ANALISI DEI LIPIDIANALISI DEI LIPIDI

L’analisi tradizionale, ancora oggi molto utilizzata, sibasa sulla determinazione di costanti analitiche moltosignificative che valutano particolari proprietà chimicheo fisiche dei lipidi

Analisi più sofisticate sul tipo di trigliceridi, sulla loroAnalisi più sofisticate sul tipo di trigliceridi, sulla lorocomposizione in acidi grassi o sui componenti minoridei lipidi, richiede l’uso di metodi strumentali.

INDICI FISICI Proprietà fisiche:

-peso specifico

-grado refrattometrico

INDICI CHIMICI Proprietà chimiche:

N°di acidità (degradazione idrolitica)

N°saponificazione (tipo di lipide o genuinità di un lipide noto)

N°iodio (insaturazioni acidi grassi)

N°perossidi, dieni, aldeidi che reagiscono con TBA (irrancidimento ossidativo)

ANALISI STRUMENTALE

Analisi spettrofotometrica

nell’U.V. delle insaturazioni coniugate

Analisi GC e HPLC

di trigliceridi

di acidi grassi,

di alcoli superiori e steroli

Indice di rifrazione = n

Costante fisica caratteristica di un lipide

i

r

A

B

va ≠ vb

n = va

vb

= sen i

sen r

n varia con λ del raggio incidente e con latemperatura (diminuisce con l’aumentare di t)

Grado refrattometrico - REFRATTOMETROREFRATTOMETRO

Indice di rifrazione

nt

Dè espressione del pesomolecolare medio degli acidigrassi e delle loroinsaturazioni

nt

Dgradi refrattometrici (scala 1,4220 – 1,48895)

1,4552

1,4580

44

48burro

1,4672

1,4679

62

63olio d’oliva

1,4742

1,4748

73

74olio di soia

L’analisi va condotta preferibilmente sul

grasso seccograsso secco

che si ottiene mediante

fusione,

decantazione,

separazione dell’acqua dai grassi,

essiccamento con Na2SO4 anidro,

filtrazione a caldo

Numero di aciditàNumero di acidità

Numero di mg di KOH necessari per neutralizzare gli acidi

grassi liberi presenti in un grammo di grasso

Determina gli acidi grassi liberi, cioè non esterificatipresenti nel lipide, pertanto ci informa sulla sua qualità(se ottenuto da una materia prima alterata) o sul suostato di conservazione.

In una beutaIn una beuta

si sciolgono 5-10 g di grasso in una miscela EtOH-Etere (1 : 2).

Si titola la miscela con KOH alcolica 0,1 N.

Indicatore: fenolftaleina

A · N · 56,1

p= N°di acidità

A = ml KOH 0,1N

56,1 = PM di KOH

p = peso del grasso

Acidità espressa come % di acido oleicoAcidità espressa come % di acido oleico

grammi di acido oleico libero contenuti in 100g di grasso

Si procede come già descritto e si calcola

A · N · 282

p · 1000· 100 = % acido oleico

282 = PM acido oleico

La legge fissa i valori di acidità per i diversi lipidi.

L’olio d’oliva viene classificato in base alla sua acidità

Con valori di acidità elevata l’olio d’oliva viene definitolampante.

Ha caratteristiche tali per cui non è commestibile, pertantonon può essere messo in commercio direttamente.

Deve prima essere rettificato

Numero di saponificazioneNumero di saponificazione

Numero di mg di KOH necessari per saponificare 1 g di

sostanza grassa.

In un palloncino:

2-3 g di grasso + 25 ml di KOH alcolica 0,5N

Si lascia bollire a ricadere per circa un’ora finchè la soluzione risulta limpida

Si raffredda e si titola l’eccesso di KOH con HCl 0,5N

Indicatore : fenolftaleina

(b – a) · N · 56,1

p= N°di saponificazione

Si esegue anche una prova in bianco

b = ml HCl 0,5N usati per titolare KOH nella prova in bianco

a = ml HCl 0,5N usati per titolare l’eccesso di KOH nelcampione

(b – a) = corrispondono ai ml di KOH effettivamente usati persaponificare il lipide

56,1 = PM di KOH

p = peso del grasso

Se il lipide ha un’acidità molto alta il numero di

saponificazione va sottratto al numero di acidità.

Il numero di saponificazione è espressione del peso

molecolare medio dei trigliceridi del lipide, pertanto

Burro = 220 valore elevato perché contiene acidi grassi a corta e media catena

Oli = 190-200

Olio d’oliva = 185-196

Numero di iodioNumero di iodio

Il numero di iodio misura il grado di insaturazione dellesostanze grasse

E’ rappresentato dalla quantità di iodio, espressa in grammi,che in determinate condizioni, è fissata da 100g di materiagrassa deacquificata e limpida.

Reattivo di Wijs: il reagente contiene 9 g di ICl3 inacido acetico glaciale eacido acetico glaciale e

tetracloruro di carbonio + 10 g polvere di iodio

si agita fino a che lo iodio si sia sciolto

Reattivo a titolo noto di iodio (tiosolfato)

Una quantità esattamente pesata di materia grassa è scioltain tetracloruro di carbonio (20ml). Si addiziona il reattivo diWijs (25ml) e si lascia reagire per la durata di un’ora al buio.Al termine di tale periodo si addizionano 20 ml di unasoluzione di KI al 10%, 100 ml di acqua, si agita e si titolacon tiosolfato 0,1N.

Indicatore: salda d’amido

Contemporaneamente si esegue una prova in bianco.

RCH = CH-R1 + ICl3 RCH – CH – R1

I Cl

KI + ICl I2 + KCl

I2 + Na2S2O3 Na2S4O6 + NaI

(b – a) · N · 126,9

p · 1000· 100 = N°di iodio

a = ml di tiosolfato usati per la prova reale

b = ml di tiosolfato usati per la prova in bianco

p = peso del campione prelevato per l’analisi

N = normalità tiosolfato

Numero di perossidiNumero di perossidi

Determinazione irrancidimento ossidativo

N° di perossidi = numero di milliequivalenti di ossigeno attivocontenuti in 1000 g di sostanza grassa

In beuta

Si pesano circa 1 g di grasso

Si addizionano 25 ml di miscela acido aceticoglaciale/cloroformio (3 : 2) eglaciale/cloroformio (3 : 2) e

0,5 ml di una soluzione satura di KI in acqua

Si lascia al riparo dalla luce per 2 minuti

Si titola con tiosolfato di sodio 0,01N

Indicatore: salda d’amido

2KI + ½ O2 + 2H+ I2 + H2O + 2K+

Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2NaI

(c – b) · N

p· 1000 = meq di ossigeno attivo

c = ml di Na2S2O3 N/100 usati per titolare il campione

b = ml di Na2S2O3 N/100 usati per titolare un bianco

Numero perossidi 10-20Numero perossidi 10-20

Determinazione aldeidi con acido tiobarbituricoDeterminazione aldeidi con acido tiobarbiturico

1g di grasso

10 ml di acido tiobarbiturico 0,01N

6 ml di HCl 0,7 N

In bagno maria bollente per 30 minuti

Dopo raffreddamento si addizionano 5 ml di acidotricloroacetico al 20%

Si filtra

Lettura spettrofotometrica a λ =532 nm contro un biancocostituito dalla miscela di reattivi senza grasso

ASSORBIMENTO nell’UVASSORBIMENTO nell’UV

In seguito a trattamento termico, esterificazione,idrogenazione, perossidazione e trattamento con alcali idoppi legami isolati si trasformano in doppi legamiconiugati che presentano una definita banda diassorbimento nell’UV.

La sostanza grassa è sciolta i isoottano

Si procede quindi alla lettura spettrofotometrica

DIENI λ = 233 nm

TRIENI λ = 262 – 268 – 274 nm

TETRAENI λ = 308 – 315 – 322 nm

PENTAENI λ = 346 nm

Burro

Olio d’oliva

N°saponificazione

220

185-195

N°iodio

26-40

<100

Grado refrattometrico

44-48

62-63

Olio di semi

Grassi solidi

Oli siccativi

190-200 >100

<80

>130

73-74 (soia)

DeterminazioneDeterminazione direttadiretta delledelle formeforme gliceridichegliceridichemediantemediante gasgas cromatografiacromatografia concon colonnecolonnecapillaricapillari

1

Mediante gas cromatografia con colonne capillari in vetrorivestite con metilsilicone polmero (SE 30), porzioni dimono-, di- e trigliceridi presenti in un olio possono esseredeterminate preparando i tetrametilsililderivati (TMS).

AnalisiAnalisi delladella componentecomponente triglicericatriglicerica mediantemedianteHPLCHPLC2 HPLCHPLC2

L’HPLC permette la separazione dei trigliceridi in funzione della lunghezza della catena e del grado di insaturazione degli acidi grassi che costituiscono il trigliceride. Questa tecnica però non consente di differenziare gli isomeri di posizione (per esempio PPL e PLP non vengono separati dal momento che i due trigliceridi possiedono lo stesso numero di atomi di C e lo stesso numero di doppi legami in quanto costituiti dagli stessi acidi grassi).

Strumentazione:

- colonna RP

- detector rifrattometrico differenziale o spettrofotometro

- fase mobile: acetone/CH3CN/CHCl3 30/50/20

1 Analisi gas-cromatografica

La gas-cromatografia permette la determinazione rapida edaccurata della composizione quali-quantitativa in acidi grassidei trigliceridi

I trigliceridi non si presentano come tali all’esame gas-cromtagrafico perché

sono poco volatili

si decompongono alle alte temperature

Si procede pertanto all’idrolisi ed alla preparazione degliesteri metilici degli acidi grassi

Preparazione degli esteri metilici da oli vegetali

Reattivo: 98 ml di MeOH + 2 ml H2SO4 + 0,1 ml benzolo

L’olio essiccato è trattato col reattivo in fiala che si chiude esi pone a 65°C per diverse ore.

Gli esteri metilici si estraggono con etere di petrolio.

Si secca con Na2SO4 anidro la soluzione eterea cheportata a piccolo volume può essere usata per l’analisigas-cromatografica.

La gas-cromatografia è condotta con l’uso di colonne ariempimento o capillaricapillari

Scelta delle condizioni operativeScelta delle condizioni operative

Nella scelta delle condizioni operative devono essere presein considerazione le seguenti variabili:

1- la lunghezza ed il diametro della colonna

2- la natura e la quantità della fase stazionaria

3- la temperatura della colonna

4- il flusso di gas vettore

5- la risoluzione necessaria

6- le dimensioni del campione da analizzare

7- la durata dell’analisi

La scelta delle condizioni operative deve quindi essere fattain base ai risultati che si ottengono analizzando una miscelastandard e devono soddisfare i seguenti requisiti:

a) deve essere possibile la separazione di tutti i seguentiacidi grassi: caprilico-caprinico-laurico-miristico-miristoleico-palmitico-palmitoleico-stearico-oleico-linoleico-arachico-linolenico-behenico-erucico.

b) la separazione deve essere totale (alla linea di base)

DETERMINAZIONE DEGLI ISOMERI TRANS

Il contenuto degli isomeri trans degli acidi grassi a numerodi atomi di C compreso tra 10 e 24 può essere determinatomediante separazione degli esteri metilici usando colonnecapillari che presentino una particolare polarità.

DETERMINAZIONE DEL GRASSO GREZZODETERMINAZIONE DEL GRASSO GREZZO

Principio del metodo:

I grassi, gli oli, gli acidi grassi sono caratterizzati dalla loroinsolubilità in acqua, dalla scarsa solubilità in alcool e dallasolubilità in solventi apolari (etere etilico e di petrolio, CS2,CHCl3, CCl4, esano, benzene,….); gli altri costituenti deiprodotti alimentari, ad eccezione di cere, resine,idrocarburi,steroli, vitamine liposolubili, clorofille e carotenoidi,non si sciolgono in quantità apprezzabili nei solventi polari

Pertanto i lipidi sono determinati per via gravimetricasfruttando le loro caratteristiche di solubilità, come estrattosfruttando le loro caratteristiche di solubilità, come estrattoetereo (estrazione solido-liquido), e poiché oltre ai grassi sonopresenti anche modeste quantità di sostanze estranee, ilgrasso estratto viene chiamato grezzo.

Apparecchiatura

estrattore Soxhlet

bilancia analitica

stufa termostata a 100-105°C

essiccatore

Reattivi

etere dietilico anidro,

oppure miscela etere etilico-etere di petrolio (frazione bassobollente: 35-45°C)

Procedimento

una quantità esattamente pesata di campioneviene essiccata in stufa e quindi introdotta nelditale di estrazione che viene chiuso con ovattasgrassata. Si effettua quindi l’estrazione etereain apparecchio Soxhlet per circa 8 ore. Dopoin apparecchio Soxhlet per circa 8 ore. Dopoevaporazione del solvente, si essicca in stufaper 1 ora a 100-105°C e dopo essiccamento inessiccatore, si pesa. Il grasso grezzo vieneespresso come percentuale riferita alla sostanzasecca.

ESTRATTOREESTRATTORE

SOXHLETSOXHLET

Refrigerante a bolle

Ditale di carta

sifone

Mantello riscaldante

PROCEDIMENTI Più RAPIDI DEL METODO SOXHLET, MA ALTRETTANTO PRECISI

1) Procedimento RÖSE GOTTLIEB(estrazione etero ammoniacale)

2) Metodo SCHMIT BONDZYUSKY(dosaggio del grasso nel formaggio)disgregazione acida + estrazione eteroammoniacale

3) Procedimento di BABCOCK (America)(recipiente di Babcock)

4) Procedimento di GERBER (Europa)Latte

(carne)4) Procedimento di GERBER (Europa)

acido solforico conc. a temperatura 55-60°C

5) MILKOTESTER (specifico per il latte)il contenuto è determinato sulla basedel peso specifico del campione o conmisure nefelometriche; completamenteautomatizzato dal prelievo delcampione al calcolo della percentualedi grasso

6) Metodo NIRS (Near Infrared System)per la determinazione del grasso nellatte: Milkoscan

(carne)

METODO di ROSEMETODO di ROSE--GOTTLIEBGOTTLIEB

DETERMINAZIONE DEL TENORE DI MATERIAGRASSA NEL LATTE

La determinazione viene effettuata per estrazione con etereetilico ed etere di petrolio di una soluzione etanolicoammoniacale dell’aliquota di analisi, seguita daevaporazione dei solventi e determinazione della massa delsolvente estratto solubile in etere di petrolio.

METODO di SCHMIDTMETODO di SCHMIDT--BONDZYNSKYBONDZYNSKY--RATZLAFFRATZLAFFRATZLAFFRATZLAFF

DETERMINAZIONE DEL TENORE DI MATERIA GRASSANEL FORMAGGIO E NEL FORMAGGIO FUSO

Il tenore di materia grassa è determinatogravimetricamente previa idrolisi del prodotto con acidocloridrico addizionato di alcool etilico e successivaestrazione della materia grassa della soluzione acidaalcolica con etere etilico ed etere di petrolio, evaporazionedei solventi e pesata del residuo.