Détermination de la fraction du génome codant pour les RNA ribosomiques et messagers dans le cerveau du rat adulte

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J. Mol. Biol. (1968) 33, 777-793

Determination de la Fraction du Ghome codant pour les RNA Ribosomiques et Messagers dans le Cerveau du Rat Ad&e

J. STEVENIN, J. SAMEC, M. JACOB ET P. MANDEL

Centre de Neurochimie du C.N.R.X., Imtitut de Chimie Biobgique Facultd de Mtiecine, Strmbourg, France

(Received 8 June 1967, and in revised form 29 January 1968)

The proportion of the total genome coding for ribosomal and messenger RNA in adult rat brain has been estimated by specific hybrid formation with homologous DNA.

The method of hybridization was that of Gillespie & Spiegelman (1966). The hybrid formation was optimum at 7O”C, in 4xSSC (0.6 M-NaCl-0.06 ~-sodium citrate) and kinetic studies showed that maximum hybridization was reached after 16 hours of incubation.

Saturation curves of DNA with brain ribosomal RNA show that a plateau is reached when approximately O*l6o/0 of the DNA has complexed with ribosomal RNA. Evidence for the specnicity of the hybrid and for the absence of con- taminating DNA-like RNA’s or spurious hybrids is as follows: (1) the ribosomal RNA has been prepared from polysomes treated with ribonuclease in such conditions that only the messenger RNA is hydrolysed (Jacob, Samec, Stevenin, Garel & Msndel, 1967) ; (2) transfer RNA’s have been eliminated on Sephadex G200 ; (3) the saturation plateau is reached for low RNA input (15 to 20 pg RNA/ml.) as expected when only a few RNA species are present ; (4) the base composition of the hybridized RNA is close to that of ribosomal RNA ((G+C)/(A+U) = 1.92).

On the basis of the DNA content per diploid rat cell, one would estimate that about 6000 cistrons are complementary to the two types of ribosomal RNA. The significance of this multiplicity of cistrons coding for ribosomal RNA may be related either to a large number of nucleolar organizers in the genome of the rat, or to a redundancy of ribosomal cistrons in a given nucleolar organizer.

The major dif%culty for the estimation of the DNA fraction complementary to messenger RNA’s is the direct determination of the specific activity of these RNA’s In the present work we have shown that, when isotopic equilibrium is reached, the specific activity of messenger RNA is equal to that of the alpha- phosphate atom of its precursors, the nucleoside triphosphates. 24 hours after intracisternal injection of 3aP the specific activities of the brain acid-soluble nucleotides are indeed identical and nearly constant for several days. The estab- lishment of saturation curves of DNA with RNA from brains of rats killed 24, 40 and 48 hours after the injection enabled us to calculate that 1.2% of the DNA was complementary to messenger RNA. In contrast to ribosomal RNA, the saturation curve represents, as expected, an addition of the saturation curves of many individual messenger RNA’s High concentration of input RNA (2 to 3 mg/ ml.) were needed to reach the plateau. The base composition of the hybridized RNA was DNA-like ((G+C)/(A+U)=0*64).

I f the molecular weight of messenger RNA’s is between IO5 and 106, the number of cistrons coding for them can be estimated to be 60,000 to 500,000. This may be due to an effectively high number of proteins coded for in the various types of brain cells, or to E redundancy of the cistrons coding for messenger RNA. There is also the possibility that some of the DNA-like RNA’s, the role and fate of which are not known yet, do not have a messenger function.

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778 J. STEVENIN, J. SAMEC, M. JACOB AND P. MAKDEL

1. Introduction Nous avons report& anterieurement (Jacob, Judes, Michaelidis, Stevenin & Mandel, 1965; Jacob, Stevenin, Jund, Judes & Mandel, 1966) l’existence dans le cerveau du rat adulte de RNA rapidement marques dont une partie importante sedimente plus rapidement que le RNA ribosomique 28 s et dont la composition en bases se rapproche de celle du DNA. Ces resultats suggerent la presence dans le cerveau de RNA mes- sagerat geants du type de ceux decrits par Scherrer, Marcaud, Zajdela, London & Gros (1966), et Scherrer & Marcaud (1965). ISous avions Bgalement Btudie les cin& tiques d’incorporation de precurseurs radioactifs dans lea RNA polysomiques (Jacob, Samec, Stevenin, Garel & Mandel, 1967). Avant d’aborder une etude plus appro- fondie de ces divers RNA, il semblait important de connaitre la fraction du genome codant pour lea RNA messagers et ribosomiques.

Lea techniques d’hybridation avec du DNA homologue permettent d’apporter une reponse a une telle question. Dana la premibre &ape de notre travail nous avons ktabli lea conditions optima d’hybridation pour lea RNA cerebraux. Nous avons ensuite determine la fraction du genome complementaire des RNA ribosomiques. De telles etudes avaient Qte effect&es pour des RNA ribosomiques d’autres tissus animaux mais lea valeurs obtenues par lea divers auteurs variaient de 0,02~,o chez l’embryon de poulet (Merits, Schulze & Overby, 1966) it 0,27% chez la drosophile (Ritossa & Spiegelman, 1965).

En cequi concerne lea RNA messagers, il n’est pas aise de determiner la fraction correspondante du genome, car leur activite specifique eat diflicile a Bvaluer et lea quantites de RNA hybrid&es sont t&s faibles. Nous avons tent& d’apporter une solution a ce probleme en tenant compte du fait que dans le cerveau, 1’activitG specifique des nucleosides triphosphates reste constante pendant une periode assez longue apres que l’equilibre isotopique ait et& Btabli. On peut done admettre, qu’a ces periodes, l’activite specifique des RNA messagers eat &gale a celle de leurs pr&urseurs directs, lea nucleosides triphosphates.

2. M&odes

(a) Composition de5 principaux tampons et solutions utilistb

Tampon A: Tris-HCl (pH 7,4) 0,Ol M, KC1 0,025 M, MgCl, 0,0025 M, saccharose 0,3 M.

Tampon B: Tris-HCl (pH 7,4) 0,Ol M, NaCl 0,14 M.

Tampon C: acetate de sodium 0,02 M (pH 5,1), polyvinylsulfate de sodium 20 pg/ml. SSC: NaCl 0,15 M, citrate trisodique 0,015 M. Des solutions diluees au dixieme ou au

centieme seront indiquees par 0,l SSC ou 0,Ol SSC; des solutions deux fois plus concen- trees par 2 X SSC, etc.

Phinol: phenol sature B 80% avec He0 et contenant O,l% de 8-hydroxyquinoleine. Mdange chloroforme-alcool isoamylique : 4 vol. de chloroforme, 1 vol. d’alcool iso-

amylique. Pronase: elle est incubee pendant 2 hr juste avant l’usage it 37°C it la concentration

de 1 mg/ml. Ribonu.cEkme pancdatique (RNase): une solution contenant 1 B 2 mg/ml. est chauffee

10 min k 80°C dans du SSC B pH 5,0 avant d’btre utilisee pour l’hydrolyse. Dboxyribonuckse pancrht@ue (DNase) : Worthington Blectrophoretiquement pure ;

l’absence de RNase de ces preparations a toujours et6 contrblee.

t Dans ce travail nous avons appele RNA massagers l’ensemble des RNA qui ne sont ni ribosomiques, ni solubles et qui ont une composition en bases proche de celle du DNA.

FRACTION OF THE GENOME CODING FOR BRAIN RNA 779

(b) Pr&naration du DNA La method0 est d&iv& de celle de Ritossa & Spiegehnan (1965). Sauf indication con-

trains, toutes les operations ont Bti effectuees entre 0 et 4°C. Le tissu est broye a la main dans un homogeneiseur de type Potter, dans du tampon A 8, raison de 10 ml. pour un cerveau de rat ad&e (environ 1,5 g de tissu frais). On centrifuge la suspension pendant 10 min a 7000 rev./min (20.000 g) dans le rotor no40 dune centrifugeuse Spinco. On obtient ainsi un culot contenant les noyaux qui est remis en suspension dans 15 ml. par cerveau de tampon B, contenant 0,5 y. de dodecylsulfate de sodium. On agite manuellement B. une temperature de 10°C pendant 5 min jusqu’a obtention d’un gel. On ajoute 0,6 vol. de phenol et on agite mecaniquement pendant 15 min. Cette agitation comme les suivantes doit &re relativement deuce pour Bviter les brisures des chaines de DNA. On centrifuge ensuite pendant 10 min a 6000 rev./mm (2750 g), dans une centrifugeuse Jouan refrigeree 8, 5°C. A la phase aqueuse ainsi obtenue, on ajoute de la ribonuclease a une concentration finale de 10 pg/ml. L’hydrolyse des RNA s’effectue a 35°C pendant 30 min. On procede ensuite a des deproteinisations en presence de 0,5% de SDS,? les deux premieres avec un demi- volume de phenol les suivantes avec un demi-volume du m&urge chloroforme-alcool isoamylique. On agite chaque fois pendant 10 min et on centrifuge l’emulsion pendant 10 min a 6000 rev./min (2750 g). Lea proteines restant dans la phase aqueuse, et en particulier la ribonuckkee, aont hydrolysees par la pronase (50 pg/ml.) pendant 2 hr a 37°C. On deproteinise a nouveau comme precedemment, 2 fois par le phenol et 3 8, 4 fois par le melange chloroform+alcool isoamylique. L’absence de ribonuclkse est testee a l’aide de RNA radioactif. Si on detecte encore une activite enzymatique, on rep&e le traitement a la pronase et les deprotknisations qui le euivent.

Le DNA est ensuite precipite par 1,2 vol. d’ethanol a 95’C et lea fibres sont recueillies sur un agitateur en verre. Elles sont redissoutes dans du 0,l SSC et la solution est conservee au froid a des concentrations de 1 8, 2 mg/ml. Toutes nos preparations de DNA ont Bte testees pour leur pouvoir matriciel dans la synthese de RNA par la RNA polymerase in vitro.

(c) Dhmturation du DNA Des solutions de DNA a 50 pg/ml. dans du 0,Ol SSC sont maintenues a 95°C pendant

6 mm. On les refroidit ensuite brusquement en lea plongeant dans un bain de glace. L’hyper- chromicite se situe entre 30 et 40%. Dans nos premieres experiences ou la denaturation s’effectuait a 100°C pendant 15 mm, la fixation du DNA sur les filtres selon la methode de Gillespie & Spiegelman (1965) Btait mains efficace.

(d) Prkparation et purijkation dea RNA Con-me pour le DNA, toutes les operations ont Bte effectuees entre 0 et 4”C, saufindication

contraire.

(i) RNA ribo8omique On prepare les polysomes du cerveau selon une methode d&rite ant&ieurement (Jacob

et al. 1967). Lea polysomes correspondant & un cerveau de rat sont mis en suspension dans 0,8 a 1 ml. de tampon A. On les traite par de la RNase a raison de 0,l pg/ml. pendant 30 mm a 0°C afin d’hydrolyser le RNA messager. Le RNA des ribosomes ainsi obtenu est extrait par le phenol: on agite pendant 10 min avec 0,8 vol. de phenol et on centrifuge a 6000 rev./min pendant 10 min (2760 g), pour &parer les phases aqueuse et phenolique. On deproteinise la phase aqueuse par agitation durant 10 mm, une fois avec un demi- volume de phenol, puis 2 a 3 fois avec un demi-volume du m&urge chloroforms-aloool isoamylique. Les phases aont a chaque fois separees par des centrifugations de 10 mm it 6000 rev./mm Les RNA sont ensuite precipites par 2 vol. d’ethanol en presence de NaCl o,l M.

Dans nos conditions exp&imentales (Jacob et al., 1967), il n’y a pas de modifications des proprietes de sedimentation des RNA ribosomiques et le RNA messager est degrade en fragments sedimentant a environ 4 s (Fig. l(a)). Ces fragments sont &mines par passage sur Sephadex G200 (voir section iv) comme le prouvent les Fig. I(E) et (b), qui presentent, avant et ap&s passage sur Sephadex, l’analyse en gradient de sacoharose des RNA

t Abreviation utili&: SDS, dodecylsulfate de sodium.

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t

(a) (b)

i ?

i

3000

2000

z -5

1000 2

w .e .$

:: 0 0 0 L a

500 ::

3

FIG. 1. Elimination des produits de d&gradation dcs RSA messagers polysomiques par passage sup Sephadex G200.

On a inject6 par voie intracisternale 1 mc de 3zP a des rats. Les animaux ont 6th sacrifles 2 hr apres l’injection et les polysomes ont Qte prepares et trait& par la ribonuclease comme decrit precedemment (Jacob et al., 1967). Le RNA a Bte extrait par le phenol froid. Apres d6prot&nisation et precipitation par l’hthanol, une partie aliquote a 6te deposee sur Sephadex G200 (voir Methodes). Un pie contenant la majeure partie de l’EasOmp initiale a Bte d&place immediatement apr&s le volume d’exclusion. Son RNA a Bte prtkipite par l’ethanol.

Les RNA (a) avant, et (b) apres passage sup Sephadex, ont Qte analyses dans un gradient lineaire de saccharose 4 b 20% dans un rotor SW25 (centrifugation 13,5 hr a 25.000 rev./min). L’extinction a 260 rnp est represent&e par -O---O-, et la radioactivite par --O--a-.

Notons que pour mettre en Qvidence la presence, puis l’elimination des RNA messagers d&ad&+, nous avons choisi un temps de marquage par le 3aP (2 hr) ou l’activite des RNA messagers est importante par rapport a celle des RNA ribosomiques.

extraits de polysomes trait& a la ribonuclease. Les fragments sedimentant aux environs de 4 s ont 6th retenus par le gel, alors clue les RNA ribosomiques ont Bte deplac& apres le volume d’exclusion.

(ii) RNA total

Des cerveaux de rat, frais ou lyophilises, sont broyes manuellement dans un homo- g&r&sew de type Potter & raison de 12 ml. de tampon C par cerveau, contenant 0,25% de SDS. On Porte ensuite iL 60°C pendant 3 min avec 0,8 vol. de phenol. On deproteinise avec le phenol, puis avec le melange chloroforme-alcool isoamylique et on precipite les acides nucleiques par l’ethanol comme pour le RNA ribosomique.

(iii) Elimination du DNA

Dams certaines experiences, on a elimint? le DNA contaminant les preparations en wtilisant sa solubilite dans des solutions salines 2 RI. On ajoute dans ce cas du SaCl en


cristaux a une solution contenant 1 8, 2 mg d’acide nucleique par ml. On l&se reposer une nuit a 0°C et on recueille par centrifugation un culot qui contient les RNA ribosomiques et messagers.

Dans la plupart des experiences cependant, nous avons hydrolyse le DNA par de la DNase. Les acides nucleiques sont dissouts dans du tampon B a raison de 1 ml. par cerveau, on ajoute du MgCl, 8, une concentration finale 0,005 M, de la DNase B 10 pg/ml. et on incube pendant 10 min a 37 “C. Puis on deprot&nise par le phenol et le melange oholoroforme- alcool isoamylique.

(iv) Elimination de petite8 molk~ulee radioactivea Certaines mol&ules incorporent t&s activement les phosphates radioactifs et conta-

minent les RNA devant servir aux experiences d’hybridation. Nous lea avons Bliminees en tirant profit de leur faible poids moleculaire et toutes nos preparations ont BtB soumises St ce traitement utilisant une colonne de Sephadex G200 de 12 mm de diametre et de 500 mm de hauteur. Le Sephadex est Bquilibm avec du tampon B qui sert Bgalement au deplacement des substances. Les operations sont effect&es en chambre froide. 1 8, 2 ml. dune solution de RNA (de 1 a 4 mg/ml.) sont places au sommet de la colonne. Un pit contenant lea RNA ribosomiques et messagers est recueilli imm&liatement apms le volume d’exclusion.

L’efficacite de cette purification appardt lorsqu’on pr&ipite le RNA a l’acide et que l’on mesure la radioaotivite des constituants acidosolubles. Elle est 8 a 100 fois plus Blevee que celle du RNA qu’elle accompagne au tours des precipitations a l’ethanol, alors qu’elle eat pratiquement nulle apres passage sur Sephadex.

Un autre avantage de cette operation est l’elimination des RNA de faible poids moleculaire, tels que les RNA de transfer% et les RNA 5 s et des fragments rtkultant d’une degradation ribonucleasique (voir i).

(e) Marqtmge du RNA

On injecte aux rats, par voie intraoisternale, 1 B 2 mc de 3aP(P-32-S-1, H3P0, sans entraineur, CEA, France) dans 0,050 ml. de NaCl 0,l M. Apres le temps de marquage choisi (voir plus loin), les snimaux sont sacri@s par decapitation.

(f) rryaridatio?a Nous avons utilise la methode de Gillespie & Spiegehnan (1965). On trempe les filtres

(Gottingen MFSO) dans du 2 x SSC pendant quelques minutes. Puis une solution a 10 pg/ml. de DNA denature dans du 2 x SSC est pass& lentement sur lea flltres. Dana nos conditions exp&imentales des filtres de 26 mm de diametre retiennent de 80 a 100 pg de DNA. Lee 6ltres sont s&h& pendant 4 hr 8, la temperature ambiante, puis pendant 2 hr sous vide a 80°C.

Dans certains cas oh de faibles quantites de DNA sont n&essaires, on decoupe des rondelles de 5 mm de diem&e dans lea filtres et on calcule la quantite de DNA correspondante.

Pour l’hybridation, le 6ltre est place dans un flacon contenant de 1 8.3 ml. de la solution de RNA a Studier et on incube dans un bain-marie B. la temperature choisie (voir plus loin). Dans le cas des filtres de 6 mm de diametre, on utilise generalement 0,2 ml. de solution de RNA.

Une fois l’incubation ache&e, le 6ltre eat lave de chaque c6ti avec 60 ml. de 4 x SSC. Le RNA non hybrid6 est &mine par incubation pendant 1 hr a 30°C avec 10 pg de RNase /ml. dans du 2 x SSC. Chaque cot6 du filtre eat a nouveau lave avec 50 ml. de 4 x SSC. Lea 6ltres sont ensuite s&h& a temperature ambiante et leur radioactivite mesuree comme dans la methode de Nygaard & Hall (1963). Nous discuterons plus loin le probleme des temoins d’hybridation.

(g) Ddtermination de l’activite’ spkifique dea nude’otides oxidosolublea

Une partie aliquote de poudre de cerveau lyophilise (200 mg) eat extraite 2 fois avec de HCIOb 0,6 N a 0°C. Les fractions surnageantes r&mies sont amenees 8, pH 5 environ avec KOH 6 N. Le precipite de KCIOl est &mine par centrifugation, La fraction surnageante eat pas&e sur une colonne de charbon active (Barnabey-Cheney, 1684) de 10 mm de diametre


et 20 mm de hauteur. On lave ensuite la oolonne avec de l’eau jusqu’a ce que la radioactivite de l’effluent soit reduite it moins de 0,l O! de la radioactivite totale. Puis on Blue les nucleotides adsorb& par un melange alcool 95’, HzO, NH40H concentre it 23% (4 :4 :2 par vol.). On Bvapore les solvants par un courant d’air chaud et on reduit le volume jusqu’a environ 1 ml. qu’on depose sur une colonne de Dowex 1 x 8, forme formiate (10 mm de diametre, 100 mm de hauteur). On Blue 1’AMPpar un gradient lineaire de 0 a 1 N d’acide formique (160 ml. HzO, 150 ml. HCOOH). Lorsqu’on desire Bluer le GMP et l’UMP, on utilise un nouveau gradient lineaire de 1 N a 3 N en acide formique (150 ml. chacun). Les fractions correspondant au sommet des pits sont rassembkks, on mesure leur densite optique et leur radioactivite et on calcule leur activite specifique.

(h) D&ermination de 2’activitS spicifique des RNA hybrid& avec Ee DNA Les RNA sont hybrid& avec le DNA et l’exces de RNA est &mine selon la technique

d&rite precedemment. Pour obtenir des quantites de RNA dosables, il est necessaire d’utiliser 8 filtres ayant immobilise 80 eg de DNA chacun. A&r d’evaluer la contamination par la nitrocellulose, par le DNA et par du RNA 6x6 non specifiquement, il faut deux types de temoins: T1 con&it& par 8 filtres ne contenant pas de DNA mais incubes avec le RNA dans les conditions de l’hybridation, T, constitue Bgalement par 8 fltres avec du DNA mais incubes saris RNA dans les memes conditions. Les temoins sont trait& paralklement aux essais tant pour les lavages suivant l’hybridation que pour l’elution et la purification du RNA que nous decrivons maintenant.

Les flltres sont incub& dans de l’eau a 70°C a raison d’un ml. par filtre pendant 4 hr. Cette operation est repetee une seconde fois. Les Bluats sont r&mis, on ajoute de la potasse de maniere it obtenir une concentration finale de 0,3 N et on laisse une nuit a 37°C. On Porte a pH 6 avec de I’HC104 3 N et on &mine le KCIOl par centrifugation. La fraction surnageante est deposee sur une colonne de charbon (8 mm de diametre, 10 mm de hauteur) . Apres adsorption, la colonne est la&e it I’eau puis it l’ethanol Q 20%, et l’elution est effect&e avec le melange alcool, eau, ammoniaque (4:4:2 par vol.). On Bvapore le solvant jusqu’a un volume d’un ml. environ qu’on depose sur une colonne de Sephadex G25 coarse (12 mm X 300 mm) Bquilibrks avec une solution de NaCl 0,Ol M. Le deplacement des nucleotides s’effectue avec la mhme solution. Deux pits peu &par& apparaissent apres le volume d’exclusion de la colonne (Fig. 6). Le premier contient du DNA contaminant, le second les nucleotides marques et un peu de produits de degradation de la nitrocellulose. On recueille les fractions correspondant a ce second pit et on elimine l’eau par lyophilisation. On reprend ensuite dans 0,25 ml. d’eau, on ajoute 0,25 ml. du reactif it l’orcine de Bial-Mejbaum (1939) et on Porte le melange a 1OO’C pendant 20 mm. Apres refroidissement, on centrifuge pour &miner de petites particules noiratres qui se sont formees. L’extinotion est alors determinee au maximum des spectres d’absorption des chromogenes du ribose (670 rnp) et des produits de degradation alcaline de la nitrocellulose (600 mr). Connaissant les rapports de extinctions a ces deux longueurs d’onde, on peut calculer la part des nucleotides du RNA dans la coloration obtenue selon la formule :

A _ dm - d) a-b

ob A est l’extinction r&lle due au ribose a 670 mp, a et b les rapports ES70mJE6,,0nvr des chromogenes du ribose et de la nitrocellulose, m et n les extinctions mesurtks a 670 et 500 mp. La quantite de RNA est oalculQ en tenant compte que 1 unite de densite optique a 670 mp Bquivaut a 9,s pg de RNA.

On deduit de la valeur obtenue pour l’essai celle du temoin T, (RNA adsorb6 d’une faGon non speoifique sur le filtre) et celle du temoin Ta (contamination par le DNA).

La radioactivite de l’echantillon est mesun% sur une partie aliquote ce qui permet de calculer l’activitt? specifique du RNA.

(i) De’termination de la composition en bases des RNA hybrid& La technique de purification des RNA, utilisee pour la determination de l’activite

spkifique d&rite dans le paragraphe precedent, a Bte utilistk, mais on a omis le passage sur colonne de Sephadex. Apres evaporation des solvants, les nucktides ont Bte repris dans


50 ~1. d’eau, on a ajoutd des nucldotides 2’3’ non marqu& comme entraineur et une Blectrophor&se sur papier a permis de les &parer (Virmaux, communication personnelle). La radioactivite contenue dans lea taches correspondent aux 4 nucldotides a QtB d&er- min6e. Un tdmoin de type T1 a Bt6 trait6 paralldlement et I’activitd au niveau de chaque nucleotide a QtB r&ranch& de celle des p&&dents.

3. Rikultats (a) InJEuence de la tempe’rature SUT la formation des hybrides

Lorsqu’on utilise du DNA immobilis& SW des filtres, la temperature optimale d’hybridation peut 6tre choisie se1011 deux critcres: d’une part elle doit &re proche de la temperature de fusion du DNA afin de favoriser l’association des chaines complcmentaires de RNA et de DNA, d’autre part elle doit &re inf&ieure B la temperature de detachement du DNA des filtres. Nous avons effect& nos essais aux temperatures de 60, 70 et 80°C pour le RNA total et le RNA ribosomique du cerveau (Fig. 2). On observe une augmentation de la quantite de RNA radioactif hybrid6

L BOY IO0

4 0

50

FIQ. 2. Influence de la temperature sur la formation dss hybrides. RNA total. Sacrifice des animaux 30 min apres l’injection de 3aP. Dee filtres contenant 64 pg de

DNA ont Bte incub& avec 64 rg de RNA (activit8 specifique: 64 cts/min/pg)/ml. pendant 7 hr dans du 6 x SSC aux temperatures indiquees.

RNA riboeomique. Sacrifice 36 hr apres l’injection de anP. Des filtres contenant 64 pg de DNA ont Qt6 incubk avec 18 pg de RNA (activit8 sp&f?que 2000 cte/min/pg) pendant 8 hr dans du 6 x SSC aux tempbtures indiquhes. Les rbsultats sont exprimes en pourcentages de la radioactivite hybridbe a 70°C.

entre 60 et 7O”C, suivie d’une reduction assez consid&able quand on atteint 80°C. Nous avons v&if% qu’a cette dernicre temperature des quantit& importantes de DNA ctaient libkrees, entrainant le RNA qui y est fix&. A 7O”C, tout le DNA reste fix8 sur les f?ltres. C’est done cette temperature que nous avons adoptbe pour nos incubations.

(b) Cin&tique de la formation des hybrides

Nous avons incube dans des conditions identiques plusieurs tubes contenant chacun des quantitks Bgales du mQme RNA et un filtre avec la m6me quantitk de DNA. La reaction a 6tB ar.r&&e aprcs des temps d’incubation variables et la radio- activitd correspondant au RNA hybrid& a Qtk dctermin6e. La Figure 3 illustre les rkultats obtenus. L’hybridation s’effectue rapidement dans les premieres heures et atteint un plateau entre 14 et 16 heures. Des rkultats identiques ont QtQ obtenus

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0 20 40 Heures

FIG. 3. Cinetique de la formation des hybrides. RNA total (-o-O-). Sacrifice des animaux 7 hr apres l’injection de s2P. 26 pg de RSA

(activite speciflque 1380 cts/min/~g) dans 0,2 ml. ont 6th incubes avec des filtres de 5 mm de tliametre contenant 485 pg de DNA a 70% dans du 4 x SSC.

RNA ribosomique (-a--.--). 0 n a utilise le m&me RNA et les memes conditions d’inruba- lion (70°C) que dans la Fig. 2.

Lea resultats ont 6te exprimBs en pourcentages de I’hybridation maxima (272 cts/min pour le RNA total, 374 cts/min pour le RNA ribosomique).

pour les RNA ribosomiques et totaux. Par la suite nous avons r&uli&rement choisi

une duke d’incubation de 15 a 16 heures pour la formation des hybrides.

(c) InJluence de la concentration saline SW la formation des hybrides

Une concentration saline relativement Blevee est generalement souhaitable pour la formation des hybrides qui se dissocient en l’absence de sels. Nous savons Qgalement que le DNA est lib&e des filtres plus facilement dans des milieux pauvres en sels. Nous avons essay& de determiner la concentration saline optima pour l’hybridation; les rkultats de nos essais sont indiques dans le Tableau 1. Nous avons fait varier la concentration en SSC des milieux d’incubation, toutes les autres conditions experimentales &ant identiques. On remarque que la quantite de mat&e1 radioactif fix&e sur le filtre en l’absence de DNA represente 5 a 8% de celle due aux hybrides

TABLEAU 1

InJLuence de la concentration saline sur la formation des hybrides

ssc cts/min pour 100 pg de DSA cts/min temoin temoin total hybrid& cts/min hybrid6

x 100

2 13 257 244 5 4 23 283 260 8 6 103 300 197 34

On a utilise du RNA total de cerveau de rats sacri%s 7 h apres injection intrecisternale de s2P. Son activite speciflque Btait de 1380 cts/min/pg. Des flltres de 5 mm de diametre contenant 4,35 pg de DNA ont 6th incubes dans 0,3 ml. d’une solution de RNA 8.100 pg/ml. pendant 16hr g, 7O’C. Ils Ont fourni 1eS valeurs figurant d8IM Ia oolonne “total". Des filtres saris DNA incubes dans les m&mes conditions donnent les valeurs “temoins”, que l’on deduit des precedents pow obtenir l’activite due aux hybrides.


dans les milieux 2 et 4xSSC (0,3 et 0,6 M en NaCl) respeotivement. Lorsqu’on augmente la concentration saline a 6 x SSC (0,9 M en NaCl), on atteint une contamination de 34%. D’autre part, l’efficacite de l’hybridation elle-m&me est diminu6e. 11 parait done justi& d’incuber dans du 4xSSC oh l’efficacite de l’hybridation est la meilleure.

(d) Fixation du RNA 8ur desfiltres sans DNA ou contenant du DNA hB&oloque

Pour le contr&le de l’hybridation, nous avons utilise des llltres sans DNA incubds avec le RNA dans les conditions utilisees pour la formation des hybrides (temoins blancs). On peut invoquer que des t&moms de ce type ne permettent pas de tenir compte de la formation de faux hybrides tels ceux d&its par McConkey & Hopkins

TABLEAU 2

Spe’ciJiciti de la $x&ion du RNA SW des j&es avec ou saris DNA

Filtres

Exp Type de RNA RNA salt8 DNA avec DNA d’E. coEi avec DNA de rat

(mg/ml.) (cts/min Ld’W (cts/min (cts/min IYhIlUS) fare) retenus) retenua)

Ribosomique

Ribosomique

Ribosomique

Tote1

Total

0,040 0,040 0,040

0,040 0,040 0,040 0,040

0,005 11 80 6 105 66 0,010 17 80 14 105 83 0,020 15 80 26 82 137 0,040 31 80 38 82 166

0,52 24 6,16 0,80 36 6,X 1,14 51 6,15 1,30 44 6,15 2,15 53 6,15

13 20 25 20 31

0 7 9

693 91 693 127 693 163 693 184 6,3 234

0,67 9 6,16 I,13 16 6,15 2,26 41 6,15

693 214 6,3 271 693 351

20 20 17 - 40 13 - 80 32

20 14 40 27 60 16 80 39

Toutes les incubations ont 6tB effeotu&s il 67% pendant 15 hr dans un milieu 4 x SSC, et les filtres ont BtB trait& dans les conditions habituelles. Les rapports RNA/DNA sont ceux utilisk pour l’6t8blissement des courbes de saturation.

(1964) et Attardi, Huang & Kabat (1965a,b). Pour repondre a une telle objection, nous avons compare systematiquement la radioactivite flxee sur des temoins “blancs” et sur des flltres portant du DNA hdterologue d’Escherichia wli. Les resultats obtenus sont consign& dans le Tableau 2.

En ce qui concerne le RNA ribosomique, on constate, aux erreurs d’experience p&s, peu ou pas de differences entre la radioactivitt? fix& sur les flltres sans DNA et sur ceux contenant le DNA d’E. wli (experience C). Cette fixation augmente

786 J. STEVENIN, J. SAMEC, M. JACOB ASD P. ,1ASDEL

legerement, avec la quantite de RNA du milieu (C) et avec la quantite de DNA fix&e sur le filtre (A et B).

Pour ce qui est du RNA total (D et E) pour lequel l’etablissement dune courbe de saturation exige un rapport RNA/DNA Bleve, on observe Bgalement un leger accroissement de la radioactivite fix&e sur les deux types de filtres temoins en fonction de la concentration en RNA. Mais ici la radioactivite fixee sur le filtre portant le DNA heterologue est regulierement plus faible que celle fix&e sur le filtre sans DNA. Ceci peut Btre dQ a l’occupation par le DNA de certains sites de la nitrocellulose qui ne sont alors plus disponibles pour le RNA.

II apparait ainsi que, si la formation de faux hybrides existe sans nos conditions experimentales, elle est peu importante par rapport a la simple fixation du RNA sur la nitrocellulose. En aucun cas la fixation de RNA par formation de faux hybrides, n’excede la fixation du RNA sur les filtres. 11 en resulte que l’adoption du temoin “blanc”, a la place d’un temoin avec du DNA hkterologue, ne modifie pas les valeurs d’hybridation du RNA ribosomique mais reduit d’environ 10% celles du RNA total. 11 s’agit done de differences peu importantes.

(e) Saturation du DNA avec les RNA ribosomiques

Pour l’etablissement de la courbe de saturation du DNA par les RNB ribosomiques, il est indispensable de s’assurer de l’absence de contamination par d’autres especes de RNA. Les RNA de type messager, possedant des proprietes chromatographiques ou des caracteristiques de sedimentation proches de celles des RNA ribosomiques, doivent etre elimix&. C’est pourquoi nous avons adopt& une methode de preparation qui permet de degrader specifiquement les RNA messagers avant qu’ils ne soient extraits. A cet effet on fait subir a des polysomes, prepares a partir des microsomes, un traitement menage a la RNase dans des conditions oh le RNA messager est degrade sans que soient modifiees les proprietes de sedimentation des RNA ribosomiques (Jacob et al., 1967). Apres extraction des RNA par le phenol, les produits de degradation des RNA messagers sont &mines par passage sur Sephadex (Fig. 1). On obtient ainsi une courbe de saturation telle celle prBsent6e dans la Figure 4. La saturation est atteinte pour des concentrations de RNA de 15 b 20 pg/ml. La quantite de RNA hybrid&e varie dans ces conditions de 0,14 a 0,16 pg/lOO pg de DNA.

vg RNA

Fro. 4. Saturation du DNA par les RNA ribosomiques de cerveau. Sacrifice des animaux 5 jours apres injection de 3zP. Activite specifique du RNA ribosomique :

1320 &s/mm/g. Hybridation a 67’C pendant 15 hr dans du 4 x SSC. 55 a 75 pg de Dh’Apar filtre. Toutes les valeurs experimentales ont 6te rapport&es a 100 pg de DNA. La masse de RSA

hybrid6 a Qte calcuk en tenant compte de l’activite specifique du RNA ribosomique determineo independamment.


(f) Xaturation du DNA avec le RNA total du cerveau

Des experiences de saturation de ce type permettent de determiner la fraction du DNA complement&e des RNA messagers B condition que l’on connaisse l’activite specifique moyenne de ces derniers. Nous avons sdmis qu’elle Btait eggale L celle des nucleotides acidosolubles, pr&urseurs directs des RNA, pourvu que le temps Qcould entre I’injection et la sewike soit stisamment long pour que l’activitk specifique des divers nucleotides soit Bgale. Nous avons determine uniquement l’activite specifique de 1’AMP epres avoir v&if% qu’entre 24 et 48 heures elle etait &gale B celle du CMP et de 1’UMP. Dans le cerveau, l’activitk specifique des nucleotides varie peu pendant une periode assez longue apres que l’equilibre isotopique (observation non publiee) ait Qte atteint. 11 est done t&s probable que les RNA messagers B renouvellement rapide comme ceux & renouvellement lent sont synth&is& & partir d’un pool de nucleotides aytysnt la m&me activite specifique.

,O-

,5-

L 0

I I

1 2

pg RNA

3

FIQ. 6. Saturation du DNA par les RNA totaux du cerveau. Sacrifke apr&a l’injection de 32P: (a) 0, 24 hr; (b)@, 40 hr; (c) X, 48 hr. L’ectivit6 spkifique du RNA messager a Bt6 suppos6e 6g,ale & celle des nucl6otides acido-

solubles et a permis de ordculer la quantit6 de RNA messager fk6e sur 100 pg de DNA (en ordonnbe).

La Figure 5 illustre les rksultets de trois experiences oh les animaux ont et6 sacrifi& 24,40 et 48 heures apres injection intracisternale de 2 mc de 32P. La saturation du DNA est atteinte pour des concentrations de RNA de l’ordre de 2 mg/ml., alors qu’il en fall&it 20 pg/ml. pour les RNA ribosomiques. 11 est B remarquer que l’allure g&r&ale de la courbe de saturation, differente de celle obtenue avec des RNA ribosomiques, peut certainement s’expliquer par I’h&&og6ntW de la population de RNA messagers dont nous n’&udions ici que I’ensemble.

La quantite de RNA hybrid6 & saturation se situe entre I,15 et I,31 pg/lOO pg de DNA. De ces valeurs, il convient de deduire la, part qui revient aux RNA ribosomiques. Nous l’avons calculee pour chaque experience et elle n’excede jamais b saturation 5% de l’rtctivite du RNA hybrid& On trouve dans ces conditions que lea RNA messagers sont complementaires d’environ 1,20% du DNA.

(g) Dt%ewnination de l’activitk s~t!ci$que du RNA hybrid6

La determination de la quantite de RNA messager complementaire du DNA n’a Bvidemment de valeur que tant que nos p&misses sont exactes. 11 importait done de


demontrer que l’activite spdcifique du phosphate des RNA messagers ou du moms des RNA hybrid&, est &gale a celle du PGC des nucleosides triphosphates. Cette demonstration presente des difficult& techniques Qvidentes: il faut 5 a 10 mg de RNA au depart pour obtenir 5 pg de RNA hybrid& Ce RNA est fix6 a environ 500 pg de DNA. De plus dans les conditions d’elution du RNA-DNA du filtre de nitrocellulose, une partie de celle-ci est entrain&e dans la solution. 11 est done difficile de doser le RNA dans l’eluat par son absorption dans l’ultra-violet, car le DNA et la nitrocellulose interferent, par le P car le DNA interfere, par la reaction du ribose avec l’orcine car la nitrooellulose et le DNA donnent des reactions parasites. Nous avons done essay6 d’eliminer dans toute la mesure du possible les causes d’erreurs resultant de la presence de DNA et de nitrocellulose.

Voici les diffkrentes &apes de la purification que now proposons et leur justification. Apres hybridation et elimination du RNA non hybride, les filtres sont maintenus a 70°C dans l’eau pendant quatre heures. Dans ces conditions dans lesquelles l’hybrido est denatur6, 25% du DNA sont elu&, 80 it 90% du RNA passent dans la solution. Une de&&me extraction de quatre heures fournit le reste du RNA. On degrade alors le RNA en nucleotides par hydrolyse alcaline.

Une partie au moins de la nitrocellulose et la majorite du DNA sont Blimin& par un passage sur une colonne de charbon comme l’ont montre des essais preliminaires ; le DNA ne s’elue que t&s peu de la colonne; des produits de degradation de la nitrocellulose se retrouvent dans l’eau et dans l’ethanol a 20% ayant servi au lavage. Les nucleotides avec, cependant, une fraction des contaminants, sont Blut% a l’ammoniaque- ethanol-eau. Le rendement en RNA marque, a ce stade, est de 85%. Aprils Bvapora- tion des solvants, on depose l’eluat de la colonne de charbon sur Sephadex 625. Le DNA p&sent est d&place immkliatement apres le volume d’exclusion, suivi des nucleotides du RNA (Fig. 6). Des mesures de radio activitd sur des parties aliquotes permettent de delimiter le pit de ribonucleotides qui est recueilli. Le rendement en materiel radioactif est alors de 40 a 66%.

IO

Fractions

FIQ. 6. Colonne de Sephadex G26 montrant les pits de DNA et de nuclirotides marquk L’Bluat de la colonne de charbon (voir texte) a Bt6 Qvapor6 sous vide, repria dans NaCl 0,01~,

puis port6 sur une colonne de Sephadex G26 de 12 mm de diambtre et de 300 mm de hauteur. Le d6placement a 6t6 effectu6 par du NaCl 0,Ol~; -@-a-, E,,,; --e---O--, 32P radio- activit6 (cts/min).


Ces nucleotides sont encore contamines par des produits de degradation de la nitrocellulose, par un peu de DNA et, bien entendu, par les nucleotides du RNA fix8 non specifiquement aux filtres pendant l’hybridation et que l’on &value grace au temoin T,.

On peut calculer la part qui revient a la nitrocellulose au tours du dosage du ribose par l’orcine en utilisant la formule donnee sous Methodes. Dans nos conditions experimentales, les rapports E870mP/E50,-,mP sont respectivement de 4,9 et de 0,37. Les valeurs dues au RNA fix6 non specifiquement et au DNA sont fournies respectivement par les temoins T, et T,, qui sont trait&s dans des conditions comparables.

11 faut ensuite soustraire du resultat la part qui revient aux RNA ribosomiques hybrid&. Sachant que 0,15Oh du DNA sont complementaires des RNA ribosomiques, connaissant la quantite de DNA au moment de I’hybridation, le taux de recuperation du RNA aprks les diverses operations et l’activite specifique des RNA ribosomiques, on peut calculer la quantite de RNA ribosomique presente dans l’echantillon et l’activite qui lui correspond.

11 est bien certain que cette methode laborieuse et delicate ne saurait donner des resultats strictement quantitatifs quand elle est pratiquee sur des quantites de l’ordre de quelques microgrammes de RNA. C’est pourquoi les resultats que nous presentons ne peuvent fournir qu’une approximation.

Deux experiences ont Bte effect&es. On a trouve pour l’activite specifique des nucleotides des RNA messagers hybrid&, 2850 et 7960 cts/min/pg contre 3385 et 6950 cts/min/pg respectivement pour les nucleotides acidosolubles, soit done 84 et 115% des valeurs que l’on pouvait prevoir. Ces chiffres paraissent satisfaisants et confirment done a la fois notre hypothese de depart et les resultats de son application.

(h) D&ermination de la composition en bases des RNA hybrid&

Les experiences ont Bte effect&es sur des cerveaux de rats sacrifies 23 L 26 heures apres l’injection de 32P dans le cas des RNA messagers et trois jours apres l’injection dans le cas des RNA ribosomiques.

Les resultats correspondant chacun a une moyenne de trois experiences sont indiques dans le Tableau 3.

Pour les RNA ribosomiques le rapport (G+C)/(A+U) est de 1,93, done superieur au rapport trouve pour les RNA ribosomiques dont la composition en bases a et&

TABLEAU 3

Composition en bases des RNA hybrid&

C A G G+C

U(T) ~ ASUP’)

RNA ribosomiquet 28,6 18,O 31,6 21,8 1,51 RNA ribosomique hybrid6 34,9 19,2 31,0 14,8 1,93 RNA hybrid6 messeger 17,3 31,7 21,6 29,4 0,64 DNA$ 20,o 29,l 21,5 29,4 0,71

t Jacob, St&en& Jund, Judes & Mandel (1966); $ Rosenberg (1959). C : cytosine ; A : adbnine ; G : guanine ; U: uracile ; T : thymine. La composition en bases des RNA hybrid& a Btk d&ermi&e par Blectrophokse sup papier

comme d&rit sous MBthodes. 51


determinee par densite optique (Jacob et al., 1966). Ces divergences resultent essen- tiellement d’un taux Bleve de cytosine et d’un taux faible d’uracile. Elles ne peuvent, etre dues ni a une contamination par des RNA de type messager qui ont un taux d’uracile Bleve et de cytosine faible, ni a la presence de produits de degradation du RNA par la RNase pancreatique, car le taux de guanine ne varie pas. La possibilitc que du RNA ribosomique non hybrid& interfere avec la composit,ion en bases de l’hybride, parait exclue: nous avons toujours tenu compte de l’act,ivite trouvtk au niveau des nucleotides des temoins apres chromatographie pour le calcul de la composition de l’hybride. Nous avons d’autre part montre qu’il n’y avait que trils peu ou pas de formations de faux hybrides dans nos conditions experimentales.

En ce qui concerne les RNA messagers, le rapport (G+C)/(AtU) est de 0,64, proche du rapport (G+C)/(Af-‘I’) du DNA (0,‘71). La teneur en cytosine est un peu plus faible que celle du DNA, celle en adenine un peu plus &levee. Les differences ne peuvent s’expliquer ni par la presence de RNA ribosomique contaminant, ni par la presence de produits de degradation de la RNase et ne semblent pas significatives.

Dans les deux cas, les RNA hybrid& ont une composition proche de celle que l’on peut prevoir pour des RNA purs de type ribosomique ou messager. On confirme ainsi que les taux d’hybridation determines experimentalement, correspondent k des RNA bien d&finis et non b un melange.

4. Discussion (a) Commentaire technique

11 est apparu quo pour obtenir du DNA entierement depourvu de RNA endogenc, comme l’exige l’hybridation, on ne peut Pviter un traitement b la RNase et que l’elimination de cette RNase necessite des traitements successifs a la pronase. Tl convient de s’assurer de l’efficacite de ces operations et de l’integrith du DN:Z obtenu. Dans ce but nous avons toujours teste les DNA pour leur pouvoir matricicl dans la spnthese in vitro des RNA par des preparations purifiees de RNA polymerasr. Nous avons constate que le pouvoir matriciel et la capacite d’hybridation Btaient inhibks parallelement ce qui a permis d’eliminer les preparations alterees.

Pour que les activites specifiques des RNA soient suffisamment &levees pour nos besoins, nous avons et& obliges de les marquer avec du 32P. Or d’autres constituants cellulaires qui incorporent ce precurseur contaminent les RNA et se fixent aisement sur les filtres de nitrocellulose. 11 est possible de les &miner par passage sur Sephadex 6200 d’oti ils sont exclus bien apres les RNA.

En ce qui concerne l’hybridation elle-meme, nous avons choisi la mcthodr de Gillespie & Spiegelman (1965), qui presente l’avantage d’une plus grande maniabilitc. Nous n’avons cependant jamais pu fixer plus de 100 pg de DNA sur des filtres dc 25 mm de diametre, c’est-b-dire environ trois fois moins que Gillespie & Spiegelman (1965) utilisant du DNA de E. co&. Dans nos conditions experimentales, a des temperatures de 65 L 70°C avec des concentrations salines 0,6 M NaCl, 0,06 M citrate de sodium, le DNA reste entierement fix8 aux filtres. L’utilisation de temperatures superieures provoque le passage du DNA dans le milieu d’incubation et,, par consequent, la reduction du taux d’hybridation observe. La concentration saline du milieu. optima pour l’hybridation, se situe aux environs de 0,6 M NaCl-0,06 hr citrate dr sodium. A des concentrations superieures, la fixation non specifique du RNA sui les filtres augmente dans de fortes proportions. A des concentrations inferieures, les taux d’hybridation obtenus sont irreguliers. Quant a la duree de la reaction


d’hybridation, l’examen des courbes montre qu’il faut environ 15 heures pour obtenir un maximum d’hybridation. Les resultats ont 6th identiques pour les RNA ribosomiques et pour le RNA total du cerveau. Merits et al. (1966), utilisant la m&me technique, ont adopt& des conditions analogues avec divers t&us de poulet.

(b) La fraction du gCnome codant pour les RNA ribosomiques

La saturation du DNA avec des RNA ribosomiques homologues a 4th frequem- ment Btudiee chez les batteries, les plantes et les animaux. Les valeurs se situent entre 0,2 et 0,4% du genome chez E. coli (Yankofsky & Spiegelman, 1962), Bacillus megaterium (Yankofsky & Spiegelman, 1963) et Bacillus subtilis (Oishi & Sueoka, 1965), et a 0,3% chez l’embryon de pois (Chipchase & Birnstiel, 1963). Chez les animaux les resultats sont beaucoup plus variables. Wallace & Birnstiel(l966) ont trouve 0,11x chez Xenopus luevis; Ritossa & Spiegelman (1965) 0,27x pour des droso- philes de type sauvage avec deux organisateurs nucleolaires; Attardi, Huang & Kabat (1965b) 0,005% pour le RNA ribosomique 28 s des cellules HeLa; McConkey & Hopkins (1964) 0,003~o dgalement pour le RNA 28 s de cellules HeLa ; et enfin Merits et al., (1966) 0,02% pour les RNA ribosomiques 28 et 18 s du poulet.

Les resultats que nous rapportons, 0,15% du DNA complementaires des RNA ribosomiques du tissu nerveux, sont nettement supkrieurs a ceux obtenus jusqu’a present pour des tissus de mammiferes et de poulet. On peut alors se demander si le taux d’hybridation relativement Bleve que nous obtenons n’est pas dill a la presence d’un type de RNA autre que le RNA ribosomique. Les RNA solubles &ant Qlimines par passage sur Sephadex G200, il fallait s’assurer de l’absence de contamination par des RNA messagers B forte activite specifique. La methode de preparation des RNA ribosomiques que nous utilisons et qui comporte une &ape preliminaire de degradation du RNA messager des polysomes, suivie de l’elimination des produits de degradation par passage sur Sephadex, rend une telle contamination peu probable. L’allure des courbes de saturation avec une atteinte du plateau pour des concentrations de RNA faible exclut Bgalement une telle possibilite. Enfin la composition en bases du RNA hybrid& presente les caracteristiques de celle du RNA ribosomique. Si l’on suppose alors que la contamination par un RNA &ranger est importante, il faudrait admettre que ce RNA a Bgalement une composition en bases de type ribosomique.

La formation de faux hybrides entre le DNA ou entre la nitrocellulose des filtres et le RNA peut &re invoquee pour expliquer un taux d’hybridation &eve. Les resultats des experiences de competition ainsi que de celles concernant la fixation du RNA sur du DNA heterologue rendent cette possibilitk improbable. Par consequent les resultats du travail suggerent que dans le cerveau du rat adulte, environO,lB% du DNA, soit 0,3% du genome si une seule des deux chames du DNA est transcrite, peuvent Qtre impliques dans la synthese dea RNA ribosomiques.

On peut se demander a combien de cistrons correspond cette fraction du genome. Les cellules oerebrales diplo’ides contiennent chacune 6,7 x 10-12g de DNA (Mandel, MQtais & Cuny, 1950). 0,15% de ce DNA, soit lo-14g, peuvent 6tre transcrits en RNA ribosomique. Le poids moleculaire moyen des RNA ribosomiques, &ant d’environ 10s, dans 10-14g il y aurait

10-14 108 x 6,02 x 10z3


soit 6000 molecules de RNA ribosomiques hybrid& par noyau diplo’ide, done 6000 cistrons sur le DNA correspondant.

Ceci reflirte une multiplicite de cistrons codant pour lea deux types de RNA ribosomiques. Une multiplicite de cistrons codant pour le meme type de RNA a Bte signalee chez B. megaterium par Yankofsky & Spiegelman (1963), qui trouvent 35 cistrons et 45 cistrons, complementaires des RNA ribosomiques 23 s et 16 s respectivement. La situation est Bvidemment plus complexe dans les cellules differenciees des tissus animaux. Lea RNA ribosomiques y sont synthktises a partir du DNA des organisateurs nucleolaires. C’est ainsi que, chez une drosophile avec deux organisa- tears nucleolaires, Ritossa & Spiegelman (1965) ont &value b 200 le nombre de cistrons codant pour chacun des RNA ribosomiques. La grande multiplicite de tels cistrons dans le DNA du rat pourrait s’expliquer par la presence d’un plus grand nombre d’organisateurs nucleolaires, qui ne seraient pas obligatoirement actifs dansle cerveau, ou par la presence de plus de cistrons ribosomiques par organisateur.

(c) La fraction du ge’nome codant pour les RNA messagers

On possede moins d’informations concernant la fraction du DNA codant pour lea RNA messagers dans les tissus animaux, probablement en raison de la difficult& St determiner l’activite specifique de ces RNA messagers. Davidson, Crippa, Kramer & Mirsky (1966) ont montre que 1,5% du DNA des oocytes du stade “lampbrush chromosomes” Btaient complementaires des RNA non ribosomiques synthetises et stock& a ce stade. Ces auteurs ont admis que dans leurs conditions experimentales, les activites spkcifiques de ces RNA Btaient Bgales a celles des RNA ribosomiques. Travaillant avec des embryons d’amphibiens, et considerant, comme nous-memes, que l’activite specifique des RNA messagers eat Bgale a celle des nucleotides acidosolubles, Denis (1966) trouve que lea RNA de gastrula d’embryons au stade du bourgeon caudal et de tetards, sont complementaires de 2,4, 5,0 et 8,9% du DNA respectivement. Le materiel qui a servi aux travaux que nous venons de titer a et& soit l’oocyte, soit des embryons entiers d’amphibiens. 11 s’agit la d’une situation fort Bloignee de celle d’un organe t&s differencie comme le cerveau du rat adulte.

Nous avons trouve que 1 ,S% du DNA Btaient complementaires des RNA messagers ou, plus precisement, de RNA n’etant ni des RNA ribosomiques ni des RNA de transfert et ayant une composition en bases proche de celle du DNA. Si l’on admet qu’une chaine seulement du DNA eat transcrite, on peut deduire que 2,4% du genome peuvent etre actifs dans le cerveau. Cette valeur est une valeur minima. En effet, s’il existe dans les RNA utilises pour l’hybridation, certains types de RNA messagers qui ont Bte synthetises a un taux beaucoup plus faible que d’autres, la masse critique necessaire pour detecter l’hybride avec le DNA ne sera pas atteinte pour lea premiers alors que lea RNA plus abondants auront deja sature le DNA. On sait en effet qu’il faut un grand exces de molecules du meme type dans le milieu pour saturer le DNA avec une espece donnee de RNA, ainsi qu’on l’a vu dans le cas des RNA ribosomiques.

En appliquant pour l’evaluation du nombre de cistrons la m&me methode que pour le RNA ribosomique, on trouve que 6,7x 1012x I,2 x 10w2=8 x lo-14g de DNA sont complementaires en moyenne des RNA messagers d’une cellule cerebrale. On peut essayer d’evaluer un poids moleculaires approximatif des RNA messagers en admettant qu’ils cadent pour des proteines contenant 100 $. 1000 acides amin&.

FRACTION OF THE GENOME CODING FOR BRAIN RNA

Leur poids moleculaire serait alors lo5 a lo6 environ. 11 y aurait done de

793

8x1O-14x6O2x1O23

105’

= 480 ooo B 8 x lo- l4 x 6,02 x 10z3 =

106 48.000 cistrons.

Ce sont 18 des valeurs t&s &levees. 11 faut cependant tenir compte que le cerveau total tel que nous l’avons etudie comprend de nombreux types cellulaires, dont une partie au moins des proteines est differente et que, comme dans le cas des RNA ribosomiques, il peut y avoir multiplicite des cistrons codant pour un m&me RNA messager. De plus une partie au moins des RNA hybride’s, qui ont une composition en bases proche de celle du DNA n’a pas obligatoirement une fonction messagere. C’est ce que suggerent, par exemple, les travaux de Shearer & McCarthy (1967) qui ont montre qu’il y avait un plus grand nombre de types de RNA complementaires du DNA dans le noyau que dans le cytoplasme ou s’effectue la traduction du message.

Ce travail fait partie de la these de doctorat es-sciences de Monsieur J. St&mm. Nous remercions le Professeur P. Chambon et le Dr M. Ramuz d’avoir bien voulu

tester nos preparations de DNA par la RNA polymerase. Le travail a Bte effect& avec l’aide materielle de la Delegation G&&ale B la, Recherche

Scientifique et Technique et du Commissariat B 1’Energie Atomique, DQpartement de Biologie.

REFERENCES

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Détermination de la fraction du génome codant pour les RNA ribosomiques et messagers dans le cerveau du rat adulte