimmt man heute an, daß sie im

Gastrointestinaltrakt als Neurotransmitter fungieren (MCCONALOGUE u.

FURNESS 1994).

Das lange Zeit in der Literatur postulierte und von ECCLES erstmals

vorgeschlagene Dale-Prinzip, das von der Ausschüttung eines einzigen

Überträgerstoffes an der Synapse einer Nervenzelle ausgeht (ECCLES 1986;

ECCLES et al. 1954), gilt mittlerweile als überholt. Heute geht man aufgrund von

neuropharmakologischen und immunhistochemischen Studien vielmehr von einer

‚plurichemischen Übertragung‘ aus (BURNSTOCK 1976; FURNESS et al. 1989).

Neben einem Hauptüberträgerstoff sind weitere Substanzen an der synaptischen

Übertragung beteiligt. Sogenannte Kotransmitter existieren neben dem

Haupttransmitter in einer Nervenzelle und besitzen eine ihm vergleichbare Wirkung.

Neuromodulatoren wird eine Beeinflussung der Intensität und Dauer der Wirkung

klassischer Überträgerstoffe zugeschrieben (WOOD 1982). Theoretisch sind

mehrere hundert Kombinationen kolokalisierter Neurotransmitter möglich. Allerdings

konnten bisher nur etwa 20-30 individuelle Gruppen im ENS nachgewiesen werden,

24 Grundlagen

die sich anhand ihres spezifischen neurochemischen Kodes einteilen lassen

(BORNSTEIN u. FURNESS 1992; COSTA et al. 1996; TIMMERMANS et al. 1997)

und die neben einer regionenspezifischen Variabilität stark speziesspezifische

Unterschiede aufweisen (MCCONALOGUE u. FURNESS 1994). Diese

Unterschiede könnten als Spezialisierung und Adaption des ENS für bestimmte

spezifische Funktionen interpretiert werden. Jedoch verdeutlicht diese Variabilität

auch, daß eine Übertragung gewonnener Daten auf andere Spezies oder andere

Regionen im Magen-Darm-Trakt nicht generell möglich ist. Die meisten Daten über

Transmitterkodierungen basieren bisher überwiegend auf Untersuchungen am

Magen und Darm des Meerschweinchens. Weit weniger Daten existieren

beispielsweise für die Maus, die in der gastrointestinalen Forschung durch die

Verfügbarkeit von „knock-out“-Tieren einen zunehmenden Stellenwert erlangt, oder

für den Menschen (WOOD 1994).

Ungefähr sieben von etwa 25 Neurotransmittern fungieren als

Hauptüberträger synaptischer Übertragung. Im folgenden werden Acetylcholin

(ACh), Substanz P sowie Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP) exemplarisch

herausgegriffen.

Acetylcholin wurde über seine kontraktile Wirkung auf glatte Muskulatur als

erster exzitatorischer Transmitter im Magen-Darm-Kanal identifiziert (DALE u.

FELDBERG 1934; DIKSHIT 1938). Das für seine Synthese verantwortliche Enzym

ist die Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT), die immunhistochemisch in den Neuronen

nachgewiesen werden kann (SCHEMANN et al. 1993; STEELE et al. 1991). Im

Kolon des Menschen zeigen mehr als 50 % der Neurone im Plexus submucosus

Immunoreaktivität für ChAT (PORTER et al. 1996).

Neben dieser cholinergen exzitatorischen Komponente existieren weitere

erregende, nicht-cholinerge Neurotransmitter wie beispielsweise Substanz P.

Immunoreaktivität für dieses Neuropeptid wurde in Darmneuronen des Plexus

myenterius und Plexus submucosus verschiedener Spezies wie Hund, Schwein,

Meerschweinchen, Maus, Ratte und Mensch nachgewiesen (SANG u. YOUNG

1996; SUNDLER et al. 1989; TIMMERMANS et al. 1990; DANIEL et al. 1985;

KEAST et al. 1985). Beim Menschen konnten im distalen Kolon


Substanz P-immunoreaktive Neurone nur im Plexus Schabadasch und im

intermediären Plexus gefunden werden, hingegen nicht im Meissner-Plexus

(CROWE et al. 1992). In der Taenia coli und im Dünndarm des Meerschweinchens

konnte in exzitatorischen Motoneuronen eine Kolokalisation von Acetylcholin und

Tachykininen, wie z. B. Substanz P, nachgewiesen werden (BROOKES et al. 1991;

FURNESS et al. 1992).

Das ebenfalls in enterischen Neuronen immunhistochemisch nachgewiesene

Vasoaktive Intestinale Polypeptid (VIP) wird der Hauptgruppe der inhibitorischen

Übertragungsmechanismen zugerechnet (FAHRENKRUG 1979), die nicht-cholinerg

und nicht-adrenerg vermittelt sind (BURNSTOCK et al. 1979; BURNSTOCK 1981).

VIP wird für die inhibitorische Wirkung auf glatte Muskulatur verantwortlich gemacht,

wobei gerade bei diesem Neuropeptid speziesspezifische und regionenspezifische

Unterschiede existieren, die es erschweren, die Rolle und Gewichtung von VIP als

hemmendem Neurotransmitter klar zu umreißen (MCCONALOGUE u. FURNESS

1994). Im distalen Kolon des Menschen konnten in allen drei Abschnitten des

Plexus submucosus VIP-erge Neurone immunhistochemisch identifiziert werden

(CROWE et al. 1992). Zusammen mit ACh erhöht VIP die Mukussekretion im

Magen-Darm-Kanal und ist Hauptüberträgerstoff in Sekretomotoneuronen (COOKE

1986; COOKE 2000). Bei synaptischen neuro-neuronalen

Übertragungsmechanismen induziert VIP exzitatorische Potentiale an den

Folgeneuronen (ZAFIROV et al. 1985).

Neben diesen drei Transmittern werden NPY, NO, ATP und Serotonin

ebenfalls zu den Haupttransmittern gerechnet.

Somit besitzt das ENS eine dem ZNS analoge Palette von erregenden und

hemmenden Mechanismen, die je nach Art der synaptischen Ausschüttung und

Vorkommen entsprechender Rezeptortypen nicht nur die interneuronale

Kommunikation definieren und depolarisierende oder hyperpolarisierende

Membranpotentiale induzieren, sondern auch die entsprechenden Effektorsysteme

aktivieren oder hemmen können. So konnte nachgewiesen werden, daß der

peristaltische Reflex durch oral projizierende erregende, cholinerge (Acetylcholin)

26 Grundlagen

Motoneurone und anal projizierende hemmende, nitrerge (Stickoxid) Motoneurone

vermittelt wird.

Vergleichbar mit dem ZNS können die Neurotransmitter des enterischen

Nervensystems anhand ihrer erregenden oder hemmenden Wirkung auf

postsynaptische Zielneurone klassifiziert werden. Tabelle 1 gibt einen Überblick

über wichtige Neurotransmitter und ihre synaptische Wirkung auf andere Neurone

im ENS wieder.

Tabelle 1: Wichtige Neurotransmitter des ENS und ihre synaptische Wirkung auf

postsynaptische Neurone (incl. identifizierter beteiligter Rezeptoren)

Exzitatorische Wirkung Inhibitorische Wirkung

f EPSP s EPSP PräsynaptischeHemmung IPSP

Acetylcholin [1]

nikotinergAcetylcholin [4]

M1, M2Acetylcholin [4]

M1, M2Acetylcholin [12]

ATP [2]

P2xVIP [5] Noradrenalin [9]

α 2Opioide [13]

δSerotonin [2]

5-HT3

Substanz P [6]

NK-1, NK-3NPY [10] Serotonin [14]

5-HT1a

Glutamat [3]

AMPAγ-Aminobuttersäure [7]

GABA ASerotonin [11]

5-HT1a

Noradrenalin [15]

α 2Serotonin [8]

5-HT1P

Galanin [16]

Somatostatin [17]

NPY [18,19]

Y1,Y2

[1] (NISHI u. NORTH 1973) [11] (PAN u. GALLIGAN 1994) [2] (GALLIGAN u. BERTRAND 1994) [12] (TOKIMASA et al. 1983) [3] (LIU et al. 1997) [13] (MIHARA u. NORTH 1986) [4] (NORTH et al. 1985b) [14] (WADE et al. 1994) [5] (ZAFIROV et al. 1985) [15] (NORTH u. SURPRENANT 1985) [6] (FRIELING et al. 1999) [16] (YAU et al. 1986) [7] (CHERUBINI u. NORTH 1984) [17] (MIHARA et al. 1987) [8] (MAWE et al. 1986) [18] (HIRAI et al. 1997) [9] (SHEN u. SURPRENANT 1990) [19] (CUNNINGHAM et al. 1994)[10] (SCHEMANN u. TAMURA 1992)


2.1.5 Neuro-neuronale synaptische Aktivität und elektrischesVerhalten

Interneuronale Kommunikation über synaptische Übertragung kann im ENS

einerseits zwischen intrinsischen enterischen Neuronen erfolgen, andererseits kann

sie auch über extrinsische vagale und sympathische Neurone auf intrinsische

Neurone stattfinden (MCCONALOGUE u. FURNESS 1994).

Werden bei intrazellulären Ableitungen interganglionäre Nervenstränge

elektrisch stimuliert, können dabei abhängig von dem entsprechenden

Neurotransmitter und aktivierten Rezeptor am postsynaptischen Neuron zwei

Formen des synaptischen Input registriert werden:

- depolarisierende, exzitatorische postsynaptische Potentiale (EPSP) und

- hyperpolarisierende, inhibitorische postsynaptische Potentiale (IPSP).

Nach Art der synaptischen Ausschüttung können diese postsynaptischen Potentiale

jeweils in schnelle, nur einige Millisekunden dauernde (fast EPSP/ fast IPSP) und

langsame, mehrere Sekunden bis Minuten andauernde Antworten (slow EPSP/

slow IPSP) unterschieden werden. EPSP bleiben je nach Stärke und Grad der

Depolarisation entweder unterschwellig oder führen als überschwellige EPSP zur

Auslösung eines oder mehrerer Aktionspotentiale, die dann entlang der Axone in

orthodromer Richtung weitergeleitet werden. Nach Stimulation interganglionärer

Nervenfasern können Axone sowie Dendriten stimuliert werden, deren Potentiale

die dazugehörige Nervenzelle direkt aktivieren. Diese verlaufen hin zum Zellsoma

und können durch intrazelluläre Injektion hyperpolarisierender Strompulse

elektrophysiologisch von synaptischen Potentialen unterschieden werden. Der im

anglo-amerikanischen Raum verwendete Terminus des ‚process potential‘ umfaßt

die Ausbreitung des Aktionspotentials sowohl in den axonalen und dendritischen

Nervenzellfortsätzen als auch die elektrotonische Ausbreitung auf der

Somamembran.

Experimentell können s EPSP/ s IPSP durch elektrische Stimulation

interganglionärer Nervenstränge mit hochfrequenten Pulssalven, f EPSP/ f IPSP

durch Einzelpulse induziert werden. Die während intrazellulärer Ableitungen bei

f EPSP und s EPSP gemessenen Membranpotentialverläufe sind exemplarisch in

28 Grundlagen

A B

20 ms

20 mV10 mV*

*

führte. Das Artefakt der Stimulation (*) ist in der intrazellulären Ableitung vor Beginn des

synaptischen Potentials zu erkennen (nach WOOD 1994).

Abbildung 1 und 2 dargestellt. Im Darmtrakt nimmt bei f EPSP nach repetitiver

Stimulation (> 0,1 Hz) die Amplitude zunehmend ab. Dieses als „Rundown“

bezeichnete Phänomen beruht nicht auf postsynaptischen Änderungen, vielmehr

geht man von präsynaptischen Autoinhibitionsmechanismen aus (HIRST u.

MCKIRDY 1974; NORTH et al. 1985a), die zu einer Reduzierung der

Signalamplitude von f EPSP führen. Bei Stimulation interganglionärer Nerven-

stränge kann es durch Aktivierung mehrerer Synapsen außerdem zur räumlichen

Abbildung 1: Schnelle erregende

postsynaptische Potentiale (f EPSP)

eines S/Typ1- Neuron im Dünndarm

nach elektrischer Stimulation eines

interganglionären Nervenstrangs. In der

intrazellulären Ableitung ist der

Membranpotentialverlauf eines unter-

schwelligen f EPSP (A) und eines über-

schwelligen f EPSP (B) dargestellt, das

zur Auslösung eines Aktionspotentials

Depolarisation

Aktionspotentialentladung

1 s5 mV

Abbildung 2: Intrazelluläre

Ableitung eines langsamen

erregenden postsynaptischen

Potentials (s EPSP) eines

S/Typ1-Neuron im Dünn-

darm nach elektrischer

Stimulation eines intergang-

lionären Nervenstrangs mittels einer Pulssalve (Balken). Während des s EPSP entsteht

eine lang anhaltende Depolarisation, wobei es zu einer Entladung von mehreren

Aktionspotentialen kommt (nach SCHEMANN 1990).


oder zeitlichen Addition der Einzelerregungen am postsynaptischen Neuron

kommen, die zu einer Erhöhung der Signalamplitude eines f EPSP führt und als

Summation bezeichnet wird.

Am jeweils aktivierten Neuron bewirken die ausgelösten s EPSP und f EPSP

eine unterschiedliche Dauer der Transmitterfreisetzung, worin eine unterschiedliche

funktionelle Bedeutung vermutet wird (WOOD 1994). Beispielsweise dauern die

beim peristaltischen Reflex auftretenden Muskelkontraktionen bzw. -relaxationen

einige Sekunden bis Minuten, ebenso wie sekretorische Mechanismen intestinaler

Krypten. Das entsprechende Korrelat auf neuronaler Ebene wird in s EPSP

vermutet, da sie am ehesten die Kriterien der kontinuierlichen

Transmitterfreisetzung an das nächste postsynaptische Neuron oder an ein

Effektorsystem erfüllen und an diesen eine kontinuierliche Inhibition oder Exzitation

bewirken können (WANG u. COOKE 1990; WOOD 1991). Innerhalb der

Reflexschaltkreise wird die funktionelle Bedeutung der f EPSP in der schnellen

Übertragung und Umwandlung neuronal kodierter Information gesehen. Gerade im

Zusammenhang mit Neuromodulation scheinen sie eine nicht unwesentliche Rolle

zu spielen, da abhängig vom Membranpotential des postsynaptischen Neuron

(hyper- oder depolarisiert) beim Eintreffen unterschwelliger EPSP die Erregung

entweder erlischt oder weitergeleitet wird. Die Rolle der inhibitorischen Potentiale

wird generell in der Beendigung auftretender Erregung gesehen. Durch den

hauptsächlich mehrere Sekunden andauernden membranhyperpolarisierenden

Mechanismus wird - als Gegensatz zum s EPSP - ein Zustand der geringen

Erregbarkeit erreicht bzw. wiederhergestellt. Ihre wichtige gegenregulatorische

Funktion wird beispielsweise bei sekretorischen Diarrhöen verdeutlicht: Die in ihrer

Aktivität gesteigerten Sekretomotoneurone werden durch Analoga-Gabe von

Opioiden, die als Transmitter für IPSP diskutiert werden, inhibiert (WOOD 1994).

Neuropharmakologisch werden an der synaptischen Übertragung beteiligte

Transmitter durch Einsatz spezifischer Agonisten oder Antagonisten und deren

Wirkung auf postsynaptische Neurone des ENS identifiziert (s. Tabelle 1).

Die meisten f EPSP werden wesentlich in ihrer Amplitude vermindert oder gar

vollständig unterdrückt, wenn nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Antagonisten

30 Grundlagen

(nAChR-Antagonisten) verwendet werden. Als Haupttransmitter für die schnelle,

erregende synaptische Übertragung wird daher Acetylcholin (ACh) angesehen, das

über nikotinerge Rezeptoren wirkt (HIRST et al. 1974; NISHI u. NORTH 1973).

Funktionell konnte gezeigt werden, daß der peristaltische Reflex durch

nAChR-Antagonisten wie z. B. Hexamethonium blockiert werden kann und damit

cholinerg vermittelt ist (FISHLOCK u. PARKES 1963; KOSTERLITZ u. LEES 1964).

Eine Beteiligung cholinerger oral und anal projizierender Interneurone bei der oralen

Kontraktion sowie bei der analen Relaxation wurde für den Menschen gezeigt

(GRIDER 1989). Bei der Pathophysiologie der Obstipation konnte eine Veränderung

cholinerger Mechanismen nachgewiesen werden (BURLEIGH 1988). Beim

Menschen existieren Hinweise, daß im Plexus myentericus f EPSP durch ACh über

nikotinerge Rezeptoren vermittelt werden (BROOKES et al. 1987). Beim

Meerschweinchen ist für den Plexus submucosus eine vollständige Inhibition aller

f EPSP durch die Verwendung von nAChR-Antagonisten beschrieben worden

(EVANS u. SURPRENANT 1992). Da aber im Plexus myentericus einige f EPSP

auch eine Hexamethonium-insensitive Komponente zeigen (GALLIGAN u.

BERTRAND 1994) und nur bei etwa 25 % eine vollständige Blockade mit

nAChR-Antagonisten erreicht wird (LEPARD u. GALLIGAN 1999; LEPARD et al.

1997), werden daher zwei Hauptgruppen von f EPSP definiert: eine nikotinerge und

eine gemischte Gruppe, letztere bestehend aus einer cholinergen,

Hexamethonium-sensitiven und einer nicht-cholinergen, Hexamethonium-

insensitiven Komponente (GALLIGAN et al. 2000; LEPARD et al. 1997).

Neben der cholinergen erregenden Komponente existieren im enterischen

Nervensystem des Meerschweinchens konkrete Hinweise, daß einige der

nicht-cholinergen erregenden f EPSP durch Serotonin und auch durch

Adenosintriphosphat (ATP) vermittelt werden (BURNSTOCK et al. 1970; EVANS et

al. 1992; GALLIGAN u. BERTRAND 1994; GALLIGAN 1999; LEPARD u.

GALLIGAN 1999; SPENCER et al. 2000). Daß dieses Mononucleotid nicht nur als

Energiespeicher und DNA-Baustein im Organismus fungiert, sondern auch als

Neurotransmitter, wurde in der von Burnstock aufgestellten „purinergic nerve

hypothesis“ formuliert (BURNSTOCK 1972; BURNSTOCK 1981). Diese purinerge


Hypothese konnte mittlerweile durch mehrere Studien, die die Funktion von ATP an

neuromuskulären Synapsen als inhibitorischen Transmitter zeigen konnten,

untermauert werden. Auch beim Menschen existieren Hinweise für eine inhibitive

Wirkung und Beteiligung von ATP an der neuromuskulären Übertragung (XUE et al.

1999).

Weit weniger Daten liegen bisher für die ATP-Wirkung bei der

neuro-neuronalen Übertragung vor. Für das Meerschweinchen konnten im Plexus

myentericus f EPSP nachgewiesen werden, die über den

P2-Purinrezeptor-Antagonist Suramin zu blockieren waren und somit ATP-vermittelt

sind (GALLIGAN u. BERTRAND 1994; ZHOU u. GALLIGAN 1998; ZHOU u.

GALLIGAN 1996). ATP scheint im Plexus myentericus gerade bei anal

projizierenden, lokalen Verschaltungen ein potentiell nicht-cholinerger, erregender

Neurotransmitter zu sein (LEPARD u. GALLIGAN 1999; SPENCER et al. 2000).

Hinweise für das Vorhandensein von ATP im Plexus submucosus des Menschen

sind in der zugänglichen Literatur nicht zu finden. Für den Plexus myentericus

konnte in fetalem Humangewebe ATP indirekt mittels Quinacrin-Methode

nachgewiesen und hiermit histochemisch zumindest eine Kolokalisation von ATP

und Stickoxid-Synthase gezeigt werden (BELAI u. BURNSTOCK 2000).

Acetylcholin fungiert auch bei s EPSP als erregender Transmitter, wobei

diese Antworten Hexamethonium-insensitiv sind. Die ACh-Wirkung dieser

langsamen Potentiale wird über muskarinerge Rezeptoren vermittelt und ist durch

Atropin blockierbar. Substanz P depolarisiert exzitatorische enterische Neurone

(KATAYAMA et al. 1979) und führt im myenterischen Plexus zu einer vermehrten

ACh-Freisetzung (YAU u. YOUTHER 1982). Dabei scheint die Freisetzung von

Substanz P frequenzabhängig und prominent bei höheren Stimulusfrequenzen zu

sein (BARON et al. 1983). Eine Beteiligung von Substanz P bei s EPSP konnte

inzwischen durch den Einsatz spezifischer Antagonisten nachgewiesen werden

(NEUNLIST et al. 1999a). VIP, γ-Aminobuttersäure (GABA) sowie Serotonin werden

ebenfalls als Transmitter für die Generierung von s EPSP angesehen (s. Tabelle 1).

Wichtige Transmitter der inhibitorischen postsynaptischen Potentiale (IPSP)

sind in Tabelle 1 aufgelistet.

32 Grundlagen

Neben den postsynaptischen Mechanismen können im ENS ebenfalls

präsynaptische Mechanismen die Informationsvermittlung durch Hemmung oder

Verstärkung synaptischer Übertragung modulieren.

Bei der präsynaptischen Hemmung wird die axonale Transmitterfreisetzung

unterdrückt. Man unterscheidet zwischen der axo-axonalen Hemmung, bei der die

Transmitterausschüttung an einem Axon durch die eines zweiten Axons unterdrückt

wird, und der Autoinhibition, bei der die Transmitterfreisetzung durch präsynaptische

Rezeptoren am aktivierten Neuron im Sinne eines negativen

„feedback“-Mechanismus unterdrückt wird (WOOD 1994) und die über

präsynaptische, muskarinerge Acetylcholin-Rezeptoren (mAChR) vermittelt wird

(NORTH et al. 1985b). Die präsynaptische Hemmung tritt an Synapsen in

Erscheinung, die f EPSP, s EPSP und IPSP generieren, und ist für den

myenterischen und submukösen Plexus des Dick- und Dünndarms beschrieben

(DEMBOWSKI u. MAYER 1982; NORTH et al. 1985b; ORT et al. 1984). Neben

Acetylcholin existieren noch eine Reihe weiterer präsynaptisch hemmender

Transmitter, die in Tabelle 1 zu finden sind.

Eine Verstärkung der Transmitterfreisetzung über präsynaptische

Mechanismen ist im Plexus myentericus des Meerschweinchens für exzitatorische

Motoneurone beschrieben worden, die über nikotinerge Rezeptoren durch

Acetylcholin vermittelt wird (GALLIGAN 1999).

Das elektrische Verhalten wird ebenfalls zur Charakterisierung enterischer

Neurone herangezogen und nach intrazellulärer Stromapplikation anhand

elektrophysiologischer Merkmale klassifiziert (BORNSTEIN et al. 1994; HIRST et al.

1974; NISHI u. NORTH 1973; WOOD 1987). Demnach lassen sich basierend auf

Untersuchungen am Plexus myentericus des Meerschweinchenileum im Darmtrakt

mit Ausnahme des Magens - hier gilt ein anderes Schema - im wesentlichen zwei

Gruppen unterscheiden (nach WOOD): AH/Typ 2-Neurone und S/Typ 1-Neurone.

AH-Neurone zeigen infolge intrazellulärer Stromapplikation Aktionspotentiale

mit einer charakteristischen, mehrere Sekunden andauernden

After-Hyperpolarisation, einer über einen Calcium-sensitiven Kalium-Kanal


gesteuerten Nachhyperpolarisation, die weitere Aktionspotentiale verhindert. Das

Aktionspotential der AH-Neurone, dessen halbmaximale Dauer etwa bei 2,3-2,5 ms

liegt (IYER et al. 1988; NEUNLIST et al. 1999a), wird über einen

spannungssensitiven Calcium-Kanal gesteuert und zeigt gegenüber dem

Natrium-Kanal-Blocker Tetrodotoxin (TTX) nur geringe Sensitivität. Einzelstimulation

interganglionärer Nervenfasern löst nur in sehr wenigen AH-Neuronen

12-20 Millisekunden andauernde f EPSP aus (TAMURA u. WOOD 1989). Nach

Stimulation mittels einer Pulssalve können bei AH-Neuronen gewöhnlich mehr als

10 Sekunden dauernde s EPSP induziert werden.

Im Gegensatz dazu erhalten S-Neurone synaptischen Input über f EPSP.

Auch sie generieren s EPSP. Das wesentlich kürzere Aktionspotential der

S-Neurone wird über einen spannungssensitiven Natrium-Kanal vermittelt und zeigt

nach intrazellulärer Depolarisation keine deutliche Nachhyperpolarisation. Es wird

durch den Natrium-Kanal-Blocker TTX vollständig blockiert.

Für den Plexus myentericus am distalen Kolon der Maus sind vergleichbare

Charakteristika auch hinsichtlich des Vorkommens von AH- und S-Neuronen

beschrieben (FURUKAWA et al. 1986). Am Plexus myentericus des distalen Kolon

des Menschen zeigt die intrazelluläre Ableitung jedoch Unterschiede (BROOKES et

al. 1987) hinsichtlich des Aussehens und der Verteilung von AH-Neuronen. In dieser

einzigen im Schrifttum vorhandenen Studie ist jedoch die untersuchte

Nervenzellzahl noch zu gering, um grundsätzliche Aussagen über

elektrophysiologische Charakteristika treffen zu können. Allerdings weisen

speziesspezifische Unterschiede auf die Problematik hin, Befunde am Tier auf den

Menschen zu extrapolieren.

Neben der experimentell ausgelösten Aktivität ist das Vorkommen von nicht

experimentell induzierter Aktivität, von Spontanaktivität beschrieben. Einzelne

spontane Aktionspotentiale sowie f EPSP treten häufig bei S-Neuronen, seltener bei

AH-Neuronen auf (FRIELING et al. 1991a; FRIELING et al. 1991b).

Elektrophysiologisch sind neben einzelnen Entladungen auch Salven von

Entladungen beschrieben, die auch nach Blockade synaptischer Übertragung

registriert werden können (WOOD 1994). Für den Menschen liegen nur sehr wenig

34 Grundlagen

Daten über das Vorkommen von Spontanaktivität vor. In der einzigen im Schrifttum

vorhandenen Untersuchung am Plexus myentericus konnten mittels intrazellulärer

Ableitung bei zwei Neuronen spontane f EPSP registriert werden (BROOKES et al.

1987). Die Autoren schließen aber als Ursache eine Schädigung der Zellen infolge

des Anstechens mit der Mikroelektrode nicht aus.

2.1.6 Techniken und Methoden zur Untersuchung des ENS

Die heutigen Erkenntnisse und Modellvorstellungen über funktionell

unterschiedliche Gruppen enterischer Neurone und über die Struktur und

Funktionsweise des ENS stützen sich grundlegend auf den kombinierten Einsatz

verschiedener histoanatomischer, elektrophysiologischer, neuropharmakologischer,

immunhistochemischer Techniken und Tracing-Studien sowie in vitro und in vivo

Registrierung der Aktivität der Effektoren.

Gerade die Etablierung intrazellulärer elektrophysiologischer Techniken

(HIRST et al. 1974; NISHI u. NORTH 1973) am ENS erbrachte Anfang der 80er

Jahre mit dem Einblick in das elektrische und synaptische Verhalten einzelner

Neurone entscheidende Fortschritte und bestätigte die bis dahin weitgehend

vermuteten komplexen neuronalen Funktionsmechanismen des ENS. Für Studien

komplexer Schaltkreise ist aber gerade das simultane Messen des synaptischen

Verhaltens mehrerer Neurone notwendig. Dies ist methodisch bisher nur in sehr

beschränktem Umfang möglich. KUNZE und Mitarbeitern gelang es, von zwei

interagierenden Neuronen - einem AH/Typ 2-Neuron und seinem entsprechenden

Folgeneuron - gleichzeitig abzuleiten (KUNZE et al. 1993). Damit konnte der

elektrophysiologische Nachweis geliefert werden, daß AH/Typ 2-Neurone in

Interneuronen und Motoneuronen s EPSP generieren. Dennoch ist die intrazelluläre

elektrophysiologische Methode für Studien neuronaler Netzwerke und für das

simultane Erfassen des synaptischen Verhaltens mehrerer Neurone aufgrund der

gegebenen Limitation auf sehr wenige Neurone nicht geeignet. Ein weiterer Nachteil

ist, daß gerade kleine Neurone aufgrund ihrer Größe nur äußerst selten mit

intrazellulären Elektroden angestochen werden und von ihnen nicht in

Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT) 35

ausreichendem Maß abgeleitet werden kann (FURNESS et al. 1988). Die

Anwendung einer optischen Meßmethode bietet das Potential, simultan mehrere

Neurone erfassen und untersuchen zu können.

2.2 Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT)

2.2.1 Einführung

Die Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT) erlaubt, simultan die Aktivität

mehrerer erregbarer Zellen durch optische Messung zu erfassen. Ein

spannungssensitiver Farbstoff fungiert dabei als molekularer Wandler und

transformiert Änderungen des Membranpotentials in optische Signale. Angewendet

wurde bislang diese Technik der optischen Membranpotentialmessung an

verschiedenen Geweben beispielsweise an Neuronen des Blutegels (SALZBERG et

al. 1973), an Bakterien (BREWER 1976), an der Speicheldrüse von Schnecken

(SENSEMAN et al. 1983), am Froschherz (KOMURO et al. 1986), am vital

gefärbten embryonierten Hühnerherz (KAMINO et al. 1989), am Abdominalganglion

der Meeresschnecke Aplysia (PARSONS et al. 1989) sowie verschiedenen

Gehirnarealen von Frosch (SALZBERG et al. 1983), Rochen (KONNERTH et al.

1987), Meerschweinchen (ALBOWITZ et al. 1990), Ratte (GRINVALD et al. 1982b)

und Mensch (SYVERSON et al. 1986).

An enzymatisch dissoziierten submukösen Neuronen des

Meerschweinchenileum konnten OBAID und Mitarbeiter 1992 prinzipiell die

Übertragbarkeit dieser optischen Methode auch auf Neurone des ENS zeigen

(OBAID et al. 1992). Die MSORT wurde bisher allerdings weder für Untersuchungen

am frisch präparierten ENS des Meerschweinchens eingesetzt noch ist sie bislang

am ENS des Menschen oder der Maus etabliert worden.

Die Multi-Site Optical Recording Technique geht auf verschiedene

Arbeitsgruppen zurück, die optische Aktivitätsmessungen an gefärbten und

ungefärbten Nervenmembranen Mitte des 20. Jahrhunderts durchführten (HILL u.

KEYNES 1949; USHAKOV 1950). 1968 konnten TASAKI und Mitarbeiter an vital

gefärbten und stimulierten Tintenfischaxonen Änderungen der Fluoreszenzintensität

36 Grundlagen

messen (TASAKI et al. 1968). Da der praktische Einsatz dieser Technik jedoch

zunächst auf große Membranoberflächen limitiert war und erhaltene optische

Signale nur von geringer Größe waren, wurden in den vergangenen Jahrzehnten

mehr als 1000 Farbstoffe auf ihre Eignung getestet (COHEN et al. 1974;

GRINVALD 1985a; ROSS et al. 1977). Viele Farbstoffe zur Messung von

Membranpotentialänderungen waren bei hohen Lichtintensitäten und in

Anwesenheit von Sauerstoff stark phototoxisch. Dies limitierte die Experimente

zunächst auf Invertebraten. Erst die stetige Entwicklung, Verbesserung und

Charakterisierung von spannungssensitiven Fluoreszenzfarbstoffen (GRINVALD et

al. 1982; GUPTA et al. 1981; LOEW et al. 1992; ROSS et al. 1977) sowie die

Optimierung der Meßapparatur durch Entwicklung leistungsstärkerer, schneller und

größerer Photodetektoren mit vielen Elementen und hoher Quantenausbeute

(COHEN et al. 1971; COHEN et al. 1974; GRINVALD et al. 1977; SALZBERG at al.

1973; WAGGONER 1979) und die Entwicklung der Computertechnik erbrachten die

technischen und instrumentellen Voraussetzungen, die optische Signalerfassung

Ende des 20. Jahrhunderts zur Untersuchung an Nervensystemen von Vertebraten

anzuwenden. Heute finden etwa 20-30 spannungssensitive Farbstoffe als

potentiometrische Sensoren Einsatz, die die Basis für diese optische Messung

bilden.

2.2.2 Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe

2.2.2.1 Bedeutung und Anwendung

Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe besitzen die Fähigkeit, sich einseitig in

Zellmembranen einlagern zu können und als molekulare Sonden Änderungen des

Membranpotentials mit einer Änderung ihrer optischen Eigenschaften, vor allem

ihres Absorptions- und Fluoreszenzverhaltens, zu beantworten. Ihre spektralen

Eigenschaften sind in mehreren Studien ausführlich untersucht worden (COHEN u.

SALZBERG 1978; FLUHLER et al. 1985; FROMHERZ u. LAMBACHER 1991;

FROMHERZ u. MULLER 1993; GUPTA et al. 1981; LOEW et al. 1985;

WAGGONER 1979).


In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl von Farbstoffen an

unterschiedlichen biologischen Geweben, wie beispielsweise Nerven- und

Muskelzellen, angewendet. Ein großer Vorteil, verglichen mit dem Einsatz von

Mikroelektroden zur Zellableitung, ist ihre Anwendbarkeit auf nahezu alle Zellarten

und Zelltypen unabhängig von ihrer Größe. Mit der geeigneten optischen

Meßapparatur ermöglichen die spannungssensitiven Farbstoffe die Detektion von

Spannungstransienten mit hoher Orts- und Zeitauflösung und schaffen die

Voraussetzung, diese entlang des Untersuchungsobjektes zu kartieren.

Da spannungssensitive Farbstoffe auf Potentialänderungen des sie

umgebenden Milieus unterschiedlich schnell reagieren, wurde von WAGGONER

1976 die Einteilung in ‚slow-response probes‘ und ‚fast-response probes‘

vorgeschlagen, die seither verwendet wird. ‚Slow-response probes‘ antworten im

Bereich von Sekunden bis Minuten mit relativ großen Änderungen des

Fluoreszenzsignals von 80-90 % pro 100 mV.

‚Fast-response probes‘ reagieren auf Spannungstransienten typischerweise

im Submikrosekundenbereich und können damit schnelle Ereignisse wie

beispielsweise Aktionspotentiale zeitgleich darstellen (GRINVALD et al. 1987;

WAGGONER 1979). Die resultierende potentialabhängige Fluoreszenzänderung ist

bei dieser Farbstoffklasse allerdings gering und liegt bei 2-10 %

Fluoreszenzänderung auf 100 mV. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten

Chromophore gehören dieser Klasse potentiometrischer Farbstoffe an.

2.2.2.2 Potentialsensitive Styrylfarbstoffe: Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPSsowie Di-8-ANEPPQ

Die in dieser Arbeit eingesetzten Farbstoffe Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPS und auch

Di-8-ANEPPQ (s. Abb. 3) zählen zur Strukturklasse der Styryl- bzw. der

Naphthylstyrylfarbstoffe. Diese Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinum Chromophore

wurden 1978 von LOEW entwickelt und zeichnen sich besonders durch eine

konstant sensitive Antwort aus (LOEW et al. 1978).

38 Grundlagen

Das Ziel von LOEW und Mitarbeitern, einen universellen potentiometrischen

Farbstoff zu erhalten, der sich auf die verschiedenen Anwendungsgebiete und

Untersuchungsprotokolle anwenden läßt, konnte mit Di-4-ANEPPS teilweise

realisiert werden. Der breite Einsatz in vielen unterschiedlichen Geweben,

beispielsweise Nervenzellen und Herzmuskelzellen, verdeutlich dies (LOEW et al.

1992; NEUNLIST et al. 1992). Di-4-ANEPPS zeichnet sich durch eine

verhältnismäßig hohe relative Fluoreszenzänderung aus bei Potentialänderungen

von 100 mV. Nachteil ist eine bei einigen Zelltypen auftretende

Membrandurchgängigkeit und auftretende Phototoxizität. Das daraufhin entwickelte

Derivat Di-8-ANEPPS besitzt hingegen eine gute Membranstabilität und zeigt eine

hohe Photostabilität bei gleichzeitig geringer Phototoxizität. Di-8-ANEPPQ ist ein

primär für neuronales Tracing entwickelter spannungssensitiver Farbstoff, der eine

sehr geringe Wasserlöslichkeit, aber hohe Lipidlöslichkeit besitzt. Allein

Di-8-ANEPPS wurde bisher am enzymatisch dissoziierten enterischen

Nervensystem angewendet und hier nur beim Meerschweinchen (OBAID et al.

1992).

Die Naphthylstyrylfarbstoffe sind größtenteils zwitterionische amphiphile

Farbstoffe und besitzen typischerweise zwei funktionelle Gruppen, einen

Naphthalinring als Elektronendonor und einen Pyridinring als Elektronenakzeptor.

Die beiden Ringsysteme sind meist über Kohlenstoffketten mit konjugierten

Doppelbindungen verknüpft. Bei der Photoexzitation kommt es zu einer

Verschiebung der positiven Ladung vom Pyridin zum Naphthalin.

Der polare Charakter von Di-8-ANEPPS und Di-4-ANEPPS wird durch die

negativ geladene Sulfatgruppe der Kohlenstoffkette hervorgerufen, die an dem

positiv geladenen Stickstoff des Pyridins gebunden ist. Hingegen besitzt das

kationische Di-8-ANEPPQ eine doppelt positive Ladung am Pyridin, die eine

einseitige Membranbindung verstärkt (LOEW 1996). Die bei einigen Derivaten

unterschiedlich langen, paarigen hydrophoben Kohlenwasserstoffketten, durch die

sich die in dieser Arbeit verwendeten Farbstoffe Di-8-ANEPPS/Di-8-ANEPPQ und

Di-4-ANEPPS unterscheiden, tragen nicht zur Fluoreszenz bei, sondern bewirken

die Verankerung in die Zellmembran. Die Tiefe und Stabilität der Verankerung steht


in Abhängigkeit zu der Länge der Hydrokarbonketten (BAMMEL et al. 1990). In den

Interzellularraum ragt die hydrophile Kopfgruppe, die das Chromophor jeweils

senkrecht zur Membran-Wasser-Grenzschicht ausrichtet.

Abbildung 3: Strukturformel dreier Naphthylstyrylfarbstoffe (links) und Lage des

Farbstoffmoleküls in einem Membranmodell (rechts)

Links Die hydrophile Kopfgruppe wird durch einen Pyridinring mit einem positiv geladenen

Stickstoffatom (N+) repräsentiert, an dem über Kohlenstoffketten einfach negativ geladene

Sulfat-Gruppen (Di-8-ANEPPS/ Di-4-ANEPPS) bzw. eine einfach positiv geladene

Quaternat-Gruppe (Di-8-ANEPPQ) gekoppelt sind. Der unpolare Teil der Farbstoffe

besteht aus dem Naphthalinring und den beiden entsprechend langen

Kohlenwasserstoffketten.

Rechts Schematische Darstellung der Integration und Ausrichtung eines potentiometrischen

Farbstoffmoleküles in die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran am Beispiel des

Styrylfarbstoffes Di-8-ANEPPS. Die hydrophile Kopfgruppe ragt in den Interzellularraum.

Di-8-ANEPPS

Di-4-ANEPPS

Di-8-ANEPPQ

Phospholipid-Doppelschicht

InterzellularraumDi-8-ANEPPS

Zellinneres

40 Grundlagen

2.2.2.3 Mechanismus der Spannungssensitivität

Für viele ‚fast-response‘-Farbstoffe sind die genauen Mechanismen der

Potentialsensitivität noch nicht hinreichend geklärt.

Jedoch konnte für die von LOEW synthetisierten Amino-Naphthyl-Ethenyl-

Pyridinum Chromophore gezeigt werden, daß die Potentialsensitivität überwiegend

auf intramolekularer Elektronenverschiebung beruht (LOEW u. SIMPSON 1981;

LOEW et al. 1979). Dieser als Elektrochromie bezeichnete Mechanismus ist

verantwortlich für die Sensitivität der Farbstoffe gegenüber dem Membranpotential.

Als Elektrochromie (Stark-Effekt) beschreibt man die Änderung der optischen

Eigenschaften eines Chromophors im elektrischen Feld der Membranspannung, die

sich in einer Frequenzverschiebung des Absorptions- bzw. Emissionsmaximums

äußert. Bei einer intramolekularen Ladungsverschiebung entgegen eines

elektrischen Feldes bedingt die zusätzlich erforderliche Photoexzitationsenergie

eine Blauverschiebung des Anregungs- sowie des Emissionsspektrums (LABHART

1967). Auch für die Styrylfarbstoffe ist diese Blauverschiebung der beiden Spektra

beschrieben (FROMHERZ u. LAMBACHER 1991).

Für eine elektrochrome Verschiebung ist eine Bewegung des Chromophors

in der Membran nicht erforderlich, deshalb können die Änderungen im

Subnanosekundenbereich stattfinden. Die optische Antwort ist damit schnell genug,

um transiente Spannungsänderungen im Millisekundenbereich, wie z. B.

Aktionspotentiale von Nervenzellen, zu detektieren. Die Ausrichtung des

Farbstoffmoleküls senkrecht zur Membran-Wasser-Grenzschicht garantiert, daß die

intramolekulare Ladungsverschiebung parallel zum transmembranen elektrischen

Feld erfolgt und durch diese erzielte Maximierung des elektrochromen

Mechanismus Spannungsänderungen linear erfaßt werden können (FLUHLER et al.

1985). Diese lineare Spannungssensitivität konnte in Kombination mit intrazellulären

Ableitungen und mit der Patch-Clamp Technik mehrfach gezeigt werden

(GRINVALD et al. 1982a; ZECEVIC u. ANTIC 1998; FLUHLER et al. 1985; ZHANG

et al. 1998). Außerdem ähnelten die simultan gemessenen optischen Signale in


ihrem Zeitverlauf den elektrophysiologisch registrierten transmembranalen

Spannungstransienten (ROSS et al. 1977).

Ein großer Vorteil für optische Messungen ist, daß diese Farbstoffe nur dann

stark fluoreszierend sind, wenn sie an Membranen gebunden sind. Sie sind

praktisch nicht fluoreszierend, wenn sie gelöst in Wasser vorliegen. Voraussetzung

für die Detektion der Fluoreszenzänderungen ist die Bindung entweder an die

Außenseite oder die Innenseite der Membran. Die in dieser Arbeit verwendeten

Farbstoffe werden ausschließlich auf der Außenseite der Membran appliziert. Die

Anregung erfolgt im grünen, die Emission im roten Spektralbereich.

2.2.3 Meßtechnologie zur Detektion optischer Änderungen

Optische Signale werden durch eine Vielzahl von Störgrößen beeinflußt, die als sog.

Rauschen die Größe der informationsübertragenden optischen Signale nach unten

begrenzen. Die Entwicklung der Meßsysteme zielt dementsprechend darauf,

Rauschkomponenten zu minimieren und Signale selbst mit geringer Lichtintensität

mit ausreichender Genauigkeit erfassen und darstellen zu können. Um

Membranpotentialänderungen an verschiedenen Orten zeitgleich und möglichst

genau zu registrieren, ist eine gute zeitliche und räumliche Auflösung erforderlich,

wobei das Ausmaß jeweils von der zu bearbeitenden Fragestellung abhängig ist.

Für die Detektion optischer Signale werden heute hauptsächlich

Photodioden-Systeme, Photomultipler und auch CCD-Kameras verwendet.

42

3 Untersuchungsgut und Methodik3.1 Untersuchtes Darmgewebe

3.1.1 Maus und Meerschweinchen

Die Untersuchungen am Plexus submucosus und Plexus myentericus wurden im

Bereich des proximalen Kolon von Maus und Meerschweinchen durchgeführt.

Für die Versuche am murinen Darmgewebe wurden männliche Tiere der

gängigen Inzuchtstämme BALB/cJ und C57BL/6 verwendet, die ad libitum mit

Altromin Haltungsfutter Nr. 1324 gefüttert wurden. Die Mäuse wurden im Alter von

3-6 Monaten durch zervikale Dislokation getötet, gleichzeitig entblutet und dann in

Rückenlage fixiert. Nach medianer Eröffnung des Abdomen wurde ein ca. 3 cm

langes Stück Colon ascendens ausgehend von der Ampulla coli (Abb. 4, X)

entnommen und mittels Inzisur oral markiert.

Bei den Untersuchungen am Meerschweinchen standen männliche und

weibliche Tiere des Auszuchtstammes BFA-bunt im Alter von 3-7 Monaten zur

Verfügung. Die Fütterung erfolgte mit Altromin Nr. 3122 und Heu ad libitum. Die

Tiere wurden zunächst per Kopfschlag betäubt und dann sofort mittels Dekapitation

getötet.

Abbildung 5: Darstellung zurEntnahmelokalisation des Dickdarmstückesbeim Meerschweinchen (modifiziert nachPOPESKO 1992a).

X Übergang vom Caecum zur Ampulla coli, [ ] entnommenes Stück Colon ascendens

Abbildung 4: Überblick über dieEntnahmelokalisation bei der Maus.Dargestellt sind Dickdarmabschnitte(modifiziert nach POPESKO 1992b).

[ ][

Untersuchungsgut und Methodik 43

Nach Fixierung in Rückenlage und medianer Bauchdeckeneröffnung wurde

ein ca. 4 cm großes Stück Colon ascendens etwa 6 cm distal der Ampulla coli

entnommen (Abb. 5) und oral markiert.

Die entnommenen Darmabschnitte wurden sofort in eisgekühlte, mit

Carbogen (O2 95 Vol%, CO2 5 Vol%, Linde GmbH, Höllriegelskreuth) gesättigte

Krebs-Lösung (s. Kapitel 8.2) verbracht.

3.1.2 Darmgewebe des Menschen

Im Zeitraum von März 1999 bis Oktober 2000 wurden vier Rektumbioptate und 30

etwa 2- 40 cm² große Ganzwandabschnitte von Teilen des Kolon und Rektum

untersucht (s. Abb. 6). Die Verwendung von Humangewebe war im Rahmen des

Teilprojektes A 10 des SFB 280 ‚Gastrointestinale Barriere‘ genehmigt worden.

Das Darmgewebe wurde jeweils bis

zur Untersuchung an der

Tierärztlichen Hochschule in

gekühlter, sauerstoffangereicherter

Krebs-Lösung aufbewahrt.

Die Bioptate waren mit

Einwilligung der Patienten durchge-

führte Probeentnahmen, bei denen

der Verdacht auf Amyloidose

bestand und ausgeschlossen werden

sollte. Die Gewebe waren unter Sicht

mit einer Exzisionszange (durch-

schneidend, mit abgewinkeltem Kopf,

8151.17, R. Wolf, Kneitlingen) 6-8 cm

ab ano aus dem dorsalen Rektum

entnommen worden. Die

Gewebestücke hatten einen

Durchmesser von ca. 0,4-0,6 cm.

Abbildung 6: Schematische Darstellung desgesamten Dickdarmes beim Menschen.Lokalisationen der hauptsächlichuntersuchten Dickdarmabschnitte sindmittels Pfeil markiert.

a Colon ascendens; b Colon transversum;c Colon descendens; d Colon sigmoideum;e Rectum

44 Eigene Untersuchungen

Die Ganzwandgewebe stammten aus Darmresektaten, hauptsächlich

entnommen im Rahmen von Karzinomoperationen. Für die Untersuchungen wurden

nur die nicht tumorös entarteten Bezirke des Resektates zur Verfügung gestellt. Ein

Teil der Darmgewebe wurde anal markiert. Die Ganzwandgewebe gelten als

Kontrolluntersuchungen. Es wurden keine Gewebe verwendet, bei denen

vorberichtlich eine Infektion mit Hepatitis oder mit dem Humanen Immundefizienz

Virus (HIV) vorlag.

Die Ganzwandgewebe waren Patienten im Alter von 35 bis 78 Jahren

entnommen worden. Das Durchschnittsalter betrug 59 ± 11 Jahre (Mittelwert ±

Standardabweichung). Das durchschnittliche Alter der Patienten, bei denen

Rektumbioptate entnommen worden waren, lag bei 46 ± 25 Jahre (Mittelwert ±

Standardabweichung, Bereich: 21-79 Jahre). Weitere Daten wie Geschlecht,

Diagnose und untersuchter Darmabschnitt sind in Tabelle 2 und Tabelle 3

aufgeführt.

Tabelle 2: Angaben zu den untersuchten Darmresektaten

Tiho-Nr. MHH-Nr. Alter Geschlecht Resektat DiagnoseH 01 MC 674 58 m Colon des. Kolon-KarzinomH 02 MC 677 48 m Rectum Rektum-KarzinomH 07 MC 684 52 m Colon des. Lionell-SarkomH 09 MC 690 35 w Colon as. AnastomosenstenoseH 10 MC 696 57 w Colon as. Pankreaskopf-KarzinomH 11 MC 703 73 w Colon des. Pankreaskopf-KarzinomH 13 MC 711 40 w Colon des. Rektum-KarzinomH 14 MC 712 78 w Colon des. Rektum-KarzinomH 18 MC 725 45 m Colon des. Rektum-Karzinom, PolyposisH 19 MC 734 64 m Colon sig. Kolon-KarzinomH 20 MC 736 54 m Rectum Rektum-KarzinomH 21 MC 741 65 m Rectum Rektum-KarzinomH 23 MC 755 60 m Colon sig. Sigma-KarzinomH 24 MC 758 61 m Colon sig. Rektum-KarzinomH 25 MC 762 77 m Rectum Sigma-KarzinomH 26 MC 764 64 m Colon des. Divertikel NachresektionH 27 MC 777 42 m Colon sig. Rektum-Karzinom


(Fortsetzung von Tabelle 2)

Tiho-Nr. MHH-Nr. Alter Geschlecht Resektat DiagnoseH 30 MC 802 73 m Colon sig. Rektum-KarzinomH 33 MC 827 66 m Colon trans. Rektum- und Kolon-KarzinomH 38 MC 840 53 m Rectum Anal-KarzinomH 40 MC 842 56 m Colon des. Rektum-KarzinomH 41 MC 845 72 w Rectum Rektum-KarzinomH 42 MC 856 65 w Colon sig. Rektum-KarzinomH 43 MC 857 60 m Colon trans. Kolon-KarzinomH 44 MC 884 68 w Colon sig. Sigma-KarzinomH 45 MC 888 51 m Colon sig. Rektum-KarzinomH 46 MC 891 49 w Colon des. Kolon-KarzinomH 47 MC 893 66 m Colon sig. BeckenexenterationH 48 MC 894 64 w Colon sig. Sigma-KarzinomH 49 MC 897 63 m Rectum Rektum-Karzinom

m = männlich, w = weiblich, as.= ascendens, des.= descendens, sig.=sigmoideum, trans.=transversum

Tabelle 3: Angaben zu den untersuchten Rektumbioptaten

Tiho-Nr. MHH-Nr. Alter Geschlecht Pathologisch-histologische DiagnoseH 17 PE 749 33 m Amyloidose der RektummukosaH 34 PE 753 21 w diskrete Amyloidose der RektummukosaH 36 PE 754 79 m Unauffällige RektumbiopsieH 37 PE 755 51 w Unauffällige Rektumbiopsie

m = männlich, w = weiblich

3.2 Präparation (s. Abb. 7)

3.2.1 Darmgewebe von Maus und Meerschweinchen

Das jeweilige Colon ascendens wurde mesenterial eröffnet und die Ingesta durch

mehrmaliges Waschen mit Krebs-Lösung (s. Kapitel 8.2) entfernt. Zur Präparation

wurde der eröffnete Darm in eine mit einem Silikonelastomer (SylgardR 184, Dow

Corning, Midland, USA) ausgegossene Petrischale verbracht. In der Petrischale

befand sich Krebs-Lösung, die durch ein Perfusionssystem in der Schale


kontinuierlich zirkulierte und in einem Reservoir permanent mit Carbogen (95 Vol%

O2, 5 Vol% CO2) angereichert und zudem gekühlt wurde.

Die Präparation erfolgte unter einem Stereomikroskop (Olympus SZ 40,

Olympus, Hamburg, Deutschland) bei 7-40facher Vergrößerung. Zur Beleuchtung

wurde eine Kaltlichtquelle eingesetzt. Zunächst wurde das Gewebe mit luminaler

Seite nach oben mit 0,1 bzw. 0,2 mm feinen Präpariernadeln (Insect pins 10 mm,

Fine Science Tools, Heidelberg) aufgespannt. Die Mukosa wurde mit feinen Dumont

Uhrmacherpinzetten (No. 4 u. 5, Fine Science Tools, Heidelberg) und einer

Irisschere (Moria 9602, Fine Science Tools, Heidelberg) schrittweise entfernt.

Für die Präparation des Plexus submucosus wurde das Gewebe mit der

serosalen Seite nach oben erneut aufgespannt. Durch gesamthaftes stumpfes

Ablösen der Muskulatur wurde der Plexus submucosus separiert.

Der Plexus myentericus wurde, nachdem Mukosa und Plexus submucosus

entfernt worden waren, vorsichtig von der anhaftenden Zirkulärmuskulatur und nach

Wenden des Präparates von Teilen der Longitudinalmuskulatur befreit, indem

schrittweise die Muskelfaserbündel mit feinen Dumont Uhrmacherpinzetten

abgezogen wurden.

3.2.2 Humangewebe

Vergleichbar mit der Präparation des Plexus submucosus bei Maus und

Meerschweinchen wurden beim Humangewebe die Mukosa und Muskulatur von

den Rektum- bzw. Kolonabschnitten entfernt. Der verbliebene Plexus submucosus

wurde entlang einer Trennfläche, die zwischen dem inneren und intermediären

Plexusanteil beschrieben wird (IBBA-MANNESCHI et al. 1995), mittels Schere

aufgeteilt. Diese Trennfläche unterteilt den Plexus submucosus des Menschen in

ein inneres und zwei äußere Drittel. Für die optischen Untersuchungen wurde

ausschließlich der innere, mukosanahe Gewebeanteil verwendet, der überwiegend

den Meissner-Plexus beinhaltet.

Die Präparation des Plexus myentericus erfolgte durch möglichst

vollständiges Abpräparieren der Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur.


Bei den maximal pfennigstückgroßen Rektumbioptaten wurde nur vorsichtig

die Mukosa entfernt. Das verbliebene Bindegewebe mit den darin enthaltenen

Plexusanteilen wurde für die optischen Fluoreszenzmessungen verwendet.

3.3 Montage in die Versuchskammer

Die Präparate wurden für die optischen Untersuchungen in einer eigens

konstruierten Spezialkammer aus Plexiglas (Abb. 8) montiert.

Das Gewebe wurde auf selbst gegossenen Silikonelastomerplatten (Sylgard®

184, Dow Corning Corporation, Midland, USA) mit gekürzten Präpariernadeln

(Länge: ca. 1-1,5 mm, Durchmesser: 0,1 mm) aufgespannt. Für die verschiedenen

Abbildung 7: Schematische Übersicht zur Präparation des Plexus submucosus (Psm) und

des Plexus myentericus (Pmy). Gezeigt ist ein Schnitt durch die Wand des eröffneten

Darmrohrs. Oben befindet sich die Schleimhaut, die zuerst entfernt wird. Der unterhalb der

Schleimhaut lokalisierte Plexus submucosus wird von der darunter liegenden Muskulatur

separiert. Schrittweises Entfernen der Zirkulärmuskulatur legt den Plexus myentericus frei.

Teile der Longitudinalmuskulatur, der der Plexus myentericus überwiegend anhaftet, können

partiell entfernt werden (umgezeichnet nach WOOD 1987).

Schleimhaut

Zirkulärmuskulatur

Longitudinal-muskulatur Psm

Pmy


Präparatgrößen standen selbst hergestellte Sylgard®- und Kunststoffplatten mit

jeweils drei unterschiedlichen Fensterungen zur Verfügung: 2 cm x 1 cm;

1,3 cm x 0,7 cm und 0,2 cm x 0,5 cm.

In eine vorgefertigte Vertiefung am Unterboden der Versuchskammeröffnung

wurde ein 160-170 µm dickes, austauschbares Deckglas mit einem Durchmesser

von 42 mm (Saur Laborbedarf, Reutlingen) durch hochvisköses Silikonelastomer

1

2

3 Gewinde

Deckglas

Zufluß

Plexiglaskammer

Abfluß

Fixierschraube

1: Druckring zur Fixation der Platten 2, 32: Starre Kunststoffplatte mit Fenster zur planen Fixierung von 33: Flexible, gefensterte Einmal- Sylgard®-Platte mit aufge- spanntem Gewebe

PERFUSION

Abbildung 8: Schematischer Aufbau der Versuchskammer, in der das zu untersuchende

Plexuspräparat auf das inverse Mikroskop montiert wurde. Ein jeweils austauschbares

Deckglas wurde an der entsprechenden Aussparung im Unterboden der Kammer

befestigt. Das Gewebe wurde auf eine dünne Sylgard®-Platte (3) aufgespannt und in die

Versuchskammer eingelegt. Auf diese Platte wurde eine starre Kunststoffplatte (2) gelegt,

um das Gewebe auf dem Deckglas plan positionieren zu können. Der Druckring (1)

wurde ebenfalls in die Versuchskammer gelegt und am Gewindestutzen mit einer

Schraube befestigt, um durch leichten Druck die beiden Platten zu fixieren.


(z. B. Baysilone-Paste®, Bayer AG, Leverkusen) befestigt. Ein selbstklebender Film,

der an Deckglasrand und Versuchskammer angebracht wurde, sorgte zusätzlich für

die notwendige Stabilität. Das Gewebe konnte dann in die wasserdichte Kammer

eingelegt und, wie in Abbildung 8 schematisch dargestellt, mit den entsprechenden

Platten fixiert werden. Über einen Zu- und Abfluß erfolgte in der Kammer während

der gesamten Versuchsdauer die kontinuierliche Perfusion mit 37 °C warmer,

Carbogen-begaster Krebs-Lösung mit einer Durchflußrate von 10 ml pro Minute bei

einem Kammervolumen von ca. 4 ml.

3.4 Apparatur der Fluoreszenzmeßtechnik undVersuchsaufbau der Fluoreszenzmessung

Das optische Meßsystem setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen:

• Lichtquelle

• Elektronischer Verschluß, „Shutter“

• Mikroskop, Filterblock, Objektive

• Glasfasergekoppeltes Photodioden-Array

incl. Verstärkern, Multiplexer und AD-Wandler

• Hardware zur Datenerfassung und entsprechende Software

• Schwarzweißkamera, Videobild

3.4.1 Lichtquelle, elektronischer Verschluß, Mikroskop,Filterblock und Objektive

Die Apparatur befand sich auf einem pneumatisch betriebenen, vibrationsfreien

Versuchstisch (Science Products GmbH, Hofheim), der durch einen Faraday-Käfig

abgeschirmt war. Optischer Baustein war ein inverses Mikroskop (IX 50, Olympus,

Tokyo, Japan), das für die Fluoreszenzmessungen im Auflichtmodus betrieben

wurde. Eine Halogenlichtquelle wurde für das Aufsuchen von Ganglien im Durchlicht

verwendet. Die Versuchskammer (s. S. 48) konnte durch eine von der


Institutswerkstatt angefertigte Halterung auf dem Objekttisch montiert und frei in

X- und Y-Richtung verschoben werden.

Für die optischen Messungen wurde als Lichtquelle eine 150 W

Xenonkurzbogenlampe (XBO 150W/CR OFR, Osram, München) verwendet, die

sich durch ihr weitgehend kontinuierliches Spektrum, ihre hohe Intensität (s. Anhang

S. 196) und gute Bogenstabilität gerade für die Fluoreszenzmessungen eignete. Sie

wurde in einem Mikroskoplampengehäuse (Model 770, OPTI QUIP, Highland Mills,

NY, USA) montiert. Das Netzteil der Lichtquelle (1600 Series D.C. Power Supplies,

OPTI QUIP, Highland Mills, NY, USA) erfüllte mit einer Rippeleigenschaft von

< 0,2% hinsichtlich der Restwelligkeit und Stabilität die erforderlichen

Anforderungen, um das bei der optischen Messung störende Rauschen durch

Fluktuation der Lichtquelle gering zu halten.

Beim Justieren der Lichtquelle wurde ein Kompromiß zwischen einer

homogenen Ausleuchtung des Gesichtsfeldes und gleichzeitig hoher Intensität

gewählt.

Aus dem Xenonlampenspektrum wurde das Anregungslicht des

Fluoreszenzfarbstoffes durch einen Exzitationsfilter (HQ 545/30 14903, Olympus,

Tokyo, Japan) herausgefiltert. Der sich anschließende dichroitische Spiegel

(DM 565, Olympus) lenkte das Licht durch entsprechende Objektive mit hoher

numerischer Apertur auf das mit dem potentiometrischen Chromophor beladene

Präparat enterischer Ganglien. Das vom Präparat emittierte und vom Objektiv

gesammelte Fluoreszenzlicht wurde dann von dem als Lichtteiler fungierenden

dichroitischen Spiegel in den Abbildungsstrahlengang freigegeben und über einen

Sperrfilter (BF 580, Olympus) auf die Glasfaseroptik des Photodioden-Arrays

gelenkt. Die Wahl dieser Filterkombination für den Farbstoff Di-8-ANEPPS stellt

eine Modifikation des Cy 3-Filters dar (s. Abb. 9) und wurde für Messungen mit

Di-8-ANEPPS durch Vergleich verschiedener Filterblöcke (s. Anhang Tab. 18)

empirisch bestimmt.

Auf die Spezifikationen des glasfasergekoppelten Photodioden-Arrays wird

im folgenden Kapitel eingegangen.


Mit einem elektronischen Verschluß (UNIBLITZ Modell D122, Vincent

Associates, New York, USA), der über die Software NeuroPlex® (RedShirtImagingTM

LLC, Fairfield, CT, USA) angesteuert wurde, konnte der Anregungsstrahlengang

geöffnet bzw. unterbrochen werden. Dies mußte durch die Software hochpräzise

gesteuert werden, damit Belichtungszeit des Gewebes und Meßzeitraum

übereinstimmten. Das Gewebe sollte außerdem nur während der eigentlichen

Messung belichtet werden, um die durch die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs

verursachten Einflüsse (z. B. Radikalbildung) auf ein notwendiges Maß zu limitieren.

Das Steuerelement des elektronischen Verschlusses war separat vom

Versuchstisch außerhalb des Faraday-Käfig angebracht, um von ihm ausgehende

Störungen zu verhindern.

100 100

50 50

0 0

800750700650600550500Wellenlänge in nm

Fluo

resz

enz

Abso

rptio

n

Abbildung 9: Anregungsspektrum (links) und Emissionsspektrum (rechts) von

Di-8-ANEPPS in Phospholipidvesikeln aufgetragen über der Wellenlänge (modifiziert

nach HAUGLAND, Molecular Probes).

Ähnliche Spektren, die sich nicht signifikant voneinander unterscheiden, gelten für

Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ. Die Einheiten der Ordinaten sind normiert für einen

willkürlichen Höchstwert von 100. Eingezeichnet ist die bei den Hauptversuchen

verwendete Filterkombination: Anregungsfilter ( ), dichroitischer Spiegel ( ),

Emissionsfilter ( )


Bei der Wahl der Objektive für die optische Messung (s. Tabelle 4) mußte auf

hohe numerische Apertur (N.A.) geachtet werden, da sowohl Anregungs- als auch

Fluoreszenzlicht durch das Objektiv gelangten. In diesem Fall waren zwei Faktoren

relevant:

1. Die N.A. determiniert die Stärke der Beleuchtungsintensität, die im Falle der

Epifluoreszenzmikroskopie proportional zur vierten Potenz der N.A. ist (COHEN

u. LESHER 1986).

2. Darüber hinaus war die N.A. der Epifluoreszenzobjektive ein entscheidender

Wert, da das Signal-Rausch-Verhältnis proportional zum Quadrat der N.A. ist

(GRINVALD et al. 1988).

Tabelle 4: Bezeichnung, Numerische Apertur, mechanische Tubuslänge, Deckglaskorrektur

und Arbeitsabstand der verwendeten Objektive I.

Objektiv Bezeichnung Num. Apertur mechan. Tubuslänge/Deckglaskorrektur Arbeitsabstand

20er Olympus JAPAN UPlanApo 0.80 Öl °°/- 0,19 mm 40er Olympus JAPAN UApo/340 0.65-1.35 Öl Iris °°/0.17 0,10 mm100er Olympus JAPAN 103665

SplanApo 100 0.70-1.40 Öl Iris 160/0.17 0,15 mm

I Angaben stammen aus Datenblättern der Firma Olympus, Hamburg

Die beiden Objektive mit Iris wurden deshalb während der optischen Aufnahme

stets mit maximal geöffneter Blende eingesetzt.

Olympus-Objektive mit 1,25facher, 4facher und 10facher Vergrößerung standen für

die Positionierung der Manipulatoren im Durchlicht zur Verfügung.

3.4.2 Glasfasergekoppeltes Photodioden-Array

Bei dem eingesetzten Photodioden-Array handelte es sich um ein

glasfasergekoppeltes Photodioden-Array (Wu Tech Instruments, Potomac, MD,

USA) mit 464 Elementen, die an 464 Glasfasern photooptisch gekoppelt sind

(s. Anhang Abb. 44). Das Array ist in einem Aluminiumgehäuse untergebracht, das


wie ein Faraday-Käfig Schutz vor elektromagnetischen Störungen bietet. Im

Photodioden-Array induzierten die einfallenden Photonen einen meßbaren

Elektronenstrom innerhalb jeder einzelnen Photodiode. Optische Signale wurden

dadurch in elektrische Signale umgewandelt.

Das glasfasergekoppelte Photodioden-Array wurde über einen C-Mount am

seitlichen Ausgang des inversen Mikroskops montiert. Jeweils zur Messung wurde

der Lichtstrahl über einen Umlenkspiegel zu nahezu 100 % auf die Glasfaseroptik

des Photodioden-Arrays gelenkt. Diese wurde am seitlichen Ausgang so justiert,

daß das Zentrum des Lichtstrahls annähernd dem Zentrum der Glasfaseroptik

entsprach. Der Lichtstrahl gelangte von den hexagonal gebündelten 464 Glasfasern

auf die entsprechenden 464 Photodioden. Diese Konstellation von Glasfasern und

Photodioden besaß für Fluoreszenzmessungen am Nervensystem des Darmes

einerseits den Vorteil, einen sehr hohen aktiven Meßbereich von 93 % (s. Anhang,

Tab. 16) zu besitzen - beispielsweise kann bei monolithischen Arrays von nicht

mehr als 50 % der Gesamtfläche gemessen werden - andererseits wurden durch

eine Glasfaserlänge von weniger als 15 cm Lichtverluste geringgehalten.

Die Photodioden sind Siliziumdioden. Durch die damit verbundene hohe

Quantenausbeute (s. Anhang, Tab. 17) wurde die Detektion selbst einer geringen

Zahl emittierter Photonen gestattet. Jedoch war selbst bei hohen Lichtintensitäten

eine Sättigung der Dioden - im Gegensatz beispielsweise zu CCD-Kamera-

Systemen - kein limitierender Faktor bei den Messungen (s. Anhang, S. 197).

Die Photoströme der einzelnen Photodioden wurden individuell verstärkt und

simultan ausgelesen.

Zusätzlich zu den 464 Dioden konnten über 8 BNC-Eingänge, parallel zu den

Messungen der Dioden, externe Pulse z. B. von einer Isolatoreinheit für elektrische

Nervenzellstimulationen eingelesen werden. Weitere Spezifikationen der Glasfasern

und der Photodioden sind im Anhang aufgeführt.

3.4.3 Verstärker, Multiplexer und AD-Wandler

Die Verstärkung des von den einzelnen Dioden erzeugten Photostroms erfolgte bei

diesem System in zwei Stufen. Die erste Verstärkerstufe war direkt im


Diodengehäuse montiert, wodurch bei den heute bevorzugt verwendeten

Photodiodensystemen das störende Meßrauschen reduziert wird. Die zweite

Verstärkerstufe war in einem separaten Gehäuse untergebracht.

1. Verstärkerstufe: Als Vorverstärker befand sich ein Strom-Spannungs-Wandler

mit zwei wählbaren Widerständen im Diodengehäuse. Die jeweilige Verstärkung

erfolgte individuell für jede Photodiode. Da die Lichtintensitäten bei

Fluoreszenzmessungen und insbesondere die zu messenden Änderungen der

Fluoreszenz sehr niedrig waren, bewegten sich die Photoströme in der

Größenordnung von einigen pA. Deshalb wurde die Einstellung der Verstärkung

mit 1 GOhm Widerständen gewählt, um diese Photoströme auf Spannungen im

Voltbereich verstärken zu können.

2. Verstärkerstufe: Die Daten wurden durch einen regelbaren 4poligen

Bessel-Tiefpass gefiltert. In den Versuchen wurde eine Grenzfrequenz von

330 Hz gewählt. Die Verstärker konnten wahlweise durch eine externe

Steuerung auf 1x, 200x, 1000x und 2000x geschaltet und mit zwei

verschiedenen Zeitkonstanten Hochpass gefiltert werden, wodurch nur

AC Signalkomponenten durchgelassen wurden. Bei den Versuchen wurde die

Zeitkonstante von 500 ms gewählt.

Die analogen Daten der Verstärkerausgänge wurden mit einem 512-Kanal

Multiplexer einem 12 bit AD-Wandler zur Digitalisierung zugeführt. Die AC-Kopplung

in den individuellen Kanälen erbrachte bei diesem System in Kombination mit dem

AD-Wandler eine effektive digitale Auflösung von 17-20 bits, da durch diesen

Aussteuerungsbereich auch Signale kleinerer Amplitude bei gutem

Signal-Rausch-Verhältnis (s. S. 61) gemessen werden konnten. Der effektive

Aussteuerungsbereich und niedrige Rauschanteil sowie eine

Hochgeschwindigkeitsbilderzeugung („High-speed Imaging“) mit ca. 1600 Rahmen

(„frames“) pro Sekunde (s. Kapitel 3.5) ermöglichten es, Messungen mit

potentiometrischen Farbstoffen am enterischen Nervensystem durchzuführen.


3.4.4 Hardware zur Datenerfassung, Datensicherung und SoftwareNeuroPlexTM

Die Datenerfassung erfolgte durch einen Intel Pentium III Computer mit 450 MHz

Prozessor und 256 MB RAM und durch ein Data Aquisition Processor-Board

DAP3200e (Microstar Laboratories Inc., Bellevue, WA, USA). Das DAP-Board

diente zum Einlesen der optischen Daten, Zwischenspeichern und zum Transfer auf

den Rechner. Bei einer Messung mit 464 Dioden und den 8 externen

BNC-Eingängen entstanden mit einer Abtastrate von 1,6 KHz bei 1000 Meßpunkten

rund 1 MB, d.h. bei einer Aufnahmedauer beispielsweise von 10 Sekunden umfaßte

die entstehende Datenmenge ca. 17 MB. Das DAP-Board mit 4 MB RAM limitierte

den Datentransfer durch eine Übertragungsrate von etwa 1,3 µsec per Sample.

Mit diesem Computersystem und durch eine Modifikation der Software

konnten Aufnahmen von 10 Sekunden Dauer konstant reproduzierbar durchgeführt

und eine theoretische Meßdauer von bis zu 27 Sekunden erreicht werden. Der

zuvor für einen Teil der Versuche eingesetzte Intel Pentium I Computer (166 MHz,

64 RAM) ermöglichte nur Aufnahmen mit max. 7-10 Sekunden Dauer, wobei nach

entsprechender Belichtungszeit des Gewebes der Datentransfer auf den Rechner

wiederholt unterbrochen wurde.

Die im Bereich mehrerer Megabyte liegenden Versuchsdaten wurden

zunächst auf der Festplatte des Computers zwischengespeichert und dann im

Anschluß eines Versuches mittels CD-Brenner auf Compact-Disc gebrannt und

zusätzlich auf einem Streamer gesichert.

Die Koordination des Meßablaufes wurde durch die unter dem

Betriebssystem Windows laufende Software NeuroPlexTM (Versionen 2.01, 2.02,

3.01, 4.01 und 4.02, RedShirtImagingTM LLC, Fairfield, CT, USA) gesteuert. Dieses

kommerziell erhältliche Steuerprogramm benutzte die Programmsprache Interactive

Data Language und erforderte für den Betrieb IDL 5.2.1 (Research System Inc,

Boulder CO, USA).

Die Meßergebnisse der 464 Photodioden und die Daten, die von den

8 externen BNC-Eingängen erhalten wurden, wurden nach jeder Messung

entsprechend ihrer Lage im hexagonalen Array stark verkleinert auf dem


Computer-Bildschirm dargestellt und konnten einzeln selektiert und vergrößert

werden. Das Programm erlaubte zur Datenanalyse die Wahl verschiedener

Hoch- und Tiefpass-Filter (z. B. Butterworth, Gauß), sowie die Berechnung der

relativen Änderung der Fluoreszenz (∆F/F) der einzelnen Photodioden (S. 74). Die

Daten der einzelnen Photodioden konnten zur weiteren Bearbeitung und Analyse in

andere Programme exportiert werden (s. Kapitel 3.12).

3.4.5 Schwarzweißkamera, Videobild

Die vital gefärbten Ganglien wurden mittels Videobild kurz nach der optischen

Messung im Fluoreszenzlicht aufgenommen, um die Meßergebnisse der einzelnen

Photodioden und die Nervenzellen im optisch untersuchten Ganglion einander

zuordnen zu können. Die zu Beginn der Versuche verwendete Videokamera

(TK-S310EG, JVC, Tokyo, Japan) erwies sich als nur bedingt geeignet. Es zeigte

sich, daß für die Überlagerung eine empfindliche und im Kontrast variabel

einstellbare Schwarzweißkamera (Mod. 4910, Cohu Inc., San Diego, Californien,

USA) unabdingbar war, um für eine Auswertung auf Einzelzellebene qualitativ gute

Videobilder auch bei verstärkter Hintergrundfärbung und schwierig erkennbaren

Neuronengrenzen zu erhalten.

Die Kamera war über einen binokularen Fototubus am Mikroskop montiert

und wurde über einen Frame-Grabber (Scion Corporation, Frederik, Maryland, USA)

gesteuert. Nach Justieren der Schwarzweißkamera mit dem Photodioden-Array

konnten Videobild und Photodiodenergebnisse im Anschluß an die jeweilige

Versuchsreihe überlagert und zugeordnet werden (s. Abb. 10).

3.5 Ortsauflösung und Zeitauflösung

Mit 464 Photodioden ist eine Meßfläche vorhanden, die die optische Ableitung von

Ganglien, die eine Vielzahl von Neuronen erhalten, erlaubt. Die Identifizierung

einzelner Nervenzellen wird durch eine hohe räumliche Auflösung erreicht. Das

Photodioden-Array befindet sich in der reellen Bildebene des Objektives. Damit ist


die erreichte Ortsauflösung nur vom Vergrößerungsfaktor des Objektives und von

der Geometrie des Arrays abhängig. Die Verwendung der in Tabelle 4 aufgeführten

Objektive ergab folgende Werte für Durchmesser und Detektionsfläche pro

Photodiode. Die detektierbare maximale Gesamtmeßfläche ist ebenfalls aufgelistet.

Durchmesserpro

Photodiode

Flächepro

PhotodiodeGesamtfläche

Objektiv: 20er 38 µm 1134 µm² ~ 0,540 mm² 40er 19 µm 283 µm² ~ 0,135 mm²100er 8 µm 50 µm² ~ 0,028 mm²

Fast alle Messungen wurden mit dem 40er Objektiv durchgeführt. Dies bedeutet,

daß bei dieser Vergrößerung auf 1-4 Photodioden das Signal einer einzelnen

Nervenzelle je nach Größe und Lage abgebildet wurde. Unter optimalen

Färbebedingungen mit geringer Färbung des nicht-neuronalen Gewebes konnten

auch bei kleinen Ganglien vereinzelt Messungen mit dem 100er Objektiv erfolgen.

Bei dem 20er Objektiv konnten ebenfalls Fluoreszenzänderungen gemessen

werden, allerdings war die Ortsauflösung pro Photodiode für die bearbeitete

Fragestellung zu gering. Zudem ergaben die relativen Intensitätsänderungen ein

ungünstiges Signal-Rausch-Verhältnis.

Die maximale Abtastrate bei Verwendung aller 464 Photodioden

einschließlich der 8 externen BNC-Eingänge liegt bei 1,6 KHz. Die zeitliche

Auflösung beträgt demzufolge 613 µsec. Sie ist Voraussetzung für die Erfassung

von Potentialänderungen im Millisekundenbereich. Folglich können auch im Bereich

weniger Millisekunden liegende Aktionspotentiale gemessen werden. Durch

Erstellen eines „Subset“‘, d.h. Selektion einzelner Dioden, kann die Abtastrate

wesentlich erhöht werden. Fast alle Messungen wurden aber ohne Reduzierung der

Gesamtmeßfläche mit der vollen Diodenzahl durchgeführt, da das Frameintervall

von 613 µsec selbst für die Darstellung von Aktionspotentialen ausreichte (s. auch

Abb. 20, S. 98).


Multi-Site Optical Recording Technique(MSORT)

Versuchskammer mitDi-8-ANEPPSbeladenen Ganglien

Objektiv

VerschlußXenonLampe150 W

II. Überlagerung von Dioden- signalen und Ganglion

I. Videobild eines gefärbten Ganglion (Mensch, PSM)

Filter-block

464 Photodioden

SignalverstärkungEinlesen in Computer

A

B

Orts -, Zeitauflösung: 283 µm², 613 µs

40X

20 µm

∆ F/F= 0,2 %

100 ms

10 ms

Rohdaten Butterworth-Tiefpass


Abbildung 10: Schematisierte Darstellung der Multi-Site Optical Recording Technique

(MSORT) mit einem Photodioden-Array bestehend aus 464 Elementen.

Lichtquelle ist eine 150 W Xenonkurzbogenlampe. Aus deren Spektrum wird nach Passage

eines elektronischen Verschlusses das Anregungslicht des Fluoreszenzfarbstoffs (grün)

selektiert und gelangt über Objektive eines hier nicht dargestellten inversen Mikroskops

auf das mit Di-8-ANEPPS beladene Nervengewebe. Das von hier emittierte

Fluoreszenzlicht (rot) wird nach Passage des Filterblocks auf die 464 Photodioden gelenkt.

Nach Verstärkung des Eingangssignals werden die Meßdaten zum Computer

weitergeleitet.

A zeigt die Computerdarstellung mit den Meßergebnissen der 464 hexagonal angeordneten

Photodioden. Die Photodioden, die sich nicht auf der Ganglionfläche befinden, wurden der

besseren Übersicht halber ausgeblendet und sind als glatte Linien abgebildet.

B Eine Photodiode mit einem Nervenzellsignal wurde exemplarisch vergrößert. Links zeigt

das Meßergebnis der Photodiode als unbearbeitetes Wandlersignal. Rechts wurde das

Signal in der NeuroPlex - Software mit einem 170 Hz Butterworth-Tiefpass gefiltert.

Die Amplitude des optischen Signals spiegelt die gemessene relative Änderung der

Fluoreszenz wider verursacht durch Änderung des neuronalen Membranpotentials. Die

zeitliche Auflösung beträgt 613 µs unter Verwendung aller Photodioden. Die

Ortsauflösung liegt beim Einsatz eines 40er Objektivs bei rund 280 µm².

Mit Hilfe eines zugleich aufgenommenen Videobildes (I.) des jeweils untersuchten

Ganglion können die einzelnen Photodiodensignale bei der Datenanalyse so überlagert

werden, daß die Meßergebnisse der einzelnen Photodioden mit den entsprechenden

Neuronen korrespondieren (II.).


3.6 Protokoll des Meßzyklus

Der komplette Versuchsablauf wurde zur Vermeidung von Umgebungsstreulicht im

Dunkeln durchgeführt. Folgende Vorgänge wurden bei allen Messungen der

Signalausbreitung eingehalten:

1. Anfärben der Neurone zur optischen Messung

2. Aufnahme der Resting Light Intensities (RLI‘s), d.h. Messung der

Hintergrundfärbung und Verrechnung des Dunkelstromes

3. Einstellung von Aufnahmedauer, Verstärkung und Zeitkonstanten,

ggf. Änderung der Abtastrate und Verminderung der Diodenzahl

4. Starten der Aufnahme

5. Softwaregesteuerte Öffnung des elektronischen Verschlusses, Beginn der

Messung

6. Belichtung des Präparates, Datenerfassung

7. Durchführung der entsprechenden Manipulationen wie elektrische Stimulation

oder Applikation von Pharmaka

8. Softwaregesteuerter Schluß des elektronischen Verschlusses, Ende der

Messung

9. Einlesen der Daten und Darstellung und Betrachtung der Meßergebnisse auf

dem Rechner

3.7 Positionsstabilität und Gewebeimmobilisation

Für die Meßdatenerfassung und –auswertung war die absolute Positionsstabilität

zwischen den Detektoren und dem zu untersuchenden Ganglion von großer

Bedeutung. Auch eine geringe Relativverschiebung zwischen mobilem Objekt und

statischem Detektor würde durch die Ortsabbildungsunschärfe die Aufnahmen

stören und würde damit die Auswertung unmöglich machen. Die durch

Bewegungsartefakte verursachte Ortsunschärfe kann die reizbedingte

Intensitätsänderung überlagern. Die Ursache der resultierenden Intensitätsänderung

ist dann jedoch nicht mehr bestimmbar.


Dies ist bei den Messungen insbesondere beim myenterischen Plexus der

Maus durch z.T. erhebliche Muskelkontraktionen zu berücksichtigen. Deshalb wurde

das Muskelrelaxans Nifedipin - ein Calcium-Kanalblocker - in einer

Endkonzentration von 1 µM (bis max. 3 µM) der perfundierten Krebs-Lösung

zugesetzt. Die zusätzlich erforderliche mechanische Immobilisation des Gewebes

erfolgte durch Anfertigen von sog. ‚Druckfüßchen‘ (WOOD u. MAYER 1978). Zwei

Edelstahldrähte wurden in hochkonzentrierter Salzlösung per Elektrolyse zu feinen

sich gleichmäßig verjüngenden Spitzen geätzt und dann annähernd L-förmig

gebogen. Mittels Mikromanipulator konnten die feinen Drahtspitzen mit einem

Abstand von ca. 200 µm präzise neben dem Ganglion plaziert und zwecks

Immobilisation auf dem fragilen Gewebe leicht gespreizt werden. Da beim Plexus

submucosus gleichfalls Änderungen in der Meßposition durch Kontraktionen von

Zirkulärmuskulaturresten sowie Resten der Schleimhautmuskulatur auftreten

konnten, wurde hier die Immobilisation einzelner Ganglien mechanisch

vorgenommen.

3.8 Einfluß verschiedener Faktoren auf das Signal-Rausch-Verhältnis

Bedingt durch die geringen Änderungen der Fluoreszenz (relative

Intensitätsänderung: ~ 10-5 –10-3) stellt das Verhältnis vom Signal zum Rauschen

(S/N) während optischer Messungen das entscheidende apparative Problem bei der

Detektion der Fluoreszenz dar. Das Gesamtstörsignal setzt sich aus einer Vielzahl

verschiedener Rauschkomponenten zusammen und ist damit multifaktoriell.

Systemimmanent ist das Dunkelstromrauschen. Der Dunkelstrom, obwohl bei

diesem Photodiodensystem relativ niedrig (< 10 pA, s. Anhang S. 196), verringert

bei geringen Lichtintensitäten das Signal-Rausch-Verhältnis. Dieses konnte durch

Erhöhung der Beleuchtungsintensität verbessert werden, da bei geringen

Lichtintensitäten eine lineare Beziehung zwischen Intensität und S/N-Verhältnis

existiert. Vorteil ist, daß auch bei vergleichsweise hohen Lichtintensitäten eine

Sättigung der Dioden im Gegensatz zu CCD-Kamera-Systemen nicht erreicht wird.


Das Dunkelstromrauschen der Photodioden am Verstärkerausgang konnte bei den

in den Versuchen erzielten Lichtintensitäten (0,5-1,5 x 10-9 Ampere) als

Rauschquelle reduziert werden. Hohe Lichtintensitäten erhöhen allerdings

gleichzeitig auch die Phototoxizität der Farbstoffe (s. Kapitel 3.9.1.1).

Maßgeblich beeinflußt wurde das S/N-Verhältnis bei den Experimenten

weiterhin durch folgende Punkte:

Das Schrotrauschen ist Hauptanteil des Rauschens bei hohen

Lichtintensitäten und liegt in der statistischen Natur der Photonenemission und

-detektion begründet. Es treten Fluktuationen des Lichtstromes aufgrund der

Quantennatur des Lichtes auf: unter Annahme einer idealen Lichtquelle werden im

Durchschnitt n Photonen/ms emittiert. Die Root-Mean-Square (RMS) Abweichung

ist dann die Quadratwurzel von n (BRADDICK 1960; MALMSTADT et al. 1974).

Das S/N-Verhältnis ist in diesem Fall proportional zur Quadratwurzel der

Lichtintensität, die den Photostrom erzeugt. Das S/N-Verhältnis kann durch

Effizienzsteigerung des lichtleitenden Systems und durch Erhöhung der

Beleuchtungsintensität verbessert werden (s. Kapitel 3.4.1). Der Übergang von

Dunkelstromrauschen in Schrotrauschen wurde bei diesem System bei einem

Photostrom von etwa 0,5 x 10-9 Ampere angegeben. Eine hohe

Beleuchtungsintensität erhöht aber wiederum auch die Phototoxizität der

Fluoreszenzfarbstoffe (s. Kapitel 3.9.1.1). Bei Lichtintensitäten im Bereich von

2-5 x 10-9 Ampere konnten bei den eigenen Messungen kaum reproduzierbare

Signalantworten erzielt werden, was auf mögliche photodynamische Schäden

hinweisen könnte.

Bei den jeweiligen Messungen mußte also ein Mittelweg gesucht werden

zwischen gutem S/N-Verhältnis und minimaler Beleuchtungsintensität.

Neben der Belichtungsintensität wird die Größe der Signalamplitude von der

Menge des integrierten Farbstoffes in die neuronale Zellmembran bzw. vom Grad

der Hintergrundfluoreszenz beeinflußt. Eine hohe Farbstoffkonzentration wiederum

ist ein toxizitätsbestimmender Faktor und limitiert die Erhöhung der Signalamplitude.

Des weiteren war zu berücksichtigen, daß ein linearer Zusammenhang

zwischen dem elektrischen Signal des Nervenzellmembranpotentials und dem


Fluoreszenzsignal besteht. Die Änderung der Fluoreszenz ist linear zur Änderung

der Membranspannung.

Das S/N-Verhältnis konnte ebenfalls durch die Wahl geeigneter Exzitations-

und Emissionsfilter beeinflußt werden (s. S. 51).

Auf weitere, technische Rauschquellen ist z. T. an entsprechender Stelle

schon eingegangen worden. Beispielsweise konnte das Vibrationsrauschen im

Strahlengang mit einem Frequenzbereich von etwa 1-50 Hz die Messungen

empfindlich stören und mußte soweit wie möglich reduziert werden. Hierzu zählte

die Vermeidung von perfusionsbedingten Bewegungen, die Gewebeimmobilisation,

die Verminderung der Bodenvibrationen durch pneumatische Isolation des

Versuchstisches sowie die Vermeidung akustischer Geräusche.

Der Rauschanteil wurde des weiteren beeinflußt durch den Verzicht auf

Raumbeleuchtung während der Messung, die Faradayabschirmung, die numerische

Apertur der Objektive (s. auch S. 52) sowie die Detektionsempfindlichkeit der

Meßapparatur, das Verstärkerrauschen und Fluktuationen der Licht- und

Spannungsquelle.

3.9 Anfärbung enterischer Neurone mit Fluoreszenzfarbstoffen

3.9.1 Anwendung potentiometrischer Farbstoffe

Obwohl die heute einsetzbaren Farbstoffe in ihren Eigenschaften wesentlich

optimiert sind, mußten bei der Anwendung generell die im folgenden aufgeführten

Aspekte berücksichtigt werden:

3.9.1.1 Phototoxizität

Photodynamischer Schaden tritt auf, wenn vital gefärbte Neurone intensiv und lang

andauernd belichtet werden. Es kommt dann bei optischen Messungen zu einer

Veränderung der Signalamplitude bis hin zum Ausbleiben der Zellantwort, wobei

teilweise auch sichtbare Schädigungen der Zellmembran auftreten.

Farbstoffmoleküle produzieren in Anwesenheit von Sauerstoff und bei intensiver


Belichtung reaktiven Singulett-Sauerstoff. Die gebildeten freien Radikale können

ihrerseits mit Membrankomponenten reagieren und können so die Neurone

zerstören (COHEN et al. 1974; POOLER u. VALENZENO 1979; ROSS et al. 1977;

WAGGONER 1976). Eine Desoxygenierung minimiert den photodynamischen

Schaden. Ein völliger Verzicht auf Sauerstoff ist jedoch bei Zellen kontraproduktiv,

die diesen zur Aufrechterhaltung ihres Stoffwechsels benötigen. Um die

photodynamische Zerstörung dieser Zellen so gering wie möglich zu halten, ist

deshalb die effektive Belichtungszeit bei den Versuchen auf das absolut notwendige

Maß zu reduzieren.

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Farbstoffe, insbesondere

Di-8-ANEPPS, zeichnen sich durch ihre relativ geringe Phototoxizität aus. Um

mögliche photodynamische Schäden in den Versuchen noch zu reduzieren, wurde

Krebs-Lösung mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen neben mit Carbogen

(95 Vol% O2, 5 Vol% CO2) und ferner mit sauerstoffreduziertem Corgon (20 Vol%

O2, 5 Vol% CO2, 75 Vol% Argon) begast. Mit beiden Lösungen wurden optische

Messungen am Plexus submucosus des Meerschweinchens durchgeführt.

Unterschiede konnten weder in der optischen Messungen noch in der

anschließenden immunhistochemischen Färbung, in der die Neurone mit dem

neuronalen Marker NSE (s. S. 79) gekennzeichnet wurden, festgestellt werden.

Inwieweit antioxidative Substanzen einen zusätzlichen protektiven Schutz bilden

könnten, wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht.

3.9.1.2 Ausbleichen

Mit steigender Belichtungsdauer kommt es bei Fluoreszenzfarbstoffen zu einer

Abnahme der Fluoreszenzintensität. Der Grad des Bleichens ist abhängig von der

Beleuchtungsintensität. Als Ursache wird eine Photoisomerisierung der im Molekül

vorhandenen Doppelbindungen angenommen. Durch möglichst geringe

Belichtungszeiten ist eine Minderung des Ausbleichens bei optischen Messungen

möglich. Bedingt durch die AC-Kopplung des Systems wurde dieses methodisch


bedingte Artefakt allerdings nicht oder nur sehr selten in den einzelnen optischen

Aufnahmen sichtbar.

3.9.1.3 Spannungssensitivität

Da die „fast-response“- Farbstoffe nur verhältnismäßig geringe Änderungen der

Fluoreszenzintensität zeigen, muß für die Signalerfassung bei den Versuchen das

Gesamtrauschen des Meßsystems so gering wie möglich gehalten werden.

3.9.2 Vorversuche

Für die Färbungen des enterischen Nervensystems wurden der spannungssensitive

Styrylfarbstoff Di-8-ANEPPS sowie Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ verwendet.

Das einzige in der zugänglichen Literatur beschriebene Verfahren zur

optischen Messung am enterischen Nervensystem (OBAID et al. 1992) wurde als

Basis für die eigenen optischen Untersuchungen genommen.

In mehreren Vorversuchen wurde in Anlehnung an das Protokoll von OBAID

und Mitarbeitern und in dem daraufhin modifizierten Protokoll der enzymatische

Andau am Plexus submucosus des Meerschweinchens durchgeführt und parallel

auch auf den Plexus submucosus der Maus übertragen. Die Integrität des

Gewebes, das Aussehen der Ganglien im Auflicht wurden als Maß für den

Andaugrad genommen und hinsichtlich seiner Reproduzierbarkeit überprüft. Als

weitere qualitative Kriterien wurde die Anfärbbarkeit der Ganglien und die Färbung

des Hintergrundes beurteilt.

In dem anschließenden Versuchsteil wurden Protokolle zur Färbung von

frisch präpariertem und nicht weiter behandeltem Nervengewebe entwickelt,

ausgehend von der von OBAID und Mitarbeitern eingesetzten

Farbstoffkonzentration für Di-8-ANEPPS. Die Vorversuche wurden sowohl am

Plexus submucosus des Meerschweinchens als auch am Plexus submucosus und

Plexus myentericus der Maus durchgeführt.


Abschließend wurden die Farbstoffe Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ als

Alternative zu Di-8-ANEPPS auf Anwendbarkeit am Plexus submucosus von Maus

und Meerschweinchen und am Plexus myentericus der Maus überprüft.

3.9.2.1 Protokoll zur enzymatischen Vorbehandlung und Färbung mitDi-8-ANEPPS in Anlehnung an OBAID et al. (1992)

120 min Inkubation bei Raumtemperatur in Carbogen-begaster Krebs-Lösung mit

100 U/ml Collagenase VII (C-0773, Sigma GmbH, Steinheim, Deutschland)

1 mg/ml Protease IX (P-6141, Sigma GmbH, Steinheim, Deutschland)

10 min Inkubation des Gewebes in Carbogen-begaster Krebs-Lösung mit folgender

Farbstoff- und Lösungsmittelkonzentration:

100 µg/ml Di-8-ANEPPS (Molecular Probes D-3167, Eugene, OR, USA)

0,95% DMSO (Sigma GmbH, Steinheim, Deutschland)

0,34% Pluronic® F-127 (Molecular Probes P-6867, Eugene, OR, USA)

Di-8-ANEPPS, DMSO und Pluronic® F-127 wurden als Stammlösung angesetzt.

3.9.2.2 Variation des Protokolls zur enzymatischen Vorbehandlung

Es wurden verschiedene Inkubationszeiten (60 min, 45 min, 30 min, 20 min und

10 min) jeweils bei Raumtemperatur und bei 37 °C erprobt, wobei das Gewebe sich

in Carbogen-begaster Krebs-Lösung mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen

von Collagenase VII (50; 100; 150 U/ 3ml) und Protease (0,75; 1,5 mg/ 3ml) befand.

3.9.2.3 Färbeprotokoll mit extrazellulärer Applikation von Di-8-ANEPPSan frisch präpariertem Gewebe

Ansetzen der Farbstoffstammlösung

Der Farbstoff Di-8-ANEPPS wurde in einer 13,5 mM Stammlösung mit 80 % DMSO

und 20 % Pluronic® F-127 angesetzt. Diese Stammlösung wurde bei 4 °C


lichtgeschützt gelagert. Vor Beginn der Versuche wurde die Stammlösung in einem

Ultraschallbad bei ca. 40 °C für 5-10 Minuten erwärmt und dadurch homogen

vermengt. Die entsprechende Menge Farbstofflösung wurde dann der gewünschten

Menge Krebs-Lösung hinzugefügt.

A. ‚Systemische‘ Färbung

Das jeweilige präparierte und schon auf die Einmal-Sylgard®-Platte aufgespannte

Gewebe wurde mit verschiedenen Farbstoffkonzentrationen in Carbogen-begaster

Krebs-Lösung mit unterschiedlicher Inkubationsdauer und Inkubationstemperatur

inkubiert. Nach der Färbeprozedur wurde das Gewebe in Krebs-Lösung gespült und

dann in die Versuchskammer montiert.

• Plexus submucosus Meerschweinchen

Farbstoffkonzentration: 80 µM, 40 µM, 20 µM und 10 µM

Inkubationstemperatur: im Wasserbad bei 37 °C

Inkubationsdauer: 10 min, 15 min und 20 min

• Plexus submucosus Maus

Farbstoffkonzentration: 80 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, 2 µM und 1 µM

Inkubationstemperatur: im Wasserbad bei 4° C, 25° C und 37° C

Inkubationsdauer: 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 90 min, 120 min

• Plexus myentericus Maus

Farbstoffkonzentration: 160 µM, 40 µM und 20 µM

Inkubationstemperatur: im Wasserbad 37 °C

Inkubationsdauer: 10 min und 20 min

B. ‚Lokale‘ Färbung

Ausgehend von den Ergebnissen des vorhergehenden Protokolls für die

systemische Färbung wurde die lokale Applikation der Farbstofflösung mittels einer

Spritzpipette (Herstellung s. Kapitel 3.10) entwickelt. Die Di-8-ANEPPS-Lösung


wurde in einer Konzentration von 200 µM und 400 µM Farbstoff in die Kapillare

gefüllt, die an ein druckluftgesteuertes Mikroejektionsystem angeschlossen wurde

und die mittels Mikromanipulator direkt oberhalb auf das schon in der

Versuchskammer befindliche Gewebe plaziert werden konnte. Der Farbstoff wurde

mit geringen Volumina bei ausgeschalteter Perfusion für 10-20 Sekunden lokal auf

das zu untersuchende Ganglion appliziert. Nach einer Inkubationsdauer von

1-2 Minuten wurde die Perfusion wieder eingeschaltet. Der Färbegrad wurde visuell

in Intervallen von fünf Minuten überprüft. Außerdem wurden optische Messungen

zur Beurteilung des Färbegrades durchgeführt.

3.9.2.4 Einsatz von Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ bei Maus undMeerschweinchen

Die beiden potentiometrischen Farbstoffe Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ wurden

am Plexus submucosus des Meerschweinchens und sowohl am Plexus

submucosus als auch am Plexus myentericus der Maus auf Anwendbarkeit

überprüft. Die beiden Chromophore wurden basierend auf dem Protokoll für die

lokale Färbung mit Di-8-ANEPPS in folgenden Konzentrationen auf die

verschiedenen Ganglien appliziert:

Di-8-ANEPPQ wurde in einer Konzentration von 200 µM und 400 µM eingesetzt.

Di-4-ANEPPS wurde in einer Konzentration von 5, 10 und 20 µM lokal auf die

Ganglien appliziert.

3.9.3 Hauptversuche

3.9.3.1 Ansetzen des Farbstoffes Di-8-ANEPPS

Di-8-ANEPPS wurde mit DMSO zu einer 13,5 mM Stammlösung angesetzt und bei

4 °C lichtgeschützt gelagert. Da nach oftmaligem und mehrwöchigem Gebrauch ein

Ausfallen der Farbstofflösung bzw. eine reduzierte Zellfärbung beobachtet werden

konnte, wurde die Stammlösung in 60 µl Aliquods aufbewahrt. Das Detergenz

Pluronic® F-127, das die Integration des lipophilen Farbstoffes in die Zellmembran


förderte, wurde jeweils in einer Konzentration von 2,75 mg/ 10 µl Stammlösung erst

am Versuchstag selbst hinzugefügt.

Pluronic® F-127 wurde mit Krebs-Lösung in einem Eppendorfgefäß angesetzt

und im Ultraschallbad bei ca. 40 °C für 5-10 Minuten gelöst.

Die aliquotierte Stammlösung wurde ebenfalls im Ultraschallbad bei ca. 40 °C

für 5-10 Minuten erwärmt, um eine gleichmäßige Vermischung von Farbstoff und

Lösungsmittel zu gewährleisten. Dann wurde die entsprechende Menge

Stammlösung zu der Krebs-Lösung mit Pluronic® F-127 hinzugefügt. Diese

Farbstoff-Krebs-Lösung wurde ebenfalls für einige Minuten im Ultraschallbad

belassen.

3.9.3.2 Färbung des enterischen Nervensystems

Zur Färbung des enterischen Nervensystems wurden die zwei im Rahmen dieser

Arbeit etablierten Methoden zur extrazellulären Farbstoffapplikation am frischen

Gewebe angewendet:

A. ‚Systemische‘ Färbung

Das folgende Färbeprotokoll fand ausschließlich beim Plexus submucosus des

Meerschweinchens Anwendung.

Das präparierte und schon auf die Einmal-Sylgard®-Platte aufgespannte

Gewebe wurde in der Farbstoffgesamtlösung mit 20 µM Di-8-ANEPPS für 10-15

Minuten bei 37 °C inkubiert und währenddessen permanent mit Carbogen begast.

Anschließend wurde das gefärbte Gewebe vier- bis fünfmal für je 1-2 Minuten in

Krebs-Lösung gespült und dann in die Kammer montiert.

Konzentration: 20 µM, Di-8-ANEPPS

Applikationsart: Gewebebad mit 37 °C für die Dauer der Inkubation

Menge: 4-6 ml Farbstoff-Krebs-Lösung

Inkubationsdauer:10-15 Minuten

Integrationszeit: 30 Minuten-5 Stunden


B. ‚Lokale‘ Färbung

Diese Färbemethode wurde hauptsächlich bei der Maus und am Humangewebe

angewendet.

Di-8-ANEPPS wurde in einer Konzentration von 200 µM verwendet. Die

Farbstoff-Krebs-Lösung wurde in eine Spritzpipette (Herstellung s. Kapitel 3.10)

gefüllt, die an ein druckluftgesteuertes Mikroejektionssystem angeschlossen war.

Der Farbstoff wurde bei ausgeschalteter Perfusion über einen Zeitraum von 10-20

Sekunden in der Versuchskammer unmittelbar auf das zu färbende Ganglion

appliziert. Die Verteilung des Farbstoffes konnte im Durchlicht verfolgt werden. Das

Ejektionsvolumen lag bei 3,75 nl ± 0,95 pro Sekunde (n=6). Die Perfusion wurde

nach einer Inkubationsdauer von max. einer Minute wieder eingeschaltet. In der sich

anschließenden Integrationszeit - sie betrug in Abhängigkeit vom untersuchten

Gewebe für das jeweilige Ganglion 5-15 Minuten und markierte den Beginn der

Meßreihe - verankerte sich der gebundene Farbstoff in die Membran. War die

Färbeintensität noch nicht ausreichend, wurde der Vorgang wiederholt.

Konzentration: 200 µM, Di-8-ANEPPS

Applikationsart: Spritzpipette für 10-20 sec

Menge: 400 µl Farbstoff-Krebs-Lösung

Inkubationsdauer: max. 1 Minute

Integrationszeit: 5-15 Minuten

3.10 Stimulation enterischer Neurone

Um enterische Neurone zu aktivieren, wurden neben elektrischer Stimulation

interganglionärer Nervenstränge auch direkt chemische Substanzen auf die

Ganglien appliziert.

Für die elektrische Stimulation enterischer Neurone wurden selbst

hergestellte monopolare Platinelektroden mittels Mikromanipulator auf verschiedene

interganglionäre Nervenbahnen plaziert. Die Platinelektroden bestanden aus einem

∅ 25 µm feinen, teflonisolierten Draht (MedwireR, Leico Industries, New York, USA),

der aus einem ca. 7 cm langen Glasschaft ragte, an dessen Ende er mit einer


Steckvorrichtung verlötet wurde. Für die elektrische Stimulation waren die

Elektroden an einen Stimulusisolator (A 360, WPI, New Haven, CT) angeschlossen,

bei dem die Stromstärke im Bereich von 1 µA bis 10 mA variiert werden konnte.

Dieser war mit einer Steuereinheit (Pulsgenerator Master-8, A.M.P.I., Jerusalem,

Israel) gekoppelt, von der aus der Reizbeginn manuell getriggert und die Reizdauer

(400 µs) kontrolliert werden konnte. Ein Kanal der Steuereinheit, der parallel mit

dem Stimuluspuls getriggert wurde, wurde an die externen BNC-Eingänge des

Photodioden-Systems angeschlossen, damit Stimulationszeitpunkt und Anzahl der

gegebenen Pulse parallel zur optischen Messung aufgezeichnet und festgehalten

werden konnten.

Die Platinelektroden wurden in einer Entfernung von 200-600 µm zum jeweils

untersuchten Ganglion auf den Nervensträngen plaziert. Um sowohl schnelle als

auch langsame erregende postsynaptische Potentiale zu erzeugen (f EPSP und

s EPSP), wurden zwei Stimulationsarten verwendet. Es wurden einzelne Pulse

(Anzahl: 1-5 Pulse) unterschiedlicher Stromstärke (30-120 µA) zur Generierung von

über- und unterschwelligen f EPSP gegeben sowie Pulssalven (Anzahl: 20; 50 oder

100 Pulse, Frequenz: 20 Hz, Dauer: 1; 2,5 oder 5 sec) zur Auslösung von s EPSP.

Als Referenzelektrode im Bad diente eine Ag-AgCl-Pellet-Elektrode (EP2, WPI, FL,

USA).

Um Erregungsverteilungen innerhalb enterischer Ganglien erstmals zu

untersuchen, wurde die Aktivität innerhalb eines Ganglion nach elektrischer

Stimulation interganglionärer Nervenbahnen gemessen und neuropharmakologisch

untersucht (Kapitel 3.11). Bei oral-anal markierten Geweben wurden

interganglionäre Nervenstränge oral bzw. anal des zur Untersuchung stehenden

Ganglion elektrisch stimuliert. Als oral bzw. anal wurden die Nervenstränge definiert,

die vor bzw. hinter einer vertikal zur oral-anal Richtung gezogenen Linie durch das

entsprechende Ganglion verliefen.

Zur chemischen Stimulation der Nervenzellen wurden Acetylcholin bzw.

hyperosmolare Kaliumchlorid-Lösung (s. Kapitel 8.4) mit Spritzpipetten direkt auf

das zu untersuchende Ganglion appliziert. Die Spritzpipetten wurden aus

Borosilikatglas-Kapillaren (Kwik-FilTM, WPI, Berlin) hergestellt, die mit einem


Flaming-Brown-Puller (P-87, Sutter Instruments, San Rafael, USA) für diesen

Zweck geformt wurden. Die Parameter wurden so gewählt, daß Spritzpipetten mit

relativ parallel verlaufendem englumigen Schaft und schnell verjüngender Spitze

entstanden. Die Spitze mußte jeweils abgebrochen werden, um Spritzpipetten mit

dem notwendigen relativ konstanten Lumen zu erhalten. Die mit Pharmaka gefüllten

Spritzpipetten wurden in einen Spezialhalter montiert. Die Ejektion des Pharmakon

erfolgte mittels Druckluft (200 kPa). Über ein Steuergerät konnte eine der drei

verschiedenen Spritzplätze des Spezialhalters angewählt werden und die Dauer der

Applikation (5 ms-1000 ms) bestimmt werden. Das Ejektionsvolumen betrug

3,75 nl ± 0,95 pro Sekunde (n= 6). Dieses Steuergerät wurde ebenfalls über die

Steuereinheit angewählt und war an die externen BNC-Eingänge des

Photodiodensystems angeschlossen, um ebenfalls den Applikationszeitpunkt und

die Applikationsdauer des Pharmakons während der optischen Messung

festzuhalten.

3.11 Neuropharmakologische Untersuchung

Um die optisch gemessene Aktivität zu charakterisieren, wurden verschiedene

Pharmaka und Antagonisten eingesetzt, die eine Einstufung in nervale und

synaptische Aktivität erlaubten und die spezifische Rezeptoren enterischer Neurone

identifizieren konnten. Die im Folgenden aufgeführten Pharmaka wurden

überwiegend perfundiert oder wurden mittels Spritzpipette, wie bei der chemischen

Stimulation beschrieben, auf das Ganglion appliziert. Applikationsart, Konzentration

und Anwendungsdauer der eingesetzten Substanzen sind jeweils im Anhang

Kapitel 8.4 aufgeführt:

• Tetrodotoxin (TTX) Blockade Na+-Kanal abhängiger Aktivität

• Cobald-/Cadmiumchlorid-Lösung Blockade synaptischer Übertragung

• Ca2+-depletierte Lösung Blockade synaptischer Übertragung

• Hexamethonium, Mecamylamin Blockade nikotinerger Rezeptoren

• Atropin Blockade muskarinerger Rezeptoren

• Suramin Blockade purinerger Rezeptoren.


3.12 Datenanalyse, Auswertung der optischen Signale und Statistik

Bei der Analyse der Meßdaten wurden zunächst das Videobild des untersuchten

Ganglion und das Hexagon, das die Messung der 464 Photodioden beinhaltete,

überlagert, um für die Signalzuordnung die genaue Position des Ganglion auf den

Photodioden zu erhalten. Hierfür war zuvor ein skaliertes Videobild auf das

Hexagon projiziert und dem Maßstab des Hexagon entsprechend angepaßt worden.

Die Meßergebnisse der einzelnen Photodioden, die sich im Bereich der

Ganglionfläche befanden, wurden auf Signalantworten manuell durchgemustert. Die

Software erlaubte es, mehrere Photodioden gleichzeitig und in vergrößerter und

expandierter Form zu betrachten. Durch die auf den 8 externen BNC-Eingängen

während der Messung eingespeisten Daten über Strompulsgabe und

Pipettenapplikation konnten diese mit den Nervenzellantworten in Beziehung

gesetzt werden. Bei meßbarer Faseraktivität nach interganglionärer

Faserstimulation wurde die Ausbreitungsgeschwindigkeit auf der Nervenfaser

berechnet und als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.

Anhand des Videobildes und unter Zuhilfenahme der anschließend

gewonnenen immunhistochemischen Daten (s. Kapitel 3.14), wurde die

Nervenzellzahl pro Ganglion bestimmt. Aufgrund der Photodiodenergebnisse wurde

nach Überlagerung mit dem Videobild der Anteil auf Stimulation aktivierter und nicht

aktivierter Neurone festgestellt, sowie der Anteil der Neurone ermittelt, die ohne

Stimulation Aktivität zeigten. Der Anteil wurde prozentual für jedes Ganglion

gesondert berechnet. Alle Ganglien wurden als Mittelwert ± Standardabweichung

der einzelnen prozentualen Anteile angegeben. Der Medianwert wurden ebenfalls

für alle Werte errechnet. Gleiches erfolgte für die elektrische Stimulation oral bzw.

anal eines Ganglion, hier wurden zusätzlich die 25 %- und 75 %-Perzentile

angegeben. Um eine Vergleichbarkeit mit vorhandenen Literaturdaten aus

intrazellulären Ableitungen zu ermöglichen, wurden die Ergebnisse neben der

prozentualen Verteilung innerhalb der Ganglien ebenfalls auf die

Gesamtneuronenzahl bezogen und prozentual berechnet.


Bei Applikation von Acetylcholin wurde für die aktivierten Neurone die

Frequenz sowie die Dauer der Entladung während des Meßzeitraums ermittelt.

Eine Beziehung zwischen Gangliongröße und prozentualem Anteil spontan

aktiver Neurone sowie zwischen Gangliongröße und prozentualem Anteil der durch

Einzelpulsstimulation aktivierten Neurone wurde mit dem Rangkorrelationstest nach

Spearman getestet. Bei Vergleichen zwischen elektrophysiologisch

charakterisierten Neuronengruppen und ihrer immunhistochemischen

Transmitterkodierung (s. Kapitel 3.14) wurde der exakte Mehrfeldertest nach

R. A. Fischer zur Überpüfung der Homogenität zweier Häufigkeiten verwendet. Bei

Vergleichen von Signaldauern wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse mit

nachfolgenden multiplen Vergleichen (Dunnett’s Test) durchgeführt. Insgesamt

wurden bei der statistischen Auswertung Unterschiede als signifikant gewertet,

wenn der P-Wert kleiner als 0,05 war.

Bei der optischen Messung kann anders als bei intrazellulären

elektrophysiologischen Ableitungen nur während des kurzen Zeitraumes der

Belichtung das elektrophysiologische Verhalten der Neurone gemessen und

aufgezeichnet werden. Um spontane Aktivität messen zu können, wurde die Form

der 'Leeraufnahme' für die eigenen Untersuchungen eingeführt. Dabei handelt es

sich bei der sog. 'Leeraufnahme' um einen Meßzeitraum, in dem keine Stimulation

erfolgt. Es wurde in der vorliegenden Arbeit diejenige Aktivität als spontan definiert,

die in einer ‚Leeraufnahme‘ oder vor einer Stimulationsfolge im Verlauf einer

Meßperiode auftrat. Bei der in einer ‚Leeraufnahme‘ registrierten Aktivität wurden

die Zeitintervalle zwischen den jeweiligen Signalen berechnet. Die Anzahl der

gemessenen Signale wurde ebenfalls ermittelt und bezogen auf den gesamten

Meßzeitraum als durchschnittliche Signalfrequenz angegeben.

Die Amplitude der optischen Signale wurde als relative Änderung der

Fluoreszenz (∆F/F) in Prozent berechnet. Die Intensitäten des Wandlersignals

waren in mV angegeben. Diese Rohdaten wurden durch die jeweiligen RLI‘s der

Photodioden und durch den entsprechenden Verstärkungsfaktor (s. Kapitel 3.4.3)

dividiert und in relative Fluoreszenzänderung in Prozent umgerechnet. Die

optischen Daten zeigen somit nur relative Änderungen der Fluoreszenz (∆F/F) an.


Durch die entsprechende Wahl der Filter und unter Berücksichtigung des

Empfindlichkeitsspektrums der Farbstoffe führte ein zunehmendes

Membranpotential zu einer Abnahme der Fluoreszenz. Die Meßdaten konnten mit

Hilfe der Software invertiert werden, so daß alle in dieser Arbeit dargestellten

Fluoreszenzsignale mit zunehmendem Membranpotential durch die Invertierung

eine ebenfalls ansteigende Amplitude besitzen.

Anders als bei konventionellen intrazellulären Zellableitungen war bei der

Analyse der optischen Meßdaten ein Vergleich der Absolutwerte der

Signalamplituden zwischen verschiedenen Messungen nicht aussagekräftig, da

keine Absolutfluoreszenzen gemessen wurden. Die Signalamplitude spiegelte eine

relative Änderung der Fluoreszenz (∆F/F) wider und war damit von Messung zu

Messung verschiedenen Störfaktoren, wie z. B. Bleichen und Veränderung der

Hintergrundfärbung ausgesetzt, so daß ein Rückschluß auf die Größe oder absolute

Änderung des Membranpotentials anhand der absoluten Werte der

Signalamplituden nicht möglich war.

Die Meßpunkte der Photodioden konnten aus dem NeuroPlexTM-Programm

als ASCII-Format exportiert und in anderen Programmen (z. B. Igor Pro,

WaveMetrics Inc., Oregon, USA) weiter bearbeitet werden.

3.13 Signal-Raum-Zeitstruktur-Analyse

Um die zeitliche und räumliche Erregungsausbreitung innerhalb eines Ganglion

nach elektrischer Stimulation erstmals zu kartieren, wurden die einzelnen

Meßergebnisse der Photodioden mit der NeuroPlexTM-Software fehlfarbenkodiert.

Jeder Meßpunkt der 464 Dioden wurde einem Farbwert zugeordnet und die Punkte

desselben Meßzeitpunktes bildeten jeweils ein Bild. Dies ist in Abbildung 11

schematisch dargestellt. Bei der für die Darstellung gewählten Farbsequenz

kodieren die roten Farbtöne die Maximumamplitude eines Signals. Die für jeden

Meßpunkt gebildeten pseudokolorierten Bilder konnten einzeln dargestellt werden

(s. Abb. 11) oder in einer Filmsequenz mit variabel einstellbarer Bildrate abgespielt

werden, wodurch sich die Aktivitätslevel nach unterschiedlichen


Stimuluslokalisationen besser verdeutlichen ließen. Diese Filmsequenz konnte

außerdem als MPEG-Format exportiert werden. Deskriptiv wurde untersucht, wie

nach Einzelstimulation die zeitliche und räumliche Abfolge der Erregung innerhalb

enterischer Ganglien verlief.

Abbildung 11: Darstellung der räumlichen und zeitlichen Erregungsausbreitung innerhalb

eines Ganglion nach Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs anhand

fehlfarbenkodierter Bilder.

A Videobildaufnahme eines mit Di-8-ANEPPS vital gefärbten submukösen Ganglion des

Menschen.

B Die Meßergebnisse der 464 Photodioden des elektrisch stimulierten Ganglion sind stark

verkleinert als Hexagon gezeigt. Die Dioden, die sich nicht auf der Ganglionfläche und den

interganglionären Nervensträngen befinden, sind ausgeblendet und als gerade Linien

dargestellt. Aus der Ganglionmitte ist ein Diodensignal vergrößert worden, das mit einem

170 Hz Butterworth-Tiefpass der NeuroPlex -Software gefiltert ist. Exemplarisch ist für

18 Punkte die Abtastrate von 613 µs hervorgehoben. Die Meßwerte der Dioden werden zur

Kartierung der Erregungsausbreitung einem entsprechenden Farbwert der abgebildeten

Farbskala zugeordnet. Dabei kodieren rote Farbwerte den Maximalwert der

Signalamplitude.

C zeigt die sich daraus für alle mit einem 170 Hz Butterworth-Tiefpass gefilterten Dioden

ergebende fehlfarbenkodierte Karte dieses Ganglion. Die dargestellte Sequenz von

18 Bildern umfaßt eine Dauer von 10,2 ms, die sich aus der Abtastrate von 613 µs ergibt.

Die ausgeblendeten Dioden außerhalb des Ganglion wurden mit einem einheitlichen

Farbwert versehen. Anhand dieser Karten kann die zeitliche und räumliche

Erregungsausbreitung innerhalb eines Ganglion und entlang der Nervenstränge visualisiert

werden. In diesem Fall ist zu erkennen, wie die Erregung (rot) entlang der stimulierten

Nervenfaser (roter Pfeil) in das Ganglion eintritt und es über die Ganglionmitte auf der

gegenüberliegenden Seite wieder verläßt. Bei 6,6 ms erkennt man, wie im rechten Bereich

sich ein Erregungsfeld zeitlich verzögert entwickelt. Die Filmsequenz („movie“) ist auf der

Webseite http://www.tiho-hannover.de/einricht/phys/ag_schemann /index.html zu finden.


0 ms 1.2

1.8

0.6

2.4 3.0

3.6 4.2 4.8

5.4 6.0 6.6

7.2 7.8 8.4

9.0 9.6 10.2 ms

Kartierung der Erregungsausbreitung innerhalb enterischerGanglien nach Stimulation eines interganglionären

Nervenstrangs

A C

10 ms

20 µm

B


3.14 Immunhistochemie

Im Anschluß an die fluoreszenzoptischen Messungen wurden die Humangewebe

und Gewebe des Meerschweinchens immunhistochemisch aufbereitet und mit

ausgewählten neuronalen Markern gefärbt, um einen kombinierten Einsatz von

optischer und immunhistochemischer Technik zu erproben und um zusätzlich zu

den optischen Daten Aussagen über Transmitterkodierungen zu erhalten.

Für die immunhistochemische Charakterisierung wurde die Versuchskammer

ausgebaut und das noch auf der Sylgard®-Platte aufgespannte Gewebe direkt im

Anschluß an die Versuche in 4%iger Paraformaldehydlösung (s. Kapitel 8.5) für

4 Stunden bei Raumtemperatur oder für 12 Stunden im Kühlschrank fixiert. Alle im

weiteren verwendeten Lösungen sind in Kapitel 8.5 aufgelistet.

Die 4%ige Paraformaldehydlösung wurde entfernt und das fixierte Gewebe

wurde 3 x 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1 M Phosphatpuffer (PBS)

gewaschen. Die Sylgard®-Platte wurde verworfen und das Gewebe wurde bis zur

weiteren Verarbeitung in PBS mit 0,1 % Natriumazid (PBS/NaN3) bei 4 °C im

Kühlschrank verwahrt.

Dadurch, daß das Gewebe während der Fixierprozedur auf der

Sylgard®-Platte belassen wurde, konnte ein starkes Schrumpfen oder Verziehen

des Gewebes weitgehend vermieden werden, so daß die optisch untersuchten

Ganglien relativ einfach wieder aufgefunden werden konnten.

3.14.1 Präinkubation

Die Präparate wurden zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen im Gewebe

in einer Lösung bestehend aus 4 % Pferdeserum oder Ziegenserum (Horse IgG

bzw. Goat IgG, Firma Sigma, Dreisenhofen), 0,5 % Triton X-100

(t-Octylphenoxypolyethoxethanol, Firma Sigma, Dreisenhofen) und PBS/NaN3 für

60 Minuten bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln (Taumelgerät Teak III,

Heidolph) präinkubiert. Das Detergenz Triton X-100 diente zur Permeabilisierung

der Zellmembran. Die Wahl des Serums war abhängig von der Herkunft der

gewählten Antikörper (s. Tabelle 5, Tabelle 6). Diese für die Präinkubation


beschriebene Lösung wurde in allen folgenden Arbeitsschritten als Basislösung

verwendet, der die jeweiligen Antikörper zugesetzt wurden.

3.14.2 Primäre Antikörper

Das Gewebe wurde in die Lösung mit den verschiedenen primären Antikörpern

(s. Tabelle 5, Tabelle 6), in unterschiedlicher Konzentration verbracht und für 16

Stunden bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln inkubiert. Bei den

humanen Geweben wurde aufgrund der Präparatdicke die doppelte Inkubationszeit

gewählt. Dies galt auch für alle weiteren Arbeitsschritte. Am Ende der

Inkubationszeit wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS jeweils für

10-15 Minuten die überschüssigen, nicht gebundenen Antikörper entfernt.

Folgende Transmitter und neuronale Marker sollten immunhistochemisch

nachgewiesen werden:

Cholinerger Marker: Cholinacetyltransferase (ChAT)

Neuropeptide: Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP)

Substanz P (SP)

Neuronale Marker: Neuronen-spezifische Enolase (NSE)

Anti-Human neuronales Protein HuC/HuD-biotinilisiert

(Anti-Hu)

Die bei den verschiedenen Präparaten verwendeten Antikörper sind in

Tabelle 5 und 6 aufgelistet.

Tabelle 5: Primäre Antikörper, die beim Gewebe des Meerschweinchens verwendet wurden.

Antigen Tierart Typ Konzentration Code Hersteller

ChAT Ziege polyclonal 1:100 AB144P Chemicon, Temecula, USA

VIP Kaninchen polyclonal 1:1000 RIN-7161 Peninsula Laboratories,Belmont, USA

NSE Kaninchen polyclonal 1:3000 16625 Polysciences, Warrington,USA


Tabelle 6: Primäre Antikörper, die beim Humangewebe verwendet wurden.

Antigen Tierart Typ Konzentration Code Hersteller

ChAT Kaninchen polyclonal 1:1500 P3YEB SCHEMANN et al. 1993

VIP Maus monoclonal 1:1000 MaVIP91278

East Acres Biologicals,Southbridge, USA

SP Ratte monoclonal 1:1000 10-SO 15 Fitzgerald, Concord, USA

Anti-Hu Maus monoclonal 1:50 A-21272 Molecular Probes, Eugene,

USA

Die immunhistochemische Identifizierung von bis zu drei Transmittern konnte

parallel erfolgen, da die verwendeten primären Antikörper aus verschiedenen

Spezies stammten. Am Humangewebe erfolgte eine Dreifachfärbung mit ChAT, SP

und VIP und beim Meerschweinchen eine Zweifachfärbung mit ChAT und VIP. Um

einen zusätzlichen Einsatz neuronaler Marker trotz identischer Herkunftsspezies zu

ermöglichen, wurden die Gewebe erst nach Beendigung und Auswertung der

inmmunhistochemischen Transmitter-Färbungen mit den entsprechenden

neuronalen Markern erneut gefärbt.

3.14.3 Sekundäre Antikörper

Die primären Antikörper wurden zur Sichtbarmachung über einen Zeitraum von

4 Stunden mit sekundären, Fluorophor-gekoppelten Antikörpern inkubiert. Um die

Fluoreszenz zu verstärken, wurde in einigen Fällen vor Zugabe der Fluorophor-

gekoppelten Antikörper das Gewebe für 4 Stunden in Biotin-gekoppeltem

sekundären Antiserum inkubiert. Die sekundären, affinitätsgereinigten Antiseren

(Ziege bzw. Esel) waren mit folgenden Fluorophoren konjugiert (Jackson Labs,

Dianova, Hamburg):

• Carboxymethylindocyanin (Cy 3);

(anti-Ziege IgG, anti-Kaninchen IgG; Verdünnung 1:500)

• Carbocyanin (Cy 2)

(anti-Kaninchen IgG; Verdünnung 1:200)


• Dichlorotriazinyl Aminofluorescin (DTAF);

(anti-Maus IgG; Verdünnung 1:200)

• 7-Amino-4-Methylcoumarin-3-Acetat (AMCA);

(anti-Ratte IgG; Verdünnung 1:50)

• Indodicarbocyanin (Cy 5);

(anti-Maus IgG; Verdünnung 1:500)

Am Ende der Inkubationszeit wurden die Gewebe wiederum dreimal mit PBS

jeweils für 10-15 Minuten gewaschen, so daß die überschüssigen, nicht

gebundenen Antikörper entfernt wurden. Die Gewebe wurden auf Poly-l-Lysin

beschichteten Objektträgern ausgebreitet, in Citifluor® AF 1 (Canterbury,

Großbritannien) eingebettet, um den Prozeß des Ausbleichens der Fluoreszenz zu

verlangsamen, und wurden dann mit einem Deckglas bedeckt.

3.14.4 Immunfluoreszenzmikroskop und Auswertung

Die immunhistochemisch gefärbten Präparate wurden an einem inversen

Fluoreszenzmikroskop (IX 70-S1F, Olympus, Tokyo, Japan) ausgewertet. Die mit

der optischen Methode untersuchten Ganglien konnten anhand ihrer Lokalisation im

fixierten Präparat wieder aufgefunden und anhand ihrer Morphologie eindeutig

identifiziert werden. Durch das Eindeckeln waren sie allerdings teilweise in ihrer

ursprünglichen Form etwas verzogen. In der folgenden Tabelle 7 sind die

verschiedenen Filterblöcke zur Anregung der Fluorophore aufgelistet.

Tabelle 7: Filterblöcke für die unterschiedlichen Fluorophore der Immunhistochemie

Filterblock- FilterblockFluorophor bezeichnung I Exzitationsfilter Dichroitischer Spiegel Emissionsfilter

AMCA (blau) U-MWU II BP 330-385 DM 400 BP 460-490

Cy 2/DTAF (grün) U-MNIBA II BP 470-490 DM 505 D 520/20

Cy 3 (rot) U-M41007 HQ 545/30X 565 DCLP HQ 610/75M

Cy 5 (infrarot) U-M41008 HQ 620/60 Q660 LP HQ 700/75I Angaben stammen aus Datenblättern der Firma Olympus, Hamburg bzw. Chroma

Technology, Brattelboro, USA. II Filterblöcke sind modifiziert.


Die Filterkombinationen erlaubten die überschneidungslose Analyse der

Fluorophore. Die Ganglien wurden mit einer Schwarzweißkamera (Mod. 4910, Cohu

Inc., San Diego, Californien, USA) aufgenommen. Diese war mit einem Computer

(Macintosh Power PC 8100/100) verbunden und wurde über die

Bildanalysesoftware IPLab Spektrum 3.1 (Signal Analytics, Vienna, Virginia, USA)

gesteuert. Im Falle des im Infrarotbereich fluoreszierenden Cy 5 konnte nur über

diese Kamera die Analyse erfolgen.

83

4 Ergebnisse

4.1 MSORT: Etablierung der Färbemethode und Vorversuche1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11T 1 2 3 4 5 6 7

4.1.1 Enzymatisch vorbehandeltes Gewebe

Die von OBAID und Mitarbeitern (1992) beschriebene enzymatische Vorbehandlung

am Ileum konnte für die eigenen Versuche am Kolon so nicht verwendet werden.

Das Häutchenpräparat des Plexus submucosus war sowohl bei der Maus als auch

beim Meerschweinchen nach diesem enzymatischen Protokoll nicht mehr in der

Versuchskammer aufzuspannen.

In Abänderung dieses Protokolls wurde der Grad der enzymatischen

Zersetzung (Dissoziation) durch Variation von Inkubationszeit, Enzymkonzentration

und Temperatur beeinflußt. Generell erwies sich der Andaugrad bei einer

Inkubationstemperatur von 37 °C als besser reproduzierbar verglichen mit der

Inkubation bei Raumtemperatur. Zwar konnten durch 35minütige Inkubation von

50 U/ ml Collagenase VII und 0,5 mg/ ml Protease beim Meerschweinchen und

durch eine 10minütige Inkubation von 50 U/ 3 ml Collagenase VII und 0,75 mg/ 3 ml

Protease auch bei der Maus erstmals Ganglien angefärbt und optische Signale

abgeleitet werden, jedoch erwies sich der Andaugrad der Gewebe von Maus und

Meerschweinchen trotz konstanter Behandlungsprozedur als nicht ausreichend

reproduzierbar. Zudem schritt die Zersetzung des Gewebes auch nach Ende der

Enzymbehandlung und selbst nach mehrmaligem Auswaschen stetig voran. Die

Ganglien erschienen bei Betrachtung im Auflicht nach wenigen Stunden alsbald

granulär und vakuolig.

Der für die zu bearbeitende Fragestellung reproduzierbar gleichbleibende

Zersetzungsgrad des Gewebes konnte somit weder bei der Maus noch beim

Meerschweinchen erzielt werden.


4.1.2 Frisch präpariertes Gewebe

4.1.2.1 ‚Systemische‘ Färbung

Plexus submucosus des Meerschweinchens

Mit der von OBAID und Mitarbeitern (1992) eingesetzten Konzentration des

Farbstoffes Di-8-ANEPPS konnten bei den eigenen Versuchen optische Signale

selbst bei kurzen Belichtungszeiten (< 3 Sekunden) im Plexus submucosus des

Meerschweinchens nicht reproduzierbar erhalten werden. Entweder blieben die

Signale bei erneuter Belichtung vollständig aus, oder zeigten sich um erheblich

verbreitert und in ihrer Amplitude stark verkleinert.

Die Reduzierung der von OBAID verwendeten Farbstoffkonzentration um fast

90 % auf 20 µM erbrachte für den Plexus submucosus des Meerschweinchens die

erforderliche Reproduzierbarkeit der optischen Antwort über mehrere Stunden

Versuchsdauer mit einer Gesamtbelichtungszeit von weit über 30 Sekunden. Die

optischen Antworten zeigten auch nach wiederholter Belichtung eine vergleichbare

Signalcharakteristik. Eine für die optische Messung ausreichende Färbung konnte

durch 10-15minütige Inkubation bei 37 °C erzielt werden. Durch die Verwendung

von frischem, nicht enzymatisch behandeltem Gewebe verstärkte sich allerdings die

Färbung des nun vorhandenen, überwiegend aus Bindegewebe und

Muskulaturresten bestehenden nicht-neuronalen Gewebes. Die damit verbundene

Erhöhung der Hintergrundfluoreszenz führte zu einer Verringerung des

Signal-Rausch-Verhältnisses, beeinträchtigte aber die Detektierbarkeit optischer

Signale nicht wesentlich.

Plexus submucosus der Maus

Am frisch präparierten Plexus submucosus der Maus erbrachte das ursprüngliche

Farbstoffprotokoll von OBAID und Mitarbeitern keine Signalantworten. Auch die

Variation der Parameter von Farbstoffkonzentration (1, 2, 5, 10, 20, 40, 80 µM),

Inkubationszeit (5, 10, 20, 40, 60, 90, 120 min) und Inkubationstemperatur (4, 25,

37 °C) führte bei der gesamthaften Färbung des Gewebes zu keinen optisch

meßbaren Nervenzellantworten.

Ergebnisse 85

Plexus myentericus der Maus

Im Plexus myentericus der Maus konnten nur bei einer Farbstoffkonzentration von

160 µM und einer Inkubationszeit von 20 Minuten vereinzelt Signale gemessen

werden, die aber größtenteils schnell in ihrer Amplitude ab- und stetig in ihrer Dauer

zunahmen. Das Nervengewebe erschien nach kurzer Belichtung körnig und blasig.

Reproduzierbare Signale über mehrere Meßzyklen konnten nicht erzielt werden.

Weiterhin war die Hintergrundfluoreszenz durch verstärkte Integration des

Farbstoffes in Muskelfaserreste der Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur erheblich.

Auch bei Veränderung der Färbeparameter konnte keine geeignete

Farbstoffkonzentration gefunden werden, die eine optimale und gleichbleibend gute

Nervenzellableitung am Plexus myentericus ermöglichte oder zumindest erwarten

ließ.

4.1.2.2 ‚Lokale‘ Färbung

Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte lokale Spritzapplikation einer

hochkonzentrierten Farbstofflösung von Di-8-ANEPPS auf die im Auflicht

aufgefundenen Ganglien erbrachte erstmals auch am frischen Gewebe des Plexus

submucosus der Maus optische Signale. Beim Plexus submucosus des

Meerschweinchens ermöglichte diese Art der Farbstoffapplikation teilweise eine

Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses.

Die Spritzapplikation einer 200 µM Di-8-ANEPPS Farbstofflösung für 10-20

Sekunden erzielte für die optischen Messungen einen guten Färbegrad des

Nervengewebes. Das Ausschalten der Perfusion noch über die Farbstoffapplikation

hinaus ermöglichte eine bessere Farbstoffanreicherung in dem zu untersuchenden

Ganglion und unterband gleichzeitig ein unerwünschtes Verteilen des Farbstoffes

auf die Ganglionumgebung. Ein einminütiges Ausschalten der Perfusion erschien

für die Farbstoffverteilung ausreichend, um möglichst schnell das Gewebe nach

Einschalten der Perfusion wieder mit sauerstoffangereicherter Krebs-Lösung zu

versorgen. Nach etwa 5-15 Minuten blieb die Färbung eines Ganglion nahezu

konstant, so daß nach diesem Zeitraum mit den ersten optischen Messungen


begonnen werden konnte. Da sich der Färbegrad des Gewebes mit der 400 µM

Farbstofflösung nur unwesentlich unterschied, wurde für die weiteren Versuche die

geringer konzentrierte Farbstofflösung (200 µM) gewählt, um die Konzentration des

Lösungsmittels DMSO möglichst niedrig zu halten.

Beim Plexus myentericus der Maus und des Menschen konnte durch diese

Applikationsart mit Di-8-ANEPPS keine optisch meßbare Signalantwort erreicht

werden. Die auf dem Plexus vorhandenen Muskelfasern wurden innerhalb kurzer

Zeit intensiv gefärbt. Eine ausreichende Färbung des neuronalen Gewebes konnte

mit der lokalen Farbstoffapplikation auch nach mehrmaligem Wiederholen der

Färbeprozedur nicht erreicht werden.

4.1.3 Tauglichkeit der angewendeten Färbemethoden für frischesGewebe

Bei dem Vergleich der beiden Färbemethoden zeigten sich Unterschiede in der

Färbecharakteristik des Gewebes. Die sich bei erfolgreicher Färbeprozedur mit

Di-8-ANEPPS für die jeweilige Färbetechnik ergebenden Unterschiede sind im

Folgenden als Vor- und Nachteile der jeweiligen Technik aufgeführt.

4.1.3.1 Vor- und Nachteile der ‚systemischen‘ Färbung

Vorteil:

• Anfärben einer Vielzahl von Ganglien im Gewebe gleichzeitig möglich

• nach Aufsuchen eines potentiellen Ganglion im Durchlicht kann ggf. die sofortige

Bestätigung im Fluoreszenzlicht erfolgen; geeignet für unklare Ganglion-

identifizierung im Durchlicht

• Zeitgewinn durch vorhergehende Färbung des Gewebes bei der Untersuchung

einer Vielzahl von Ganglien und mehrstündiger Versuchsdauer

Nachteil:

• höhere Hintergrundfluoreszenz als bei der ‚lokalen‘ Färbung

• Dauer zwischen Färbung der Ganglien und ihrer Untersuchung sehr variabel;

dadurch stark unterschiedliche Integrationszeit

Ergebnisse 87

• Bei mehrstündiger Versuchsdauer teilweise Farbstoffinternalisierung möglich

• Keine Überprüfung und Steuerung des Färbegrades möglich

• Belichtung noch nicht untersuchter, aber schon gefärbter Ganglien durch

Streustrahlung

4.1.3.2 Vor- und Nachteile der ‚lokalen‘ Färbung

Vorteil:

• niedrige Hintergrundfluoreszenz

• Überprüfung und Steuerung des Färbegrades eines Ganglion

• Nachfärbung möglich, Ausbleicheffekte können dadurch ausgeglichen werden.

• Für jedes Ganglion annähernd gleiche Integrationszeit, so daß auch bei über

mehrere Stunden andauernder Versuchsdauer kaum Farbstoffinternalisierung

beobachtet werden konnte.

Nachteil:

• Ganglien müssen für die lokale Färbung im Auflicht identifiziert werden können

• relativ aufwendige Färbeprozedur bei der Untersuchung mehrerer Ganglien

4.1.4 Färbecharakteristik und Eignung von Di-8-ANEPPS sowieseiner Derivate Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ

Die Untersuchungen in den Vor- und Hauptversuchen ergaben: Di-8-ANEPPS ist für

die optische Messung am enterischen Nervensystem von Maus, Meerschweinchen

und des Menschen in unterschiedlichem Maße geeignet und zeigt verschiedene

Färbecharakteristika. Bei den Geweben, bei denen Di-8-ANEPPS nicht optimal

erschien, wurden die Derivate Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ auf ihre Eignung

getestet.

Als Bemessungsgrundlage für die Eignung des jeweiligen Farbstoffes wurden

folgende visuell wahrnehmbare und mit der optischen Meßtechnik erfaßbare

Kriterien zugrunde gelegt:


- Anfärbbarkeit, Darstellbarkeit von interganglionären Fasern, Ganglien und

Neuronen in der Vitalfärbung

- Anteil von aufgefundenen zu anfärbbaren Ganglien

- Maß der unspezifischen Farbstoffintegration in Bindegewebe und Muskulatur

- Messung der Fluoreszenzintensität und Durchführbarkeit der optischen Messung

4.1.4.1 Humangewebe

Di-8-ANEPPS färbte beim Plexus submucosus des Menschen nahezu alle

aufgesuchten und lokal gefärbten enterischen Ganglien an, unabhängig von der

Darmregion. Die Umrisse der vital gefärbten Ganglien und interganglionären

Nervenstränge waren im Fluoreszenzlicht bei mehr als zwei Dritteln der Ganglien

gut von der unspezifischen Hintergrundfärbung abzugrenzen. Im Vergleich zum

Nervengewebe zeigte sich eine schwache Färbung des Bindegewebes. Die

Umrisse der Nervenzellen stellten sich als helle Bezirke im Gegensatz zu dem

dunkel erscheinenden Zellsoma dar (Abb. 12 links), so daß einzelne Nervenzellen

schon in der potentiometrischen Färbung des vitalen Humangewebes identifiziert

werden konnten. Ein Vergleich der Di-8-ANEPPS Aufnahmen vital gefärbter

Ganglien mit denen der anschließend fixierten und immunhistochemisch

aufbereiteten Ganglien bestätigte dies. Wie Abbildung 12 exemplarisch zeigt, sind

die mit dem neuronalen Marker Anti-Hu immunhistochemisch identifizierten

Nervenzellen des fixierten Ganglion ebenfalls in der potentiometrischen Vitalfärbung

desselben Ganglion erkennbar. Optische Signalantworten konnten bei rund 95 %

der individuell angefärbten submukösen Ganglien erhalten werden.

Es zeigte sich, daß sich Di-8-ANEPPS für Untersuchungen am submukösen

Humangewebe sehr gut eignete und eine effektive Versuchsdurchführung erlaubte.

Hingegen färbte sich im Plexus myentericus (n= 4 Gewebe) die Muskulatur

unabhängig von der Färbetechnik intensiv mit Di-8-ANEPPS. Das Nervengewebe

konnte weder im Fluoreszenzlicht visuell wahrgenommen werden, noch war es

möglich, optische Signale abzuleiten. Di-8-ANEPPS erwies sich für Untersuchungen

am myenterischen Plexus als nicht geeignet. Auch die Farbstoffe Di-4-ANEPPS und

Ergebnisse 89

Di-8-ANEPPQ ermöglichten ebenfalls keine optische Messung. Sie zeigten

hinsichtlich ihrer Färbecharakteristik eine mit der des Plexus myentericus der Maus

vergleichbare Färbung (s. Kapitel 4.1.4.2).

20µm 20µm

Abbildung 12: Enterisches Ganglion im Plexus submucosus des Menschen dargestellt in

der Vitalfärbung mit Di-8-ANEPPS und als Immunfluoreszenzaufnahme. Links zeigt die

Fluoreszenzaufnahme des vitalen Ganglion beladen mit dem spannungssensitiven

Farbstoff Di-8-ANEPPS. Durch die hellen Umrisse und dunklen Zellkörper sind die

Nervenzellen (n= 9) im Farbstoff-beladenen Ganglion deutlich zu erkennen. Rechts zeigt

die immunhistochemische Darstellung desselben Ganglion nach Fixierung. Mittels des

Fluorophor-gekoppelten Antikörpers Anti-Hu wurden spezifisch nur neuronale Zellkörper

markiert. Die einzelnen Nervenzellen sind durch ihre hellen Zellkörper zu erkennen. Alle

Nervenzellen des immunhistochemisch untersuchten Ganglion sind auch in der linken

Di-8-ANEPPS Färbung wie in einem Negativbild zu erkennen. Der Pfeil kennzeichnet

exemplarisch eine Nervenzelle.

4.1.4.2 Gewebe der Maus

Bei der Maus färbte Di-8-ANEPPS im Plexus submucosus des Kolon selbst bei

lokaler Farbstoffapplikation nur vereinzelt Ganglien mit ihren interganglionären

Nervensträngen, hingegen wurden Bindegewebe und Muskulaturreste intensiv

gefärbt. Allein von den im Fluoreszenzlicht sichtbaren Ganglien - das sind nach

Farbstoffapplikation weniger als 10 % - konnten Signalantworten erhalten werden.


Diese Ganglien stellen sich dann allerdings, wie in Abbildung 13 gezeigt,

vergleichbar mit denen des Menschen dar. Im Plexus myentericus zeigte sich eine

intensive Färbung verbliebener Muskulaturreste bei schemenhaft gefärbten

Ganglien (s. Abb. 14), von denen nur sporadisch Signale auf den interganglionären

Nervensträngen abgeleitet werden konnten. Di-8-ANEPPS zeigte sich für den

Plexus submucosus der Maus nur sehr bedingt geeignet. Eine effektive

Versuchsdurchführung war durch das nicht reproduzierbare Anfärben submuköser

Ganglien nicht gegeben. Für den Plexus myentericus der Maus war Di-8-ANEPPS

nicht geeignet. Zwischen den beiden Inzuchtstämmen BALB/cJ und C57BL/6

konnten bei der Anfärbbarkeit des Plexus submucosus und des Plexus myentericus

keine Unterschiede festgestellt werden.

Das ebenfalls im murinen Plexus submucosus und Plexus myentericus je an

drei Geweben getestete Farbstoffderivat Di-4-ANEPPS erwies sich als nicht

tauglich. Dieser gleichfalls extern applizierte Farbstoff internalisierte bei einer

Konzentration von 5 µM, 10 µM und 20 µM innerhalb weniger Minuten bis zu einer

halben Stunde in das Zellinnere. Dies ist in Abbildung 14 bei einem Großteil der

Neurone am Beispiel des Plexus myentericus zu erkennen. Charakteristischerweise

hob sich bei der Farbstoffinternalisation der dunkle Zellkern vom hellen Zellsoma

ab. Eindeutige Zellsignale waren dann nicht mehr zu erhalten. Wie in Abbildung 14

dargestellt, waren Ganglionumrisse und Zellgrenzen nur kurz nach der

Farbstoffapplikation gut sichtbar.

Der an vier Geweben zusätzlich getestete Farbstoff Di-8-ANEPPQ war bei

der Maus im Färbeverhalten mit Di-8-ANEPPS vergleichbar und bot keine

Alternative.

Abbildung 13: Vitales Ganglion im submukösen Plexus

der Maus gefärbt mit Di-8-ANEPPS. Die Nervenzellen

(n= 9) sind durch ihre hellen Umrisse zu erkennen. Die

Färbung des Hintergrundes beruht auf der verstärkten

Integration des Farbstoffes in nicht-neuronales Gewebe,

bei der Maus hauptsächlich aus Bindegewebe bestehend.20µm

Ergebnisse 91

Abbildung 14: Die drei Abbildungen stellen

Fluoreszenzaufnahmen von Ganglien im Plexus

myentericus der Maus dar, die mit einem 40er

Objektiv aufgenommen wurden.

Oben ist das mit Di-8-ANEPPS lokal

gefärbte Ganglion in der linken Bildhälfte nur

andeutungsweise zu erkennen (s. Pfeile).

Typischerweise färbt Di-8-ANEPPS bei der Maus

die Zellumrisse nicht an. Hingegen deutlich

erkennbar sind die hell gefärbten im Bild längs und

quer verlaufenden Muskulaturreste. In der rechten

Bildhälfte sind Ganglionkonturen nicht mehr von

der Hintergrundfärbung abzugrenzen.

In der Mitte ist ein Ganglion kurz nach der

Farbstoffapplikation mit Di-4-ANEPPS dargestellt.

Die Nervenzellen sind anhand ihrer hellen Umrisse

zu erkennen (Pfeil). Auffällig sind verglichen mit

der oberen Abbildung die nur undeutlich gefärbten

Muskulaturreste.

Unten ist ein mit Di-4-ANEPPS gefärbtes

Ganglion zu sehen, bei dem fast alle Nervenzellen

die für die Farbstoffinternalisation typische

Färbung des Zytoplasmas unter Aussparung des

Zellkerns („Spiegeleicharakteristik“) zeigt. Die

Pfeile markieren zwei solcher Nervenzellen.

Optische Signale konnten in diesem Fall nicht

mehr abgeleitet werden. 20µm

20µm

20µm


4.1.4.3 Gewebe des Meerschweinchens

Beim Meerschweinchen waren bei den mit Di-8-ANEPPS gefärbten submukösen

Geweben Ganglionumrisse und Nervenzellgrenzen teilweise schwierig von der

Hintergrundfärbung abzugrenzen (s. Abb. 15). Ohne immunhistochemische Färbung

war allein anhand der potentiometrischen Färbung eine eindeutige

Nervenzellidentifizierung selten möglich. Jedoch konnten die im Auflicht

aufgesuchten Ganglien stets gefärbt und bei nahezu allen Ganglien optische

Zellantworten abgeleitet werden, bei ebenfalls reproduzierbar guten

Signalantworten.

Di-4-ANEPPS internalisierte, wie bei der Maus, ebenfalls innerhalb kurzer

Zeit selbst bei einer Konzentration von 5 µM in die Neurone und war für die optische

Registrierung an submukösen Neuronen im Kolon nicht geeignet. Die Applikation

von Di-8-ANEPPQ auf fünf Ganglien des Plexus submucosus führte zu einer von

Di-8-ANEPPS nicht unterscheidbaren Ganglionfärbung und optischen

Signalantwort.

20µm 20µm

Abbildung 15: Diese Abbildungen zeigen die Fluoreszenzaufnahme eines vitalen Ganglion

im Plexus submucosus des Meerschweinchens. Links ist das Ganglion mit Di-8-ANEPPS

(200 µM) gefärbt. Die Zellgrenzen der Neurone sind allerdings beim Meerschweinchen,

verglichen mit Maus und Mensch, nur schemenhaft zu erkennen. Rechts zeigt dasselbe

Ganglion, zusätzlich gefärbt mit Di-4-ANEPPS (10 µM) 20fach geringer konzentriert als

Di-8-ANEPPS. Im Ganglion sind die neuronalen Zellkerne als dunkle Rundungen zu

erkennen, heller sind das Soma und die Zellumrisse. Diese Somafärbung ist charakteristisch

für eine Internalisation des Farbstoffs. Für Di-4-ANEPPS ist dies charakteristisch im Kolon

des Meerschweinchens.

Ergebnisse 93

4.2 Validierung optischer Signale neuronaler Herkunft1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15T 1 2 3 4 5 6 7

Optische Signale, die mit der MSORT von dem mit Di-8-ANEPPS beladenen

Darmgewebe von Maus, Meerschweinchen und des Menschen registriert wurden,

sollten zuerst auf ihre neuronale Herkunft hin untersucht werden.

Gängige, in elektrophysiologischen Experimenten verwendete chemische

und elektrische Stimuli wurden eingesetzt, um Nervenzellerregung auszulösen. Die

mit den Nervenzellen korrespondierenden Photodioden wurden daraufhin auf die

induzierte, optisch meßbare Nervenzellerregung untersucht. Die neuronale Herkunft

der mit der MSORT registrierten Aktivität wurde in Kombination mit

neuropharmakologischen Untersuchungen untermauert. Zudem wurden die

Signaldauer sowie der Signalverlauf zur Charakterisierung der optisch registrierten

Aktivität hinzugezogen.

Im folgenden werden die verschiedenen optisch gemessenen

Nervenzellantworten allgemein beschrieben und differenziert.

4.2.1 Chemische Stimulation

An vital gefärbten enterischen Neuronen wurden depolarisierende Änderungen des

Membranpotentials durch lokale Spritzapplikation von hyperosmolarer

Kaliumchloridlösung (100 mM) und des exzitatorischen Neurotransmitters

Acetylcholin (ACh; 0,5 mM) induziert. Die entsprechenden Photodioden wurden auf

optische Nervenzellaktivität überprüft.

Die extrazelluläre Erhöhung des Kaliums verursachte

Membrandepolarisationen, die auch in den optischen Messungen auf den

korrespondierenden Photodioden als transiente Änderung der Fluoreszenzintensität

detektiert werden konnten (s. Abb. 16).

Die lokale Applikation des Neurotransmitters ACh führte ebenfalls zu

meßbaren transienten Fluoreszenzänderungen. Diese nach Applikation von ACh

gemessenen Signale blieben in Anwesenheit des nAChR-Antagonisten

Mecamylamin aus, was auf eine Blockade der ACh-Wirkung schließen ließ (n= 17

Neurone). Die Signalantwort trat jedoch nach Auswaschen des rezeptorspezifischen


nAChR-Antagonisten wieder auf (s. Abb. 17). Nicht beeinflußt wurden die durch

lokale ACh-Applikation ausgelösten optischen Signale durch Calcium-depletierte

Lösung (n= 9 Neurone) (s. Abb. 18, Ia). Da Calcium-depletierte Lösung nur die

synaptische Übertragung blockiert, konnte damit die direkte postsynaptische

Wirkung von ACh nachgewiesen werden. In einem von der ACh-Applikationsstelle

entfernten und nicht direkt stimulierten Ganglion konnte hingegen die zeitlich etwas

verzögerte, optisch meßbare Aktivität durch die Calcium-depletierte Lösung

blockiert werden, wodurch die synaptische Herkunft der im benachbarten Ganglion

registrierten Signale belegt werden konnte (s. Abb. 18).

Die fluoreszenzoptisch erhaltenen Signale zeigten eine Dauer von etwa

4-6 ms mit einem steilen An- und Abstieg der Signalamplitude und ähnelten in ihrer

Signalcharakteristik konventionell intrazellulär abgeleiteten Aktionspotentialen.

Abbildung 16: Meßdaten einer Photodiode von einem mit Di-8-ANEPPS gefärbten

enterischen Neuron im Plexus submucosus der Maus nach Spritzapplikation von

hyperosmolarer Kaliumchloridlösung (links) und von Acetylcholin (rechts). Die „Peaks“

sind gemessene Änderungen der Fluoreszenz infolge neuronaler Membrandepolarisation

und entsprechen Aktionspotentialen. Die Signalamplitude ist als relative Änderung der

Fluoreszenz (∆F/F) angegeben. Während des Meßzeitraumes von 3,2 s konnten nach Gabe

von hyperosmolarer Kaliumchloridlösung 14 Aktionspotentiale mit einer

durchschnittlichen Entladungsfrequenz von 7 Hz registriert werden. Die Gabe von

Acetylcholin führte bei demselben Neuron zur Auslösung von 29 Aktionspotentialen mit

einer durchschnittlichen Entladungsfrequenz von 20 Hz. Die Daten wurden mit einem

Butterworth-Tiefpass bei 200 Hz gefiltert.

∆F/F= 0,1%

500 ms

Kaliumchloridlösung (100 mM) Acetylcholin (0,5 mM)

ACh500 ms

KCl1 s

Ergebnisse 95

Abbildung 17: Optisch registrierte Aktivität eines submukösen Ganglion der Maus nach

Spritzapplikation von Acetylcholin (500 ms; 0,5 mM). A In der Fluoreszenzaufnahme (JVC

Kamera) sind Nervenzellen (a-e) zu erkennen sowie interganglionäre Nervenstränge (*).

Rechts und links sind die Meßergebnisse der korrespondierenden Photodioden nach Gabe

von 500 ms ACh gezeigt. Die Aktivität der Nervenzellen a und e ist mit expandierter

Zeitachse in B dargestellt. Die lokale Applikation des nAChR-Antagonisten Mecamylamin

1 s vor ACh-Gabe blockiert die ACh induzierte Aktivität. Nach Auswaschen des

Antagonisten kann die ACh-Antwort wieder registriert werden.

500 msc

d

b

a

e ∆F/F

= 0,

2 %ACh 500 ms

A

∆F/F= 0,2 %

1 s Mecamylamin (1 mM)

1 min Auswaschen

4 min Auswaschen

eaB

ACh 500 ms ACh 500 ms

20 µm

cd

ba

e

*

*

**

500 ms


Abbildung 18: Optisch registrierte Aktivität zweier muriner submuköser Neurone in ver-

schiedenen Ganglien. A Fluoreszenzbild der beiden Ganglien I und II. B Auf Ganglion I

wurde lokal ACh (0,5 mM; 500 ms) appliziert, hingegen nicht auf Ganglion II. Der

Applikationszeitpunkt auf Ganglion I ist auch bei Ganglion II markiert ( ). Neuron I a zeigt

eine durch Ca2+-depletierte Lösung unbeeinflußte ACh-Antwort, die erst durch den nAChR-

Antagonisten Mecamylamin blockiert wird. Die zeitlich verzögert auftretende Aktivität in

Neuron II a kann hingegen durch Ca2+-depletierte Lösung blockiert werden.

AChII

I

Auswaschen

Calcium-depletierte Lösung (1,25 mM Calcium)

Mecamylamin (200 µM)∆F

/F=

0,1%

200 ms

20 µm

A B

ACh

II

I

ACh

ACh

ACh

I a II a

a

a

Ergebnisse 97

4.2.2 Elektrische Stimulation

Nach elektrischer Stimulation von interganglionären Nervensträngen wurde Aktivität

der interganglionären Nervenstränge und von der Ganglionzellen auf den

korrespondierenden Photodioden abgeleitet.

4.2.2.1 Interganglionäre Nervenstränge

Auf den interganglionären Nervensträngen konnte nach Stimulation die neuronale

Herkunft der optisch registrierten Aktivität durch reversible Blockierung mit dem

Neurotoxin Tetrodotoxin (TTX) nachgewiesen werden (s. Abb. 19). Die Dauer der

Signale lag im Bereich von 3-8 ms und die Signalcharakteristik zeigte den für

Aktionspotentiale typischen steilen Anstieg und Abfall der Signalamplitude. Es

zeigte sich, daß eine Verringerung des verwendeten Abtastintervalls von 0,6 ms auf

0,1 ms die Darstellbarkeit des Nervenstrangaktionspotentials nicht verbesserte

(s. Abb. 20). Die Signaldauer lag mit dem Abtastintervall von 0,613 ms bei

Nervenstrang TTX(0,3 µM)

Auswaschen

∆ F/F=0,5 %

5 ms

260

µm

Abbildung 19: Aktivität eines

interganglionären Nervenstrangs

nach dessen elektrischer

Stimulation (Pfeil) registriert auf

zwei verschiedenen Photo-

dioden. Das Summenaktions-

potential wird durch das Neuro-

toxin TTX reversibel blockiert.

Auf der 260 µm entfernten

Photodiode wird das Aktions-

potential zeitlich um ca. 0,6 ms

verzögert registriert. Die

Meßdaten wurden mit einem

Butterworth-Tiefpass bei 170 Hz

gefiltert.


4,6 ± 0,9 ms und die relative Änderun

(n= 18), verglichen mit einer Aktionspo

0,73 ± 0,19 (n= 18) bei einem Ab

unterschieden sich nicht sign

Ausbreitungsgeschwindigkeit der Aktion

4.2.2.2 Überschwellige und untepostsynaptische Potentia

Die elektrische Stimulation interganglio

von Nervenzellen in enterischen Gan

der Nervenzellkörper zeigten eine opti

und dem Amplitudenverlauf mit der v

vergleichbar war. Diese optisch gem

12 ms, zeigten eine langsame Abnahm

der konventionellen Elektrophysiol

Hexamethonium blockiert werden.

Neuropharmakologie jedoch, daß sich

verschiedenen Komponenten zusamme

∆ F/F= 0,5 %

1 msAbtastintervall0, 106 µs

Abtastintervall0,613 µs

Abbildung 20: Aktivität eines inter-

ganglionären Nervenstrangs nach elektrischer

Stimulation registriert mit zwei verschiedenen

Abtastraten. Eine Erhöhung der Abtastrate

von 1,6 kHz auf 9,4 kHz und Verkleinerung

des Abtastintervalls (°) von 0,613 µs auf

0,106 µs führt zu keiner signifikant besseren

Darstellbarkeit der Summenaktionspotential-

dauer.

g der Fluoreszenz (∆F/F) bei -0,68 ± 0,18

tentialdauer von 4,6 ± 0,9 ms und ∆F/F von

tastintervall von 0,1 ms. Diese Werte

ifikant voneinander. Die berechnete

spotentiale lag im Bereich von 0,2-0,5 m/s.

rschwellige schnelle erregendele (f EPSP) sowie Nervenfaserpotentiale

närer Nervenstränge führte zur Aktivierung

glien. Die korrespondierenden Photodioden

sche Signalcharakteristik, die von der Dauer

on f EPSP aus intrazellulären Ableitungen

essenen f EPSP dauerten stets mehr als

e der Amplitude und konnten - wie auch in

ogie - durch den nAChR-Antagonisten

Bei einigen Signalen zeigte die

die optisch registrierte Aktivität aus zwei

nsetzte:

Ergebnisse 99

- aus einer Aktionspotential-ähnlichen Hexamethonium-insensitiven Komponente

in der frühen Phase der Depolarisation (s. Abb. 21) und

- aus einer Hexamethonium-inhibitiven oder Hexamethonium-sensitiven

Komponente in der späten Phase der Depolarisation (s. Abb. 21, Pfeil).

Bei diesen gemischten optischen Antworten wurde die späte Phase der

Depolarisation durch Calcium-depletierte Lösung ebenfalls vollständig blockiert

(s. Abb. 21). Dies untermauerte die synaptische Herkunft dieser späten

Komponente und zeigte die Existenz von f EPSP. Hingegen konnte die frühe,

Abbildung 20: Expandierte Diodensignale gemessen auf einem interganglionären

Nervenstrang (oben) und auf einer Nervenzelle (unten) nach elektrischer Stimulation mit

Einzelstrompulsen (Pfeile) im Plexus submucosus des Menschen. Die obere Reihe zeigt

die Aufnahme von Axonspikes, die nicht durch Hexamethonium oder

Calcium-depletierte Lösung in ihrer Dauer beeinflußt werden. Die untere Reihe zeigt die

optische Aktivität eines Neuron, bei der ein Teil der Nervenzellantwort -in der späten

Phase der Depolarisation (unterbrochener Pfeil)- durch Hexamethonium und durch

Calcium-depletierte Lösung blockiert wird. Dies läßt auf eine gemischte Antwort von

synaptisch vermitteltem f EPSP (Pfeil) und „process potential“ schließen.

Kontrolle

50 ms

Hexamethonium(200 µM)

∆F/F= 0,2%

Auswaschen Calcium-depletierteLösung (0,25 mM)


Aktionspotential-ähnliche Phase der Depolarisation ebenso wie Aktionspotentiale

von interganglionären Nervensträngen in Anwesenheit Calcium-depletierter Lösung

nicht blockiert werden (s. Abb. 21). Tetrodotoxin (TTX) blockierte stets diese

fluoreszenzoptisch gemessenen Signale, wodurch eindeutig die neuronale Herkunft

gezeigt werden konnte. Diese registrierte Aktivität deutete auf

Nervenzellfortsatzaktivität im Sinne der „process potentials“ hin. Diese

Hexamethonium-insensitive und durch Calcium-Depletion nicht blockierbare

optische, Aktionspotential-ähnliche Signalform wurde hinsichtlich ihrer Herkunft

nicht weiter differenziert.

Beim Einsatz von Calcium-depletierter Lösung und von Cobald-Cadmium-

Lösung traten Effekte auf, die den Einsatz dieser Lösungen bei den optischen

Untersuchungen einschränkte. So konnten bei einigen Ganglien nach Auswaschen

der Lösung keine Signale mehr abgeleitet werden, selbst nach kurzer

Belichtungszeit. Teilweise trat nach 10-15 minütiger Perfusion auch eine irreversible

Verbreiterung der optischen Signalantwort auf, was gerade bei Aktionspotentialen

auffiel. Die Erhöhung der Calciumkonzentration in der Calcium-depletierten Lösung

von 0,25 mmol auf 1,25 mmol zeigte eine Verlangsamung der auftretenden

Wirkung. Weder eine Veränderung der Hintergrundfluoreszenz noch eine visuelle

Veränderung der Nervenzellen konnte beobachtet werden. Da mögliche toxische

Effekte nicht auszuschließen waren, wurden nur die Ganglien in die Auswertung

miteinbezogen, bei denen die Wirkung reversibel war.

Repetitive Gabe von Einzelstrompulsen während eines Meßzyklus führte in den

optischen Signalen teilweise zu einer Abschwächung sowie zu einer Verstärkung

der f EPSP-Charakteristik. Dies deutete generell darauf hin, daß mit der optischen

Methode sowohl „Rundown“ als auch Summation erfaßt werden konnten (Abb. 22).

Insgesamt zeigte sich ein hohes Maß an Übereinstimmung hinsichtlich der optisch

gemessenen Nervenzellantworten und den Daten aus der konventionellen

Elektrophysiologie hinsichtlich des Signalverlaufes und der Signaldauer.

Ergebnisse 101

4.2.2.3 Langsame erregende postsynaptische Potentiale (s EPSP)

Nach elektrischer Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs durch Gabe

von Pulssalven über eine extrazelluläre Elektrode konnten in der weiteren

stimulationsfreien und mehrere Sekunden andauernden optischen Meßperiode

transiente Fluoreszenzänderungen gemessen werden, die Aktionspotentialen

glichen und auf die Existenz von s EPSP hindeuteten. Die langsame Depolarisation

der Zellmembran während eines s EPSP konnte mit diesem System nicht

Abbildung 21: Optische Aktivität dreier Neurone eines submukösen Ganglion des Meer-

schweinchens nach elektrischer Stimulation (s. Pfeile) eines interganglionären Nerven-

strangs. Umrisse von Ganglion und Lokalisation der drei Neurone sind auf dem

Photodioden-Array rechts eingezeichnet. Neuron a zeigt zwei überschwellige f EPSP ( )

mit abnehmender Amplitude gefolgt von einem unterschwelligen dritten Signal. Neuron b

antwortet auf Einzelstrompulse mit unterschwelligen f EPSP ohne Abnahme der Amplitude.

Neuron c zeigt nach repetitivem Stimulus ein Summation, die zur Entladung eines

Aktionspotentials führt.

100 ms

∆F/F= 0,2%

Summation

f EPSPunterschwellig

Rundowna

b

c

Photodioden-Array


dargestellt werden. Neuropharmakologisch erwies sich die nach der Stimulussalve

gemessene Aktivitätsentladung als insensitiv gegenüber Hexamethonium,

wohingegen sich die nach Einzelstimulation ausgelösten f EPSP als nikotinerg

vermittelt erwiesen (s. Abb. 23). Dadurch konnte nachgewiesen werden, daß die

nach der Pulsfolge gemessenen Aktivität nicht von f EPSP, sondern von s EPSP

herrührte.

Abbildung 22: Optisch gemessene Nervenzellaktivität eines submukösen Neuron des

Meerschweinchens nach Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs (roter Pfeil)

sowie Aufnahme des fixierten Neurons mit Immunoreaktivität für ChAT. A Nach Ende der

Dauerstimulation (Balken) kommt es zu einer s EPSP ähnlichen Aktionspotentialent-

ladung. Nach Einzelstimulus zeigt dieses Neuron ebenfalls auch f EPSP. In Anwesenheit

des nACh-Antagonisten Hexamethonium bleibt die lang andauernde Erregung (s EPSP)

weiterhin auslösbar, wohingegen die schnelle Erregung (f EPSP) vollständig blockiert

wurde. B In der immunhistochemischen Aufnahme ist die Lage des Neurons im fixierten

Ganglion mittels Kreis markiert.

∆F/F

=0,0

8%

s EPSP

in Hexamethonium (200µM)

20 Hz, 5s

20 Hz, 5s

1 s

Pulssalve

f EPSP

60 ms

Einzel-stimulus

Pulssalve

ChAT

20 µm

Submuköses Ganglion desMeerschweinchens mit

Immunoreaktivität für ChAT

A B

Ergebnisse 103

Da die langsame Depolarisation im Verlaufe eines s EPSP nicht gemessen

werden konnte, mußte bei der Interpretation der Meßdaten berücksichtigt werden,

ob Nervenzellen beispielsweise Spontanaktivität zeigten. Der Einsatz eines

nAChR-Antagonisten allein war nicht ausreichend. Aufgrund der relativ hohen

Belichtungszeiten von bis zu 10 s konnten die Aufnahmen nicht beliebig oft

wiederholt werden, da nach 3-4 maliger Belichtung die Signalamplitude zunehmend

abnahm.

4.2.3 Immunhistochemie

Die im Anschluß an die optischen Messungen fixierten Gewebe wurden

immunhistochemisch aufbereitet. Dabei zeigte sich, daß eine Kombination von der

MSORT mit der Immunhistochemie sowohl beim Menschen (n= 26 Gewebe) als

auch beim Meerschweinchen (n= 10 Gewebe) generell möglich war. Eine

Überlagerung der optischen Signale mit der immunhistochemischen Aufnahme

∆F/F

=0,1

%

500 ms

ChATVIPSP

ACh 10ms

ACh 10ms

10µm

a

b

der Immunhistochemie (ChAT, VIP und SP) ist Neuron a

(rot). Bei Neurone b sind ChAT/VIP (gelb) kolokalisiert. Beid

Abbildung 23: Überlage-

rung von Immunhistoche-

mie und optisch registrier-

ter Aktivität. Dargestellt

ist ein Ganglion mit zwei

Nervenzellen (a, b) im

Plexus submucosus des

Menschen. Beide Neurone

wurden nach Spritzappli-

kation von ACh (0,5 mM,

roter Pfeil) aktiviert. In

immunoreaktiv für ChAT/-

e Neurone sind SP-negativ.


konnte durchgeführt werden (s. Abb. 24 und 25). Die immunhistochemische

Charakteristik ist für das Humangewebe im speziellen Teil Kapitel 4.3 zu finden.

Beim Meerschweinchen konnte nur bei etwa jedem 5ten Ganglion eine

ausreichende Färbung erreicht werden.

,

Abbildung 24: Immunhistochemische Aufnahme eines optisch untersuchten Ganglion mit

drei interganglionären Nervensträngen (*) im Plexus submucosus des Meerschweinchens.

Rot gefärbt sind Nervenzellen mit Immunoreaktivität für ChAT (n= 4), grün zeigt den

Neurotransmitter VIP (n= 3). Rechts: Die Meßdaten der Photodioden (weiß) wurden auf

die immunhistochemische Aufnahme des Ganglion projiziert. Nach elektrischer

Nervenstrangstimulation zeigten alle Neurone eine schnelle erregende Antwort.

10 µm

ChAT

VIP

100 ms

∆ F/F= 0,5%

*

*

*

Ergebnisse 105

4.3 MSORT: Hauptversuche1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 161718 1920 21 22 23 24 25 T 1 2 3 4 5 6 7

4.3.1 Optische Registrierung von Nervenzellaktivität amDarmnervensystem des Menschen

Von insgesamt 30 Resektaten konnten vom Plexus submucosus in 26 Geweben

aus Kolon (n= 21) und Rektum (n= 5) Signale optisch abgeleitet werden. Bei 4

Geweben konnten keine Daten gewonnen werden (MHH-Nr. MC 696, 703, 736 und

741; s. Tab. 2, S. 44).

Von vier Rektum-Bioptaten konnten bei einem Gewebe Ganglien aufgefunden,

angefärbt und Signale erhalten werden (MHH-Nr. PE 749; s. Tab. 3, S. 45).

Insgesamt 74 submuköse Ganglien wurden in den 26 Resektaten und dem einen

Rektum-Bioptat untersucht. Bei 70 Ganglien mit über 660 Neuronen konnten

optische Signalantworten gemessen werden. Die Gesamtzellzahl innerhalb eines

Ganglion konnte in Kombination mit immunhistochemischen Daten bei 60 Ganglien

mit 610 Neuronen ermittelt werden. Die Nervenzellzahl pro Ganglion lag im Schnitt

bei 10,2 ± 5,9 Neurone (Median: 9,0; Bereich: 2-25 Neurone).

4.3.1.1 Vorkommen von schnellen erregenden postsynaptischenPotentialen (f EPSP) nach Stimulation interganglionärerNervenstränge

Um den prozentualen Anteil induzierbarer Aktivität innerhalb enterischer Ganglien

zu charakterisieren, wurden interganglionäre Nervenfasern durch Gabe von

Einzelstrompulsen elektrisch stimuliert. Der Anteil aktivierter Neurone wurde

ermittelt und prozentual auf die Gesamtzahl der im jeweiligen Ganglion

vorhandenen Neurone bezogen.

51 Ganglien (n= 22 Gewebe) mit insgesamt 537 Neuronen wurden

untersucht. Im Mittel befanden sich 10,5 ± 6,1 Neurone innerhalb eines Ganglion

(Median: 9; Bereich: 2-25 Neurone). Insgesamt wurden 83 interganglionäre

Nervenstränge elektrisch gereizt.

Durchschnittlich 55 % ± 32 % der Neurone (Median: 57 %) wurden innerhalb

eines Ganglion nach Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs aktiviert,


wobei der Anteil aktivierter Neurone nach Nervenstrangstimulation von

0 % bis 100 % reichte (s. Anhang, Tab. 19). Eine Beziehung zwischen der

Gangliongröße und dem prozentualen Anteil der aktivierten Neurone sowie

zwischen der Gangliongröße und der Aktivierung aller Neurone eines Ganglion

konnte nicht festgestellt werden.

Von 537 Neuronen wurden bei 83 Nervenfaserstimulationen insgesamt 366

Neurone (68,2 %) aktiviert. Zur Bestimmung der Qualität der induzierten

Nervenzellerregung wurden 247 Neurone in 31 Ganglien mit dem

nAChR-Antagonisten Hexamethonium weiter untersucht, um synaptische

Übertragungsmechanismen zu identifizieren und mögliche beteiligte

Neurotransmitter im Humandarm zu ermitteln.

Bei 68 Neuronen (27,5 %) konnte mit dem nAChR-Antagonisten die

Zellantwort vollständig blockiert werden (s. auch Abb. 36 A). Dieser Hexa-

methonium-inhibitive Effekt läßt auf eine ACh-Wirkung schließen, die rein nikotinerg

vermittelt ist. Die Dauer dieser nikotinergen f EPSP lag bei 14 analysierten

Neuronen im Bereich von 14,1 ms-92,7 ms mit einem Mittelwert von 41,3 ms ±

18,9 ms.

Als Hexamethonium-sensitiv erwies sich die Zellantwort ebenfalls bei 179 von

247 Neuronen. Dabei konnte bei 169 Nervenzellen (68,4 %) die Depolarisation im

Zuge des f EPSP ebenfalls blockiert werden. Ferner zeigten diese Nervenzellen

nach Stimulation eines Nervenstrangs ein verbleibendes optisches Signal, das von

der Morphologie mit einem Aktionspotential vergleichbar war. Die Dauer dieser

Aktionspotential-ähnlichen Signale lag bei 5,4 ± 1,2 ms. Diese Signale konnten

weder durch den muskarinergen-Acetylcholin-Rezeptor (mAChR)-Antagonisten

Atropin (n= 8 Neurone getestet) noch durch Calcium-depletierte Lösung zur

Hemmung synaptischer Übertragung blockiert werden (n= 12 Neurone getestet).

Durch den Natrium-Kanalblocker TTX hingegen konnten diese

Aktionspotential-ähnlichen Signale vollständig blockiert werden (n= 75 Neurone

getestet). Dies wies bei diesen Neuronen auf das Vorliegen von „process potentials“

hin. Die Stimulation eines weiteren Nervenstrangs bei 76 Neuronen führte bei 41 zu

Ergebnisse 107

einer vollständigen Blockierung der Nervenzellantwort, bei 35 Neuronen zeigten

sich wiederum die Aktionspotential-ähnlichen Signale.

Bei 10 der 179 Hexamethonium-sensitiven Neurone (4,0 %, n= 4 Ganglien),

deutete die Form der Signalamplitude und die Dauer von 30,7 ± 5,3 ms auf noch

vorhandene synaptische Übertragungsmechanismen und damit auf die Existenz von

f EPSP hin. Fünf dieser Neurone (n= 2 Ganglien) wurden neuropharmakologisch

untersucht, um die Hexamethonium-insensitive Komponente dieser f EPSP zu

analysieren. In Anwesenheit des nAChR-Antagonisten führte der

mAChR-Antagonist Atropin (0,5 µM) bei drei Neuronen zu einer vollständigen

Blockierung der direkten Stimulusantwort. Bei diesen Neuronen konnte in

Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium durch lokale, direkte

Applikation von Acetylcholin noch Nervenzellerregung induziert werden, wobei diese

Wirkung dann durch Atropin blockiert wurde. Bei einem weiteren Neuron wurden die

durch Hexamethonium reduzierten f EPSP durch Atropin ebenfalls blockiert, wobei

dann nur noch eine Aktionspotential-ähnliche Signalcharakteristik gemessen wurde,

was auf „process potentials“ hindeutete. Insgesamt konnte damit eine Beteiligung

∆F/F = 0,1 %

50 ms

Kontrolle Hexamethonium(200 µM)

Hexamethonium(200 µM)

Atropin (0,5 µM)

Auswaschen 15 min

Abbildung 26: Submuköses Neuron im Rektum des Menschen nach elektrischer

Stimulation (Pfeile) eines interganglionären Nervenstrangs. Das f EPSP zeigt Sensitivität

gegenüber dem nAChR-Antagonisten Hexamethonium und kann durch den

mAChR-Antagonisten Atropin vollständig blockiert werden. Nach dem Auswaschen der

Antagonisten erscheint die Signalantwort wieder .


muskarinerg vermittelter Übertragungsmechanismen aufgezeigt werden

(s. Abb. 26).

Die Nervenzellantwort des fünften pharmakologisch untersuchten Neuron

erwies sich in seiner f EPSP ähnlichen Signalcharakteristik unbeeinflußt durch den

mAChR-Antagonisten Atropin. Eine vollständige Blockierung der Signalantwort

wurde in Anwesenheit des P2-Rezeptor-Antagonisten Suramin erreicht (s. Abb. 27).

Hexamethonium(200 µM)Atropin (0,5 µM)

Suramin(100 µM)

Kontrolle Auswaschen10 min

100 ms

∆ F/F= 0,1%

Abbildung 27: Optisch registrierte f EPSP zweier submuköser Neurone im Rektum des

Menschen nach elektrischer Stimulation (s. Pfeil) eines interganglionären Nervenstrangs.

Bei Neuron a konnte die Aktivität durch den nAChR-Antagonisten Hexamethonium nicht,

bei Neuron b vollständig blockiert werden. Bei Neuron a trat eine vollständige Blockierung

der Aktivität durch den P2-Antagonisten Suramin ein. Nach 10 min Auswaschen können

f EPSP schon wieder ausgelöst werden. Die Meßwerte wurden mit einem

Butterworth-Tiefpass bei 200 Hz gefiltert.

In der Immunhistochemie (hier nicht dargestellt) zeigten beide Nervenzellen

Immunoreaktivität nur für ChAT und nicht für Substanz P oder VIP.

Ergebnisse 109

Die relative Fluoreszenzänderung (∆F/F) und die Dauer der f EPSP wurde getrennt

nach erster und zweiter Stimulation für 40 willkürlich gewählte Neurone (n= 11

Ganglien in vier Geweben) ermittelt (Tab. 8). Dabei erfolgte die zweite Stimulation

im Durchschnitt 0,38 ± 0,03 s nach der ersten Stimulation. In intrazellulären

Ableitungen wird „Rundown“ als Abnahme der Amplitude definiert. Bei den

optischen Messungen wurde eine Abnahme von 10 % als Grenzwert gewählt. Bei

15 Neuronen (Nr. 26-40, Tab. 8) trat beim zweiten f EPSP eine mehr als 10%ige

Reduzierung der Amplitude auf, was auf das Vorliegen von „Rundown“ hindeutete.

Die Amplitude des f EPSP nach der zweiten Stimulation wurde um durchschnittlich

24, 9% ± 8,4 % reduziert. 6 Neurone zeigten eine Zunahme der Amplitude beim

zweiten Stimulus um durchschnittlich 36,8 ± 13,6 %, was auf Summation hindeutete

(Nr. 1-6, Tab. 8). Weitere 19 Neurone zeigten eine Amplitudenveränderung, die im

Vergleich zum ersten f EPSP im Bereich von ±10 % schwankte (Nr. 7-25, Tab. 8)

und im Mittel bei 1,4 % ± 6,0% lag. Die Dauer des zweiten f EPSP verringerte sich

bei 21 Neuronen um mehr als 10 % im Vergleich zum ersten Stimulus. Bei 3

Neuronen verlängerte sich die Dauer um mehr als 10 %. Eine Korrelation zwischen

Amplitudenabnahme und Abnahme der Dauer erwies sich als statistisch nicht

signifikant.

Für alle untersuchten Neurone (n= 537) wurde der neurochemische Kode für

ChAT, Substanz P und VIP ermittelt (s. Tab. 9). Die Neurone, die nach elektrischer

Stimulation f EPSP zeigten, sind mit ihrem neurochemischen Kode aufgelistet.

Dabei zeigte sich hinsichtlich der neurochemischen Kodierung kein signifikanter

Unterschied (P-Wert=0,053) zwischen den durch f EPSP aktivierten und den nicht

aktivierten Neuronen. Allerdings schienen bei den nicht aktivierten Neuronen mehr

ChAT/- Neurone in Relation zu ChAT/VIP Neuronen aufzutreten (45 ChAT/- und

55 ChAT/VIP) als bei den Neuronen, die f EPSP zeigten (65 ChAT/- und

148 ChAT/VIP).


Tabelle 8: Relative Änderung der Fluoreszenz (∆F/F) und Dauer (ms) für f EPSP

generierende Neurone (n= 40) nach wiederholter Stimulation interganglionärer

Nervenstränge.

∆∆∆∆F/F (%) Dauer (ms)Nr. 1.

f EPSP2.

f EPSP% von

f EPSP 11.

f EPSP2.

f EPSP% von

f EPSP 1 1 0,12 0,19 (158%) 36,8 41,1 (112%) 2 0,18 0,26 (144%) 56,4 50,9 (90%) 3 0,11 0,15 (136%) 33,7 36,2 (107%) 4 0,27 0,36 (133%) 53,3 52,1 (98%) 5 0,12 0,16 (133%) 47,8 38,6 (81%) 6

> 10

%

0,23 0,27 (117%) 33,7 30,7 (91%) 7 0,26 0,28 (108%) 73,6 66,8 (91%) 8 0,14 0,15 (107%) 25,7 26,4 (102%) 9 0,30 0,32 (107%) 56,4 49,0 (87%)10 0,29 0,31 (107%) 53,9 36,2 (67%)11 0,19 0,20 (105%) 48,4 34,3 (71%)12 0,42 0,42 (100%) 22,7 25,7 (114%)13 0,24 0,24 (100%) 31,9 33,7 (106%)14 0,30 0,30 (100%) 33,1 33,1 (100%)15 0,13 0,13 (100%) 55,2 49,0 (89%)16 0,20 0,20 (100%) 36,2 30,0 (83%)17 0,29 0,28 (97%) 41,1 36,2 (88%)18 0,23 0,22 (96%) 28,2 20,8 (74%)19 0,29 0,27 (93%) 48,4 58,8 (122%)20 0,28 0,26 (93%) 38,0 34,3 (90%)21 0,27 0,25 (93%) 34,3 29,4 (86%)22 0,42 0,39 (93%) 70,5 55,8 (79%)23 0,25 0,23 (92%) 27,6 26,4 (96%)24 0,13 0,12 (92%) 33,1 29,4 (89%)25

± 10%

0,21 0,19 (90%) 60,1 38,6 (64%)26 0,22 0,19 (86%) 35,6 31,3 (88%)27 0,34 0,29 (85%) 38,0 38,0 (100%)28 0,28 0,23 (82%) 25,1 24,5 (98%)29 0,22 0,18 (82%) 30,0 27,6 (92%)30 0,48 0,38 (79%) 35,6 38,6 (109%)31 0,34 0,27 (79%) 23,9 20,2 (85%)32 0,32 0,25 (78%) 50,9 41,1 (81%)33 0,22 0,17 (77%) 25,7 23,3 (90%)34 0,13 0,10 (77%) 52,7 40,5 (77%)35 0,23 0,17 (74%) 42,9 36,8 (86%)36 0,30 0,22 (73%) 58,8 52,1 (89%)37 0,21 0,15 (71%) 48,4 33,7 (70%)38 0,40 0,25 (63%) 33,1 28,2 (85%)39 0,33 0,20 (61%) 25,1 25,7 (102%)40

< 10

%

0,34 0,20 (59%) 44,1 33,1 (75%)

Ergebnisse 111

Tabelle 9: Neurochemische Kodierung (ChAT, SP, VIP) von Neuronen, die nach

elektrischer Stimulation f EPSP zeigten, und Kodierung von denen, die nicht aktiviert

wurden. Dargestellt ist ebenfalls die Gesamtkodierung.

Stimulusantwort Neurochemische Kodierung

MSORT ChAT/- ChAT/VIP ChAT/ SP VIP/- -/- n= ...

GESAMTKODIERUNGn= 537

110(30%)

203(56%)

20(5%)

23(6%)

9(3%)

365(100%)

f EPSP ChAT/- ChAT/VIP ChAT/ SP VIP/- -/- n= ...

gesamtn= 366 65 148 14 13 6 246

nikotinergn= 247

{davon Hexamethonium-sensitiv; n= 10}

45

1

108

3

10

-

6

2

6

-

175

6

nicht getestetn= 119 20 40 4 7 - 71

nicht aktivierte Neurone ChAT/- ChAT/VIP ChAT/ SP VIP/- -/- n= ...

n= 171 45 55 6 10 3 119


Durch Spritzapplikation von ACh wurde die Aktivierung submuköser Neurone

des Menschen durch nikotinerge Mechanismen untersucht. 91 Neurone in 20

Ganglien (14 Gewebe) wurden durch Spritzapplikation von 0,5 mM Acetylcholin

(Dauer 5-200 ms) aktiviert. Mit ansteigender Applikationsdauer stieg die

Entladungsfrequenz der registrierten Aktionspotentiale (s. Abb. 28, Abb. 29). Die

Entladungsfrequenz betrug bei einer ACh-Applikationsdauer von 100-200 ms

8-55 Hz. Während des Meßzeitraumes dauerte die ACh-Wirkung bis zu 3 s. Bei 18

Neuronen (n= 5 Ganglien) wurde der nAChR-Antagonist Hexamethonium

perfundiert, wobei sich die Nervenzellantwort bei 6 Neuronen vollständig inhibieren

ließ. 12 Neuronen erwiesen sich als Hexamethonium-sensitiv, was sich in einer

Aktionspotentialentladung mit reduzierter Frequenz äußerte. Diese verbliebene

Hexamethonium-insensitive Antwort (s. Abb. 29) konnte vollständig durch den

mAChR-Antagonisten blockiert werden (n= 11 Neurone getestet).

Abbildung 28: Dosis-korrelierte Entladung von Aktionspotentialen bei acht submukösen

Neuronen des Menschen (siehe verschiedene Symbole) nach Spritzapplikation von 0,5 mM

Acetylcholin. Eine ansteigende Dauer der Spritzapplikation (Abszisse) führt bei den

Neuronen zu einer Erhöhung der Entladungsfrequenz der Aktionspotentiale (Ordinate).

50

40

30

20

10

0

10010 Dauer der ACh- Applikation (ms)

AP-

Fre

quen

z (H

z)

Ergebnisse 113

∆F/F=0,2%ACh 3 ms

Leeraufnahme

ACh 150 ms in Hexamethonium (200 µM)

ACh 150 ms in Hexamethonium (200 µM)+ Atropin (0,5 µM)

500 ms

ACh 150 ms

ACh 50 ms

ACh 10 ms

Abbildung 29: Dosis-korrelierte

Aktivität eines submukösen Neuron

des Menschen nach Spritzapplikation

des Neurotransmitters ACh (0,5 mM).

Dargestellt sind die Meßergebnisse

der korrespondierenden Photodiode

(280 µm²).

In einer Leeraufnahme, in der keine

Stimulation erfolgte, zeigt dieses

Neuron, wie auch in den

darauffolgenden Messungen, keine

Spontanaktivität.

Nach Spritzapplikation von ACh

zeigt sich eine Entladung von

Aktionspotentialen. Die

durchschnittliche Frequenz (5, 9, 22,

31 Hz) der Entladung und die Anzahl

der ausgelösten Aktionspotentiale

steigt mit zunehmender Dauer der

ACh-Spritzapplikation an (Pfeil;

3 ms, 10 ms, 50 ms and 150 ms).

Bei diesem Neuron wurde die

Aktivität in Anwesenheit des

nAChR-Antagonisten reduziert und

konnte durch den mAChR-Antago-

nisten Atropin vollständig blockiert

werden.

Die Daten sind mit einem 170 Hz

Butterworth-Tiefpass gefiltert.


4.3.1.2 Untersuchung auf das Vorkommen von langsamen erregendenpostsynaptischen Potentialen (s EPSP)

Wie häufig s EPSP im enterischen Nervensystem des Menschen auftreten, sollte

mit den folgenden Untersuchungen abgeklärt werden. 21 Ganglien (n= 15 Gewebe,

208 Neurone) mit durchschnittlich 9,9 ± 6,2 Neuronen innerhalb eines Ganglion

(Median: 9; Bereich: 2-21 Neurone) wurden nach elektrischer Stimulation eines

interganglionären Nervenstrangs mittels einer Pulssalve (20 Hz, 2-5 sec) auf das

Vorkommen von s EPSP untersucht. Dabei wurde eine im Verlaufe oder nach der

Stimuluspulsfolge auftretende Aktionspotentialsentladung als Hinweis auf das

Vorliegen von s EPSP gewertet. Um nikotinerg vermittelte ACh-Wirkungen, die

durch das Induzieren von f EPSP bei der optischen Messung eine ähnliche Aktivität

hervorrufen könnten, auszuschließen, wurde ein Teil der Experimente in Gegenwart

eines nAChR-Antagonisten durchgeführt (s. Abb. 30). Die Messungen in

Anwesenheit und ohne den nAChR-Antagonisten werden im folgenden zunächst

zusammen und dann getrennt dargestellt. Die Prozentangaben beziehen sich

einmal auf die mit dieser Fragestellung untersuchte Neuronengesamtzahl und dann

auf die durchschnittliche prozentuale Verteilung der Neurone innerhalb der

Ganglien.

Insgesamt konnte bei 5 von 208 nach einer Pulssalve aktivierbaren Neuronen

(2,4 %) s EPSP festgestellt werden, wobei diese sowohl im Kolon (n= 4) als auch im

Rektum (n= 1) registriert werden konnten. Diese fünf Neurone befanden sich in vier

verschiedenen Ganglien. Der Anteil von s EPSP generierenden Neuronen innerhalb

aller untersuchten enterischen Ganglien lag im Mittel bei 2,2 % ± 5,1 % (Median:

0 %; Bereich: 0 %-20 %). Dabei konnte bei den Neuronen, bei denen s EPSP

auftraten, nach Einzelstromstimulation auch stets f EPSP ausgelöst werden, welche

durch Hexamethonium blockiert wurden. In der Immunhistochemie konnte für 3 der

Neurone mit s EPSP der neurochemische Kode für ChAT, VIP und Substanz P

ermittelt werden: Zwei Nervenzellen zeigten Immunoreaktivität für ChAT/VIP, eine

nur für ChAT/-. Der überwiegende Anteil (86,3 %) der Neurone zeigte infolge der

Stimulation mittels Pulssalve keine lang andauernde optisch meßbare Aktivität und

Ergebnisse 115

somit keine mit der MSORT erfaßbaren Hinweise auf die Existenz von s EPSP. Für

28 Neurone (11,6 %) konnte die gemessene Aktivitätsentladung mit der optischen

Methode nicht als unmittelbare Folge der Pulssalve eindeutig interpretiert werden,

da diese Neurone vor und während dieser Dauerstimulation zusätzliche

Aktivitätsmuster (s. u.) aufwiesen.

Bei 13 von den 21 Ganglien (n= 8 Gewebe) mit 141 Neuronen wurde in

Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium eine Dauerstimulation an

17 interganglionären Nervensträngen durchgeführt. 19 der 141 Neurone (13,5 %)

zeigten optisch meßbare Erregung, die auch nach der Gabe der Pulssalve

fortdauerte und auf das Vorliegen von s EPSP hindeutete. Allerdings war bei 15

dieser Neurone (10,6 %) zuvor bereits Spontanaktivität oder eine andauernde

Aktivitätsentladungen auf Einzelpulsstimulation („late onset spike discharge“,

s. Kap. 4.3.1.4) aufgetreten. Somit konnte bei diesen Neuronen nicht zweifelsfrei

von einer stimulusinduzierten langsamen Depolarisation im Sinne der s EPSP

ausgegangen werden. Bei vier Neuronen (2,8 %, n= 3 Ganglien) konnte die Aktivität

∆F/F=0,1%

1 sPulssalve (20 Hz, 5 s)

Abbildung 30: Optisch registrierte Aktivität eines submukösen Neuron im Rektum des

Menschen in Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium (200 µm) nach

Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs. Die Dauer der Pulssalve ist durch den

breiten Balken markiert. Gegen Ende der Stimulation ist eine Signalentladung zu

erkennen, die auf die Existenz eines s EPSP hinweist. Gegen Ende der 9,5 sekündigen

Belichtungszeit tritt erneut eine Aktionspotentialentladung auf. Die Daten wurden mit

einem 240 Hz Butterworth-Tiefpass und einem 5,5 Hz Butterworth-Hochpass gefiltert.


als s EPSP klassifiziert werden, wobei eines dieser Neurone durch Stimulation von

zwei verschiedenen Nervensträngen aktiviert wurde. Ausgedrückt als prozentuale

Verteilung innerhalb der mit Hexamethonium untersuchten enterischen Ganglien

generierten damit durchschnittlich 3,0 % ± 6,3 % der Neurone (Median: 0%,

Bereich: 0 %-20 %) s EPSP.

Weitere acht Ganglien (n= 7 Gewebe) mit 67 Neuronen wurden mittels

Pulssalve ohne Anwesenheit eines nAChR-Antagonisten stimuliert. Hierbei zeigte

ein Neuron (1,5 %) ein charakteristisches s EPSP. Dies sind bei diesen Messungen,

bezogen auf die prozentuale Verteilung innerhalb der Ganglien, im Schnitt

0,6 % ± 1,8 % Neurone (Bereich: 0 %-5 %). Bei weiteren neun Neuronen (13,4 %)

konnte ebenfalls Aktivität gemessen werden, jedoch traten auch hier vorher

Spontanaktivität oder Aktivitätsentladungen auf Einzelstimulation hin auf.

Ergebnisse 117

4.3.1.3 Vorkommen von nicht experimentell induzierter Aktivität(„Spontanaktivität“) und Eigenschaften dieser Nervenzellen

Insgesamt 56 Ganglien (n= 24 Gewebe) wurden auf das Vorhandensein von

Spontanaktivität überprüft. Als Spontanaktivität wurden optische Signale

klassifiziert, die während der für die Untersuchungen eingeführten ‚Leeraufnahmen‘

auftraten bzw. die während einer Meßperiode vor Stimulationsbeginn registriert

wurden. Bei etwas mehr als der Hälfte der Ganglien (n= 29) konnten während des

Meßzeitraumes keine Hinweise auf Spontanaktivität beobachtet werden,

wohingegen bei 27 Ganglien ein Teil der enterischen Neurone spontan aktiv war. In

der vorliegenden Arbeit ist somit beim Menschen in ungefähr jedem zweiten

enterischen Ganglion spontane Aktivität nachgewiesen worden. Dabei trat diese

Aktivität unabhängig von der Darmregion sowohl im Kolon (n= 20) als auch im

Rektum (n= 7) auf.

Um von spontan aktiven Neuronen die Verteilung innerhalb enterischer

Humanganglien zu erhalten, wurde die Gesamtzahl enterischer Neurone jeweils pro

Ganglion ermittelt und der prozentuale Anteil spontan aktiver Neurone bestimmt.

Entsprechend dieser Fragestellung konnten 51 Ganglien (n= 23 Gewebe,

500 Neurone) von den 56 Ganglien ausgewertet werden. Es befanden sich

durchschnittlich 9,8 ± 5,7 Neuronen (Median: 9; Bereich: 2-21 Neurone) in einem

Ganglion. In den 25 Ganglien (n= 14 Gewebe, 258 Neurone), in denen

Spontanaktivität gemessen wurde, traten im Mittel 41,1 % ± 27,8 % spontan aktive

Neurone pro Ganglion auf (Median: 40 %, Bereich: 4,8 %-100 %). Bezogen auf alle

51 Ganglien konnte damit Spontanaktivität durchschnittlich in 20,1 % ± 28,3 % der

Neurone innerhalb enterischer Ganglien registriert werden (Median: 0 %, Bereich:

0 %-100 %).

Ob ein möglicher Zusammenhang zwischen Gangliongröße und

prozentualem Anteil von Spontanaktivität existiert, wurde mit dem

Rangkorrelationstest nach Spearman getestet. Zwar zeigt sich bei den untersuchten

Ganglien eine Tendenz, daß bei zunehmender Gangliongröße das Vorkommen von

Spontanaktivität abnimmt (Korrelationskoeffizient: -0,5; P-Wert 0,026), allerdings

beruht diese Signifikanz allein auf dem Vorhandensein zweier Ganglien mit sehr


geringer Neuronenzahl (2 und 3 Neurone; s. Abb. 31, Pfeil). Werden diese beiden

Ganglien nicht berücksichtigt, ist die Korrelation statistisch nicht aussagekräftig

(Korrelationskoeffizient: -0,3; P-Wert 0,16).

Bezogen auf die untersuchte Neuronenzahl z

Neuronen 88 Neurone (17,6 %) im Humangewebe spon

lag während einer Aufnahmedauer von 1 bis 3

Entladungsfrequenz bei 4,2 ± 3,1 Hz (Median: 3,2 Hz;

Neurone). Für einige Neurone (n= 46) wurden die

einzelnen Signalen und in einer Klassenbreite von 20

als absolute Häufigkeit für jedes normierte Intervall gra

Die Zeitintervalle zwischen den einzelnen Signalen lag

von 100 bis 200 ms, mit einem Maximum im Zeitinterva

als einem Drittel der Neurone auftrat. Wie die Inter

einzelne Neuron (n= 46) verteilt, ist in Abbildung 33 dar

Gesamtzahl der Neurone pro Ganglion0 5 10 15 20 25

Ant

eil d

er N

euro

ne m

it Sp

onta

nakt

ivitä

t (%

)

0

20

40

60

80

100

Abbildung 31: Vorkommen

von Spontanaktivität innerhalb

enterischer Ganglien des

Menschen. Die prozentuale

Verteilung spontan aktiver

Neurone innerhalb der

Ganglien (n= 25) ist gegen die

Gesamtzahl der Neurone pro

Ganglion aufgetragen. Der

Pfeil markiert diejenigen

Ganglien, aufgrund derer es zu

einer Korrelation zwischen

Gangliongröße und Anteil von

Spontanaktivität kommt.

eigten von insgesamt 500

tane Aktivitätsmuster. Dabei

sec die durchschnittliche

Bereich: 0,8-16,7 Hz; n= 48

Zeitintervalle zwischen den

ms-Intervallen eingeteilt und

phisch dargestellt (Abb. 32).

en am häufigsten im Bereich

ll 120-140 ms, das bei mehr

vallhäufigkeit sich auf jedes

gestellt. Mehr als 70% der

Ergebnisse 119

31

3

4

6

7

8

8

18

15

13

1110

76

2

6 6

32

32 2

5

1 2 1 1 1 1 1 1

4

1

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

05

1015

2025

3035

40

1510

5

0ab

solu

te H

äufig

keit

rela

tive

Häu

figke

it (%

)

klassierte Signaleinzelintervalle (ms)

Abbildung 32: Häufigkeitsverteilung der Signaleinzelintervalle von spontan aktiven

Neuronen (n= 46). Die Zeitabstände zwischen den Signalen wurden auf der

Abszissenachse in Intervallen von 20 ms klassiert. Die Ziffern oberhalb der Säulen

geben die Anzahl der Nervenzellen an, die das entsprechende Intervall belegten, wobei

die Unterteilung innerhalb der Säulen die einfache oder mehrfache Intervallbesetzung

für die jeweiligen Nervenzellen veranschaulicht. Die Verteilung ist eingipflig mit einem

Maximum im Intervall 120-140 ms. Dabei haben 9 Zellen dieses Intervall einfach,

9 mehrfach belegt.


Abbildung 33: Darstellung der Spontanaktivität von 46 Neuronen aus Kolon und

Rektum (a-t‘). Die Einzelintervalle zwischen den spontanen Signalen wurden für jedes

Neuron in einer Klassenbreite von 20 ms gegen die absolute Häufigkeit der

Intervallbesetzung dargestellt. 72 % der spontan aktiven Neurone (n= 33) zeigen

Signalabstände, die unter 200 ms liegen. Bei 20 % (n= 9) liegen die Signalabstände

zwischen 200 ms und 400 ms, 8 % (n= 4) zeigen Signalintervalle größer als 400 ms.

klassierte Signalintervalle (ms)

abso

lute

Häu

figke

it

Ergebnisse 121

Neurone zeigten zwischen einzelnen Signalen Intervalle von unter 200 ms. Neben

den Signalintervallen, also den Zeitabständen zwischen zwei Signalen, wurde

während des Meßzeitraumes von 1,2 bis 3,2 s die durchschnittliche

Entladungsfrequenz für 48 Neurone ermittelt und in 1 Hz-Intervallen klassiert. Dies

ist in Abbildung 34 graphisch dargestellt. Am häufigsten wurde (16-19%) eine

durchschnittliche Signalfrequenz zwischen 1-4 Hz registriert.

Inwieweit die optisch registrierte Spontanaktivität endogenen oder

synaptischen Ursprungs ist, wurde für 44 spontan aktive Neurone ermittelt. Es

zeigte sich, daß sowohl synaptische als auch endogene Mechanismen in

enterischen Humanganglien beteiligt sind. Calcium-depletierte Lösung (n= 10

Neurone getestet) blockierte die Aktivität bei acht spontan aktiven Neuronen.

86

42

0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 170

1510

50

abso

lute

Häu

figke

it

rela

tive

Häu

figke

it (%

)

durchschnittliche Signalfrequenz (Hz)

Abbildung 34: Histogramm zur durchschnittlichen Signalfrequenz spontan aktiver

Humanneurone während eine Aufnahmedauer von 1,2 bis 3,2 s ohne experimentelle

Stimulation. Die Entladungsfrequenz der Neurone (n= 48) wurde auf der

Abszissenachse in einer Klassenbreite von 1 Hz gruppiert. Auf der Ordinatenachse ist

links die absolute Häufigkeit, rechts die relative Häufigkeit in Prozent angegeben.

Etwa 55 % der Nervenzellen (n= 26) zeigen Entladungsfrequenzen von 1-4 Hz.

Rund 70 % der Neurone (n= 33) haben Entladungsfrequenzen bis 5 Hz. 27 % der

Neurone befinden sich in den Intervallen von 5-10 Hz.


Bei zwei Neuronen wurde sie nicht beeinflußt, was bei diesen Nervenzellen auf den

endogenen, nicht-synaptischen Ursprung hinweist. Der nAChR-Antagonist

Hexamethonium blockierte vollständig die Spontanaktivität in 12 von 34

untersuchten Neuronen, was vermuten läßt, daß diese Spontanaktivität durch ACh

Ausschüttung und nachfolgender Aktivierung nikotinerger Rezeptoren erzeugt

worden war. Die Zeitintervalle zwischen einzelnen spontanen Signalen wurden für

Neurone, bei denen die spontane Aktivität nikotinerg vermittelt war, sowie für

Neurone, bei denen Hexamethonium die Aktivität nicht blockierte, in Klassen von

20 ms Breite dargestellt (s. Abb. 35).

Von den verbleibenden 22 Hexamethonium-insensitiven Neuronen wurde der

Anteil synaptisch vermittelter Aktivität nicht weiter abgeklärt. Allerdings wurden zwei

Neurone mit Suramin weiter untersucht (s. Abb. 36). Die Spontanaktivität erwies

sich bei einem Neuron als sensitiv, jedoch konnte nach dem Auswaschen keine

erneute Aktivität reproduziert werden.

Die immunhistochemische Charakterisierung für ChAT, VIP und SP konnte

bei insgesamt 46 Neuronen ermittelt werden (s. Tab. 10). Dabei zeigten 70 %

Immunoreaktivität für ChAT/VIP, 15 % für ChAT/-, 9 % für VIP/- und 7 % für

ChAT/SP. Verglichen mit der Gesamtkodierung zeigte sich bei der

Transmitterkodierung der spontan aktiven Neurone kein signifikanter Unterschied

(P-Wert=0,064).

Bei 84 Neuronen (n= 13 Ganglien), die während Leeraufnahmen keine

spontane Aktivität zeigten, trat reversibel in Gegenwart des nAChR-Antagonisten

Hexamethonium Spontanaktivität bei 7 Neuronen (n= 3 Ganglien) auf, die bei drei

der untersuchten Neuronen auch noch bei Gabe des mAChR-Antagonisten Atropin

fortdauerte. Ein weiteres Neuron zeigte erst in Anwesenheit von Atropin

Spontanaktivität. Bei 93 Neuronen (n= 10 Ganglien) trat während mehrerer

Meßzyklen vor und während der Hexamethoniumgabe keine Spontanaktivität auf.

Ergebnisse 123

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

02

4

11

3

1 1 1 1 1 1

1 2

abso

lute

Häu

figke

it

rela

tive

Häu

figke

it (%

)20

10

klassierte Signalintervalle (ms)

0

02

46

8

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

1 1 1 1 1 1 1 1111

11 222

23

2

3

4

4

4

4

abso

lute

Häu

figke

it

rela

tive

Häu

figke

it (%

)12

108

4klassierte Signalintervalle (ms)

146

20

Abbildung 35: Zwei Häufigkeitsverteilungen von Signaleinzelintervallen bei spontan

aktiven, submukösen Neuronen. Als Klassenbreite wurden 20 ms-Intervalle gebildet.

Die Anzahl der Nervenzellen, die das entsprechende Intervall belegt haben, gibt die

Ziffer oberhalb der jeweiligen Säulen an. Wie häufig von einer Nervenzelle das

Intervall belegt wurde, wird durch die Unterteilung innerhalb einer Säule dargestellt.

Oben Neurone (n= 6), deren Spontanaktivität in Anwesenheit des nAChR-Antago-

nisten Hexamethonium fortdauerte.

Unten Neurone (n= 10) mit nikotinerger Spontanaktivität.


Abbildung 36: Aktivität dreier submuköser Neurone im

Kolon des Menschen. A Alle drei Neurone (a; b; c) zeigten

nach Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs

f EPSP, die durch den nAChR-Antagonisten

Hexamethonium inhibiert werden konnten. B Die ohne

Stimulation („Leeraufnahme“) registrierte Spontanaktivität wurde bei zwei der Neurone

(a; b) nicht blockiert. Bei Neuron c wurde die Aktivität blockiert. In Anwesenheit des

purinergen P2-Antagonisten Suramin trat bei Neuron a keine Aktivität mehr auf, bei

Neuron b konnte weiterhin spontane Aktivität registriert werden. Ein 170 Hz Butterworth-

Tiefpass wurde verwendet. C Das Videobild zeigt die Fluoreszenzaufnahme des Ganglion

mit den entsprechend markierten Nervenzellen. Der untere Nervenstrang des Ganglion

wurde zur Auslösung von f EPSP stimuliert (Pfeil).

Andauernde ”spontane” AktivitätDurch Stimulationausgelöste

f EPSP

20 µm

ab

”Leeraufnahme”

Hexamethonium (200 µM)

+ Suramin (100 µM)

∆ F/

F= 0

,2 %

100 ms

50 ms

a b ba

Hexamethonium (200 µM)

cc

c

A B

Ergebnisse 125

Tabelle 10: Immunhistochemische Dreifachfärbung mit ChAT/VIP/SP für Neurone mit

Spontanaktivität

Registrierte Aktivität Neurochemische Kodierung

Spontan aktive Neurone ChAT/- ChAT/VIP ChAT/ SP VIP/- -/- n= ...

Insgesamt 7(15%)

32(70%)

3(7%)

4(9%)

- n= 46(100%)

nikotinerg 1 3 - - - n= 4

Hexamethonium-insensitiv 3 9 - 2 - n= 13

GESAMTKODIERUNG 110(30%)

203(56%)

20(5%)

23(6%)

9(3%)

365(100%)


4.3.1.4 Vorkommen einer andauernden Stimulus-induziertenAktivitätsentladung, „late onset spike discharge“

Im Verlaufe der Untersuchungen konnte beim Menschen nach elektrischer

Einzelpulsstimulation (1-4 Hz) interganglionärer Nervenstränge wiederholt ein

Aktivitätsmuster beobachtet werden, das als eine andauernde stimulusinduzierte

Aktivitätsentladung, „late onset spike discharge“, in der vorliegenden Arbeit

bezeichnet wird. Dieses Aktivitätsmuster erscheint nach ein- bis zweimaliger

elektrischer Stimulation interganglionärer Nervenstränge als eine ausgeprägte, nach

dem Stimulus mehrere Millisekunden (> 800 ms) fortwährende Entladung von

erregenden Potentialen mit erhöhter Frequenz (14-31 Hz, n= 7 Neurone analysiert).

Im Folgenden soll dieses bisher in den optischen Untersuchungen nur beim

Menschen identifizierte Aktivitätsmuster näher charakterisiert werden.

48 Ganglien (n= 22 Gewebe) wurden analysiert mit durchschnittlich

11,3 ± 6,0 Neuronen (Median: 10; Bereich: 2-25 Neurone). Bei 9 Ganglien (18,8 %)

konnte nach Stimulation von interganglionären Nervensträngen dieses

Aktivitätsmuster registriert werden (n= 6 Gewebe). Diese Aktivitätsentladung trat bei

Ganglien der beiden untersuchten Darmregionen sowohl im Kolon (n= 4 Ganglien,

3 Gewebe) als auch im Rektum (n= 5 Ganglien, 3 Gewebe) auf. In diesen Ganglien

konnte bei 31,7 % ± 22,2 % der Neurone „late onset spike discharge“ ausgelöst

werden (Median: 29,2 %; Bereich: 7,7 % bis 75,0 %). Bezogen auf alle untersuchten

Ganglien zeigten im Mittel 5,1 % ± 14,6 % der enterischen Neurone (Median: 0 %,

Bereich: 0 %-75 %) „late onset spike discharge“.

Insgesamt wurden 67 interganglionäre Nervenstränge - ein bis drei pro

Ganglion - durch wiederholte Gabe von Einzelstrompulsen stimuliert. Von 366 durch

Stimulation aktivierten Neuronen wiesen 7,4 % der Neurone „late onset spike

discharge“ auf, die unabhängig von der Darmlokalisation sowohl bei Neuronen im

Kolon (n= 12 Neurone) als auch im Rektum (n= 15 Neurone) ausgelöst werden

konnte. Um die synaptische Herkunft und eventuell beteiligte Neurotransmitter zu

identifizieren, wurden 21 Neurone näher charakterisiert. Die synaptische Herkunft

dieses Aktivitätsmusters (n= 2 Neurone) konnte nach Perfusion mit

Calcium-depletierter Lösung gezeigt werden.

Ergebnisse 127

In Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium traten bei untersuchten

19 Neuronen die drei folgenden Antworten auf:

Vollständige Blockierung durch Hexamethonium (7 Neurone),

Hexamethonium-sensitiv (2 Neurone),

Hexamethonium-insensitiv (10 Neurone).

Bei 3 der 10 Hexamethonium-insensitiven Neuronen wurde die

pharmakologische Wirkung des mAChR-Antagonisten Atropin auf die vorhandene

„late onset spike discharge“ untersucht. Das Aktivitätsmuster konnte bei den drei

Neuronen durch Atropin vollständig blockiert werden (s. Abb. 37).

AuswaschenAtropin(0,5 µM)

Kontrolle Hexamethonium(200 µM)

∆F/F=0,05%

100 ms

100 ms

∆F/F= 0,05 %

Kontrolle Hexamethonium(200µM)

Auswaschen

Abbildung 37: Stimulusinduzierte Aktivität („late onset spike discharge“) in zwei

verschiedenen submukösen Neuronen enterischer Humanganglien. In Anwesenheit des

nAChR-Antagonisten Hexamethonium wurde die direkte Nervenzellantwort auf die

Stimulation jeweils vollständig blockiert. Oben ist bei dem Neuron ebenfalls die spät

einsetzende Aktivitätsentladung blockiert worden und ist damit nikotinerg vermittelt. Unten

konnte erst mit dem mAChR-Antagonisten Atropin die Aktivität reversibel blockiert

werden, was auf eine Beteiligung muskarinerger Mechanismen hinweist. Die

Meßergebnisse sind mit einem Butterworth-Tiefpass bei 200 Hz gefiltert.


Damit konnte bei 12 der 19 untersuchten Neurone eine Beteiligung

cholinerger Mechanismen an dieser „late onset spike discharge“ beim Menschen

gezeigt werden, d. h. der Neurotransmitter Acetylcholin war entweder über

nikotinerge oder über muskarinerge Mechanismen bei der Generierung involviert.

Für einige Neurone, die dieses Aktivitätsmuster zeigten, wurde die neurochemische

Kodierung für ChAT, Substanz P, und VIP ermittelt (n= 13, s. Tabelle 11). 12

Neurone zeigten Immunoreaktivität für ChAT, 9 Neurone für VIP und eines für SP,

wobei ChAT/VIP (n= 9) und ChAT/SP (n= 1) kolokalisiert waren. Ein weiteres

Neuron war nur für den neuronalen Marker immunoreaktiv. Verglichen mit der

Gesamtkodierung war der Unterschied in der Transmitterkodierung nicht signifikant

(P-Wert=0,49).

Tabelle 11: Pharmakologische und immunhistochemische Charakteristik (ChAT/VIP/SP)

von submukösen Humanneuronen, die eine andauernde stimulusinduzierte

Aktivitätsentladung („late onset spike discharge“) generieren.

Neurochemische KodierungNeuropharmakologischeCharakteristik

ChAT/- ChAT/VIP ChAT/SP VIP/- -/-

2 4 - - 1nikotinerg

(n= 9)

inhibitiv (n= 7)Hexamethonium sensitiv (n= 2) - 2 - - -Cholinerg

(n= 12)muskarinerg

(n= 3)Atropin inhibitiv (n= 3)

- 2 1 - -

(n= 1) Nicht-nikotinerg, n.a. - 1 - - -

Gesamt n= 13 2 9 1 - 1

n.a. = nicht analysiert

Ergebnisse 129

4.3.1.5 Erregungsverteilung innerhalb enterischer Ganglien nachoraler bzw. analer Stimulation interganglionärerNervenstränge

Interganglionäre Nervenstränge, die oral und anal enterischer Ganglien verliefen,

wurden bei 24 Ganglien (n= 11 Gewebe) elektrisch durch Gabe von

Einzelstrompulsen stimuliert. Dadurch sollten erstmals grundlegende Daten über die

Erregungsverteilung innerhalb enterischer Ganglien gewonnen werden. Die Anzahl

aktivierter exzitatorischer Neurone wurde anschließend für jede Stimulationsrichtung

bestimmt, auf die Gesamtzahl der Neurone eines Ganglion bezogen (s. Anhang,

Tab. 19) und miteinander für beide Stimulationsrichtungen verglichen.

Sowohl nach oraler als auch nach analer Stimulation wurden

Neuronenpopulationen aktiviert. Nach oraler Nervenfaserstimulation zeigten

durchschnittlich 62 %, nach analer etwa 57 % der Neurone innerhalb eines

Ganglion erregende Potentiale. Beim Vergleich der beiden Stimulationsrichtungen

ergaben sich hinsichtlich des Prozentsatzes der oral bzw. anal aktivierten Neurone

keine statistisch signifikanten Unterschiede. Ein Vergleich der nach jeweiliger

Stimulation aktivierter Neurone ergab:

• Durchschnittlich wurde etwa die Hälfte der Neurone (45 %) eines enterischen

Ganglion durch Stimulation zweier Nervenstränge, sowohl eines oral als auch

eines anal lokalisierten Nervenstrangs, aktiviert. Dies deutet auf die Existenz von

Konvergenz im ENS hin (Abb. 38; Säule ‚O u. A‘). Dabei wurden signifikant mehr

Neurone projektionsunspezifisch (oral und anal aktiviert) als

projektionsspezifisch (nur oral, nur anal) aktiviert.

• Etwa ein Drittel der Neurone (28 %) zeigte eine Nervenstrang-spezifische

Aktivierung, d.h. die entsprechenden Neurone wurden entweder nur durch

Stimulation des oral oder des anal verlaufenden Nervenstrangs aktiviert

(Abb. 38; Säule ‚O ≠ A‘). Ein Vergleich des prozentualen Anteils der nur durch

orale bzw. nur durch anale Stimulation aktivierten Neurone erwies sich als

statistisch nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 38; Säulen ‚nur oral‘ und

‚nur anal‘).


• Ein Drittel der Neurone (27 %) konnte weder nach Stimulation eines oralen noch

eines analen interganglionären Nervenstrangs aktiviert werden (Abb. 38; Säule

‚nicht aktiv‘).

Abbildung 38: Übersicht über das prozentuale Mittel aktivierter Neurone enterischer

Ganglien nach Stimulation oraler (O) bzw. analer (A) interganglionärer Nervenfasern.

Die prozentualen Angaben sind aus der Summe der untersuchten Ganglien (n= 24)

gebildete Werte. Die Säule O u. A zeigt Neurone, die durch beide

Stimulationsrichtungen projektionsunspezifisch aktiviert wurden, die Säule O ≠≠≠≠ A zeigt

die Nervenstrang-spezifische Aktivierung, aufgeteilt (s. Pfeile) in jeweilige

Stimulationsrichtung (nur oral, nur anal).

Median (%) 66 63 297 850 20

± 23

Erregungsverteilung in enterischen Ganglien

100

%

Mittelwert (%)

Standardabweichung

0

20

40

60

80

0

20

40

60

80

100

57 27

Oral Analnicht

aktiviert

± 30 ± 2816

nur oral

± 2412

nur anal

± 20± 2845

O u. A

28

O ≠ A

± 2662

75%-Perzentil

25%-Perzentil 49 47 50 030 14

84 71 3429 1660 35

Ergebnisse 131

Unter Berücksichtigung der Darmregionen wichen von den Gesamtergebnissen die

für Rektum (8 Ganglien) und Kolon (16 Ganglien) erhaltenen Daten untereinander

nicht signifikant ab. Neuropharmakologisch zeigte sich mit dem

nAChR-Antagonisten Hexamethonium zwischen oral oder anal, also

projektionsspezifisch aktivierten Neuronen sowie projektionsunspezifisch aktivierten

Neuronen, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Vorkommens von

„process potentials“ sowie den synaptisch vermittelten Antworten.

Für die neuropharmakologisch untersuchten Neurone (n= 180 Neurone, 16

Ganglien) wurde die Immunoreaktivität für ChAT, VIP und Substanz P ermittelt. Bei

rund 70 % der Neurone (n= 124) konnten immunhistochemische Daten erfaßt

werden. Dabei wurde unterschieden zwischen Neuronen, die bei beiden

Stimulationen geantwortet haben (n= 104), und Neuronen, die nur nach Stimulation

einer Nervenfaser geantwortet haben (n= 35), sowie den Neuronen, die nicht

aktiviert wurden (n= 37). Ihre neuropharmakologischen Charakteristika sind mit der

Transmitterkodierung in Tabelle 12 ,Tabelle 13 und Tabelle 14 aufgelistet. Bei den

Neuronen, die projektionsspezifisch nur durch anale Stimulation aktiviert worden

waren, zeigten verglichen mit der Aktivierung oral signifikant (P-Wert =0,01) mehr

Neurone mit ChAT/VIP.

Tabelle 12: Neurone, die nach Stimulation eines Nervenstrangs nicht aktiviert wurden, und

ihr neurochemischer Kode

Neurochemische Kodierung

Faserstrangstimulation ChAT/- ChAT/VIP

ChAT/SP VIP /- -/- n= 37

Nicht aktiviert 17(46%)

15(41%)

2(5%)

1(3%)

2(5%)

37(100%)

2(5%)

GESAMTKODIERUNG 110(30%)

203(56%)

20(5%)

23(6%)

9(3%)

365(100%)


Tabelle 13: Neuropharmakologische Charakterisierung und neurochemischer Kode (ChAT,

Substanz P und VIP) der Neurone, die von einem Nervenstrang aktiviert wurden. Die

Prozentangaben wurden zur Veranschaulichung aufgeführt.

NeuropharmakologischeCharakterisierung Neurochemische Kodierung

Faserstrangoral n= 20 ChAT/

-ChAT/

VIPChAT/

SP VIP /- -/- n= 14

nikot. f EPSP 3 1(33%)

2(67%) - - - 3

(100%)

nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität 17 4

(36%)1

(9%)2

(18%)1

(9%)3

(27%)11

(100%)

Faserstranganal n= 15 ChAT/- ChAT/

VIPChAT/

SP VIP /- -/- n= 8

nikot. f EPSP 8 - 6(100%) - - - 6

(100%)

nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität 7 - 2

(100%) - - - 2(100%)

Tabelle 14: Neuropharmakologische Charakterisierung und neurochemischer Kode (ChAT,

Substanz P und VIP) der Neurone, die von zwei Nervensträngen aktiviert wurden. Die

Prozentangaben wurden zur Veranschaulichung aufgeführt.

NeuropharmakologischeCharakterisierung Neurochemische Kodierung

Faserstrangoral

Faserstranganal n= 104 ChAT/

-ChAT/

VIPChAT/

SPVIP/

- -/- n= 65

nikot. f EPSP nikot. f EPSP 23 1(8%)

11(84%)

1(8%) - - 13

(100%)

nikot. f EPSP nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität 14 3

(50%)3

(50%) - - - 6(100%)

nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität nikot. f EPSP 27 7

(37%)8

(42%) - 1(5%)

3(16%)

19(100%)

nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität

nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität 35 7

(29%)15

(63%) - 1(4%)

1(8%)

24(100%)

nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität

nikot. f EPSP +syn. Input +

Fortsatzaktivität5 - 2 - 1 - 3

Ergebnisse 133

4.3.1.6 Aktivität von interganglionären Nervensträngen

Aktivität von interganglionären Nervensträngen konnte beim Menschen nur

vereinzelt gemessen werden. Interganglionäre Nervenstränge wurden zum einen

bei der lokalen Färbung je nach Ausdehnung des Ganglion nicht immer ausreichend

mit Farbstoff beladen, zum anderen befanden sie sich meist nicht auf derselben

Fokusebene wie das entsprechende Ganglion und konnten bei der optischen

Messung damit nicht gleichzeitig erfaßt werden. Die in einigen Fällen gemessene

Aktivität elektrisch stimulierter interganglionärer Nervenfasern bestand aus der

Summe von Einzelfasersignalen. Für sechs Ganglien konnte die

Ausbreitungsgeschwindigkeit der Aktionspotentiale entlang der Nervenstränge mit

0,34 ± 0,11 m/s berechnet werden (Bereich: 0,20-0,48 m/s). Die Dauer der

gemessenen Aktionspotentiale lag bei 5,2 ± 1,3 ms (n= 82 Signale analysiert).

4.3.1.7 S/N-Verhältnis, relative Änderung der Fluoreszenz,durchschnittliche Belichtungszeit und Reproduzierbarkeit

Das ‚peak-to-peak‘ S/N-Verhältnis lag beim Humangewebe für Aktionspotentiale bei

24 % ± 8 % der Signalamplitude (Bereich 12%-45 %, n= 40 Ganglien analysiert).

Die relative Änderung der Fluoreszenz (∆F/F) betrug bei submukösen

Humanganglien durchschnittlich -0,38 % ± 0,20 % (Bereich von -0,11 % bis -1,53 %;

n= 40 Ganglien analysiert). Das Verhältnis zwischen Aktionspotentialen zu f EPSP

betrug etwa 2:1. Die Belichtungsdauer pro Ganglion lag im Durchschnitt bei 35,1 ±

17,2 s mit bis zu 80 s Gesamtbelichtungszeit. Die Dauer der optischen Experimente

betrug pro Ganglion durchschnittlich 105 ± 53 min (n= 65 Ganglien analysiert) mit

einer Maximaldauer von bis zu 5 Stunden. Während dieses Zeitraumes konnten

wiederholt Messungen durchgeführt werden. Nach Stimulation konnte

Nervenzellaktivität bei einer Belichtungsdauer von 9 s bis zu viermal hintereinander,

bei 3,1 s mehr als zehnmal hintereinander wiederholt registriert werden.

Einen zusammenfassenden Überblick über die im Humandarm mit der

MSORT registrierten Aktivität gibt Abbildung 39 wieder.


Abbildung 39: Übersicht über die mit der MSORT am Humandarm gemessene Nervenzell-

erregung. Die optisch registrierten erregenden Potentiale (f EPSP, „process potential“, Spon-

tanaktivität, „late onset spike discharge“, s EPSP) sind exemplarisch mit der entsprechenden

prozentualen Verteilung angegeben, z. B. waren 95 % der f EPSP rein nikotinerg vermittelt,

bei 5 % existierte zusätzlich eine weitere Komponente, bei der purinerge Mechanismen be-

teiligt waren. Die projektionsspezifische und -unspezifische Erregungsausbreitung ist anhand

fehlfarbenkodierter Bilder dargestellt. Rot kodiert die Maximumamplitude eines erregenden

Potentials. Die Zeitpunkte der elektrischen Stimulation von interganglionären Nerven-

strängen sind jeweils durch Pfeile (Einzelstimuli; rot) und Balken (Pulssalven; rot) markiert.

Projektionsspezifischeund projektions-unspezifischeErregungsausbreitung

∆F/F

= 0,

1 %

f EPSP

nikotinerg > 96%purinerg

Nervenzellfortsatzerregung”process potentials”in jedem Ganglion

20 ms

40 ms

Spontanaktivitätca. 18 %

100 ms

s EPSPca. 2 %

20 Hz 1000 ms

”late onset spike discharge”ca. 7 %

∆F/F= 0,1%

100 ms

∆F/F= 0,2%

0ms

6.1

12.2

18.3

0ms

6.1

12.2

18.3

∆F/F

= 0,

1 %

∆F/F

= 0,

1 %

Ergebnisse 135

4.3.2 Optische Registrierung von Nervenzellaktivität im Plexussubmucosus der Maus

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 161718 1920 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3435363738 39T 1 2 3 4 5 6 7 891011121314

Im Plexus submucosus der Maus konnten bei insgesamt 23 Ganglien (acht Tiere)

mit über 122 Neuronen Nervenzellantworten optisch untersucht werden.

Applikation von 0,5 mM ACh auf murine enterische Ganglien (n= 21, sieben

Tiere) führte zu einer Entladung von Aktionspotentialsalven (Abb. 40, 41). Bei

ACh-Applikation mit einer Dauer von 200-500 ms lag die Frequenz der induzierten

Aktionspotentialentladungen im Bereich von 5,0 bis 51,5 Hz. Die ACh-Wirkung hielt

abhängig von der Dauer des Meßzeitraums bis zu 2,7 s an. Sowohl Dauer als auch

Frequenz der Aktionspotentialentladung erwiesen sich Dosis-korreliert, d. h. eine

ansteigende Dauer der ACh-Applikation führte sowohl zu einer Erhöhung der

Frequenz als auch zur Erhöhung der Anzahl ausgelöster Aktionspotentiale in den

Neuronen (s. Abb. 42). Die Dauer der ausgelösten Aktionspotentiale lag bei

5,7 ± 1,6 ms (n= 50).

Bei 41 Neuronen (n= 10 Ganglien, drei Tiere) wurde die Neuropharmakologie

der ACh-Antwort untersucht (Abb. 17, Abb. 41). Der nAChR-Antagonist

Mecamylamin (200 µM) blockierte die Aktionspotentialentladung in 39 der 41 mit

100 ms 50 ms 20 msACh

500 ms

∆F/F=0,08 %

10 ms

Abbildung 40: Optische Registrierung der Acetylcholin-Antwort eines submukösen Neuron

der Maus. Die Applikation von ACh (0,5 mM; Pfeil) induziert Aktionspotentialentladun-

gen, die abhängig von der Dauer der ACh-Gabe ansteigen. Bei der Applikationsdauer von

10 ms, 20 ms, 50 ms und 100 ms wurden 1, 3, 10, und 17 Aktionspotentiale während des

Meßzeitraumes von 3,1 s ausgelöst. Die optischen Daten wurden mit einem Butterworth-

Tiefpass bei 170 Hz gefiltert.


ACh stimulierten Neurone (95,1 %), was auf eine nikotinerg vermittelte

ACh-Wirkung schließen ließ (s. auch Abb. 17, S. 95). Bei zwei der 41 untersuchten

Neurone (4,9 %) trat eine Mecamylamin-sensitive Antwort auf, die mit einer

reversiblen Senkung der Entladungsfrequenz von 40 Hz auf 8 Hz bzw. von 51,5 Hz

auf 3 Hz verbunden war und somit eine ebenfalls nikotinerg vermittelte

ACh-Wirkung aufzeigte (s. Abb. 41). Die verbleibende nicht-nikotinerge Antwort ist

sehr wahrscheinlich durch muskarinerge Rezeptoren vermittelt.

500 ms

Kontrolle Mecamylamin(200 µM)

Auswaschen10 min

∆F/F=0,05%

ACh ACh ACh1 s 1 s 1 s

Abbildung 41: Optische Aktivität eines murinen submukösen Neuron nach Spritz-

applikation Acetylcholin (0,5 mM; 1 s; Pfeil). In Anwesenheit des nAChR-Antagonisten

Mecamylamin senkte sich bei diesem Neuron die Frequenz der Aktionspotentialentladung

von 40 Hz auf 8 Hz. Nach Auswaschen des nAChR-Antagonisten konnte auf

ACh-Applikation die vorherige Zellantwort wieder ausgelöst werden.

Die Nervenzellzahl konnte bei 12 Ganglien (sechs Tiere), die mit

Di-8-ANEPPS gefärbt worden waren, ermittelt werden. Im Mittel befanden sich 5,2 ±

2,6 Neurone in einem Ganglion (Bereich: 2-10 Neurone, Median: 5). Bei Applikation

von ACh auf die murinen submukösen Ganglien haben durchschnittlich 87,8 % ±

17,8 % (Bereich: 40-100 %, Median: 95 %) der Neurone innerhalb eines Ganglion

auf ACh-Stimulation geantwortet (s. Tab. 15). Bezogen auf die

Ergebnisse 137

Gesamtneuronenzahl haben von 62 Nervenzellen 54 (87 %) auf Gabe von ACh

reagiert. 13 % der Neurone zeigten keine Antwort.

Etwa 2 % (n= 2) der murinen submukösen Neurone zeigten während des

Meßzeitraumes von zwei bis sechs Sekunden spontane Aktivität.

Durch elektrische Stimulation interganglionärer Nervenfasern konnte bei der

Maus Aktivität in Form von f EPSP und s EPSP induziert werden. Dies war

allerdings bei den wenigsten Ganglien (< 15 %, n= 3 Ganglien) möglich, da

interganglionäre Nervenstränge nur schwierig zu identifizieren waren. Abbildung 43

zeigt ein submuköses Ganglion, dessen interganglionärer Nervenstrang stimuliert

wurde. Während einer Pulssalve wurden alle Neurone innerhalb des Ganglion

aktiviert. Einige Neurone (s. Abb. 43 c, d) zeigten nach Ende der Stimulation eine

andauernde Aktionspotentialentladung, die auf das Vorhandensein von s EPSP

hindeutet.

Tabelle 15: Übersicht über den prozentualen Anteil von durch Acetylcholin aktiven

Neuronen innerhalb muriner submuköser Ganglien.

Nr. Neurone proGanglion

Antwortauf ACh

Anteilin %

M 1 4 3 75M 1 5 2 40M 1 7 7 100M 1 5 4 80M 2 5 4 80M 2 2 2 100M 3 8 7 88M 3 3 3 100M 3 2 2 100M 5 10 9 90M 6 8 8 100M 7 3 3 100

∑ 62 54 -Median 5 3,5 95

Mittelwert ±Standardabweichung

5,2 ± 2,6 4,5 ± 2,5 87,8 ± 17,8


4.3.2.1 Reproduzierbarkeit und S/N-Verhältnis

Die durch ACh-Applikation induzierten Membranpotentialänderungen konnten bei

einer Aufnahmedauer von 3,1 s mindestens achtmal innerhalb eines

Meßzeitraumes von 30 Minuten wiederholt werden. Nach elektrischer Stimulation

interganglionärer Nervenstränge zeigten die optisch gemessenen f EPSP während

eines Meßzeitraumes von etwa 80 Minuten mit durchschnittlich 13 Aufnahmen von

je 2,8 s Dauer eine reproduzierbare Signalcharakteristik.

Das ‚peak-to-peak‘ S/N-Verhältnis lag für die Aktionspotentiale der Maus bei

33 % ± 5 % der Amplitude der Aktionspotentiale (Bereich: 28 %-47 %, n= 15). Mit

einem 200 Hz Butterworth-Tiefpass betrug die relative Fluoreszenzänderung (∆F/F)

von Aktionspotentialen -0,29 % ± 0,15 %(Bereich: -0,11 % bis -0,63 %, n= 15)

Abbildung 42: Dosis-korrelierte

Entladung von Aktionspotentialen

von vier murinen submukösen

Neuronen ( , , , ) nach Gabe von

0,5 mM Acetylcholin in ansteigender

Dauer der Spritzapplikation. Auf der

Ordinate ist die Aktionspotential-

frequenz in Hz angegeben.

Dauer der ACh- Applikation (ms)

AP-

Fre

quen

z (H

z)

14

12

10

8

6

4

300200100

2

0

0

Ergebnisse 139

A

25 µm

dc

b

a

B

a

C

b d

c

20 ms

1 s∆F/F=0,2%

∆F/F=0,15%

Abbildung 43: Darstellung optischer Aktivität in einem murinen submukösen Ganglion

nach elektrischer Stimulation eines interganglionären Nervenstranges mittels Pulssalve.

A Videobild des Ganglion gefärbt mit Di-8-ANEPPS. Zellgrenzen und Ganglionumrisse

sind zu erkennen. B Ganglion wurde auf das Photodioden-Array projiziert, um die mit den

Neuronen korrespondierenden Photodioden zu identifizieren. C sind optische Signale von

vier Dioden nach elektrischer Stimulation (20 Pulse, 20 Hz, 400 µs Pulsdauer, 1 s ).

a zeigt die Aktivität gemessen auf einem interganglionären Nervenstrang. b ist die Aktivität

eines Neuron, in dem durch die Stimulation f EPSP ausgelöst wurden. c und d sind optische

Signale zweier Neurone, die nach Ende der Pulssalve eine s EPSP ähnliche Aktivität zeigen.

Bei d sind außerdem zwei Signale mit expandierter Zeitachse darstellt. Das linke Signal

zeigt ein f EPSP induziertes Aktionspotential mit ausgeprägter Schulter, die bei der

Entladung von Aktionspotentialen im Zuge des s EPSP fehlt. Die optischen Signale wurden

mit 170 Hz Tief- und mit 7,7 Hz Hochpass gefiltert.

140

5 DiskussionZiel dieser Arbeit war es, die „Multi-Site Optical Recording Technique“, MSORT, am

enterischen Nervensystem (ENS) des Dickdarms von Meerschweinchen, Maus und

vom Menschen zu etablieren, um Nervenzellaktivität von einer Vielzahl enterischer

Neurone auf Einzelzellebene simultan zu erfassen. Diese drei Spezies wurden

gewählt, weil das Meerschweinchen etabliertes Modelltier in der

Neurogastroenterologie ist und die Maus durch die Möglichkeit von „knock-out“

Tieren für zukünftige Fragestellungen im ENS an Bedeutung gewinnt. Die

Verfügbarkeit von Humandarm erlaubte auch im Hinblick auf gastrointestinale

Erkrankungen, die MSORT erstmals auch am Menschen zu etablieren, um

physiologische Mechanismen am Darmnervensystem zu charakterisieren. Ziel war

es, diese Untersuchungen an frischem, nicht enzymatisch behandelten Gewebe

durchzuführen. Für die Untersuchungen mit der MSORT wurden die

spannungssensitiven Farbstoffe Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ

aus der Klasse der Naphthylstyrylfarbstoffe gewählt und auf ihre Anwendbarkeit am

ENS getestet. Die jeweiligen Gewebe waren für die Messungen so mit einem

spannungssensitiven Farbstoff zu beladen, daß optisch gemessene Signale

reproduzierbar detektiert werden konnten. Die erhaltenen Signale sollten dann

weitgehend charakterisiert und das Potential dieser Methode ermittelt werden.

Darüber hinaus sollte eine Kombination der MSORT mit immunhistochemischen

Techniken überprüft werden. Zum Schwerpunkt der Arbeit wurde bei den

neuropharmakologischen Studien hauptsächlich das Humangewebe, da es trotz der

klinischen Relevanz an Kenntnissen über grundlegende elektrophysiologische

Eigenschaften des humanen ENS mangelt und da sich hier durch die optimale

Eignung der getesteten spannungssensitiven Farbstoffe eine effektive

Versuchsdurchführung ergab. Die Färbecharakteristika der verschiedenen Gewebe,

die Vorteile und Limitationen der optischen Methode sowie die Ergebnisse der

neuropharmakologischen Studien sind zu diskutieren. Abschließend erfolgt ein

Ausblick über zukünftige Anwendungsmöglichkeiten der MSORT am ENS.

Einsatz der spannungssensitiven Farbstoffe im ENS 141

5.1 Einsatz der spannungssensitiven Farbstoffe Di-8-ANEPPS,Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ im enterischenNervensystem

Entscheidender Schritt für die Durchführung und Anwendung der MSORT am

enterischen Nervensystem ist die Integration eines potentiometrischen

Fluoreszenzfarbstoffs in die Nervenzellmembran. Intramembranal gelegene

spannungssensitive Farbstoffmoleküle detektieren Spannungstransienten, indem

sich die spektralen Farbstoffeigenschaften ändern. Dies erfordert prinzipiell eine

hohe Sensitivität, ausreichende Fluoreszenzintensität und eine gleichzeitig geringe

Phototoxizität der gewählten Farbstoffe, um elektrische Potentialdifferenzen als

optisches Signal vom störenden Meßrauschen abheben und erfassen zu können.

Neben diesen Farbstoffeigenschaften ist die Einlagerung in nicht-neuronales

Gewebe ein weiteres wesentliches Kriterium, um Membranpotentialänderungen mit

einem ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis detektieren zu können. Zum

nicht-neuronalen Gewebe gehören Muskelfasern, Bindegewebszellen,

Fettgewebszellen sowie Blutgefäße. Die Verankerung der Farbstoffmoleküle in

nicht-neuronale Membranen führt durch eine hohe Hintergrundfärbung zu einer

Verschlechterung der Signaldetektion. Die Eignung des spannungssensitiven

Farbstoffes war somit bei optischen Untersuchungen der zentrale Faktor, da mit ihm

- unabhängig von der apparativen Ausstattung - die Versuchsdurchführung steht

oder fällt. Da das membranphysiologische und membranspezifische Verhalten der

potentialsensitiven Farbstoffklassen weitgehend unerforscht ist, war eine

Vorhersage, ob sich ein Farbstoff für Untersuchungen eignet, nicht möglich. In

dieser Arbeit wurden spannungssensitive Farbstoffe erstmals am ENS des

Menschen und der Maus angewendet.

OBAID und Mitarbeiter verwendeten beim Meerschweinchen am Plexus

submucosus des Ileum vor der Gewebefärbung mit dem Farbstoff Di-8-ANEPPS ein

enzymatisches Protokoll, um durch Reduktion von nicht-neuronalem Gewebe, wie

beispielsweise Bindegewebe und Muskulatur, die Signalamplitude zu maximieren

(OBAID et al. 1992; OBAID et al. 1999). In den eigenen Untersuchungen konnte ein

Protokoll entwickelt werden, durch das optische Messungen am Plexus

142 Diskussion

submucosus im Kolon des Meerschweinchens sowie erstmals auch bei der Maus

möglich wurden, jedoch erwies sich der Andaugrad des Gewebes als nicht

reproduzierbar.

Am frischen Gewebe zeigten sich nach Inkubation mit Di-8-ANEPPS

unterschiedliche Färbecharakteristika für Maus, Meerschweinchen sowie für den

Menschen, die zu einer unterschiedlichen Eignung dieses Farbstoffes führten und

die die optische Registrierung im ENS der jeweiligen Spezies entweder

verhinderten, erschwerten oder, wie im Falle der Untersuchungen des Menschen,

eine effektive Versuchsdurchführung erlaubten. Zudem konnte gezeigt werden, daß

eine Anwendbarkeit des Farbstoffes am Plexus submucosus nicht gleichzeitig eine

Anwendbarkeit auch auf den myenterischen Plexus miteinschloß.

Ursachen der unterschiedlichen spezies- und plexusspezifischen

Gewebefärbung bei Maus, Meerschweinchen und beim Menschen sind

hauptsächlich im Zusammenhang mit dem Anteil nicht-neuronalen Gewebes zu

sehen, wodurch die Penetration der Farbstoffmoleküle zum Zielgewebe erschwert

wurde oder die Bindung des Farbstoffes an nicht-neuronales Gewebe zu einer

erhöhten Hintergrundfärbung führte. Inwieweit eine Verschiebung der

Farbstoffspektra, wie sie für die Farbstoffklasse der Merocyanine zwischen

Invertebraten und Vertebraten beschrieben wurde (ROSS u. REICHARDT 1979),

bei den eigenen Untersuchungen mit Styrylfarbstoffen möglich erscheint, ist fraglich.

Optische Signale konnten bei der Maus mit Di-8-ANEPPS an enzymatisch

behandelten Ganglien abgeleitet werden. Dies deutet darauf hin, daß eine

verminderte oder ausbleibende Signaldetektion bei frischem Gewebe primär auf

dem Vorhandensein und einer unterschiedlichen Zusammensetzung und Dichtigkeit

des nicht-neuronalen Gewebes beruht und nicht von einer Änderung der spektralen

Farbstoffeigenschaften abhängt. Daß die Färbung und Färbequalität in gewissem

Umfang auch durch die Art der Farbstoffapplikation beeinflußt werden konnte,

wurde durch die in dieser Arbeit entwickelte lokale Applikation einer konzentrierten

Farbstofflösung gezeigt. Bei der Maus wurde dadurch eine optische Ableitung an

frischem Gewebe überhaupt erst ermöglicht. Die mit lokaler hochkonzentrierter

Farbstoffapplikation gleichzeitig verbundene hohe Lösungsmittelkonzentration von


DMSO, die möglichst nicht über 0,1 % liegen sollte (SCHEMANN, persönliche

Mitteilung), schien offensichtlich aufgrund der kurzen Inkubationszeit das

Nervengewebe nicht zu beeinflussen, was in Kombination mit intrazellulärer

Ableitung bestätigt werden konnte (NEUNLIST et al. 1999b).

Die Färbecharakteristik mit den eingesetzten spannungssensitiven

Farbstoffen kann zusammengefaßt wie folgt bewertet werden: Es konnte gezeigt

werden, daß Di-8-ANEPPS für Studien am Plexus submucosus im Kolon und

Rektum des Menschen ein Farbstoff ist, der eine optimale Eignung für optische

Messungen besitzt, da neben einer reproduzierbar guten Anfärbung des neuronalen

Zielgewebes, schon in der Vitalfärbung ein Erkennen der Nervenzellumrisse

ermöglicht wurde. Dadurch steigerte sich die Effektivität der Versuchsdurchführung.

Beim Meerschweinchen wurde die Effektivität der Untersuchungen deswegen

eingeschränkt, weil die fluoreszenzoptische Identifizierung einzelner Nervenzellen

beim frischen, nicht-enzymatisch behandelten Gewebe erschwert war. Es wäre

wünschenswert, einen Farbstoff zu finden, der dies auch hier ermöglicht.

Bei der Maus war Di-8-ANEPPS am frischen submukösen Gewebe selbst bei

lokaler Färbung nicht ausreichend, da Ganglien nur vereinzelt anzufärben waren.

Eine enzymatische Vorbehandlung des Gewebes ist bei der Anwendung von

Di-8-ANEPPS generell empfehlenswert, um eine befriedigende Erfolgsquote bei der

optischen Registrierung zu erhalten. Es bleibt weiteren Untersuchungen

vorbehalten, für frisch präpariertes murines Gewebe (Plexus submucosus, Plexus

myentericus) andere potentiometrische Chromophore auf ihre Eignung zu testen.

Das Derivat Di-4-ANEPPS eignete sich nicht für die Anwendung am ENS des Kolon

von Maus und Meerschweinchen, und das extrazellulär applizierte Di-8-ANEPPQ

bot keine verbesserte Färbung verglichen mit Di-8-ANEPPS.

Die eigenen Untersuchungen unterschieden sich in einigen wesentlichen Punkten

von den Untersuchungen von OBAID und Mitarbeitern. Das von OBAID et al. (1992)

verwendete Färbeprotokoll für Di-8-ANEPPS gewährleistete in der vorliegenden

Arbeit trotz kurzer Belichtungszeiten von 1-3 s nicht die mehrmalige

Reproduzierbarkeit der optischen Signalantwort. Das Ausbleiben der Signalantwort

144 Diskussion

nach kurzer Belichtung und die Veränderung der Signalcharakteristik durch die

Verbreiterung der Signaldauer und die rapide Abnahme der Amplitude deuteten auf

phototoxische Schäden hin. Phototoxizität entsteht durch reaktiven

Singulett-Sauerstoff, der durch Farbstoffmoleküle im Anregungszustand

hervorgerufen wird (KALYANARAMAN et al. 1987; POOLER 1972; POOLER u.

VALENZENO 1979). Eine 90%ige Reduzierung der Farbstoffkonzentration führte in

der vorliegenden Arbeit bei der systemischen Färbung zu einer verlängerten

Gesamtbelichtungsdauer ohne Veränderung der Signalcharakteristik. Durch die

Senkung der Farbstoffkonzentration konnte die Radikalbildung von singulärem

Sauerstoff vermutlich reduziert werden. Dabei schienen sich lange

Belichtungspausen und möglichst kurze Belichtungszeiten (im Bereich von 1-2 s)

als positiv auf die Gesamtbelichtungszeit auszuwirken. Die trotz hoher

Farbstoffkonzentration von OBAID und Mitarbeitern erzielten Belichtungszeiten von

1minütiger (OBAID et al. 1992) bzw. 5minütiger (OBAID et al. 1999) Dauer wurden

vermutlich durch den Einsatz von Antioxidantien und Radikalfängern zur

Phototoxizitätssenkung ermöglicht, wobei eine wiederholte Belichtung jedoch nicht

realisierbar war. Antioxidantien und Radikalfänger wurden bei den eigenen

Untersuchungen nicht verwendet, da weder die Eigenwirkung dieser Substanzen

bekannt ist, noch Konzentrationsangaben existieren, die eine Beeinflussung

neuronaler Strukturen ausschließen lassen. Kritisch ist ebenfalls die von OBAID und

Mitarbeitern vorgenommene Senkung der Sauerstoffspannung im Perfusionsbad

zur Reduzierung der Phototoxizität (OBAID et al. 1992; OBAID et al. 1999), da

gerade für Nervengewebe die Sauerstoffversorgung essentiell ist. Zwar wurde

gleichzeitig die Stoffwechselaktivität durch Senkung der Versuchstemperatur von

37 °C auf Raumtemperatur verringert, allerdings führen Untersuchungen bei

Raumtemperatur zu einer Veränderung der Signale, indem sich beispielsweise die

Dauer verlängert. In den eigenen Untersuchungen konnte durch die vorgenommene

90%ige Senkung der Farbstoffkonzentration auf die Reduzierung der

Sauerstoffspannung und der Versuchstemperatur verzichtet werden. Zudem muß

bei der von OBAID et al. (1992, 1999) verwendeten enzymatischen Andauung des

Plexus submucosus die Frage nach der Vitalität des Gewebes gestellt werden.


Durch eine verbesserte Art der Farbstoffapplikation, d.h. durch die lokale Färbung

einzelner Ganglien, konnte im Rahmen dieser Arbeit auf eine enzymatische

Vorbehandlung verzichtet werden, so daß der Einsatz von frischem Gewebe

erstmals möglich wurde. In der vorliegenden Arbeit führten somit mehrere

entscheidende Modifikationen zu einer verbesserten optischen Registrierung, die

näher an den physiologischen Bedingungen liegt, als das von OBAID et al. (1992)

beschriebene Protokoll.

5.2 Vorteile und Limitationen der MSORT

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß mit der MSORT

eine große Anzahl enterischer Neurone simultan untersucht und auf Einzelzellebene

analysiert werden kann. Damit ist es möglich, innerhalb kurzer Zeit eine Vielzahl

enterischer Neurone unabhängig von ihrer Zellgröße zu untersuchen und die

interneuronale Kommunikation zu analysieren, wobei zugleich die zeitliche und

räumliche Erregungsausbreitung nicht nur innerhalb eines Ganglion, sondern auch

entlang interganglionärer Nervenstränge festgehalten werden kann. Im Vergleich zu

intrazellulären Ableitungen handelt es sich bei der optischen Technik um eine

nicht-invasive Methode, da ein Anstechen der Nervenzellen zur

Membranpotentialmessung nicht erforderlich ist.

Die in der vorliegenden Arbeit erfolgte Charakterisierung der optischen

Signale anhand neuropharmakologischer Untersuchungen mit spezifischen

Antagonisten und anhand der verschiedenen Signaleigenschaften zeigte, daß eine

weitgehende Übereinstimmung mit Daten elektrophysiologischer Techniken

existierte. Der direkte Vergleich zwischen optisch registrierten Signalen und

intrazellulärer Ableitung wurde durch den kombinierten Einsatz beider Techniken im

ENS des Meerschweinchens untersucht (NEUNLIST et al. 1999b). Wir konnten die

intrazellulär gemessenen Signale wie f EPSP und s EPSP gleichzeitig in den

optischen Messungen registrieren, wobei langsame Depolarisation des s EPSP

aufgrund der AC-Kopplung des Systems nicht gemessen werden konnten.

Hingegen wurden die infolge depolarisierender intrazellulärer Pulse ausgelösten

146 Diskussion

Aktionspotentiale ebenso, wie die durch das s EPSP generierten Aktionspotentiale

registriert. Hinsichtlich der Signalform fiel bei den optisch abgeleiteten f EPSP und

auch bei den Aktionspotentialen ein schnellerer Zeitverlauf auf: „fast-response

probes“ sind in der Lage, Membranpotentialänderungen besser als Mikroelektroden

darzustellen (MULLER et al. 1986).

Trotz der weitgehend übereinstimmenden Daten erfordert die optische

Messung neuronaler Spannungstransienten verglichen mit konventionellen

elektrophysiologischen Techniken ein Umdenken hinsichtlich der

Versuchsdurchführung und der Interpretation der Ergebnisse. Hierfür sind folgende

Faktoren wesentlich:

• Direkte Manipulationen des Membranpotentials über Applikation intrazellulärer

Strompulse sind durch den alleinigen Einsatz der optischen Methode nicht

möglich. So können mit der MSORT beispielsweise antidrome von orthodromen

Potentialen nicht - wie in der intrazellulären Ableitung durch Klemmen der

Membranspannung - differenziert werden. Allein anhand der Signalmorphologie

kann keine Unterscheidung getroffen werden, da es sich richtungsunabhängig

jeweils um Aktionspotentiale handelt.

Eine Abgrenzung zum f EPSP kann jedoch über neuropharmakologische

Ansätze erfolgen.

• Im Verlaufe der eigenen Untersuchungen zeigte sich jedoch, daß der Einsatz

von Calcium-depletierter Lösung oder Cobald-/Cadmiumchlorid-Lösung zur

Unterscheidung synaptischer oder antidromer Potentiale nur mit Einschränkung

bei optischen Messungen verwendet werden kann. Die auftretenden Probleme

waren gekennzeichnet durch einen rapiden Abfall der Amplitude und die

Verbreiterung der Signaldauer. Ursächlich könnten phototoxische Effekte,

Veränderungen der Farbstoffmoleküle oder Änderungen in der Membranfluidität

bzw. -stabilität zugrunde liegen. Bisher liegen für ‚fast-response probes‘

allerdings keinerlei Literaturdaten vor, die dieses Phänomen erklären könnten.

Für die Anwendung von ‚slow-response probes‘ ist die Möglichkeit zur Bildung

nichtfluoreszierender Komplexe mit verschiedenen Pharmaka (z. B. Phloretin,

Vorteile und Limitationen der MSORT 147

Dinitrophenol, Antimycin A) beschrieben (WAGGONER 1979). Da jedoch bei

dieser Farbstoffklasse generell andere Membraninteraktionen und

Funktionsmechanismen vorliegen, ist ein Vergleich mit ‚fast-response probes‘

nicht möglich. In Kombination mit intrazellulären Ableitungen konnten bei

Di-8-ANEPPS gefärbten Geweben Hinweise gefunden werden, daß in

Anwesenheit der Cobald/Cadmium-Lösung keine Nervenzellerregung mehr

durch intrazelluläre Pulse ausgelöst werden konnte (KAMM, unveröffentlichte

Ergebnisse), was auf eine irreversible Schädigung der Nervenzelle hindeutet.

• Die gängigen elektrophysiologischen Klassifikationsschemata intrazellulärer

Ableitungen und Unterscheidung in AH- und S-Neurone können bisher direkt

nicht vorgenommen werden. Die für AH-Neurone typische

Nachhyperpolarisation des Aktionspotentials sowie die Calcium-bedingte

‚Schulter‘ in der Repolarisationsphase, die eine verlängerte

Aktionspotentialdauer im Vergleich zu S-Neuronen bedingt, können in der

verwendeten Systemkonfiguration anhand des Signalverlaufes nicht identifiziert

werden. Ein direkter Vergleich von elektrophysiologischen Daten und optisch

gewonnenen Daten ist deshalb nur in beschränktem Umfang möglich. Eine

neuropharmakologische Unterscheidung könnte jedoch durch den Einsatz von

TTX getroffen werden, da Aktionspotentiale von AH-Neuronen im Gegensatz zu

S-Neuronen nur geringe TTX-Sensitivität aufweisen (HIRST et al. 1974; HIRST

et al. 1985). Inwieweit das Signal-Rausch-Verhältnis für eine sichere

Identifizierung ausreicht, müßte in Kombination mit intrazellulären Ableitungen

untersucht werden.

• Mit der in dieser Studie verwendeten Systemkonfiguration (relative Fluoreszenz-

änderung, AC-Kopplung) konnten quantitative Messungen der Änderungen des

Membranpotentials sowie die Messung langsamer Depolarisationen oder

Hyperpolarisation nicht bestimmt werden. Die Identifizierung von s EPSP und

s IPSP ist damit nur mit Einschränkung oder indirekt möglich. Für die

Identifizierung von s EPSP ist die gleichzeitige neuropharmakologische

Untersuchung mit nAChR-Antagonisten notwendig, um eine sichere Abgrenzung

148 Diskussion

zu f EPSP zu erhalten. IPSP können nur dann identifiziert werden, wenn eine

zuvor beobachtete Erregung nicht mehr induziert werden kann oder reduziert ist.

• Die kontinuierliche Ableitung von Nervenzellaktivität über mehrere Minuten bis

Stunden ist aufgrund der Phototoxizität der Farbstoffe limitiert. Um

photodynamische Schäden zu reduzieren und einen längeren Meßzeitraum zu

ermöglichen, werden bei optischen Messungen Antioxidantien und

Radikalfänger eingesetzt (OBAID et al. 1992; OBAID et al. 1999; SCHAFFER et

al. 1994). Kontinuierliche Aufnahmen von 5 min werden beschrieben,

wiederholte Messungen sind aber dennoch nicht möglich (OBAID et al. 1999).

Bei den optischen Messungen handelt es sich, verglichen mit intrazellulären

Techniken, die 30 min bis zu 6 Stunden permanent ableiten können, um

Momentaufnahmen. Die weitere Entwicklung neuer Farbstoffe mit verminderten

phototoxischen Eigenschaften und der gezielte Einsatz von Antioxidantien

könnten die optische Technik weiter verbessern. Allerdings ist noch nicht geklärt,

welchen Einfluß Antioxidantien selbst auf die Vitalfunktion der Nervenzellen

besitzen und in welchen Konzentrationen diese Stoffe angewendet werden

können.

In den letzten Jahren wurden mehrere nicht-invasive Techniken etabliert, die

enterische Nervenzellaktivität registrieren und visuell erfaßbar machen. Zunächst

beschränkten sich diese Methoden auf sehr langsame Änderungen nervaler

Aktivitätslevel. So wurde eine Erhöhung der Cytochrom-Oxidase-Aktivität als

Hinweis für eine gesteigerte neuronale Aktivität beschrieben (MAWE u. GERSHON

1986). Die Expression des DNA-Bindungsproteins Fos, einem

Transskriptionsprodukt von c-fos Proonkogenen, wurde ebenfalls in mehreren

Studien als Indikator für Transskriptions-Translations-Aktivität und damit als

Parameter für stimulusinduzierte nervale Aktivität eingesetzt (KIRCHGESSNER et

al. 1992; MIAMPAMBA et al. 1997; SHARKEY et al. 1999). Der Nachteil dieser

beiden Methoden liegt darin, daß sie nur sehr langsame Änderungen widerspiegeln

und der Stimulus über mehrere Minuten bzw. Stunden andauern muß. Zudem

Vorteile und Limitationen der MSORT 149

belegte eine Studie die eingeschränkte Spezifität der stimulusinduzierten Fos

Expression (RITTER et al. 1997).

Eine verbesserte räumliche und zeitliche Auflösung konnte durch die optische

Registrierung neuronaler Calciumionenströme („Calcium-Signaling“,

„Calcium-Imaging“) erzielt werden. Allerdings können auch mit dieser bisher am

ENS etablierten Methode schnelle Änderungen der Nervenzellaktivität nicht

aufgelöst werden, da die Calciumfluxe nur im Sekundenbereich detektiert werden

(KIMBALL u. MULHOLLAND 1995; SIMEONE et al. 1996; VANDEN BERGHE et al.

2000). Darüber hinaus ist eine Änderung intrazellulärer Calciumkonzentrationen

kein direkter Hinweis auf einen erhöhten oder erniedrigten Aktivitätslevel in

enterischen Nervenzellen, da intrazelluläre Calciumspiegel nicht zwingend mit einer

erhöhten oder verringerten elektrischen Aktivität korreliert sind, so daß hierfür die

Technik des „Calcium-Signaling“ mit intrazellulären Ableitungen (SHUTTLEWORTH

u. SMITH 1999; VOGALIS et al. 2000) kombiniert werden muß. Demgegenüber

besitzt die optische Registrierung neuronaler Spannungstransienten mit Hilfe der

„fast-response probes“ den Vorteil, Nervenzellerregung direkt und - verglichen mit

„slow-response probes“- in Echtzeit („Real-Time“) messen zu können. Die in der

vorliegenden Arbeit etablierte MSORT ist in der Lage, mit einer hohen räumlichen

und zeitlichen Auflösung Aktionspotentialentladungen sowie unterschwellige

synaptische Vorgänge zu registrieren und somit Nervenzellerregungen direkt zu

messen (NEUNLIST et al. 1999b). Die MSORT ermöglicht damit erstmals die

Registrierung aller Nervenzellen in einem Ganglion und die Darstellung der

Erregungsausbreitung innerhalb und zwischen enterischen Ganglien.

Wie die vorliegende Arbeit zeigte, liegt das Potential von der MSORT auch

darin, direkte Ableitungen in humanen Darmgeweben einschließlich Bioptaten

durchzuführen. Bisher existierte aufgrund methodischer Limitationen nur eine

Studie, die den Versuch unternommen hatte, mit intrazellulären Ableitungen

enterische Neurone in Humangeweben zu untersuchen. BROOKES et al. (1987)

benötigten mehrere Jahre, um 27 Nervenzellen im Plexus myentericus intrazellulär

abzuleiten. Im Vergleich dazu ist mit der MSORT eine Charakterisierung von

Nervenzellzahlen in dieser Größenordnung innerhalb eines Versuchstages möglich.

150 Diskussion

Damit ist die MSORT nicht nur eine wertvolle und konkurrenzfähige Alternative zu

bisherigen konventionellen elektrophysiologischen Techniken, sondern sie ist die

einzige Methode, die in Zukunft intrazelluläre Ableitungen ersetzen könnte.

Zukünftige Herausforderungen auf dem Gebiet der Neurogastroenterologie liegen

also in der nicht-invasiven Ableitung neuronaler Aktivität im enterischen

Nervensystem.

5.3 Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen amHumandarm

Mit der MSORT sollte am Humangewebe untersucht werden, welche

Neurotransmitter bei der schnellen neuro-neuronalen Übertragung im Plexus

submucosus von Kolon und Rektum beteiligt sind und ob Acetylcholin alleiniger

Neurotransmitter bei der schnellen synaptischen Übertragung ist. Weiterhin sollte

festgestellt werden, welche Aktivitätsmuster im ENS des Menschen existieren.

Außerdem sollte eine Aussage über das Verteilungsmuster der Erregung nach

oraler und analer Stimulation innerhalb enterischer Ganglien getroffen werden.

In der vorliegenden Studie konnte beim Menschen im submukösen Plexus

von Kolon und Rektum die Rolle nikotinerger Mechanismen im Zusammenhang mit

schnellen EPSP bei der neuro-neuronalen Kommunikation aufgezeigt werden.

Acetylcholin ist über nikotinerge Rezeptoren Transmitter bei der schnellen

synaptischen Übertragung im Plexus submucosus des Menschen. Etwa 96 % der

induzierten f EPSP wurden durch den nAChR-Antagonisten Hexamethonium

vollständig blockiert und erschienen allein durch ACh vermittelt zu werden. Direkte

Spritzapplikation von ACh auf submuköse Neurone bewirkte bei den getesteten

Nervenzellen gleichermaßen Änderungen des Membranpotentials, die durch den

nAChR-Antagonisten Hexamethonium reduziert bzw. vollständig blockiert wurden.

Damit konnte gezeigt werden, daß ACh auch auf Einzelzellebene im Humandarm

als wesentlicher Neurotransmitter fungiert, was in Übereinstimmung mit

Ergebnissen funktioneller Untersuchungen im humanen Kolon steht, die die

wesentliche Bedeutung cholinerger, nikotinerger Mechanismen bei der Kontrolle der

Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen am Humandarm 151

Motilität aufgezeigt haben (FISHLOCK u. PARKES 1963). Immunhistochemische

Studien bestätigen ebenfalls, daß das zur ACh-Synthese relevante Enzym, die

ChAT, bei mehr als 50 % der Neurone im submukösen Plexus des Dickdarms

prominent ist (PORTER et al. 1996), im Rektum sind es annähernd 90 %

(SCHNEIDER et al. 2001). ACh kann damit auch im Humandarm als

Haupttransmitter angesehen werden, wie es schon für verschiedene Spezies u. a.

Meerschweinchen, Schwein, Ratte, Maus und Frettchen gezeigt wurde (LOMAX u.

FURNESS 2000; MANN et al. 1999; SANG u. YOUNG 1998; SANN et al. 1998;

TIMMERMANS et al. 2001).

Allerdings zeigten im humanen Plexus submucosus einige Nervenzellen in

Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium weitere synaptische

Aktivität, die das Vorliegen einer nicht-cholinergen Komponente aufzeigte. Dies

steht im Gegensatz zu bisherigen Befunden im Plexus submucosus des

Meerschweinchens, wo f EPSP durch nAChR-Antagonisten vollständig blockiert

werden (EVANS u. SURPRENANT 1992; GALLIGAN et al. 2000). Die Existenz von

nicht-cholinergen f EPSP korreliert jedoch mit Untersuchungsergebnissen im Plexus

myentericus des Meerschweinchens (GALLIGAN u. BERTRAND 1994). Hier zeigen

nur etwa 25 % der f EPSP eine vollständige Blockade durch nAChR-Antagonisten.

Dreiviertel der Neurone weisen eine nicht-cholinerge Komponente auf, die

hauptsächlich durch ATP und zu etwa 10 % durch Serotonin vermittelt wird. Als

weiterer exzitatorischer Kotransmitter von ACh wird bei AH/Typ 2-Neuronen

Glutamat diskutiert, das über postsynaptische AMPA-Rezeptoren glutamaterge

f EPSP auslöst (LIU et al. 1997).

Die inhibitive Wirkung des P2-Antagonisten Suramin bei den eigenen

Untersuchungen zeigte, daß im Plexus submucosus des Menschen nicht-cholinerge

f EPSP ebenfalls durch ATP vermittelt werden. Damit konnte in der vorliegenden

Arbeit erstmals ATP als Neurotransmitter der schnellen neuro-neuronalen

Übertragung im ENS des Menschen nachgewiesen werden. Ob alle

nicht-cholinergen f EPSP auch ATP vermittelt sind und nicht noch weitere

Neurotransmitter wie Serotonin oder Glutamat beteiligt sind, muß zukünftigen

Untersuchungen vorbehalten bleiben. Die Existenz von nicht-cholinergen f EPSP im

152 Diskussion

Plexus submucosus läßt, verglichen mit dem Plexus submucosus des

Meerschweinchens, speziesspezifische und funktionelle Unterschiede vermuten. Es

wird angenommen, daß ATP am Plexus myentericus ein Transmitter

deszendierender Interneurone ist, die neben ACh Somatostatin oder Serotonin als

Kotransmitter besitzen (GALLIGAN et al. 2000; LEPARD et al. 1997; SPENCER et

al. 2000). Einige Autoren sehen ATP aber auch als Neurotransmitter der primär

afferenten, sensorischen Neurone (BROOKES et al. 1995; FURNESS 2000). Beide

diskutierten Funktionen von ATP könnten im Plexus submucosus des Menschen

zutreffen.

Überraschend ist die Tatsache, daß in den eigenen Untersuchungen einige f EPSP

(n= 4) mit einer nicht-nikotinergen Komponente durch den mAChR-Atropin blockiert

werden konnten. Als Erklärungsmöglichkeiten stehen zur Diskussion:

• Schnelle postsynaptische Potentiale werden durch ACh über muskarinerge

postsynaptische Rezeptoren vermittelt. Dies würde im Gegensatz zu bisherigen

Literaturangaben stehen, bei denen f EPSP im ENS durch den

mAChR-Antagonisten Atropin nicht beeinflußt werden (BROOKES et al. 1987;

NISHI u. NORTH 1973; NORTH et al. 1985a).

• Neben der Ausschüttung von ACh kommt es zur Freisetzung eines

Kotransmitters, wobei die Freisetzung dieses nicht-nikotinergen Transmitters

erst über Aktivierung präsynaptischer muskarinerger ACh-Rezeptoren erfolgt.

Eine Blockade dieser präsynaptischen ACh-Rezeptoren mit

mAChR-Antagonisten würde die Freisetzung des Kotransmitters und damit das

nicht-nikotinerge f EPSP blockieren. Im Rückenmark der Ratte zeigen

Untersuchungen, daß durch muskarinerge Rezeptoren die Erregbarkeit

inhibitorischer Interneurone erhöht wird und die Freisetzung des

Neurotransmitters GABA gesteigert wird (BABA et al. 1998). Eine Verstärkung

der Transmitterfreisetzung über muskarinerge präsynaptische Rezeptoren wird

ebenfalls beim Nervus phrenicus angenommen (WESSLER 1989) und wird für

die Freisetzung von ACh in der Harnblase des Menschen beschrieben

(SOMOGYI u. DE GROAT 1999). Präsynaptische muskarinerge Rezeptoren


werden im enterischen Nervensystem nur im Zusammenhang mit präsynaptisch

hemmenden Mechanismen genannt, über die Acetylcholin seine eigene

Ausschüttung hemmt (NORTH et al. 1985a; WOOD 1994). Bisher ist lediglich

über nikotinerge Mechanismen die erhöhte Freisetzung von ACh beschrieben

worden (GALLIGAN 1999).

Die Reduzierung der Amplitude von f EPSP nach repetitiver Gabe von

Einzelstrompulsen, die bei einem Teil der Neurone auftrat, deutet im submukösen

Plexus des Menschen darauf hin, daß die Transmitterfreisetzung an der Synapse

abhängig von der Stimulationsfrequenz reduziert wird. Diese als „Rundown“

bezeichnete Inhibition erscheint in ähnlicher Weise beim Meerschweinchen im

Plexus submucosus des distalen Kolon (FRIELING et al. 1991b), im Plexus

myentericus des Dünndarms (DEMBOWSKI u. MAYER 1982; ORT et al. 1984) und

im Rektum (TAMURA u. WOOD 1989). Auf regionale Unterschiede weist das

Fehlen dieses Phänomens im Plexus myentericus des Kolon (WADE u. WOOD

1988) ebenso wie im Magen des Meerschweinchens hin (SCHEMANN u. WOOD

1989a; TACK u. WOOD 1992). Beim Schwein wurde hingegen im myenterischen

Plexus des Dünndarms kein „Rundown“ beobachtet, was zudem auf

speziesspezifische Unterschiede hindeutet (CORNELISSEN et al. 2001). Im Colon

descendens der Ratte zeigten anders als beim Meerschweinchen 22 % der

myenterischen Neurone „Rundown“ (BROWNING u. LEES 1996). Welche

funktionelle Bedeutung dieses Phänomen „Rundown“ innerhalb der enterischen

Schaltkreise besitzt, ist noch nicht geklärt. „Rundown“ wird z. T. durch

präsynaptische Hemmung der Acetylcholinausschüttung erklärt. Neben ACh,

welches über muskarinerge Rezeptoren wirkt, werden eine Reihe weiterer

Neurotransmitter wie beispielsweise Noradrenalin, NPY oder Serotonin diskutiert

(WOOD 1994).

Nach Blockierung des synaptischen Inputs durch den

nAChR-Antagonisten-Hexamethonium zeigten etwa zwei Drittel der Neurone

Aktionspotential-ähnliche Aktivität. Es konnte jedoch nicht abgeklärt werden, ob das

morphologische Korrelat dieser Aktionspotential-ähnlichen Aktivität auf dendritischer

154 Diskussion

oder axonaler Stimulation der entsprechenden Neurone beruhte. Nach Stimulation

mehrerer Nervenstränge können Rückschlüsse auf die Morphologie der Neurone

insofern nur bedingt geschlossen werden, da es sich sowohl um multidendritische,

multiaxonale als auch um bipolare Neurone, also Neurone mit einem axonalen und

einem dendritischen Nervenzellfortsatz handeln könnte. Im Plexus submucosus des

Dünndarms werden mukosal projizierende Nervenzellen mit multidendritischer

uniaxonaler Morphologie und Immunoreaktivität für Somatostatin und VIP

beschrieben, sowie Dogiel Typ II Neurone (HENS et al. 2000; TIMMERMANS et al.

2001), die als primär afferente (sensorische) Neurone diskutiert werden (KUNZE et

al. 1995; KUNZE u. FURNESS 1999). Im Kolon konnten nach retrograder

Markierung von Mukosa, Submukosa und Zirkulärmuskulatur bisher uniaxonale

Neurone mit filamentösen Dendriten nachgewiesen werden (PORTER et al. 1999).

Welche Funktion diese Neurone ausüben und welche morphologischen

Charakteristika generell submuköse Neurone im Humandarm besitzen, ist jedoch

noch weitgehend unklar.

Auffällig bei den eigenen Untersuchungen war der vergleichsweise geringe

Prozentsatz von s EPSP. Im Plexus submucosus des Meerschweinchens wurden in

intrazellulären Ableitungen s EPSP bei 40 % der Neurone registriert

(SURPRENANT 1984b). 64 % des S-Neurone und 74 % der AH-Neurone zeigen im

distalen Kolon s EPSP (FRIELING et al. 1991b). Im Plexus myentericus wird das

Vorkommen von s EPSP bei 25 % der Neurone angegeben (WADE u. WOOD

1988). Bei der Ratte wurde bei 8 % der myenterischen Neurone im Kolon s EPSP

beobachtet (CORNELISSEN et al. 2001). Im Dickdarm des Meerschweinchens

wurde bei 15 % der AH-Neurone s EPSP nachgewiesen (TAMURA u. WOOD

1989). Bei myenterischen, zur Mukosa projizierenden Neuronen konnten s EPSP in

dieser Subpopulation bei 94 % ausgelöst werden (NEUNLIST et al. 1999a). Ähnlich

wie in den eigenen Untersuchungen sind auch im myenterischen Plexus des

Menschen selten s EPSP abgeleitet worden (BROOKES et al. 1987). Dies

unterstreicht die Vermutung, daß speziesspezifische Unterschiede eine Rolle

spielen. Altersbedingte Änderungen in der Innervation (KOCH et al. 1986) als

Ursache für Unterschiede werden trotz des hohen Durchschnittsalters der


Patienten, verglichen mit Untersuchungen am Meerschweinchen, von BROOKES et

al. (1987) als unwahrscheinlich angesehen. Das seltene Vorkommen von s EPSP in

der vorliegenden Arbeit könnte außerdem methodisch bedingt sein. Langsame

Depolarisationen können mit diesem AC-gekoppelten System nicht registriert

werden (NEUNLIST et al. 1999b), so daß möglicherweise nur die s EPSP registriert

wurden, die überschwellig werden und als Folge Aktionspotentiale auslösten. Eine

Veränderung der Operationsgewebe durch die Manipulationen im Rahmen der

OP-Entnahme gilt als Ursache für die geringe Anzahl an s EPSP als

unwahrscheinlich (BROOKES et al. 1987).

Nervenzellen im enterischen Nervensystem lassen sich anhand ihrer

Tansmitterkodierung in verschiedene individuelle Gruppen einteilen. In der

vorliegenden Arbeit wurden drei Neurotransmitter immunhistochemisch untersucht:

VIP und Substanz P sowie ACh, das über das ACh-synthetisierende Enzym, die

ChAT, nachgewiesen wurde. Es zeigten mehr als die Hälfte aller optisch

untersuchten Neurone im Kolon und Rektum ChAT/VIP (56 %), gefolgt von

ChAT/- (30 %), ChAT/SP (5 %) und VIP/- (6 %). Eine Kolokalisation von ChAT/VIP

und Substanz P trat nicht auf. Dies ähnelt Daten vom Plexus submucosus des

humanen Rektum (SCHNEIDER et al. 2001): ChAT/VIP (58 %) bildete bei dieser

Untersuchung ebenfalls die größte Population, gefolgt von ChAT/- (22 %),

ChAT/SP (8 %) und VIP/- (2 %). Zwar konnten in der vorliegenden Studie keine

signifikanten Unterschiede zwischen dem neurochemischen Kode und der

jeweiligen elektrischen Aktivität gefunden werden, allerdings zeigten die nicht durch

f EPSP aktivierten Neurone, im Vergleich zu Neuronen mit f EPSP, eine

verhältnismäßig größere Population von ChAT/- als von ChAT/VIP Neuronen. Auch

im myenterischen Plexus existiert eine Population von ChAT-Neuronen, die keine

schnellen cholinergen EPSP aufweist. Diese Population enthält zusätzlich

Substanz P und Calbindin und fungiert als intrinsische primär afferente Neurone

(FURNESS et al. 1998; NEUNLIST u. SCHEMANN 1997; NEUNLIST et al. 1999a).

Anhand des neurochemischen Kodes Rückschlüsse auf die funktionelle Bedeutung

zu ziehen, ist derzeit für den Menschen nicht möglich. Auffällig ist, daß die Neurone,

156 Diskussion

die in dieser Arbeit nur durch anale Stimulation aktiviert wurden, signifikant mehr

ChAT/VIP aufwiesen, als nach oraler Stimulation, obwohl neuropharmakologisch

keine Unterschiede festgestellt werden konnten. Retrograde Tracingstudien im

humanen Kolon haben innerhalb des submukösen Plexus VIP-erge

Zirkulärmuskelmotoneurone identifiziert, die anale Projektionen zeigen (PORTER et

al. 1999). Die Autoren konnten jedoch polarisierte Projektionen VIP-erger

submuköser Neurone nicht feststellen. VIP-positive submuköse Neurone könnten

beim Menschen sowohl als Sekretomotoneurone, Interneurone oder

Zirkulärmuskelmotoneurone fungieren. Welche Bedeutung ChAT/VIP-Neurone im

Humandarm besitzen, die zudem die größte Population bilden, ist nicht geklärt.

Beim Meerschweinchen existiert im Kolon jedoch eine strikte Trennung zwischen

ChAT-positiven und VIP-positiven Neuronen (NEUNLIST et al. 1998; NEUNLIST u.

SCHEMANN 1998), ebenso wie im Dünndarm, wobei fast alle submukösen

Neurone durch diese beiden Transmitter identifiziert werden (BORNSTEIN u.

FURNESS 1992; GERSHON et al. 1994).

Im enterischen Nervensystem geht man davon aus, daß funktionell

individuelle Neurone nicht in speziellen Ganglien liegen, sondern sich auf

verschiedene Ganglien verteilen. Ein submuköses Ganglion könnte damit primär

afferente Neurone, Interneurone sowie Motoneurone beinhalten (COOKE u.

REDDIX 1994). In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die

Erregungsausbreitung innerhalb enterischer Ganglien nach elektrischer Stimulation

interganglionärer Nervenstränge registriert. Nach oraler bzw. analer Stimulation

konnten in der vorliegenden Studie etwa gleich viele Neurone aktiviert werden, was

darauf hindeutet, daß funktionell individuelle Neuronentypen nicht in einzelnen

Ganglien mit Projektionspräferenzen angeordnet sind. Untersuchungen mit

DiI-markierten, über Mukosa, Submukosa und Zirkulärmuskulatur

retrograd-gelabelten submukösen Neuronen zeigten beim Menschen weder orale

noch anale oder zirkumferentielle Projektionspräferenzen (PORTER et al. 1999).

Durch die Stimulation interganglionärer Nervenstränge wurden prinzipiell alle

Neurone, die über diese Faser synaptischen Input erhielten, unabhängig von ihrer

Funktion, aktiviert. Zudem erschienen nicht alle Neurone gleichzeitig in einem


Ganglion aktiviert zu werden, was auf unterschiedliche Projektionslängen hindeutet.

Hierfür spricht, daß Neurone, die am Eintritt des stimulierten Faserstrangs lokalisiert

waren, früher als in anderen Bereichen des Ganglion aktiviert wurden.

Die nicht durch experimentelle Manipulationen hervorgerufene Spontanaktivität

konnte in der vorliegenden Studie im Plexus submucosus des Menschen bei etwa

der Hälfte der untersuchten Ganglien beobachtet werden, wobei sie bei rund ein

Fünftel der untersuchten Neurone gemessen wurde. Diese Aktivität wurde dabei

nicht nur durch endogene Mechanismen hervorgerufen. Es konnte gezeigt werden,

daß synaptische Mechanismen ebenfalls involviert sind. Dabei konnte eine

Beteiligung nikotinerger Rezeptoren gezeigt werden, was auf ACh als

Neurotransmitter verweist und mit bisherigen Daten beim Meerschweinchen

übereinstimmt (NISHI u. NORTH 1973; WADE u. WOOD 1988). Im Plexus

submucosus der Maus wurde etwa 10fach weniger Spontanaktivität beobachtet.

Das Phänomen der neuronalen Spontanaktivität ist bisher im ENS des

Magens und des Darmtrakts verschiedener Spezies beschrieben worden. Im Plexus

myentericus des Menschen wurde bei 2 von 27 Neuronen spontane Aktivität

nachgewiesen (BROOKES et al. 1987). Insgesamt schwanken die Angaben in der

Literatur zum Vorkommen von Spontanaktivität zwischen 7-30 % der jeweils

untersuchten Neuronenpopulationen (BROOKES et al. 1987; FRIELING et al.

1991b; NISHI u. NORTH 1973; SCHEMANN u. WOOD 1989b; SURPRENANT

1984a). In Plexus myentericus-Muskulatur-Präparaten vom Meerschweinchen und

von der Maus kommt sogar bei 50 % bis 95 % der Neurone Spontanaktivität vor,

was mit der Intaktheit neuro-muskulärer Schaltkreise in Zusammenhang gebracht

wird (FURUKAWA et al. 1986; HIRST et al. 1974; SURPRENANT 1984a). Die

durchschnittliche Signalfrequenz spontan aktiver Neurone lag bei den eigenen

Untersuchungen zwischen 0,8 bis 17 Hz, wobei 94 % der Nervenzellen

Entladungsfrequenzen von 1 Hz bis 8 Hz zeigten. Im intestinalen Plexus

submucosus des Meerschweinchens werden in optischen Messungen

durchschnittliche Entladungsfrequenzen im Bereich von < 1 bis 7 Hz angegeben,

wobei nur wenige Neurone Entladungsfrequenzen über 1 Hz zeigen (OBAID et al.

1999). Andere intrazelluläre Studien beobachteten Maximalfrequenzen von 4-6 Hz

158 Diskussion

über 10 s, gefolgt von 10-45minütigen Ruhephasen (SURPRENANT 1984a). Die

Variation bei den Angaben über durchschnittliche Entladungsfrequenzen ist mit den

unterschiedlich langen Meßzeiträumen bzw. Beobachtungszeiträumen der Neurone

zu erklären, die von einigen Sekunden - bei den eigenen Untersuchungen - über

mehrere Minuten (OBAID et al. 1999) bis hin zu Stunden variieren (SURPRENANT

1984a). Bei den Ergebnissen von OBAID et al. (1999) ist eine methodisch bedingte

Beeinflussung der Nervenzellaktivität nicht ganz auszuschließen, da die

beobachtete Spontanaktivität als Folge der enzymatischen Vorbehandlung und der

reduzierten Sauerstoffspannung im Perfusionbad entstanden sein könnte. Dies

könnte zudem erklären, warum vermehrt Frequenzen unterhalb von 1 Hz

beobachtet wurden.

Die in dieser Arbeit erstmals im Humandarm beobachtete stimulusinduzierte

andauernde Aktivitätsentladung („late onset spike discharge“) trat nach

Einzelstimulation interganglionärer Nervenstränge auf und war durch eine länger

andauernde Entladung erregender Potentiale mit einer Frequenz von 14 bis 31 Hz

gekennzeichnet. Dieses Aktivitätsmuster, das etwa in jedem fünften Ganglion

beobachtet werden konnte, trat bei etwa 8 % aller untersuchten Neurone auf. Die

Ergebnisse dieser Studie lassen vermuten, daß dieses Aktivitätsmuster mindestens

aus zwei Signalkomponenten besteht, einer muskarinergen und einer nikotinergen

Komponente. Die ebenfalls beobachtete Hexamethonium-Insensitivität läßt darauf

schließen, daß weitere bisher noch nicht identifizierte Neurotransmitter involviert

sind. In Frage kämen hierfür glutamaterge wie auch serotoninerge Mechanismen

(GALLIGAN et al. 2000).

Ausblick sowie möglicher Einsatz der optischen Methode am ENS 159

5.4 Ausblick sowie möglicher Einsatz der optischen Methode amENS

In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, daß die MSORT bei

Untersuchungen des enterischen Nervensystems sowohl in der Tiermedizin als

auch in der Humanmedizin eingesetzt werden kann. Dies ist insofern von

Bedeutung, da gerade am ENS speziesspezifische Unterschiede existieren und in

der Humanmedizin idiopathische gastrointestinale Dysfunktionen und

Malfunktionen, wie beispielsweise der Symptomkomplex des Reizdarms, ein

enormes klinisches Problem mit hoher Prävalenz darstellen. Erforderlich für die

Analyse von Funktionsstörungen ist jedoch die Erfassung komplexer interneuronaler

Interaktion. Das simultane und dennoch getrennte Ableiten von einer Vielzahl von

Neuronen war bisher am Humandarm nicht realisiert worden. Ein Ziel der

vorliegenden Studie, die MSORT erstmals auch beim Menschen zu etablieren,

ermöglicht in Zukunft, Studien neuronaler Netze direkt am vitalen Humangewebe

durchzuführen. Es bietet sich zudem die Möglichkeit, wie in dieser Studie ebenfalls

gezeigt werden konnte, tiefe, in die Submukosa dringende Rektumbioptate von

Patienten vital zu untersuchen, worin das Potential für einen neuen diagnostischen

Ansatz in der gastroenterologischen Funktionsprüfung liegt.

Die Etablierung der MSORT am Humandarm zeigt zugleich die Aussicht, die

MSORT in der Tiermedizin nicht nur bei Labornagern, sondern auch bei Großtieren

anwenden zu können. Voraussetzung ist allerdings die Eignung des

potentiometrischen Chromophors sowie die präparatorische Zugänglichkeit von

Plexusanteilen bei Geweben mit einer Dicke von mehreren Millimetern.

Seitens der klinischen Neurogastroenterologie werden zukünftige

Herausforderungen darin liegen, Eigenschaften des enterischen Nervensystems

des Menschen eingehender unter pathophysiologischen Fragestellungen zu

charakterisieren. Die MSORT kann in Abhängigkeit von der jeweiligen Fragestellung

beispielsweise bei pathophysiologischen Studien oder bei der Testung von

Pharmaka eingesetzt werden. Für das Verständnis neuronaler Netzwerke kann die

160 Diskussion

MSORT eine wertvolle Ergänzung im Rahmen der „Computional Neuroscience“

bieten, die entwickelten Computermodelle (THOMAS et al. 1999; THOMAS et al.

2000) am vitalen enterischen Netzwerk zu verifizieren und durch neue, mit der

MSORT gewonnene Daten zu ergänzen bzw. diese Daten als Basis für neue

Computermodelle zu verwenden.

161

6 Zusammenfassung

Das enterische Nervensystem (ENS) besteht aus zwei Nervengeflechten, dem

Plexus submucosus und dem Plexus myentericus. Bisher wurden konventionelle

elektrophysiologische Techniken wie intra- und extrazelluläre Ableitungen

eingesetzt, um die elektrophysiologischen Eigenschaften enterischer Neurone zu

untersuchen. Diese Methoden sind nur begrenzt einsetzbar, da sie nicht geeignet

sind, mehrere Neurone simultan auf Einzelzellebene zu untersuchen oder die

Aktivität enterischer Neurone im Humandarm zu messen.

Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, die ‚Multi-Site Optical Recording

Technique‘ (MSORT) am frisch präparierten Darmgewebe von Maus,

Meerschweinchen und vom Menschen zu etablieren, um erstmals simultan auf

Einzelzellebene eine Vielzahl von Neuronen zu untersuchen.

Neuropharmakologische Studien wurden aufgrund der klinischen Relevanz

hauptsächlich am enterischen Nervensystem des Menschen durchgeführt.

Ergebnisse dieser Arbeit können wie folgt zusammengefaßt werden:

1. Die MSORT wurde erfolgreich am frisch präparierten Plexus submucosus des

Kolon von Maus und Meerschweinchen sowie im Kolon und Rektum des

Menschen (Operationsgewebe und Bioptate) zur Charakterisierung

elektrophysiologischer Eigenschaften etabliert. Ein speziell entwickeltes

Färbeprotokoll ermöglichte die gezielte lokale Färbung einzelner enterischer

Ganglien mit dem spannungssensitiven Farbstoff Di-8-ANEPPS, der sich für

Studien am Plexus submucosus eignete.

2. Die MSORT konnte am Plexus submucosus mit immunhistochemischen

Techniken kombiniert werden, um Transmitterkolokalisationen und damit den

neurochemischen Kode submuköser Neurone zu erfassen (Mensch,

Meerschweinchen). Beim Menschen wurden im Kolon und im Rektum bei rund

70 % der optisch untersuchten Neurone immunhistochemische Daten

162 Zusammenfassung

gewonnen: 56 % der Neurone zeigten ChAT/VIP, 30 % ChAT/- , 5 % ChAT/SP

und 6 % VIP/-.

3. Neuropharmakologische Untersuchungen submuköser Neurone zeigten beim

Menschen im Kolon und Rektum die Dominanz cholinerger Mechanismen bei

synaptischen Vorgängen. Die Gabe von Acetylcholin auf 91 Neurone induzierte

Aktionspotentialsalven, deren Entladungsfrequenz einen Dosis-korrelierten

Anstieg im Zusammenhang mit der Acetylcholin-Applikationsdauer zeigten.

Elektrische Stimulation interganglionärer Nervenstränge induzierte bei 366 von

537 Neuronen f EPSP. Nach repetitiver Stimulation konnte bei einigen Neuronen

„Rundown“ registriert werden. Etwa 96 % der untersuchten f EPSP wurden

durch Hexamethonium blockiert und waren damit über postsynaptische

nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren vermittelt. Vier Prozent der f EPSP zeigten

neben der nikotinergen eine weitere nicht-nikotinerge Komponente. Hier konnte

durch die Blockierung mit Suramin ATP als ein Neurotransmitter identifiziert

werden.

4. 18 % der Neurone zeigten Spontanaktivität, die synaptischen Ursprungs war.

Eine Beteiligung nikotinerger Mechanismen konnte bei 12 von 34 Neuronen

gezeigt werden. Die außerdem auftretende Hexamethonium-Insensitivität

deutete auf endogene, nicht-synaptisch vermittelte Mechanismen hin.

5. Bei ca. 2 % der Neurone wurden s EPSP nach Gabe von Stimulationssalven

nachgewiesen.

6. Bei 7 % der Neurone trat ein als „late onset spike discharge“ bezeichnetes

Aktivitätsmuster auf, das sich nach ein- bis zweimaliger Stimulation

interganglionärer Nervenstränge als länger andauernde Entladung erregender

Potentiale in einer Frequenz von 14-31 Hz zeigte. Bei 12 von 19 untersuchten

Neuronen konnte eine Beteiligung nikotinerger und muskarinerger Mechanismen

gezeigt werden. Die Hexamethonium-Insensitivität bei 10 Neuronen läßt auf die

Existenz weitere Transmitter bei der Generierung dieses Aktivitätsmusters

schließen.

7. Nach oraler Stimulation interganglionärer Nervenstränge wurden im Durchschnitt

62 % und nach analer Stimulation 57 % der Neurone innerhalb enterischer

Zusammenfassung 163

Ganglien aktiviert. Dabei wurden 45 % der Neurone durch beide Richtungen,

28 % wurden Nervenfaserstrang-spezifisch und 27 % wurden nicht aktiviert. Die

Population der Neurone, die nur nach analer Stimulation aktiviert wurde, zeigte

signifikant mehr ChAT/VIP.

Es konnte dargelegt werden, daß die MSORT eine wertvolle und konkurrenzfähige

Alternative zu bisherigen konventionellen elektrophysiologischen Techniken

darstellt. Zudem erlaubt die MSORT eine zuverlässige und reproduzierbare

Ableitung vom enterischen Nervensystem des Menschen.

164

Summary

Saskia Elisabeth Christiane Peters

Simultaneous recordings of neuronal activity in the enteric nervous system ofthe large intestine of the mouse, the guinea-pig and humans using theMulti-Site Optical Recording Technique (MSORT)

The enteric nervous system (ENS) consists of two ganglionated plexus, the plexus

submucosus and the plexus myentericus. Up to now conventional

electrophysiological methods like intra- and extracellular recordings were used to

study electrophysiological properties of enteric neurones. These methods have

certain limitations in that they are unsuitable for recording from a large population of

neurones simultaneously or for measuring activity of enteric neurones in human

specimens.

The aim of this study was to establish the ‘Multi-Site Optical Recording Technique‘

(MSORT) to record from freshly isolated preparations from mice, guinea-pigs and

humans and simultaneously from a large population of enteric neurones. The

neuropharmacological properties were mainly investigated in human enteric

neurones because of its clinical importance.

The results of the present study were:

1. The MSORT was successfully established to characterise electrophysiological

properties of submucosal neurones in the colon (mouse and guinea-pig) as well

as in the colon and rectum of humans. It was possible to stain individual enteric

ganglia by local application of the voltage sensitive dye Di-8-ANEPPS.

2. It was possible to combine the MSORT with immunhistochemical techniques to

detect transmitter colocalisation patterns and thereby the neurochemical code of

submucosal neurones (human, guinea-pig). In the human colon and rectum

immunhistochemical data were obtained from 70 % of the optically studied

Summary 165

neurones: 56 % of the neurones were ChAT/VIP, 30 % ChAT/- , 5 % ChAT/SP

and 6 % VIP/-.

3. In the colonic and rectal human submucosal plexus, neuropharmacological

studies demonstrated the importance of cholinergic mechanisms in mediating

synaptic events. Similarly the application of acetylcholine onto 91 neurones

elicited a burst of action potential discharge which increased in a concentration-

dependent fashion with, the increased duration of the acetylcholine application.

Electrical stimulation of interganglionic fibre tracts revealed f EPSPs in 366 out of

537 neurones. After repetitive stimulation run-down was detected in colonic as

well as in rectal neurones. About 96 % of f EPSP were blocked by

hexamethonium and therefore mediated by the release of acetylcholine

activating postsynaptic nicotinic receptors. 4 % of the f EPSP showed

non-nicotinic components. Some of these were blocked by suramine and hence

ATP could be identified as one of the involved transmitters.

4. 18 % of the neurones showed spontaneous activity which was synaptically

mediated. Cholinergic nicotinic mechanism played a role in 12 out of 34

neurones. However this spontaneous potential discharge was also in part

hexamethonium insensitive, indicating endogenous, non-synaptic mechanisms

responsible for its initiation.

5. About 2 % of the neurones showed s EPSP after application of trains of stimuli to

interganglionic fibre tracts.

6. 7 % of the neurones showed activation patterns which are referred to as ‘late

onset spike discharge’. They were evoked by single pulse electrical stimulation

of interganglionic nerve fibres and consisted of a volley of action potentials which

occurred with a longer latency than the f EPSP. Potentials during the late onset

spike discharge occurred at a frequency of 14-31 Hz. In 12 of 19 neurones

nicotinic and muscarinic mechanism were involved. Because ‘late onset spike

discharge’ was not affected by hexamethonium in 10 neurones it must be

concluded that additional transmitters were involved in the initiation of this

activity pattern.

166 Summary

7. After oral stimulation of interganglionic fibre tracts, on average 67 % of the

neurones within enteric ganglia were activated; however after anal stimulation

this was the case for 57 % of the neurones. In this process 45 % of the neurones

were activated by both methods of stimulation whereas 28 % were fibre tract

specifically activated and 27 % were not at all activated. The population of those

neurones which were only activated after anal stimulation revealed significantly

more ChAT/VIP.

It has been shown that the MSORT is a powerful new tool for recording excitability

in the enteric nervous system and has advantages over conventional

electrophysiological methods. Thus, MSORT enabled reliable and reproducible

recordings from human enteric nerves.

167

7 Literaturverzeichnis

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195

8 Anhang8.1 Spezifikationen der Meßapparatur

Abbildung 44: Photo-

optische Kopplung von

Glasfasern und Photodioden

im Gehäuse des

Photodioden-Arrays.

Das auf das

Glasfaserbündel auftreffende

Licht (Pfeil) wird von den

464 Glasfasern auf die 464

Photodioden geleitet und

erzeugt dort einen

Photostrom (aus Daten der

Firma RedShirtImaging).

Tabelle 16: Spezifikationen Glasfaseroptik (nach Herstellerangaben)

Glasfaserlänge: < 15 cm

Photooptische Kopplung: Epoxid

Glasfaserkern: Polymethyl Methacrylat

Ummantelung: Fluorgeniertes Polymer

Faserdurchmesser: 0,75 mm

Aktive Meßfläche: 93%

Optische Eigenschaften: Spektrale Empfindlichkeit: 400-800 nm

Abschwächung: <200 dB/km @ 650 nm

Brechungsindex: Kern: 1,492 / Mantel: 1,417

Numerische Apertur: 0,47

Einfangwinkel: 56o

196 Anhang

Tabelle 17: Spezifikationen Photodioden (nach Herstellerangaben)

Photodiodenarray:Wu Tech InstrumentsPotomac MD USASN # H 469020_

Diodenanzahl: 464 Elemente

Externe Eingänge: 8 externe BNC

Material: Silizium

Dunkelstrom: < 10 pA

Parallelwiderstand: > 50 Gohm

Strahlungsempfindlichkeit: (630 nm) 0,42 A/W

Parallelkapazität: 200 pF

Quantumeffizienz: > 0,9

500300 400 600 700 800 900

Wellenlänge ( nm)

Spek

trale

Stra

hlun

gsin

tens

ität (

rel.

Einh

eite

n)

20

40

60

80

100

Abbildung 45: Spektrale Verteilung

der Strahlungsintensität einer XBO-

Kurzbogenlampe (Verändert nach

Datenblättern der Firma Osram).

Abbildung 46: Transmissionskurven

des modifizierten Cy3-Filterblocks für

die Messungen mit dem Farbstoff

Di-8-ANEPPS. (Verändert nach

Datenblättern der Firma Olympus).

HQ 545/30X

565 DCLP

400 600 800

50

100

0

Tran

smis

sion

(%)

Wellenlänge (nm)

BF 580

Spezifikationen der Meßapparatur 197

Tabelle 18: Getestete Filterblöcke für die Fluoreszenzmessungen

Fluoreszenz- Filterblock- FilterblockAnwendung bezeichnung I Exzitationsfilter Dichroitischer Spiegel Emissionsfilter

Breitbandfilter U-MWIG BP 520-550 565 DCLP BA 580 IFCy 3 U-M41007 HQ 545/30X 565 DCLP HQ 610/75M

Cy 3 II U-M41007 II HQ 545/30X 565 DCLP BF 580Texasrot U-MWIY BP 545-580 DM 600 BA 610 IF

I Angaben stammen aus Datenblättern der Firma Olympus, Hamburg; II Filterblock ist modifiziert.

8.2 Protokolle und Lösungen für die Vitalerhaltung der Gewebe

Krebs-Lösung (293 mosmol/l, begast mit Carbogen pH 7,4)

Na H2 PO4 MW: 120,0 g/mol, 1,2 mmol/l 0,144 g

NaCl MW: 58,44 g/mol, 117 mmol/l 6,84 g

NaHCO3 MW: 84,01 g/mol, 25 mmol/l 2,10 g

Glucose MW: 180,2 g/mol, 11 mmol/l 1,98 g

KCl MW: 74,55 g/mol, 4,7 mmol/l 0,350 g

Mg Cl2*6H2O MW: 203,3 g/mol, 2,5 mmol/l 0,244 g

Vor Zugabe von Calciumchlorid ca. 15 min mit Carbogen begasen (pH!)

Ca Cl2*2H2O MW: 147,0 g/mol, 1,2 mmol/l 0,368 g

Aqua bidest. ad 1l

Abbildung 47: Leistungskurve des NeuroPlex

Dioden-Systems. A Dioden messen nahe der

Ideallinie (3x106-1010 Photonen/ms) z. B. bei

Fluoreszenz- (II) und Absorptionsmessungen

(III) von in vitro Gehirnschnitten sowie

Ganglien B Übergang vom Dunkelstrom- zum

Schrotrauschen (5x103-106 Photonen/ms) z. B.

bei Fluoreszenzmessungen von Einzelzellen (I)

C Technisches Rauschen bewirkt bei sehr hohen

Intensitäten Abflachung.

(aus: http://www.redshirtimaging.com)

101

102

103 104 105 106 107 108 109 1010 1011

103

104

105

102

Lichtintensität(Photonen/ms auf 0,2% der Abbildungsfläche)

Lich

tinte

nsitä

t div

idie

rt du

rch

Rau

sche

n

NeuroPlex

Ideal (limitiert durch Schrotrauschen)

I II III

A

B

C

198 Anhang

8.3 Protokolle und Lösungen für die Multi-Site Optical RecordingTechnique

DI-8-ANEPPS (MW: 592,88 g/mol), Molecular Probes D-3167

DI-8-ANEPPS 5,0 mg

DMSO 625 µl

Stammlösung (13,5 mM) aliquotieren zu 60 µl, bei 4 °C lichtgeschützt lagern

Aliquods jeweils vor Gebrauch 10-15 min im Ultraschallbad bei 40 °C erwärmen

Farbstofflösung für ‚lokale Färbung‘ mit Spritzpipette (200 µM)

tgl. frisch ansetzen

Pluronic - F127 1,65 mg

Krebs-Lösung 400 µl

10-15 min im Ultraschallbad bei 40 °C auflösen

Stammlösung (13,5 mM) 6,0 µl


Farbstofflösung für ‚systemische Färbung‘ des Gewebes (20 µM)

tgl. frisch ansetzen

Pluronic - F127 1,65 mg

Krebs-Lösung 4,0 ml


Stammlösung (13,5 mM) 6,0 µl


DI-4-ANEPPS (MW: 481 g/mol), Molecular Probes D-1199

DI-4-ANEPPS 5,0 mg

DMSO 625 µl

Stammlösung (10,3 mM), bei 4 °C lichtgeschützt lagern

DI-8-ANEPPQ (MW: 732 g/mol), Molecular Probes D-6925

DI-8-ANEPPQ 5,0 mg

DMSO 500 µl

Stammlösung (13,6 mM), bei 4 °C lichtgeschützt lagern

Protokolle und Lösungen der Pharmaka für neuropharmakologische Untersuchungen 199

8.4 Protokolle und Lösungen der Pharmaka für neuropharmakologischeUntersuchungen

Acetylcholin (MW: 182 g/mol), Sigma A-6625

Aqua bidest. 1,0 ml

Acetylcholinchlorid 1,8 mg

Stammlösung aliquotieren zu 50 µl, bei –20 °C lagern

Endkonz. für Spritzpipette 0,5 mM

Stammlösung (10-2 M) 50 µl

Krebs-Lösung ad 1,0 ml

Atropin (MW: 676,8 g/mol), Sigma A-0257

Aqua bidest. 1,0 ml

Atropin 0,7 mg

Stammlösung aliquotieren zu 50 µl, bei –20 °C lagern

Endkonz. für Perfusion 0,5 µM


Krebs-Lösung ad 100 ml

lichtsensitiv

Calcium-depletierte Lösung; ‚low-Calcium high-Magnesium‘-Lösung

Na H2 PO4 MW: 120,0 g/mol, 1,2 mmol/l 0,144 g





Mg Cl2*6H2O MW: 203,3 g/mol, 16 mmol/l 3,25 g


Ca Cl2*2H2O MW: 147,0 g/mol, 0,25 mmol/l 0,037 g

Aqua bidest. ad 1,0 l

200 Anhang

Cobald-/Cadmiumchlorid-Lösung





MgCl2*6H2O MW: 203,3 g/mol, 2,5 mmol/l 0,244 g


CaCl2*2H2O MW: 147,0 g/mol, 1,2 mmol/l 0,368 g

CoCl2 MW: 237,9 g/mol, 2 mmol/l 0,476 g

Hexamethonium (MW: 362,2 g/mol), Sigma H-0879

Aqua bidest. 1,0 ml

Hexamethoniumbromid 36 mg

Stammlösung (10-1 M), bei 4 °C lichtgeschützt lagern

Endkonz. für Perfusion 200 µM



Endkonz. für Spritzpipette 1 mM



Kaliumchlorid Lösung (MW: 74,551 g/mol), Merck

Aqua bidest. 100 ml

Kaliumchlorid 3,73 g

mit 5x10-1 M Kalium-Acetat-Lösung auf pH 7,25 einstellen

Stammlösung (5x10-1 M), bei 4 °C lagern


Stammlösung (5x10-1 M) 213 µl

Krebs-Lösung mit 17 mM NaCl 850 µl

Protokolle und Lösungen der Pharmaka für neuropharmakologische Untersuchungen 201

Nifedipin (MW: 346,3 g/mol), Sigma N-7634

Ethanol 1,0 ml

Nifedipin 3,46 mg

Stammlösung (10-2 M), bei 4 °C lagern, wöchentlich erneuern

Endkonz. für Perfusion 1 µM - 5 µM

Stammlösung (10-2 M) 50 µl - 250 µl

Krebs-Lösung 500 ml

Mecamylamin (MW: 203,8 g/mol), Sigma M-902

Aqua bidest. 1,0 ml

Mecamylaminhydrochlorid 20 mg

Stammlösung (10-1 M), bei 4 °C lagern






Krebs-Lösung ad 1,0 ml

CdCl2 MW: 183,3 g/mol, 0,4 mmol/l 0,073 g


Suramin (MW: 1429,2 g/mol), Sigma S-2671

Aqua bidest. 0,699 ml

Suramin Natriumsalz 100 mg

Stammlösung (10-1 M) aliquotieren zu 100 µl, bei –20 °C lagern




202 Anhang

Tetrodotoxin, TTX (MW:511,4 g/mol), Tocris 1069

Aqua bidest. 1,9554 ml

Tetrodotoxin Citrat 1,0 mg

Handschuhe tragen, hgr. neurotoxisch;

Stammlösung (10-3 M) aliquotieren zu 50 µl, bei –20 °C lagern

Endkonz. für Perfusion 300 nM



8.5 Protokolle und Lösungen für die Immunhistochemie

Fixierlösung: 4 % Paraformaldehyd

Paraformaldehyd 2,0 g

Phosphate Buffer ad 50 ml

unter Rühren bei 60°C unter Abzug lösen, abkühlen lassen

Pikrinsäure (1,2 %). 100 µl

möglichst frisch ansetzen, max. 5 Tage bei 4 °C aufbewahren

Phosphate Buffer (0,1 M)

Aqua bidest. 800 ml

Na H2 PO4 * H2O 3,0 g

Na2 HPO4 * 2H2O 21,7 g

mit 1M NaOH oder 1M H3 PO4 auf pH 7,44 einstellen


PBS Phosphate Buffered Saline

NaCl 8,8 g

Aqua bidest. 800 ml

Phosphate Buffer (pH= 7,44) 116 ml


bei 4 ° lagern

Protokolle und Lösungen für die Immunhistochemie 203

PBS-Natriumazid (0,1 %): PBS/NaN3

Natriumazid (NaN3) 1,0 g

PBS ad 1,0 l

bei 4 ° lagern

8.6 Tabellenanhang

Tabelle 19: Erregungsverteilung innerhalb enterischer Ganglien (n=24) nach oraler bzw.

analer Stimulation interganglionärer Nervenstränge

MHH-Nr.

GanglionZellzahl

Oral Anal Projektions-unspez.

Projektions-spez.

Nuroral

Nuranal

Inaktiv

MC 888 2 0(0%)

2(100%)

0(0%)

2(100%)

0(0%)

2(100%)

0(0%)

MC 893 2 2(100%)

2(100%)

2(100%)

0(0%)

0(0%)

0(0%)

0(0%)

MC 840 4 0(0%)

1(25%)

0(0%)

1(25%)

0(0%)

1(25%)

3(75%)

MC 894 4 3(75%)

1(25%)

1(25%)

2(50%)

2(50%)

0(0%)

1(25%)

MC 893 5 5(100%)

0(0%)

0(0%)

5(100%)

5(100%)

0(0%)

0(0%)

MC 840 6 0(0%)

1(17%)

0(0%)

1(17%)

0(0%)

1(17%)

5(83%)

MC 827 7 3(43%)

4(57%)

3(43%)

1(14%)

1(14%)

0(0%)

3(43%)

MC 884 7 7(100%)

5(71%)

5(71%)

2(29%)

2(29%)

0(0%)

0(0%)

MC 891 7 4(57%)

5(71%)

4(57%)

1(14%)

0(0%)

1(14%)

2(29%)

MC 884 8 7(88%)

7(88%)

6(75%)

2(25%)

1(13%)

1(13%)

0(0%)

MC 827 9 5(56%)

6(67%)

5(56%)

1(11%)

0(0%)

1(11%)

3(33%)

MC 840 9 6(67%)

4(44%)

4(44%)

2(22%)

2(22%)

0(0%)

3(33%)

MC 840 9 4(44%)

0(0%)

0(0%)

4(44%)

4(44%)

0(0%)

5(56%)

MC 888 10 5(50%)

7(70%)

5(50%)

2(20%)

0(0%)

2(20%)

3(30%)

MC 891 10 9(90%)

8(80%)

8(80%)

1(10%)

1(10%)

0(0%)

1(10%)

204 Anhang

(Fortsetzung Tabelle 19)

MHH-Nr.

GanglionZellzahl

Oral Anal Projektions-unspez.

Projektions-spez.

Nuroral

Nuranal

Inaktiv

MC 897 10 8(80%)

5(50%)

5(50%)

3(30%)

3(30%)

0(0%)

2(20%)

MC 897 12 6(50%)

8(67%)

6(50%)

2(17%)

0(0%)

2(17%)

4(33%)

MC 884 15 15(100%)

9(60%)

9(60%)

6(40%)

6(40%)

0(0%)

0(0%)

MC 840 17 11(65%)

9(53%)

6(35%)

8(47%)

3(18%)

5(29%)

3(18%)

MC 856 17 13(77%)

15(88%)

13(77%)

2(12%)

0(0%)

2(12%)

2(12%)

MC 842 20 12(60%)

13(65%)

12(60%)

1(5%)

0(0%)

1(5%)

7(35%)

MC 845 20 14(70%)

13(65%)

12(60%)

3(15%)

2(10%)

1(5%)

6(30%)

MC 894 21 10(48%)

12(57%)

9(43%)

4(19%)

1(5%)

3(14%)

8(38%)

MC 827 25 18(72%)

13(52%)

13(52%)

4(16%)

4(16%)

0(0%)

8(32%)

205

DanksagungMein Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. M. Schemann, für die Überlassung derabwechslungsreichen, innovativen und fächerübergreifenden Thematik, für seine jederzeitzugesagte Unterstützung und für die Möglichkeit, völlig selbständig zu arbeiten.

Der Studienstiftung des deutschen Volkes möchte ich für die großzügige finanzielleUnterstützung danken. Darüber hinaus möchte ich mich ganz besonders bei Herrn Prof.Dr. H. Gasse und Herrn Dr. M. Brocker bedanken, da sie Ansprechpartner und Ratgeber injeder Phase der Dissertation waren und mich stets ermutigt und unterstützt haben.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. W. Drommer und den Mitgliedern derKommission für das Aufbaustudium, da ich das nach mehr als 30 Jahren auslaufendeAufbaustudium an der Tierärztlichen Hochschule abschließen durfte.

Herrn Dr. R. Koch, Fachgebiet Medizinische Physik der Tierärztlichen Hochschule, dankeich ganz besonders für die unkomplizierte und tatkräftige Hilfe in physikalisch-technischenFragen, für viele sehr bereichernde Diskussionen und für so machen guten Rat.

Allen jetzigen (K. Michel, M. Rohn) und ehemaligen Mitarbeitern (U. Firzlaff, H. Sann, M.Neunlist, K. Kamm, H. Pfannkuche, E. Köhn, D. Reiche, C. König) der „Arbeitsgruppe Schemann“möchte ich für die Arbeitsatmosphäre danken. Insbesondere danke ich Herrn Dr. MichelNeunlist für die Einweisung in die optische Apparatur und Herrn Dr. Klaus Michel für seineHilfe bei Computer- und Druckerproblemen. Frau Susanne Hoppe danke ich ganz herzlichfür die Unterstützung bei den immunhistochemischen Färbungen und für viele gute Ideen.Bei Frau Bärbel Leppich möchte ich mich sehr herzlich für die zahlreichen Hilfestellungenbei zeitaufreibenden „Kleinigkeiten“, für viele gute Taten und so manches aufmunterndeWort gerade in der Schlußphase der Dissertation bedanken. Herrn Dirk Voigtländer sei fürseine immer aufmunternde Hilfsbereitschaft gedankt.

Den Tierpflegern Michael Rohde, Yvonne Armbrecht und Nadine Helms danke ich sehrherzlich für ihr kompetentes Engagement bei der Zucht und Haltung der Meerschweinchenund bei der Versorgung der Mäuse (Stichwort: „Mäuse-Häuser“).Dem Feinmechanikermeister Klaus Grunert und den Auszubildenden der InstitutswerkstattPaul und Marian danke ich ganz herzlich für die reibungslose Planung und die schnelleAnfertigung der für die Versuche notwendigen Manipulatoren und für viele „dringendeBauteile“. Auch Herrn Schnabel möchte ich danken.

Allen Mitgliedern der „Arbeitsgruppe Dr. S. Bischoff“ an der Medizinischen HochschuleHannover insbesondere Frau Weiher, Nicole Abraham, Claudia Mierke und ThomasGebhardt sei für die schnelle und stets zuverlässige Bereitstellung des OP-Materials undder Rektumbioptate gedankt.

Herrn Wallbrecht vom Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannovermöchte ich für die freundliche und die stets pünktliche Bereitstellung der beidenMäusestämme danken.

Nicht zuletzt danke ich allen Mitarbeitern des Physiologischen Institutes, insbesondere FrauBecker und Frau Pufal.

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Simultane Registrierung neuronaler Aktivität im …Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover Simultane Registrierung neuronaler Aktivität im enterischen