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hrolf-kennebeck
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Die Messenger RNA (mRNA) erhält nach der Transkription sowohl eine 5‘-Kappe wie einen 3‘-Polyadenylat-Schwanz
5‘-Kappe
3‘-Poly(A)-SchwanzmRNA
(post-transkriptionale Modifizierung)
3‘ Polyadenylat-Schwanz
mRNA
5‘ 5‘ 5‘ 5‘
3‘
Spaltsignal
mRNA
n = 200 - 300 Nukleotide
der Polyadenylatschwanz wird erstzum Ende der Transkription von einemEnzym (PolyA-Polymerase) an dasgespaltende 3‘-Ende angehängt(Transkriptions-Termination)
Spaltung durchEndonuclease
Der polyA-Schwanz 1. erhöht Stabilität der mRNA2. wichtig beim Export dermRNA ins Zytoplasma
3‘ UTR
ORF
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Die Polyadenylierung der mRNA
DNA
RNA-Polymerase
polyA-PolymerasemRNA
Der Poly(A)-Schwanz erlaubt die einfache und schnelle biochemische Reinigung von poly(A)+ RNA
durch Affinitätschromatographie
Säule mit poly(U) gebunden an kleineSepharose-Kügelchen
reine poly(A)+ RNA>Northern, cDNA-Synthese, RT-PCR
Die Bildung der 5‘-Kappe an der mRNA erfolgt nur bei Eukaryonten
ungewöhnliches 5‘-5‘Triphosphat
7
2‘
5‘
5‘
3‘
der 5‘-Kappe wird noch während der Transkription von den entsprechenden Enzymen (“capping enzymes“)an das 5‘-Ende angehängt
die 5‘-Kappe erhöht die Stabilität der mRNA - Kontrolle der Gen-Expression
die 5‘-Kappe ist wichtig beim Export der mRNA in das Zytoplasma und bei der anschließenden Translation(Anlocken von Initiationsfaktorender Translation)
vom Gen kodiert später angehängt
RNA-Turnover
De-Adenylierung und Entfernung der 5‘-Kappe sind Signale zum Abbau der mRNA
5‘-Kappe
“decapping enzyme“
Die Cap-Struktur („Kopfgruppe“) eukaryontischer RNA-Moleküle
(A) wird bei der posttranslationalen Prozessierung abgespalten
(B) befindet sich am 5’ -Ende der mRNA und enthält einen methylierten
Guanylrest
(C) wird durch die RNA-Polymerase ll bei der Initiation der Transkription
synthetisiert
(D) blockiert bei der Translation die Peptidyltransferase-Reaktion
ist ein Produkt der Transesterifizierung beim Spleißvorgang
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
……eine weitere post-transkriptionale Veränderung
das Spleißen der Prä-mRNA
Die Entdeckung des Spleiß-Phänomensbis 1977 hatte man die Vorstellung, daß die DNA-Sequenz eines Gens co-linear mit der Aminosäure-Sequenz ist
als man aber die reife mRNA von bestimmten Genen isolierte (polyU-Affinitätschromato-graphie) und mit der entsprechenden DNA-Matritze hybridisierte und die DNA::RNA-Hybride im Elektronenmikroskop sichtbar machte, gab es eine unerwartete Entdeckung
>>>> die gereinigte mRNA war viel kürzer als die DNA-Matritze
Intron
Exon
TACGGATCGTA ACAGTAGGCTATAAC
AUGCCUAGCAU-UGUCAUCCGAUAUUG
NNNNCTA
NNNNCTA
NNNN N
Die Struktur des Hühner-Ovalbumin-Gens
DNA-Matritze
Elektronenmikroskopie Zeichnung
E
mRNA
die Schleifen A-G sind die 7 Introne, die im primären Transkript noch vorhanden sind,später aber bei der Reifung der mRNA herausgeschnitten werden.
das Entfernen der Introne wird als Spleißen (“splicing“) bezeichnet
AUGStop
Exon Intron
8000 Nts
Intronsequenzen werden durchSpleißen entfernt
reife mRNA
Protein (Ovalbumin)
Translation
Prä-mRNA
Chromosom mit 1.5 x 108 Nucleotid-Basenpaaren - ca. 3000 Gene
0.5% des Chromosoms enthält Gene >>> 15 Gene
ein Gen mit 105 Nucleotid-Basenpaaren
Promoter
Transkription
Intron Exon
Spleißen
mRNA
Prä-mRNA
Transkription Bildung der 5‘-Kappe
Exon Intron
Spleißosome
IntronSpleißen
Polyadenylierung
prä-mRNA
mRNA
> das Spleißen ist ein äußerst komplizierter Vorgang - ca. 300 Komponenten beteiligt
> der Spleiß-Enyzm-Komplex wird Spliceosome genannt
> die meisten Gene höherer Eukaryonten haben Introne (bis zu 40 pro Gen)
> die Exone sind weniger als 1000 BP lang, in der Regel 100-200 Nukleotide (entspricht 30-50 Aminosäuren)
> die Größe der Introne schwankt von 50 - 20 000 Nukleotide
> die DNA, die den Intronen entspricht, ist daher viel mehr als die DNA, die für die Exone kodiert (Gen > 50.000 BP; mRNA > 5.000 BP)
die Entfernung des Introns aus der Prä-mRNA muß äußerst präzise ablaufen, damit die reife mRNA korrekt für das entsprechende Protein kodiert
die Präzision muß auf ein Nukleotid genau sein (molekulares Skalpell)
prä-mRNA
mRNAKorrekt gespleißt
mRNAfalsch gespleißt
fehlerhaftes Spleißen > frameshift Mutation>andere Aminosäuresequenz
korrektes Spleißen
Wie schneidet das Spliceosom derart korrekt die Introne aus der Prä-mRNA?man findet beim Vergleich der Exon/Intron-Übergänge bzw. Intron/Exon-ÜbergängeConsensus-Sequenzen
A G G U A A G U…………………..C A G GConsensus-Sequenz
5‘-Spleißstelle 3‘-Spleißstelle
• die Basensequenz eines Introns beginnt GU und endet mit AG
• Introne haben noch eine wichtige interne Stelle, die stets ca. 20 - 50 Nukleotide stromaufwärts von der 3‘ AG-Spleißstelle liegt und Verzweigungsstelle (“branch site“) genannt wird. In Hefe lautet die Verzweigungsstelle nahezu immer UACUAAC (TACTAAC-Box)
• Bereiche zwischen der 5‘ und 3‘ Spleißstelle und der Verzweigungsstelle sind relativ unwichtig für das Spleißen des Introns
• durch Mutationen in jeder dieser drei wichtigen Regionen kann es zur Hemmung des Spleißens bzw. zu einem veränderten Spleißen kommen
• falsches Spleißen verursacht auch Krankheiten, z. B. einige Formen von Thalassämien = erbliche Blutkrankheiten (Anämien) >>> defekte Hämoglobinsynthese
Allgemeine Regeln bei den Spleiß-Consensus-Bereichen
5‘-Spleißstelle 3‘-Spleißstelle“branch site“
GUAAGAG UACUAAC CAG G.................
(1) Normale Globin prä-mRNA
Exon 2 Exon 3Exon 1 Intron 2Intron 1
(2) Mutierte Globin prä-mRNA
Exon 2 Intron 2
Punktmutation
Exon 1
verlängertes Exon
Intron 1 Exon 3
Exon 2 Exon 3Exon 1mRNA
Protein
Protein
-Thalassämien
128
kein Häm
-----CCTATTGGTCTATTTTCCACCCTTAG GCTG-------
-----CCTATAG GTCTATTTTCCACCCTTAG GCTG---
Mutation
Exon 2
Exon 3
normale Spleißstelle
Stop Codon
Exon 2
neue Spleißstelle
Exon 3 (2)
(1)
StopExon 2Exon 1mRNA Exon 3
am Spleißvorgang sind viele Komponenten beteiligt
Spleiß-Enzyme
5‘-Kappe3‘
U1U2
U5 U6
U4
U-snRNA (Uridin-rich, small nuclear RNA)
U-snRNAs
Proteine+
U-snRNPs(Snurps)
Exon 2Intron
konserviertes Ain TACTAAC-Sequenz
biochemisch handelt es sich beim Spleißen um die Spaltung und Neubildung von Phosphodiester-Bindungen = Transesterifizierungs-Reaktionen (ohne Energie)
das Spleißen beginnt mit einem nukleophilen Angriff der 2‘-OH-Gruppe des kon-servierten Adenins innerhalbdes Introns auf die 3‘-5‘Phosphodiester-Bindung am 5‘ Exon/Intron-Übergang
Exon 2
es entsteht das Lasso-Intermediat (“lariat“)
Ex1 Ex2
5‘ 3‘Verzweigung
U1 und U2 die 5‘-Spleißstelle und die Verzweigungsstelle
U-snRNPs(Snurps)
die verschiedenen U-snRNPs reagieren nacheinander mit den verschiedenen Spleiß-stellen, bis sich ein funktions-fähiges Spliceosom ausgebildet hat
U4, U5 und U6 lagern sich zusammen
bei der Bindung von U4, U5 und U6 kommt es zum 5‘-Spleißen
U6 hält Exon 1 im Spliceosom (Lasso-Bildung “lariat“)
U2 und U4 verlassen das Spliceosom
U1 verläßt das Spliceosom
U5 und U6 verlassen das Spliceosom
5‘
3‘
U1
Wie können die Snurps am Spleißvorgang teilnehmen?
die snRNA-Moleküle haben an den Stellen, an denen keine Proteine gebunden sind, einzel-strängige RNA-Bereiche, die komplimentär zu den Consensus-Bereichen im Intron sind
U1
U2
Exon 1 Exon 2Intron
Verzweigungsstelle5‘-Spleißstelle 3‘-Spleißstelle
U2 bindet an die Verzweigungsstelle
U1 bindet an die 5‘-Spleißstelle
U5 bindet an die 3‘-Spleißstelle
GUCCAUUCA
hemmendes Oligonukleotid
U1
Hemmung des Spleißvorgangs durch Auto-Immunantikörper
Hemmung des in vitro Spleißens durch Auto-Immunantikörper (Patienten mit systemischem Lupus erythematodes)
Autoimmun-Krankheit: Antikörper gegen zelleigene Proteine; z. B. gegen die Sm-Proteine der U-snRNPs
Gelenke und die meisten Organsysteme stark beeinträchtigt
>>>> Schlüsselrolle der U-snRNPs beim Spleißen entdeckt mit Hilfe dieser AK
Der Mechanismus des Prä-mRNA-Spleißens
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Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
Restriktionsendonukleasen
(A) sind am Spleißen von mRNA-Vorläufermolekülen beteiligt
(B) integrieren reverse Transkripte der Retrovirus-RNA ins Genom der Wirtszelle
(C) spalten die 5’-Cap-Struktur vom Ende der mRNA
(D) entfernen die Poly(A)-Sequenz vom 3’ -Ende der mRNA
sind Enzyme, die in Bakterien Phagen-DNA spalten
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
(E)
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
9 kb = 9 000 BP/3 = 3 000 AS x 100 Da = 300 000 Da
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
52Ein Gen enthält zwei Exons: Die Anzahl der Basen in der codierenden Sequenz beträgt 300 im Exon 1 und 600 im Exon 2. Die mittlere relative Molekülmasse der von diesen Exons codierten Aminosäuren ist 110/Aminosäure.
Welche relative Molekülmasse wird für das codierte Protein mit einem Fehler von plus/minus 1000 bestimmt?
(A) 3 000(B) 10 000(C) 33 000(D) 100 000(E) 330 000
Welche physiologische Bedeutung hat das Spleißen?
Warum gibt es Introne in der prä-mRNA, die beim Reifung zur mRNA entfernt und abgebaut werden?
warum Gene Introne haben ist in vielen Fällen noch unklar (Introne sind letztendlich Abfall!)
Welche physiologische Bedeutung hat das Spleißen?
Man kennt physiologisch-relevante Spleißvarianten:(1) alternatives Spleißen: erlaubt, aus einem einzigen Gen mehrere Genprodukte zu erhalten (Dogma 1 Gen > 1 Protein)(2) Trans-Spleißen: 5‘-Exon eines Gens wird an das 3‘-Exon eines anderen Gens gehängt >> dies ermöglicht der Zelle neue Genprodukte (Proteine) mit neuer Funktion zu schaffen
Alternatives Spleißen (z. B. 3‘-alternativ)
Beispiele für alternatives Spleißen findet man bei den Immunglobulinen, Myosine, Hormonen etc.
Exon 1 Exon 2 Alt.Exon
Exon 1 Exon 2
Exon 1 Exon 2Alt.Exon Intron
Alt.ExonIntron Intron
IntronAlt.Exon
5‘ 3‘
3‘
Der Lebenszyklus einer mRNA
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