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DETERMIN ACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS PARA EL PROCES O
DE INFECCIÓN VIRAL EN Pseudomonas aeruginosa Y S U IMPLICACIÓN EN
LA FAGO-TERAPIA.
DIANA CATALINA ARDILA MONTOYA
UNIVERS IDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C 2008
IQ‐2009‐I‐3
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DETERMIN ACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS PARA EL PROCES O
DE INFECCIÓN VIRAL EN Pseudomonas aeruginosa Y SU IMPLICACIÓN EN LA
FAGO -TERAPIA.
DIANA CATALINA ARDILA MONTOYA
Proyecto de grado presentado para optar el título de Ingeniera Química.
Asesor
ANDRÉS FERN ANDO GONZÁLEZ
Ingeniero Químico, Ph.D.
UNIVERS IDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C 2008
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“A las dos personas más importantes de mi vida,
mis padres Carmenza y Adolfo, por engrandecer
cada uno de mis días con su amor incondicional.
Gracias por tantos sacrificios y esfuerzos, y
sobre todo por creer siempre en mi”.
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AGRADECIMIENTOS
Y estoy aquí, la misma persona de siempre, un poco más enfocada en mi vida, supongo.
Esto, lo debo en parte a todo lo que aprendí con la realización de este trabajo de grado, el
cual me mostró el camino hacia lo que realmente me apasiona.
Quiero agradecer a las personas que de una u otra manera contribuyeron con la realización
de este proyecto y por consiguiente aportaron a mi vida:
A mis padres, porque a ellos les debo todo lo que soy.
A mi asesor Andrés Fernando González quien es una de las personas que más admiro,
gracias por aportar tanto a mi formación como ingeniera, por su amistad y sobre todo por confiar en mí y enseñarme que las cosas deben hacerse con pasión.
A la familia Hempe por el gran privilegio que me dieron.
A mis Hermanas Liliana y Paula. Lili, gracias por mostrarme que el camino es la
perseverancia. Pau gracias por ser mi amiga y dejarme ser tu ejemplo.
A José M aría Robles. Aunque no estés con nosotros te recordaremos siempre.
A Luz Dary Rugeles por ser mi gran ayuda en la realización de la parte experimental del proyecto.
A Miguel Ángel Tovar por su amistad y por transmitirme su conocimiento. Gracias por
enseñarme tantas cosas Miguel.
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A Nicolás Cuervo, por considerarme su hermanita y por ayudarme en la parte inicial de las
simulaciones.
A mis amigos, Nathalia Florez, Jenny Peña, Catalina Prada, Andrea Ramos, Liz Rodriguez,
Heidy Fajardo, Jaime Téllez y Jairo Buenaventura por su especial amistad y por ser mi
familia mientras la mía está lejos.
A mis Tías Rosalba M ontoya y M artha M ontoya y a M is abuelitas por estar siempre
pendientes de mi.
A Pablo Ñañez, por aportar con su conocimiento a la culminación de este proyecto, y sobre
todo por llenar mis días de Alegría.
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RES UMEN
La fago-terapia es una alternativa para combatir bacterias patógenas resistentes a
antibióticos. Ésta consiste en la utilización de bacteriófagos (fagos) o partículas virales que
infectan bacterias y por lo tanto inhiben el crecimiento de la población de células.
Con el fin de tener una mejor comprensión de la dinámica de infección viral se han
planteado modelos matemáticos que describen la interacción fago-bacteria, a partir de los
cuales es posible evaluar los parámetros que influyen en la velocidad del proceso infectivo
(parámetros cinéticos).
En este trabajo se pretende hallar los parámetos cinéticos del proceso de infección viral en
dos diferentes cepas de Pseudomonas aeruginosa: P1 y M 1C.1. Para esto se plantearon seis modelos, los cuales hacen diferentes consideraciones acerca del sistema.
Una vez los modelos estuvieron planteados, se realizo una optimización mediante recocido
simulado para disminuir el error entre los modelos y los datos in vivo obtenidos mediante
la realización de curvas de crecimiento.
Después de calculados los parámetros cinéticos se procedió a realizar una verificación de estos simulando el modelo con los resultados obtenidos. Se realizaron perfiles de la
variación en el tiempo de la población de células infectadas, no infectadas, densidad de
fago libre y concentración de sustrato, durante el proceso infectivo. A partir de esto se derterminó que el modelo seis es el que mejor se ajusta al comportamiento del s istema real
en P. aeruginosa P1, lo que quiere decir que para este sistema las células infectadas y no
infectadas crecen a diferentes tasas y que existe un periodo de latencia después del cual el
fago es activado. Para el P. aeruginosa M 1C.1 se encontró que el modelo que hace una mejor aproximación a los datos del sistema real es el modelo dos, sugiriendo de esta
manera que células infectadas y no infectadas tienen la misma velocidad de crecimiento,
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pero que la presencia del fago hace que esta disminuya en comparación con un sistema que
no ha sido infectado con fagos.
El hecho que para cada uno de los sistemas estudiados exista un modelo diferente que
describa el sistema in vivo, quiere decir que existe una diferencia significativa en el
comportamiento y dinámica de infección entre diferentes cepas de P.aeruginosa.
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TABLA D E CONTENIDOS
1. INTRO DUCCIÓ N .......................................................................................................1
2. OBJETIVOS ................................................................................................................4
2.1. General.....................................................................................................................4
2.2. Específicos...............................................................................................................4
3. MARCO TEÓ RICO ....................................................................................................5
3.1. FAGO-TERAPIA......................................................................................................5
3.1.1. Historia de la fago-terapia: Generalidades. .......................................................5
3.1.2. Ventajas y desventajas de la fago-terapia comparada con los ant ibiót icos ...........6
3.1.3. Estudios recientes in vivo ................................................................................9
3.1.4. Estado actual de la fago-terapia aplicada a Humanos ...................................... 11
3 .2 . PRI NCIPI OS DE L A BIOL OGÍA DE BACTE RI ÓFAGOS. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . 1 2
3.2.1. Ciclo lít ico ................................................................................................... 15
3.2.2. Ciclo lisogénico............................................................................................ 18
3.3. EST UDIOS ACERCA DE LA INTERACCIÓN FAGO-BACT ERIA. ....................... 20
3.4. MODELOS MATEMÁTICOS PARA DESCRIBIR EL PROCESO DE INFECCIÓN
VIRAL EN BACT ERIAS. ...................................................................................... 22
3.4.1. Aproximaciones determiníst icas .................................................................... 23
3.4.2. Algoritmos estocást icos................................................................................. 25
3.5. MÉT ODOS DE OPT IMIZACIÓN USADOS EN INGENIERÍA REVERSA. ............. 29
3.5.1. Método de los Mínimos Cuadrados ................................................................ 29
3.5.2. Recocido Simulado ....................................................................................... 30
3.5.3. Algoritmos genéticos .................................................................................... 32
4. MATERIALES Y MÉTO DOS ................................................................................... 35
4.1. DET ERMINACIÓN DE LA DENSIDAD ÓPT ICA DEL CULTIVO ......................... 35
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4.2. DET ERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA. .......................... 35
4.3. DET ERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CÉLULAS ............................ 36
5. MODELOS MATEMÁTICO S DEL SISTEMA ......................................................... 37
6. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETRO S CINÉTICOS .................................... 42
7. RESULTADO S Y ANÁLISIS .................................................................................... 45
7.1. RESULTADOS EXPERIMENT ALES ..................................................................... 45
7.2. PROCESO DE INGENIERÍA REVERSA ................................................................ 50
8. CONCLUSIO NES...................................................................................................... 58
9. RECO MENDACIONES ............................................................................................ 59
10. REFERENCIAS......................................................................................................... 60
11. ANEXO S.................................................................................................................... 68
ANEXO 1. PERFILES OBTENIDOS PARA P.aeruginosa P1. ............................................. 68
ANEXO 2. PERFILES PARA P.aeruginosa M1C.1. .............................................................. 75
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INDICE DE TABLAS
T abla1. Comparación entre los ant ibiót icos y los Bacteriófagos como agentes terapéuticos contra
infecciones bacterianas.................................................................................................7
T abla 2. Diluciones a sembrar de acuerdo con el porcentaje de transmitancia ............................... 36
T abla 3.Significado y unidades de las variables/parámetros de las ecuaciones de los modelos ...... 41
T abla 4. Parámetros cinét icos est imados para el proceso de infección viral en P.aeruginosa P1..... 50
T abla 5. Parámetros cinét icos est imados para el proceso de infección viral en P.aeruginosa M1C.1 ...................................................................................................................... 51
T abla 6. Cálculo de los mínimos cuadrados para los modelos 1-6 . P.aeruginosa P1..................... 55
T abla 7. Cálculo de los mínimos cuadrados para los modelos 1-4 . P.aeruginosa M1C.1 .............. 56
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Micrografía electrónica de un fago B33 con cabeza y cola. .......................................... 15
Figura 2.Micrografía electrónica de E.coli CR34 infectada con el fago PR4. a) 4 min después del
contacto. b) 8 min después del contacto. ..................................................................... 16
Figura 3. Ciclo lít ico de infección de un fago a una bacteria ........................................................ 18
Figura 4. Ciclo lisogénico de la infección de un fago a una bacteria............................................. 19
Figura 5. Proceso ut ilizado por recocido simulado para calcular los parámetros cinét icos de cada
uno de los modelos. .................................................................................................. 44
Figura 6. Absorbancia en el t iempo para P.aeruginosa P1........................................................... 46
Figura7. Concentración de células en el t iempo para P.aeruginosa P1 ......................................... 46
Figura 8.Concentración de glucosa en el t iempo para P.aeruginosa P1 ....................................... 47
Figura 9. Aabsorbancia en el t iempo para P.aeruginosa M1C.1................................................... 48
Figura10. Concentración de células en el t iempo P.aeruginosa M1C.1 ....................................... 49
Figura 11. Concentración de glucosa en el t iempo P.aeruginosa M1C.1 ...................................... 49
Figura 12. Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de concentración
de células no infectadas para P.aeruginosa P1........................................................ 52
Figura 13. Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de concentración
de células infectadas para P.aeruginosa P1 ............................................................ 52
Figura 14. Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de densidad de
fago libre para P.aeruginosa P1 ............................................................................. 52
Figura 15. Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de concentración
de sustrato para P.aeruginosa P1............................................................................ 53
Figura 16. Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración
de células no infectadas para P.aeruginosa M1C.1 ................................................. 53
Figura 17. Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración
de células infectadas para P.aeruginosa M1C.1...................................................... 54
Figura 18. Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de densidad de
fago libre para P.aeruginosa M1C.1 ....................................................................... 54
Figura 19. Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración
de sustrato para P.aeruginosa M1C.1 ..................................................................... 54
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1. INTRODUCCIÓN
Las infecciones nosocomiales o intrahospitalarias son aquellas que un paciente adquiere
después de su ingreso a un hospital u otra institución de salud (Organización mundial para
la salud, 1997-2002); éstas constituyen un problema de gran trascendencia económica y
social, además de ser un desafío para clínicas, hospitales y el personal médico responsable
(Lebeque et al, 2006). Son causadas por microorganismos como bacterias, hongos o
parásitos presentes en el hospital, o por la propia flora del paciente, y causan transtornos
discapacitantes que reducen la calidad de vida y generalmente la muerte del paciente
(Organización mundial para la salud, 1997-2002).
Particularmente se ha encontrado que la bacteria Pseudomonas aeruginosa es una de las causas principales de infecciones adquiridas y mortalidad en el medio hospitalario
(Lebeque et al, 2006). Afecta distintos sitios anatómicos y órganos como vías aéreas
superiores, pulmones, válvulas cardíacas, vías urinarias, infecciones en la vía quirúrgica en
pacientes post-operados y heridas abiertas (Lebeque et al, 2006).
En la actualidad el principal tratamiento utilizado para combatir dichas enfermedades de
origen bacteriano, es el uso de antibióticos. Sin embargo, algunas mutaciones en estas bacterias las han vuelto fármaco-resistentes, y por lo tanto la terapia con antibióticos no es
efectiva. Es por esto que se ha hecho necesaria la búsqueda de nuevos tratamientos anti-
bacteriales como lo es la fago terapia.
La fago-terapia consiste en la utilización de bacteriófagos (fagos) o partículas virales que
infectan bacterias y por lo tanto inhiben el crecimiento de la población de células
(Summers, 2001). El mecanismo que sigue el fago y que es aprovechado en la fago terapia, es comúnmente llamado ciclo lítico, y consiste inicialmente en el reconocimiento de la
célula por medio de la partícula viral, seguido de una inyección de la información genética
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de este (ADN o ARN) a través de la superficie celular. Posteriormente, el genoma del fago
se multiplica en el interior de la bacteria, usando su maquinaria replicativa, para formar
nuevas partículas virales, las cuales después de una lisis de la célula son liberadas para
iniciar un nuevo ciclo de infección (Hermoso et al, 2007). En cuestión de sólo horas las
bacterias son superadas en número por los fagos, lo que causa un exterminio en la
población.
Con el fin de tener una mejor comprensión de la dinámica de infección viral se han
planteado modelos matemáticos que describen la interacción fago-bacteria, los cuales son
una útil herramienta para el entendimiento de la base teórica de la fago-terapia. A partir de
dichos modelos es posible evaluar los parámetros que influyen en la velocidad del proceso
infectivo (parámetros cinéticos).
Lo anterior tiene una profunda implicación en la fago-terapia, ya que con el correcto
entendimiento de la dinámica de infección, es posible desarrollar y optimizar estrategias de
tratamiento con fagos que sean ef icaces para combatir bacterias patógenas (Sulakvelidze
et al, 2001).
De los estudios más recientemente publicados acerca de la dinámica de fagos en bacterias
es el realizado por Jain et al (2006),en el cual se realiza la investigación de la dinámica viral del fago MS2 en E.coli, implementando la discriminación de cinco modelos
determinísticos mediante estrategias probabilísticas. Dichos modelos manejaban hipótesis
y consideraciones diferentes acerca del sistema (Sulakvelidze et al, 2001).
El proyecto Bioprospección de microorganismos y análisis de su aplicación por medio de
técnicas de modelamiento, realizado por el Departemento de Ingeniería Química de la
Universidad de los Andes en conjunto con el Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIM IC) y la Fundación Santa Fé, busca analizar la efectividad de la actividad
bacteriolítica de bacteriófagos nativos a la hora de combatir enfermedades nosocomiales.
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Además pretende obtener un modelo que describa la interacción entre una específica clase
de bacteriófago y varias especies de bacterias causantes de infecciones hospitalarias que
prediga la variación en el tiempo de las poblaciones, y corroborar los resultados arrojados
por el modelo con variaciones medidas experimentalmente de estas poblaciones en tiempo
real.
En este trabajo, que hace parte del proyecto anteriormente descrito, se planteará un modelo
que permita evaluar y analizar el sistema Fago-P.aeruginosa, hallando los parámetros
cinéticos del sistema mediante métodos de optimización que reduzcan el error entre el
modelo y los datos experimentales. Se determinarán perfiles de la variación en el tiempo de
la población de células infectadas, no infectadas, densidad de fago libre y concentración de
sustrato, durante el proceso infectivo.
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2. OBJETIVOS
2.1.General
• Plantear un modelo que describa el proceso de Infección viral que se lleva a
cabo en P. aeruginosa y determinar los parámetros cinéticos del sistema
mediante métodos de optimización que reduzcan el error entre el modelo y los datos experimentales.
2.2. Es pe cí fi cos
• Determinar perfiles de la variación en el tiempo de la población de células
infectadas, no infectadas, densidad de fago libre y concentración de sustrato,
durante el proceso infectivo.
• Determinar los parámetros cinéticos del proceso de infección viral mediante
estrategias de optimización como mínimos cuadrados, recocido simulado o
algoritmos genéticos, de tal manera que se reduzca el error entre el modelo y los datos experimentales.
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3. MARCO TEÓRICO
3 .1. FAGO -TERAPÍA
La aparición de cepas de bacterias patógenas resistentes a antibióticos, se ha convertido en
un grave problema de salud pública. Es por esto, que se ha hecho necesario el desarrollo de
agentes antibacteriales totalmente nuevos, que permitan su implementación en tratamientos contra infecciones bacterianas. La fago terapia representa uno de estos nuevos tratamientos
(Hermoso et al, 2007).
3.1.1. Historia de la fago terapia: Generalidades.
La historia de la fago terapia comienza con las observaciones realizadas por el bacteriólogo
Británico Ernest Hanking en 1896 y el bacteriólogo Ruso Nikolay Fyodorovich Gameleya en 1898, los cuales reportan actividad antibacteriana dada por algún agente o sustancia
desconocido contra Vibrio cholerae y Bacilus subtilis respectivamente (Sulakvelidze et al,
2001). El tema no tuvo avance alguno hasta que en 1915 Frederik Twort, un medico bacteriólogo Ingles, lo reintrodujo en el ámbito de científico, reportando un fenómeno
similar al encontrado por Hanking hacia ya aproximadamente veinte años, con la
diferencia que Twort formulo una hipótesis, en la cual atribuye este fenómeno, entre otras
posibilidades, a la acción de un virus (Hermoso et al, 2007; Sulakvelidze et al, 2001). En 1917 el microbiólogo Franco-canadiense Felix d’Herelle reportó investigaciones
sistemáticas de la naturaleza de los bacteriófagos y su habilidad para ser agentes
terapéuticos, ya estos eran capaces de ser parásitos de bacterias (Carlton, 1999). El nombre bacteriófago, dado a estos virus que infectan bacterias, fue escogido por d’Herelle, y fue
formado a partir de las palabras “bacteria” y “fagein” (comer o devorar en Griego)
(Sulakvelidze et al, 2001).
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Aunque fue se dice que en 1919 d’Herelle fue el primero en usar los bacteriófagos
terapéuticamente, la primera aplicación de fagos en enfermedades infecciosas de humanos
reportada, viene de 1991 y fue hecha por Richard Bruynoghe y Joseph M aisin quienes
usaron fagos para tratar una enfermedad de la piel causada por staphylococos (Hermoso et
al, 2007). En 1930 el laboratorio comercial de d’Herelle en Paris produjo al menos 5
preparaciones de bacteriófagos en contra de varias infecciones bacterianas. Estos fueron
comercializados por la que después sería la gran compañía francesa L’ore’al. Diez años
más tarde, Estados Unidos comenzó con la producción de fagos contra Staphylococos,
Streptococos, E.coli entre otros, los cuales fueron usados contra infecciones crónicas
respiratorias, vaginitis y abscesos (Sulakvelidze et al, 2001).
Los fagos fueron usados desde 1920 hasta 1950 para curar infecciones causadas por
bacterias y tuvieron gran importancia durante la segunda guerra mundial, en la cual fueron muy efectivos cuando se usaron en el tratamiento de soldados con heridas infectadas
Hermoso et al, 2007). Sin embargo el uso de bacteriófagos tuvo una disminución drástica
con el descubrimiento de los antibióticos. Pero la capacidad de mutar de las bacterias para
sobrevivir, ha causado que estas se vuelvan resistentes a los antibióticos, es por esto, que
actualmente existe un gran número de cepas de bacterias que deben ser combatidas
mediante tratamientos diferentes. Lo anterior ha dado como resultado que la fago terapia
este tomando fuerza nuevamente y se realicen muchos esfuerzos en el estudio de los bacteriófagos para uso terapéutico, empleando y combinando nuevas técnicas moleculares,
matemáticas e ingenieriles que implican un trabajo multidisciplinario.
3.1.2. Ventajas y desventajas de la fago terapia comparada con los antibióticos
Los bacteriófagos y los antibióticos se parecen en cuanto a que son utilizados para
combatir bacterias patógenas. Sin embargo difieren en muchos sentidos. Esto implica que
el tratamiento para combatir infecciones bacterianas mediante estos dos agentes
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antibacteriales, sea diferente, tomando en cuenta las ventajas y desventajas que puede
tener uno sobre el otro. Un paralelo entre estos dos medios terapéuticos se muestra en la
Tabla 1.
Tabla1. Comparación entre los antibióticos y los Bacteriófagos como agentes terapéuticos contra infecciones
bacteri anas.
Antibióticos Bacteriófagos
Pueden emplearse para diferentes cepas
de bacterias. Atacan los microorganismos
patógenos y la microflora normal del
cuerpo (Sulakvelidze et al, 2001)..
Tienden a tener un rango muy cerrado de
hospederos y deben ser administrados solo los
fagos que sean fuertemente líticos para la
bacteria que infecten (Hermoso et al, 2007).
Debido a que los antibióticos siempre
tienen el mismo principio activo, las
bacterias pueden mutar para crear
resistencia a estos (Sulakvelidze et al, 2001).
- Se replican siempre en el sitio de la infección,
lo que implica un suministro constante del fago
(Hermoso et al, 2007), aunque pueden no
siempre ser líticos bajo condiciones
fisiológicas y por lo tanto la bacteria puede
crear resistencia después de la infección
(Hermoso et al, 2007). Pero como los fagos
también tienen la capacidad de mutar, cambian
su ADN conforme las bacterias lo hacen, es por esto que es menos probable que las
bacterias sean inmunes a la infección de un
Bacteriófago.
Las preparaciones de los antibióticos son más sencillas de hacer y emplear
(Sulakvelidze et al, 2001).
Las preparaciones de fagos deben estar
totalmente libres de bacterias y sus componentes tóxicos, sin embargo, la
esterilización puede inactivar los fagos
(Hermoso et al, 2007).
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Los fagos tienen muchas ventajas y algunos problemas cuando son usados en terapia contra infecciones causadas por bacterias (Tabla 1). Estos problemas ya han sido tratados y
se han reportado soluciones que han sido eficaces a la hora de enfrentarlos. Algunas de
estas se nombran a continuación.
• Como el rango de hospederos de los fagos es muy cerrado y solo infectan ciertas cepas
de bacterias, se suministra al paciente un coctel de fagos para asegurarse que alguno de
los virus presentes en este infecte las bacterias que se quieren combatir (Carlton, 1999;
Dussan et al, 2007) También se han desarrollado fagos multivalentes que pueden lisar
varias colonias de bacterias (Carlton, 1999).
• Para tener una preparación de fagos totalmente estéril se usan técnicas modernas de
purificación como centrifugación y filtración estéril, las cuales garantizan que el fago
permanece viable (Carlton, 1999).
• Para el problema de la lisogenia, la cual no provee una lisis lo suficientemente rápida y
un crecimiento exponencial del número de fagos como se necesita en la fago terapia, se
ha tomado la decisión de solo usar fagos que hagan ciclo lítico (Carlton, 1999).
• Hay reportes en la literatura en los cuales se muestra que pueden haber anticuerpos
que neutralicen a los bacteriófagos cuando estos son empleados para combatir infecciones
M últiples efectos laterales, como alergias,
desordenes intestinales e infecciones secundarias (Sulakvelidze et al, 2001).
No tienen efectos laterales conocidos
(Sulakvelidze et al, 2001).
El desarrollo de un nuevo antibiótico
puede llevar años (Sulakvelidze et al,
2001).
La selección de un nuevo fago es un proceso
relativamente rápido que puede tomar solo días
o semanas (Sulakvelidze et al, 2001).
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bacterianas. La solución a esto es usar grandes cantidades de los fagos, para de esta manera
compensar el efecto de los anticuerpos (Carlton, 1999).
A partir del desarrollo de estas soluciones, se ha hecho más fácil el uso de bacteriófagos
como terapia alternativa contra las infecciones bacterianas; causando que la fago terapia
tome mayor fuerza y sea usada nuevamente como tratamiento contra bacterias patógenas.
Esto ha incentivado las investigaciones en esta área con el fin de encontrar mejores
soluciones para poder enfrentar los problemas acarreados por este método, haciendo posible
el uso de la fago terapia como una opción eficaz para poder combatir infecciones.
3.1.3. Estudios recientes in vivo
Los estudios que se realizan actualmente al igual que los que se realizaron desde el inicio
de la fago terapia son hechos en animales, principalmente ratones. En estudio realizado en el 2004, se aislaron fagos de E .coli de niños de Bangladesh y
Suiza. Estos virus fueron caracterizados como fagos T4 y se ensayaron en cepas de E.coli
patógenas y no patógenas a las cuales fueron sometidos ratones. Los resultados mostraron
que prácticamente todas las células de E. coli fueron lisadas por al menos uno de los fagos
(Sulakvelidze et al, 2001).
Otro estudio realizado en el año 2002. reportó como ratones infectados con Enterococcus faecim (VRE) fueron inyectados con fagos específicos-VRE, mostraron una mejoría al
transcurrir solo 45 min después de haber sido inyectados con el fago. La infección pareció
ser totalmente combatida a las 5 horas después de haber sido suministrado el virus (Sulakvelidze et al, 2001).
En el estudio realizado en al año 2003, bacteriófagos ΦMR11 fueron ensayados en
infecciones de ratón causadas por Staphylococcus aureus. Los ratones que no fueron inyectados con el fago murieron a las 6-7 horas después de la infección bacteriana, pero a
los que si fue suministrado ΦM R11 fueron protegidos. Esto llevó a los autores a concluir
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que el efecto bactericida de los fagos fue el factor determinante en la protección de los
ratones (Sulakvelidze et al, 2001).
También existen estudios realizados en animales diferentes a ratones como pollos, pájaros y
peces.
Por ejemplo en el año 2002, se ensayó la fago terapia en pájaros con infecciones
respiratorias causadas por E. coli. Lo fagos contra E.coli fueron suministrados en diferentes
formas: en un saco de aire, mediante agua para beber, por medio de un aerosol e
inyecciones intramusculares. Los pájaros fueron protegidos mas rápidamente de la
infección cuando se suministro el fago mediante la bolsa de aire e intramuscularmente. Esto
llevo a concluir a los investigadores que el medio de suministro del tratamiento también
afecta la eficiencia de este, y que los que mejor funcionan son los que pueden transfieren
los fagos al torrente sanguíneo (Sulakvelidze et al, 2001).
Un grupo Japonés en 2003 administraron fagos contra Lactococcus garviae y Pseudomonas
plecogssicida a peces infectados con estas bacterias. Los fagos fueron administrados
oralmente o directamente en el área infectada. Para ambas formas de suministro del
tratamiento se encontró que los peces fueron protegidos contra las bacterias ef icazmente
(Sulakvelidze et al, 2001).
En estudios realizados en diferentes animales infectados con E. coli, se comparo el efecto de una sola inyección intramuscular de fagos contra E.coli y varias dosis de antibióticos
inyectados Los investigadores encontraron que la inyección de virus fue mucho más
efectiva que varias inyecciones cargadas de antibióticos (Summers, 2001), concluyendo de esta manera que la fago terapia es un tratamiento que combate con mayor efectividad las
infecciones causadas por bacterias patógenas que el tratamiento con antibióticos.
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3.1.4. Estado actual de la fago terapia aplicada a Humanos
En la actualidad la fago terapia se emplea en humanos en su mayoría para combatir
infecciones causadas por bacterias que se encuentran en clínicas y hospitales, las cuales son
comúnmente llamadas enfermedades nosocomiales. Estas enfermedades pueden contraerse
mediante suturas o heridas abiertas expuestas al ambiente, o simplemente por vía
respiratoria.
M uchos de estos casos son crónicos, y las bacterias causantes de la infección son resistentes
a múltiples drogas (M DR), como los son varias cepas de Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella Pneumoniae y E. coli. Es por esto que ahora se están
tratando estas enfermedades mediante terapia con bacteriófagos, ya que en un 90% de
casos en que se ha empleado, ha sido efectivo en un 100%, sin ningún tipo de efectos
laterales en el paciente (Summers, 2001), En su mayoría los fagos se han suministrado oralmente pero haciendo un pretratamiento de los fagos con geles o del paciente con
antiácidos para proteger las moléculas del virus de los ácidos gástricos (Summers, 2001),
De esta manera se garantiza que los fagos pasen al torrente sanguíneo, y en unas pocas
horas puedan atacar a las bacterias infecciosas.
A continuación se nombran algunos estudios realizados de fago terapia en Humanos.
En el estudio realizado por Babalova et al en 1968 se uso fago-terapia para combatir una infección causada por Shigella, en la cual se obtuvo un 100% de eficacia de los fagos como
herramienta para curar a los pacientes infectados con esta bacteria.
Otro estudio realizado por Perepanova et al en 1995 en la cual se utilizarn fagos como
terapia para curar enfermedades urológicas inflamatorias causadas por Staphylococcus,
E.coli y Proteus en 46 pacientes. El tratamiento tubo excelentes resultados con una eficacia
del 92%.
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Un estudio realizado por Sakandelidz en 1991 para combatir infecciones respiratorias
causantes de alergias como rinitis, conjuntivitis, faringitis y dermatitis causadas por
Staphylococcus, Streptococcus, E.coli, P.aeruginosa y Enterococci fueron tratadas con
fagoteriapia en 360 pacientes con alguna de las alergias mencionadas, 404 con antibióticos
y 576 con una mezcla de antibióticos y fagos. Una mejora clínica se obtuvo en 86,48 y 83%
de los casos respectivamente, demostrando que el tratamiento con fagos es más efectivo
que el tratamiento con medicinas.
El estudio realizado por Stroj et al en 1999 utilizó fago terapia en pacientes con meningitis
cerebroespinal causada por K.pneumoniae, la cual tuvo resultados exitosos después de
haber usado antibióticos sin ningún tipo de resultado.
En todos estos estudios se administraron los fagos por medio oral obteniendo buenos
resultados.
3.2. PRIN C IPIOS DE LA BIO LOGÍA D E BAC TERIÓ FAGO S .
Los bacteriófagos (fagos) son virus capaces de infectar bacterias. Dependen
completamente de la célula bacteriana y usan la maquinaria enzimática de esta para la
replicación de su material genético. Este último puede ser ADN o ARN. Los fagos más
conocidos son los que poseen ADN de doble cadena, aunque también existen fagos que
poseen ADN de cadena sencilla (Prescott, 2005). Los fagos pueden tener diferentes morfologías como fagos icosaedros sin cola, virus con
cola contráctil (Fig.1), virus con cola no contráctil y fagos filamentosos (Prescott, 2005).
El grado con que un fago depende de la célula hospedera está en función de su tamaño. Los virus de tamaño pequeño tienen la información de las proteínas de su cubierta viral y las de
su ensamblaje, y para su replicación dependen exclusivamente de las enzimas de la célula
hospedera. Los fagos de tamaño medio inducen unas cuantas enzimas para su replicación
haciéndolos dependientes de la bacteria que infectan, pero en menor grado que los virus de
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tamaño pequeño. Los fagos de mayor tamaño contienen cerca de 20 genes esenciales que
definen la síntesis de precursores de un aparato replicativo completo que es independiente
del cromosoma (Peñaranda, 1996).
Los fagos ocupan todos los hábitats del mundo en donde se encuentren bacterias. Se ha
estimado que por cada célula bacteriana existen 10 partículas de fagos. Algunos de estos
fagos pueden tener un rango muy cerrado de hospederos, es decir son muy específicos, y
otros pueden infectar varias especies de bacterias (Skurnik y Strauch, 2005).
Después de la infección de la célula hospedera, los fagos pueden tomar diferentes caminos.
Algunos fagos siguen el ciclo lítico en donde se multiplica dentro de la bacteria y la lisa al
final del ciclo para liberar nuevas partículas virales. Otros fagos son temperados, es decir
siguen el ciclo lisogénico, en donde se integran al cromosoma de la bacteria y permanecen
en estado no activo como profagos por periodos extendidos de tiempo. Si la bacteria se
encuentra en condiciones ambientales peligrosas el profago se activa y tomo el camino lítico, al final de cual, la célula es lisada y se liberan nuevas partículas de fago (Skurnik y
Strauch, 2005; Prescott, 2005; Peñaranda, 1996).
.
Para comprender como se sintetiza el nuevo material genético de los fagos es necesario
conocer como este penetra la célula, como se multiplica, empaqueta y libera. A
continuación se dan a conocer los pasos que toma un virus para lograr una infección
exitosa.
• Adsorción del virus en la célula bacteriana por enlace a receptores específicos. Depende
de la superficie celular (Skurnik y Strauch, 2005; Peñaranda, 1996).
• Penetración del material genético a través de la superficie celular y de las capas de la
membrana interior de la célula (Skurnik y Strauch, 2005; Peñaranda, 1996). La
liberación del material genético de su envoltura puede estar estrechamente relacionado
con el proceso de su replicación (Peñaranda, 1996).
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• Reconocimiento y expresión del material genético: replicación a una forma dúplex,
transcripción de una región determinada del genoma, traducción de una región especial
de mRNA (Peñaranda, 1996). En esta etapa se sintetizan proteínas tempranas
involucradas en el apagar la maquinaria del hospedero y en la replicación del genoma
del fago (Skurnik y Strauch, 2005)
• M ultiplicación y maduración apropiada para el empaquetamiento (Peñaranda, 1996).
• Expresión de las proteínas tardías involucradas en la formación de nuevas partículas de fago y en la lisis de la bacteria hospedera (Skurnik y Strauch, 2005)
• Ensamblaje de las cabezas y colas, y empaquetamiento del genoma (Skurnik y Strauch,
2005; Peñaranda, 1996).
• Lisis celular y liberación de las nuevas partículas virales (Skurnik y Strauch, 2005;
Peñaranda, 1996).
La habilidad de los fagos para infectar y matar bacterias al final del ciclo, es la base para
usarlos como agentes terapéuticos contra infecciones causadas por bacterias patógenas. Sin
embargo el éxito de la fago terapia depende de que todos los pasos que fueron listados arriba se lleven a cabo correctamente (Skurnik y Strauch, 2005). Esto de pende en principio
de que el paso inicial (reconocimiento y adsorción) se efectué de un modo altamente
específico y que garantice una duplicación rápida y una competencia, con probabilidades de
ganar, con la gran cantidad de ADN de la célula hospedera (Peñaranda, 1996). Las
responsables de que esto pueda ocurrir, son un grupo de proteínas que se encargan del
reconocimiento y conducción del material genético del fago a través de las capas de la
membrana de la bacteria y de las demás etapas que son necesarias para la multiplicación y
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maduración de este (Peñaranda, 1996). La proteína encargada de la adsorción y dirección
del material genético de acuerdo al tipo de acido nucleído del que esta conformado, es
llamada proteína piloto. Si los fagos tienen ADN de cadena sencilla (ssADN), la proteína
piloto lo dirige al sistema replicativo. Si el fago tiene ADN de cadena doble (dsADN), la
proteína piloto lo dirige hacia la RNA polimerasa para transcripción. Algo similar ocurre
cuando el material genético del fago está conformado por ARN. La proteína dirige la
entrada de este hacia los ribosomas, con el fin que realice su función mensajera para
síntesis de proteínas especificas del bacteriófago (Prescott 2005; Peñaranda, 1996).
Figura 1. Micrografía electrónica de un fago B33 con cabeza y cola. Tomada de Morgan y Stanisich, 1975
3.2.1. Ciclo lítico
El ciclo de vida de un fago que culmina con la lisis de la célula bacteriana y la liberación
de nuevas partículas virales, es llamado ciclo lítico (Prescott 2005). Este comienza con la adsorción y penetración del material genético del fago en la célula
hospedera, el cual no se hace de manea azarosa, sino gracias a estructuras especificas
llamadas receptores que pueden encontrarse en los lipopolisacaridos de la membrana
celular, flagelos y cilios (Prescott 2005).
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En la mayoría de los fagos la absorción comienza con el contacto de las fibras de la cola
con la superficie bacteriana. Entre más fibras tengan contacto, mejor es el enlace del fago
con la célula. La base de la cola contiene una lisozima que permite la penetración del tubo
de la cola a través de la capa de peptidoglicano. Luego el material genético baja desde la
cabeza, por medio del tubo y llega al interior de la bacteria. En la Fig.2 se observa la
infección e un fago a una E. coli después de 4 y 8 min de haber tenido contacto con la
membrana de la bacteria. A los 4 min se observa el enlace del fago a la bacteria, y un 20%
del material genético ya se encuentra en el interior de la célula. A los 8 min el 50% del
material genético ya ha sido inyectado a la bacteria (Lundström et al, 1978) [13].
Figura 2. Micrografía el ectrónica de E.coli CR34 infectada con el fago PR4. a) 4 min después del contacto.
b) 8 min después del contacto. Tomada de Morgan y Stanisich, 1975
Los virus líticos contienen 3 grupos de genes que se transcriben en tiempos diferentes
después de la infección: Los tempranos inmediatos, los tempranos tardíos y los tardíos
(Prescott 200; Peñaranda, 1996). Los primeros se transcriben y traducen antes de la síntesis del material genético. Estas proteínas son las responsables de detener la maquinaria de
síntesis moléculas necesarias para la célula hospedera. Luego el ADN de la bacteria es
degradado por una ADNasa codificada por uno de estos genes tempranos del fago, (Peñaranda, 1996). La síntesis de proteínas tardías va acoplada con la replicación del
material genético. En esta fase las proteínas que se sintetizan son las de la formación de la
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cápside y una lisozima que digiere la pared bacteriana permitiendo la lisis de esta después
del ensamblaje de los fagos. (Prescott 2005; Peñaranda, 1996).
Para la construcción de partículas virales existen tres vías, en cada una de ellas se forma
independientemente la cabeza, la cola y las fibras de la cola. La cabeza y la cola deben
estar completamente formadas antes de que se puedan unir, luego las fibras de la cola se
unen a la base de esta. Un estricto orden secuencial asegura la formación de los fagos de
manera correcta (Peñaranda, 1996). La construcción de los fagos no ocurre solamente por
autoensamblaje sino también por la contribución de proteínas de andamiaje y algunas
proteasas. Las primeras sirven como moldes para promover la asociación. Las segundas
tienen un papel crucial en la formación y ensamblaje de la cabeza (Prescott 2005;
Peñaranda, 1996). El empaquetamiento del material genético en la cabeza se realiza por el
superenrollamiento de este, ya que una cadena de una longitud de aproximadamente 56µm
tiene que introducirse en una cabeza con un eje longitudinal de 0,1µm (Peñaranda, 1996). Para el empaquetamiento existen 2 posibilidades: que el DNA se introduzca en la cabeza
preformada, o que la cabeza se forme alrededor del DNA enrollado (Peñaranda, 1996).
En la lisis celular están involucrados un gran número de genes del fago: unos dirigen la
síntesis de endolisinas que atacan la pared celular de peptidoglicano, y los otros están
involucrados en la formación de proteínas como la llamada holina que produce una lesión
en la membrana plasmática deteniendo la respiración de la bacteria, lo que permite que la
endolisinas ataquen el peptidoglicano (Prescott 2005). Cuando el daño a las membranas de la célula este efectuado, las nuevas partículas virales salen para infectar nuevas bacterias.
En la Fig.3 se puede observar a grandes rasgos como es un ciclo lítico de infección.
Figura 3. Ciclo lítico de infección de un fago a una bacteria
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3.2.2. Ciclo lisogénico
En la vía lisogénica el material genético del bacteriófago se integra covalentemente al
cromosoma de la célula en un sitio específico. La mayoría de las funciones del fagos se
detienen cuando su material genético se integra al de la bacteria (Peñaranda, 1996). De esta
manera el genoma del virus permanece con el de la célula hospedera y se replica con el
genoma bacteriano para generar un clon de la célula infectada que crece y se divide por
largos periodos de manera normal (Prescott 2005). Cada uno de estos fagos puede lisar la
célula bajo condiciones ambientales apropiadas (Prescott 2005; Peñaranda, 1996). Las
bacterias que son infectadas por fagos temperados, que son los que toman la vía lisogénica,
no pueden ser reinfectadas por el mismo fago, es por esto que se dice que son inmunes a la
superinfección (Weaver, 2008 ; Castillo & Bartell 1974). Esto es una ventaja para los
fagos, ya que por el ciclo lítico se corre un ries go muy grande de destruir toda la población
de bacterias, por lo cual el virus queda desprotegido por largos periodos de tiempo en los que puede degradarse. Esto se previene si el virus toma el ciclo lisogénico, ya que es más
probable que las células sobrevivan, llevando consigo el genoma del fago. Es por esto que
cuando un virus tiene un M OI (índice de multiplicidad) muy alto, se favorece el camino
lisogénico (Prescott ,2005; Peñaranda, 1996; Weaver, 2008).
La lisogenia se establece, ya que aunque en el inicio de la infección se producen las mismas
proteínas tempranas que en el ciclo lítico, se produce también una proteína represora que apaga la maquinaria de transcripción de los demás genes menos el que codif ica para este
represor (Konopa et al, 2000). Entonces como no se puede producir más progenie del fago,
a este no le queda más remedio que integrarse al cromosoma de la célula. En el ciclo lisogénico existen tres etapas:
• Establecimiento: aquí se da la integración del material genético del fago en el de la
bacteria, y de la inactivación de las funciones líticas del virus (Prescott, 2005;
Peñaranda, 1996; Weaver, 2008).
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• M antenimiento: en donde solo se expresa el gen que codif ica para el represor que se
une a 2 operadores, lo que evita directamente la transcripción de los genes temprano
inmediatos quedando bloqueada la vía lítica (Prescott, 2005, Peñaranda, 1996;
Weaver, 2008).
• Liberación: se da cuando se inactiva el represor y se produce la expresión de genes
líticos, entonces el genoma del fago es liberado del cromosoma bacteriano (Prescott,
200; Peñaranda, 1996; Weaver, 2008).
La radiación ultra violeta o agentes químicos (Peñaranda, 1996), es decir
condiciones ambientales peligrosas a las que pueda estar sometida la célula
producen el paso de la lisogenia al estado lítico (Konopa et al, 2000). Después de que el genoma del virus es liberado y se induce el ciclo lítico, todos los hechos
suceden de la misma manera que como si el fago hubiera tomado este camino, y los
cuales se explicaron anteriormente. En la Fig. 4 se puede observar cómo se lleva a cabo un ciclo lisogénico.
Figura 4. Ciclo lisogénico de la infección de un fago a una bacteria.
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3.3. ES TUDIOS ACERCA D E LA INTERACCIÓN FAGO-BACTERIA.
En los últimos años se han estudiado las estructuras, tanto del fago como de la célula
hospedera, que son responsables del reconocimiento y adsorción del virus, así como del
poder antibacterial que tienen los fagos. Estos estudios se basaban anteriormente en
corroborar que para todas las cepas de bacterias y especies de virus actuaban las mismas
estructuras como receptores del fago. Pero recientemente se ha descubierto que no solo los
compuestos peptídicos y lipídicos que conforman la membrana de la bacteria toman parte
en este proceso. Se ha descubierto que también los virus que poseen una capa de lípidos en
la cápside inyectan su ADN de manera más fácilmente a la célula hospedera, y que además
estructuras bacterianas como cilios son parte crucial en el reconocimiento del virus.
También se ha demostrado que los fagos tienen acción antibacterial gracias a proteínas que pueden causar lesiones a la membrana de la bacteria así como puede detener toda su
maquinaria replicativa:
Un estudio realizado por Lundström et al en 1978, demostró que los lípidos que contiene
en el interior de la cápside el fago PR4, juegan un rol importante en el proceso de
inyección del material genético en Pseudomonas aeruginosa, E.coli CR34, Ecoli J53 I y E.
coli J53. La capa lipídica del fago se encuentra continuamente en contacto con el ADN y
ayuda a empujarlo fuera de este.
El estudio realizado por Roncero et al en 1990, demostró que los cilios en Pseudomonas
aeruginosa son necesarios para la adsorción de los fagos B3 y D3112. Los investigadores realizaron mutaciones a las bacterias, de modo que unas colonias no producían cilios y las
otras eran deficientes en los lipopolisacáridos de la membrana. Se encontró que en las
bacterias que no poseían cilios pero si tenían lipopolisacáridos, el fago no se adsorbía. Por
el contrario, en las que tenían deficiencia en los lipopolisacáridos pero si tenían cilios, los fagos si se adsorbían. De esta manera llegaron a la conclusión que las estructuras de
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motilidad como los cilios jugaban un papel importante en el enlace específico del fago a la
bacteria y en la adsorción de este.
En 2005 Rotem et al, realizaron un estudio en el cual se descubrió que existen péptidos que
se derivan de la secuencia genómica de las lisinas del fago, y que tienen un fuerte poder
antibacterial, ya que inhiben la proliferación de estos micoorganismos y por consiguiente
causan su muerte.
Holland et al en 2005, en su estudio hecho con Pseudomonas aeuruginosa y fagos
filamentosos como PF1, encontraron que existen proteínas en sus pili que facilitan la
adsorción de este en la célula. Esto se evidencio también en diferentes bacteriófagos
filamentosos que se expusieron a cepas de Pseudomonas aeruginosa.
En el estudio realizado por Castillo y Bartel en 1974 se descubrió que una vez adsorbido el
fago 2 en Pseudomonas aeruginosa esta tenía incapacidad para reabsorber el mismo fago.
Acompañado de este fenómeno, se encontró que el virus tomaba la vía lisogénica. El hecho
que el fago no pueda reabsorberse se debe a que las bacterias que ya habían sido infectadas
presentaban deficiencia en los lipopolisacáridos y los polisacáridos de su membrana. De
esta manera se concluyó que estos compuestos actúan como receptores para la infección del
bacteriófago a la célula.
Como se puede observar en la mayoría de estos estudios se responsabiliza a estructuras y
compuestos de membrana de la célula, de facilitar el reconocimiento y la adsorción del fago en la bacteria. Sin embargo se ha visto que estructuras que pertenecen al fago mismo
ayudan también a su reconocimiento por parte del microorganismo y a la inactivación de
lipopolisacáridos de la membrana celular para evitar reinfección de estos a la bacteria.
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3.4. MODELOS MATEMÁTICOS PARA DES CRIBIR EL PROCES O DE
INFECCIÓN VIRAL EN BACTERIAS
Grandes e importantes avances en el campo de la biología molecular, como el
descubrimiento de nuevas técnicas para secuenciar el genoma completo de un organismo y
saber la expresión de ciertos genes bajo determinadas condiciones ambientales, así como el
descubrimiento de nuevas relaciones entre vías metabólicas e interacciones entre ADN,
proteínas, RNA, moléculas pequeñas y organismos, han causado un incremento en la
cantidad y complejidad de la información recolectada. De esta manera, el ensamblaje de
todas estas “piezas” para crear una visión integral de los sistemas biológicos se ha
convertido en un verdadero reto (Roncero et al, 1990; Rotem et al, 2005). Es por esto que
herramientas como el modelaje matemático y técnicas de simulación computacional han
sido de gran ayuda para poder entender el comportamiento, topología y dinámica de sistemas celulares, dando una gran aproximación a datos experimentales tomados de estos
(Roncero et al, 1990).
Para poder entender y modelar correctamente un sistema biológico se debe cumplir con los
siguientes pasos (Rotem et al, 2005).
• Identificación de la estructura del sistema
• Análisis del comportamiento del sistema.
• Control del sistema
• Diseño del sistema.
Todo este proceso se ha denominado Ingeniería Reversa; en la cual, a partir de datos
experimentales se hace un análisis del sistema para identificar sus componentes y relaciones; así como la creación de una representación abstracta de este, lo que facilita su
estudio (Rotem et al, 2005).
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Para poder cumplir con este propósito, muchos métodos han sido planteados, involucrando
diferentes áreas como estadística, cinética química, análisis de control metabólico, algebra,
optimización, entre otros (Rotem et al, 2005). Estos modelos pueden ser estocásticos o
determinísticos.
Los modelos estocásticos se basan en el hecho de que pueden ocurrir eventos aleatorios en
el sistema, los cuales tienen gran impacto en el comportamiento y evolución de este en el
tiempo (Holland et al, 2005). M uchos estudios han reportado la ocurrencia de fluctuaciones
estocásticas y ruido en sistemas vivos. Solamente, observando la expresión de algunos
genes en las células se puede establecer la naturaleza estocástica de los fenómenos de
transcripción y traducción (Roncero et al, 1990). La estocasticidad en sistemas dinámicos
puede darse en dos maneras: estocasticidad intrínseca, la cual es inherente al sistema, y
estocasticidad extrínseca, la cual es causada por variaciones aleatorias de factores
ambientales como temperatura, concentraciones de sustrato etc. (Roncero et al, 1990). Por lo tanto son usados cuando el sistema es homogéneo y las fluctuaciones en este son
signif icativas (M eng et al , 2004).
3.4.1. Aproximaciones determinísticas
Los modelos determinísticos se basan en la variación de ciertas propiedades del sistema en el tiempo, sin tener en cuenta eventos aleatorios que puedan ocurrir en este. Estos métodos
incluyen sistemas de ecuaciones, que son típicamente ecuaciones diferenciales, las cuales
capturan las relaciones esenciales entre los constituyentes del sistema (Srivastava et al, 2002; You ,2002).
Para poder modelar la cinética de la infección de un fago a una bacteria, y hallar los
parámetros que la determinan, se han propuesto modelos tanto determinísticos como estocásticos.
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La cinética determinística se relaciona con la evolución de un sistema de reacciones en el
tiempo, en donde las concentraciones de los reactivos cambian continuamente con el
progreso de la reacción (Schulz-Trieglaff, 2005). La idea detrás de la formulación
determinística de la cinética de las reacciones, es que aunque ciertos componentes pueden
tener movimientos aleatorios, el comportamiento total del sistema sigue un patrón
determinado, el cual puede modelarse determinísticamente (Schulz-Trieglaff, 2005).
La cinética estocástica se basa en el hecho de que los cambios en las especies o
componentes de la reacción no ocurren en intervalos iguales de tiempo (Krishnan, 2007) y
que los factores medioambientales pueden causar fluctuaciones aleatorias en el sistema.
Aunque desde hace muchos años existen modelos que describen la dinámica de infección
de fagos en bacterias, y que han sido aplicados a fago terapia, hay muy pocas publicaciones
que soporten la habilidad y exactitud de esos modelos para predecir el proceso de
infección in vivo. De los primeros modelos usados en fago terapia, fue el desarrollado por Levin y Bull en 1996 quienes analizaron los datos obtenidos por Smith y Haggins en 1982
usando un fago genérico. Los autores reportaron la imprecisión del modelo para estimar
los parámetros cinéticos, así como la gran brecha que había entre los datos experimentales
y los hallados mediante el modelo. Además los autores predijeron que la eficacia de la fago
terapia depende de la dosis inicial del fago, el periodo de latencia y la tasa de la adsorción
de este en la célula bacteriana. En 2001 Payne y Jans utilizaron el mismo modelo de
crecimiento de fagos para hacer un estudio conceptual de la fago terapia. Pudieron concluir que el éxito de la fago terapia depende de los umbrales relacionados con densidad y los
tiempos críticos asociados (Weld et al, 2004)
De los estudios más recientemente publicados es el realizado por Jain et al, en 2006. En este estudio se realiza la investigación de la dinámica viral del fago MS2 en E.coli,
implementando la discriminación de modelos determinísticos mediante estrategias
probabilísticas.
Los datos experimentales se obtuvieron a partir de procesos continuos y batch. Algunos valores para las variables se obtuvieron directamente de la experimentación y otros a partir
de regresiones lineales de datos experimentales. Después de esto se procedió a comparar
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los datos experimentales con los que fueron predichos mediante el método de
discriminación de modelos, el cual se basa técnicas Bayesianas, que determinan cual de los
5 modelos es el más probable, que no es necesariamente el mejor.
De este estudio se concluyó que las células resistentes a fagos siempre están presentes y
estas se convierten en la población dominante cuando hay virus en el medio. Cuando no
hay virus, las células resistentes y las no resistentes compiten por el sustrato siendo estas
últimas las que dominan la población ya que tienen una tasa de crecimiento mayor a las de
las células resistentes. El hecho de que siempre existan bacterias resistentes, implica que en
algún momento el fago va a degradarse por falta de hospedero (Jain et al, 2006).
Otra conclusión importante es que el organelo que es responsable de la adsorción del fago,
como son los cilios o pili, como es de esperarse, crecen en mayor proporción cuando las
bacterias se encuentran en un medio r ico. Lo que lleva a concluir que el fago se adsorbe
mejor cuando las células tienen suficiente sustrato (Jain et al, 2006).
3.4.2. Algoritmos estocásticos
Además de estas aproximaciones determinísticas basados en ecuaciones diferenciales, se
han desarrollado también algoritmos estocásticos que toman en cuenta eventos aleatorios
que pueden ocurrir en el sistema.
Por ejemplo en 1998 Arkin et al, estudiaron el acople entre las f luctuaciones en las tasas de expresión génica y la selección del fenotipo, analizando el circuito de decisión Lisis-
lisogenia en el fago λ infectando E.coli. El modelo cinético del circuito usa una
formulación estocástica de la cinética química, mecanismos estocásticos de la expresión de genes, y un modelo de termodinámica estadística para la regulación del promotor. En este
trabajo no fueron usadas aproximaciones determinísticas, ya que estas no pueden predecir
estadísticamente el comportamiento de sistemas reguladores los cuales producen resultados
probabilísticos (Arkin et al, 1998).
A continuación se nombran algunos algoritmos estocásticos utilizados:
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Algoritmo de Gillespie
Fue desarrollado para simular sistemas químicos y bioquímicos con alta precisión
utilizando bajos esfuerzos computacionales. Genera una trayectoria estadísticamente
correcta de un evento estocástico. M atemáticamente es una variación del método de Monte
Carlo. La idea es resolver la ecuación maestra basado en la suposición que el sistema es
homogéneo. En cada paso, el sistema está exactamente en un estado. El Objetivo es simular
directamente la evolución en el tiempo del sistema, determinando la naturaleza y ocurrencia
de la próxima reacción en un determinado estado en un tiempo t (M eng et al, 2004).
Algoritmo denominado Stochsim algorithm
Fue formulado por M orton-Firth en 1998, el cual trata los componentes biológicos del
sistema como objetos individuales que interactúan de acuerdo con la distribución de
probabilidad derivada de los datos experimentales (M eng et al, 2004). Dado el tratamiento probabilístico de las interacciones entre los componentes del sistema, este algoritmo es
capaz de de reproducir fenómenos estocásticos reales (Meng et al, 2004). Se diferencia del
algoritmo de Gillespie porque utiliza intervalos de tiempos fijos que pueden ser
optimizados con la precisión deseada (Meng et al, 2004).
Algoritmos paralelos. Este método fue desarrollado por Schwehm en 1996, y se basa en descomponer el volumen
de control total en pequeños volúmenes de control, los cuales poseen un número de
componentes reactantes pequeño. Cada sub-volumen es tratado con el algoritmo de Gillespie. Este algoritmo fue desarrollado con el f in de evitar grandes esfuerzos
computacionales (M eng et al, 2004).
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Algoritmos espacio-temporales.
Son los que toman en cuenta la posición espacial de los componentes dentro del sistema
además de tomar en cuenta el tiempo en el que se realizan las interacciones de los
componentes dentro de este. Estos algoritmos fueron creados para incorporar las
interacciones que se llevan a cabo a nivel biológico en el mundo real, los cuales se efectúan
en un espacio tridimensional (Meng et al, 2004). Estos algoritmos usan los de Gillespie y
el Stochsm algorithm, pero incorporándoles información acerca de la distribución espacial
de las moléculas y de los componentes presentes en el sistema, modelando por ejemplo,
fenómenos difusionales a través de la membrana celular como un conjunto de reacciones y
tomando en cuenta las implicaciones que tienen sobre estas, la ubicación dentro de la célula
de los reactivos y el movimiento Browniano de las moléculas de estos (M eng et al, 2004).
Algoritmos Híbridos. Estos algoritmos combinan el modelaje de sistemas de manera determinística, con la
solución de estos mediante algoritmos estocásticos. Por ejemplo es posible integrar un ODE
(Ordinary differential equation) por medio del algoritmo de Gillespie. Estos algoritmos son
útiles en los casos en que no se tiene información detallada acerca del sistema, además
ayudan a cerrar la brecha entre las escalas macroscópicas y microscópicas del sistema
(Meng et al, 2004). Los algoritmos híbridos capturan de manera relevante el
comportamiento real de un sistema biológico (Meng et al, 2004). Estos algoritmos se han utilizado en algunos estudios sobre quorum sensim en Vibrio fischeri, una bacteria de
origen marino, combinando ODE con eventos discretos; de este mismo modo se han
estudiado los mecanismos de infección del fago λ (M eng et al, 2004).
Además de aproximaciones determinística y estocásticas existen otras alternativas para el
análisis del proceso infectivo de un bacteriófago, como lo es el análisis de incertidumbre.
Este consiste en realizar cálculos con intervalos de números reales en donde la repuesta no se ve afectada por errores de redondeo dando limites rigurosos a el intervalo en donde se
asegura se encuentra una solución exacta. Cabe aclarar que si el intervalo es muy amplio,
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la respuesta no es útil, por lo tanto es necesaria la utilización de un nuevo algoritmo de
solución que permita obtener un intervalo más estrecho (Gillespie,1977): El trabajo que
actualmente realizan Carol Barreto y Camila López como Proyecto de grado en Ingeniería
Química en la Universidad de los Andes (Bogotá-Colombia) (Barreto y López, 2008). se
basa en la comparación entre la aproximación estocástica y el análisis de incertidumbre
para el estudio de la dinámica del fago MS2 en E. coli. Ellas trabajan por un lado el quinto
modelo determinístico propuesto por Jain et al en 2006, el cual fue descrito previamente,
realizando algebra de intervalos y por otro lado plantean un modelo estocástico utilizando
redes de petri y aplicando el algoritmo de Gillespie. Hasta el momento los resultados
obtenidos demuestran que tanto el modelo estocástico como el determinístico solucionado
con análisis de incertidumbre, describen adecuadamente el sistema.
Otro importante trabajo es el que realiza M aría Fernanda Tafur también como proyecto de grado en Ingeniería Química en la Universidad de los Andes (Bogotá-Colombia) (Tafur
2008), Ella desarrolló un modelo que describe el desarrollo del fago λ en E. coli. El modelo
controla transcripción y traducción de los genes con una configuración en donde un
promotor controla un gen, cuyo producto de proteínas regula otro promotor. Los eventos de
este modelo corresponden a los más importantes genes involucrados en la decisión del
desarrollo del fago y se modelan con cinética estocástica. Como estrategia de solución se
implementara el modelo en Dizzy y se optimizará la dosis del fago para controlar poblaciones patógenas de E.coli mediante Recocido simulado.
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29
3.5. MÉTODOS DE OPTIMIZACIÓN USADOS EN INGEN IERÍA REVERSA.
En ingeniería reversa, uno de los principales objetivos, después de plantear un modelo
mediante una algoritmo ya sea determinístico o estocástico, es hallar los parámetros que
determinan el comportamiento del sistema, lo cual requiere el uso de algoritmos de
optimización. Este último aspecto, es decir, la optimización, juega un rol muy importante a
la hora de resolver un problema de ingeniería reversa, ya que la solución correcta para este,
garantiza el desarrollo de un modelo dinámico (M oles et al, 2003). Para este propósito se
han desarrollado estrategias de optimización que pueden solucionar modelos
determinísticos basados en ecuaciones diferenciales y métodos con principios estocásticos
que se pueden aplicar tanto a modelos determinísticos como estocásticos.
Los métodos más comúnmente aplicados a problemas de Ingeniería reversa se nombran a
continuación
3.5.1. Método de los Mínimos Cuadrados
Este método es usado para estimar los coeficientes o parámetros que mejor describen el
comportamiento de un sistema a partir de datos experimentales (Edgar et al, 2001) En este
los valores de los parámetros en la función de regresión se hallan minimizando la suma de
la diferencia de cuadrados entre los datos observados y los estimados (NIST/SEM ATECH,
2008) La función objetivo a minimizar se puede observar en la ecuación (1):
∑ ∑ (1)
Donde n son el numero de conjuntos de datos experimentales, p son el numero de variables
independientes, X son las variables independientes y son los parámetros del modelo.
Los pasos a seguir son:
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• Diferenciar f con respecto a cada .
• Igualar cada derivada parcial a cero.
• Obtener p ecuaciones que se relacionan con los p valores desconocidos de los
parámetros .
• Resolver las ecuaciones lineales simultáneas por métodos matriciales.
Los métodos estocásticos se basan en aproximaciones probabilísticas. Dado que existen elementos aleatorios involucrados en estos métodos, no se puede garantizar la convergencia
a un óptimo global. Sin embargo pueden localizarse en las vecindades de la solución con
relativa eficiencia, sin hacer muchos esfuerzos computacionales y en tiempos moderados.
Además los métodos estocásticos son fáciles de implementar y no requieren la
transformación del problema original (Moles et al, 2003).
Los métodos estocásticos más empleados en la solución de problemas de optimización en
sistemas biológicos son: Recocido Simulado (Simulated Annealing) y los algoritmos genéticos que hacen parte de los algoritmos de computación evolucionaría (M oles et al,
2003).
3.5.2. Recocido Simulado
El método Recocido simulado pertenece a los algoritmos de búsqueda local, el cual se basa
en la analogía con el recocido de metales (Edgar et al, 2001). El sistema se considera como un sólido cristalino al cual se le quieren aumentar el tamaño de los cristales y reducir los
defectos. Para este objetivo es necesario que se aumente la temperatura rápidamente hasta
derretirlo y luego bajarla lentamente para garantizar que los átomos se ubiquen en los
niveles más bajos de energía. Si se baja la temperatura rápidamente pueden aparecer
irregularidades dentro del cristal, y el nivel de energía del solido es mucho más alta que la
que tuviera si la estructura del cristal fuera perfecta. Es por esto que se prefiere bajar la
temperatura lentamente, de esta manera el cristal tendrá la energía más baja posible y por lo tanto no deben aparecer defectos en la estructura del cristal (Edgar et al, 2001). De esta
IQ‐2009‐I‐3
31
manera, el óptimo del sistema será cuando este se encuentre en el menor “nivel de energía”.
Es por esto que se podrían imaginar similares los procesos que ocurren cuando las
moléculas de una sustancia van colocándose en los diferentes niveles energéticos buscando
el equilibrio a una determinada temperatura, y los que ocurren en los procesos de
minimización en optimización local (para la maximización sería semejante) (Restrepo et
al, 2004). Este método tiene como base el algoritmo propuesto por Metrópolis, el cual da
una eficiente simulación de una colección de átomos a una temperatura dada (Kirkpatrick et
al, 1983) Aunque el concepto físico de temperatura no tiene significado alguno en el campo
de la optimización, se debe usar como un parámetro que hay que ir ajustando (Restrepo et
al, 2004).
En cada paso del algoritmo, un átomo tiene un desplazamiento aleatorio hacia un nivel de
energía. Si la energía del nuevo estado es menor o igual al inicial, el desplazamiento es
aceptado, y el nuevo estado encontrado será el punto de partida para el próximo desplazamiento. El caso en que la energía del nuevo estado sea mayor a la del estado inicial
es tratado probabilísticamente: la probabilidad que el nuevo estado de energía sea aceptado
es proporcional al factor de Boltzman, es decir:
∆ exp∆
2
La parte aleatoria del algoritmo es implementada por números aleatorios que se distribuyen
en el intervalo (0,1). Uno de estos números es seleccionado para compararlo con ∆ .
Si es menor que ∆ la nueva configuración es retenida, si no, la configuración original
es usada nuevamente como punto de partida para el próximo desplazamiento (Restrepo et
al, 2004; Kirkpatrick et al, 1983).
En términos de optimización una vez fijado el parámetro T produciendo una perturbación,
se acepta directamente la nueva solución como el nuevo punto inicial, si por ejemplo el
costo disminuye o en el caso que aumente se trata probabilísticamente de la misma manera
que se hace con el recocido de metales (Kirkpatrick et al, 1983).
IQ‐2009‐I‐3
32
El inconveniente que tienen los demás algoritmos de búsqueda local es que pueden caer en
óptimos que no son el óptimo global y no salir de ellos. Para evitar esto, Recocido
simulado, permite una cierta probabilidad, cada vez menor conforme la técnica se acerque a
la solución óptima, a el paso a soluciones peores. Esto es porque el factor de Boltzman está
en función de la temperatura, y cada vez que esta disminuye, disminuye rápidamente la
probabilidad que se acepte una solución peor a la actual (Restrepo et al, 2004).
3.5.3. Algoritmos genéticos
Son algoritmos de búsqueda heurística basados en ideas genéticas evolutivas de selección
natural. La idea básica de los algoritmos genéticos fue diseñada para simular problemas de
sistemas naturales que cumplen con la idea básica desarrollada por Charles Darwin de la
supervivencia del más fuerte. Estos algoritmos han sido ampliamente estudiados,
experimentados y aplicados en diversos campos de la ingeniería y la biotecnología como la optimización de parámetros de modelos que describen el comportamiento de un sistema
(Barreto y López, 2008).
Estos algoritmos son típicamente caracterizados por los siguientes aspectos (M oles et al,
2003):
Trabajan en base a un grupo de variables (redes genéticas artificiales) y no con las variables
en sí mismas.
• Trabaja un grupo de soluciones potenciales (población), con el fin de obtener la mejor solución.
• No utilizan información obtenida directamente de la función objetivo ni de sus
derivadas.
• Aplican reglas probabilísticas.
Un algoritmo genético básico que produce resultados aceptables incluye 3 operadores
(Moles et al, 2003):
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33
Reproducción: El objetivo general es guardar la información obtenida en redes genéticas
artificiales de manera correcta, de modo que “sobreviva la próxima generación”. A esta red
se da un valor el cual tiene la probabilidad de ser escogido como el padre en el proceso de
reproducción de una nueva generación (Moles et al, 2003):
Entrecruzamiento: es el proceso en el que la red es dividida en segmentos que son
intercambiados con los segmentos de otra red. De esta manera se producen nuevas redes
diferentes a las originales. Para optimización esto significa la explotación de un área de
búsqueda de soluciones o de parámetros (Barreto y López, 2008; M oles et al, 2003):
M utación: se ve reflejada en cambios de pequeñas porciones de los códigos genéticos que
hacen parte de la red. En optimización esto significa un cambio en el área de búsqueda de
los parámetros (Barreto y López, 2008; Moles et al, 2003).
En el algoritmo primero se generan redes aleatorias para la población solución. La siguiente
generación es generada aplicando los operadores de reproducción, entrecruzamiento y
mutación. La nueva generación se basa en probabilidades individuales asignada por la
forma de la función objetivo, de esta manera la generación que sobrevive es la que da el
mejor valor a la función objetivo (M oles et al, 2003).
La selección proporcional es expresada matemáticamente como (M oles et al, 2003):
∑ (3)
Donde Pi es la probabilidad de selección, fi es la aptitud de la i-ésima red.
1 4
Donde FO es el valor de la función objetivo para la i-ésima red.
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34
Estos algoritmos han sido aplicados en problemas robustos como finanzas, información de
sistemas, operaciones de producción, toma de decisiones, problemas que involucran
electromagnetismo (Barreto y López, 2008) y por supuesto solución de modelos que
describen sistemas biológicos con gran éxito.
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35
4. MATERIALES Y MÉTODOS
P. aeruginosa P1, P1 y M1C.1, fueron cultivadas en medio mínimo de sales toda la noche a
37°C en erlenmeyers de 250ml, a 200 rpm. Seguido de esto 50 ml de medio fresco fue
inoculado con 5 ml del cultivo anterior, en un erlenmeyer de 250ml a 37°C en el shaker a
200rpm (cultivo secundario). Después de 5h 200 µl de solución de fago fueron inyectados
al cultivo, al cual se le hicieron mediciones de OD600, concentración de glucosa, y
determinación de unidades formadoras de colonia por mililitro, con el fin de construir la
curva de infección. Cabe aclarar que la solución de fagos fue suministrada por Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIM IC).
Nota: Los procedimientos descritos a continuación ara P.aeruginosa P1, fueron realizadas en el Centro de Investigaciones M icrobiológicas (CIM IC). Para P.aeruginosa M1C.1
fueron realizados en el laboratorio de biotecnología del departamento de Ingeniería
Química de la universidad de los Andes.
4.1. DETERMINACIÓN DE LA D ENS IDAD ÓPTICA DEL C ULTIVO.
Para determinar OD600 del cultivo, se tomaron muestras de 1000µl cada hora durante 10 horas para P.aeruginosa P1 y durante 45 h para P.aeruginosa M1C.1. Se realizaron
lecturas de absorbancia y porcentaje de transmitancia a cada muestra, en un
espectrofotómetro génesis.
4.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOS A.
Con el fin de determinar la concentración de glucosa en el medio, se tomaron muestras de
1000µl cada hora durante 10 horas para P.aeruginosa P1 y durante 45 h para P.aeruginosa
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M 1C.1. Las muestras fueron centrifugadas a 14000rpm por 15 minutos con el fin de separar
las células del medio de cultivo. Este último fu tratado con kit de glucosa, el cual contiene
la enzima glucosa oxidasa. Dicha enzima, como su nombre lo indica oxida este azúcar,
dando un producto con coloración, lo cual permite hacer una lectura espectrofotométrica
del mismo. Las mediciones de absorbancia se realizaron a 500nm.
4.3. DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR
Después de leer el porcentaje de transmitancia de las muestras tomadas directamente del
cultivo secundario en cada instante de tiempo se realizan diluciones a la muestra
dependiendo del resultado del porcentaje de transmitancia como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Diluciones a sembrar de acuerdo con el porcentaje de transmitancia
%Transmitancia Diluciones a
sembrar
89-99 -2,-3,-4
80-89 -3,-4
71-80 -4,-5
45-70 -5,-6
30-45 -6,-7
<30 -7,-8,-9
La siembra se realizo en superficie. Posteriormente se realizó el conteo de colonias.
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37
5. MODELOS MATEMÁTICO DEL SIS TEMA.
Para modelar el proceso de infección viral en P. aeruginosa se realizó el planteamiento de seis
modelos, los cuales manejan parámetros y consideraciones diferentes del sistema, cinco de ellos
fueron tomados de Jain et al, 2006. A continuación se describe cada uno de ellos. Tanto el
significado como las unidades de las variables y parámetros de las ecuaciones se encuentran en la
tabla 3.
Modelo 1. Solo células infectadas crecen: Este modelo clasif ica las células bacterianas en
infectadas y no infectadas, en donde las infectadas no crecen. El incremento en la densidad
de población de bacterias se debe solo al crecimiento de las células no infectadas.
5
6
7
⁄
(8)
,
,
Modelo 2. Células infectadas y no infectadas crecen a la misma tasa.
Este modelo es una modificación del modelo 1.
10
11
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38
12
⁄ ⁄
(13)
, ,
Modelo 3. Células infectadas y no infectadas crecen a diferentes tasas.
15
16
17
1
⁄
1
⁄ 18
,
,
, ,
Modelo 4. Solo crecen células no infectadas, hay presencia de células resistentes al fago. Las bacterias no infectadas se dividen en dos subpoblaciones: las sensibles al fago (Z) y las
resistentes al fago (R). Ambas poblaciones tienen tasas de crecimiento diferentes.
21
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39
22
23
24
1
⁄
1⁄
25
,
,
,
,
28
Modelo 5. Hay presencia de células resistentes al fago, solo células no infectadas crecen,
las células no infectadas se lisan a los 480 min.
29
30
31
32
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40
1
⁄
1
⁄ 33
Donde U es una función escalón que toma valores de 0 para los primeros 480 min, y 1 para
tiempos mayores a 480 min.
Modelo 6. Células infectadas y no infectadas crecen a diferentes tasas. Las células no
infectadas se lisan a los 480 min.
34
35
36
1
⁄
1⁄
37
, ,
, ,
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41
T abla 3. Significado y unidades de las variables/parámetros de las ecuaciones de los modelos
Variable/parámetro Significado Unidades
X Concentración de células no infect adas UFC/ml.
Y Concentración de células infectadas UFC/ml.
P Concentración de fago libre UFP/ml
S Concentración de sustrato mg/l
µx Tasa de crecimiento de células no
infectadas
min-1
µy Tasa de crecimiento de células infectadas min-1
µmaxX Tasa máxima de crecimiento de células no
infectadas.
min-1
µz Tasa de crecimiento de células sensibles la
fago
min-1
µR Tasa de crecimiento de células resistentes min-1
k1 Tasa de infección min-1
k2 Tasa de muerte min-1
k3 Tasa de lisis de células infectadas min-1
k4 Tasa a la cual la progenie de fagos se
reproduce
min-1
k5 Tasa a la cual las partícul as del fago se
degradan
min-1
k6 Tasa de muerte de células resistentes min-1
Yx/S Factor de rendimiento asociado con la
producción de células no infectadas
respecto al sustrato consumido
células/g glucoasa
Yy/S Factor de rendimiento asociado
con la producción de células infectadas
respecto al sustrato consumido
células/g glucoasa
YR/s rendimientos asociados a la producción de
células resistentes
células/g glucoasa
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42
Yz/s rendimiento asoci ado a la producción de
células sensibles al fago
células/g glucosa
Ks,x Constante de Monod para células no
infectadas
mM glucosa
Ks,y Constante de Monod para células
infectadas
mM glucosa
Ks,R constante de monod para las células
resistentes
mM glucosa
Ks,z constantes de monod para las células
sensibles al fago
mM glucosa
6. DETERMIN ACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS .
Para determinar los parámetros cinéticos del proceso de infección viral en P.aeruginosa, se
realizó un proceso de optimización utilizando recocido simulado minimizando los mínimos
cuadrados entre los datos experimentales y el modelo. Para esto fue necesaria la
implementación de la herramienta desarrollada en M ATLAB ® “System biology toolbox” (Schmidt y Jirstrand, 2006).
Una vez calculados los parámetros cinéticos se procedió a hacer una verificación de estos corriendo los modelos con los resultados obtenidos. Se realizaron perfiles de la variación en
el tiempo de la población de células infectadas, no infectadas, densidad de fago libre y
concentración de sustrato, durante el proceso infectivo.
Dichos perfiles fueron comparados con los obtenidos experimentalmente, en donde la
densidad de células no infectadas se tomaron como las UFC/ml de las células viables
presentes en el cultivo infectado, la concentración de células infectadas se determino
IQ‐2009‐I‐3
43
haciendo la diferencia entre las células presentes en el cultivo al que no se le inyectó el
fago, y las células viables presentes en el cultivo infectado. Los datos correspondientes a la
densidad de fago libre fueron generados in silico a partir de cada uno de los modelos.
En este caso particularmente, se usa el algoritmo de recocido simulado para hallar los
parámetros cinéticos del proceso de infección viral en P. aeruginosa. Para esto, como
primera instancia, el algoritmo halla los parámetros de cada modelo con las condiciones
iniciales dadas, y genera datos solucionando dichos modelos. Luego calcula la energía del
estado, traducida en la distancia entre los datos obtenidos y los datos experimentales.
Posteriormente una perturbación al estado inicial es generada, dando como resultado un
nuevo estado del sistema, para el cual son calculados nuevamente los parámetros del
sistema.
Con estos parámetros se generan nuevos datos los cuales son comparados con los datos experimentales hallando la distancia entre estos (Energía del nuevo estado). Si la energía de
nuevo estado es menor que la inicial, este estado se acepta como el nuevo estado inicial. De
lo contrario si la energía el nuevo estado es mayor a la del estado inicial, el nuevo estado no
se rechaza inmediatamente, sino que se trata probabilísticamente como se describe a
continuación: Se realiza el cálculo de la probabilidad del nuevo estado mediante la
ecuación 34 utilizando un valor de temperatura inicial. Si ∆ es menor a un número
aleatorio generado entre cero y uno, el nuevo estado se acepta como estado inicia, si no se
rechaza. Cada vez que se calculen nuevas probabilidades, hay que disminuir lentamente la
temperatura. En la Figura 5 se muestra el procedimiento que usa recocido simulado para el
cálculo de los parámetros cinéticos de cada modelo. Cabe aclarar que este algoritmo hace
parte de los algoritmos de optimización del “System biology toolbox” de M ATLAB
(Schmidt y Jirstrand, 2006): herramienta utilizada durante el desarrollo de este trabajo.
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44
Figura 5. Proceso utilizado por recocido simulado para calcul ar los parámetros cinéticos de cada uno de los
modelos.
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45
7. RES ULTADOS Y ANÁLISIS
7.1. RESULTADOS EXP ERIMENTALES
A continuación se muestran los resultados de la curva de infección y la concentración de
glucosa en el tiempo para P.aeruginosa P1 y M1C.1.
La Figura 6 muestra los resultados de la lectura de absorbancia a 600nm en el tiempo para los cultivos infectados y no infectados con fago para P.aeruginosa P1. Se puede notar que
antes de 8h la absorbancia para los dos cultivos crece de la misma manera. Después de 8 h
la absorbancia del cultivo con fago disminuye en comparación con la absorbancia del
cultivo libre de fago. Esto da una primera noción de la dinámica del sistema: después de 8h
la concentración de células no infectadas disminuye en el cultivo infectado con fagos.
En la figura 7 se puede observar la concentración de células no infectadas en los cultivos con y sin fago. Antes de 8h la concentración de bacterias es la misma para ambos cultivos
en cada instante de tiempo. Sin embargo después de este tiempo, el cultivo que contiene el
fago sufre una disminución abrupta en la concentración de células bacterianas. De esto es posible decir que el fago se activa después de la octava hora teniendo en cuenta que este fue
inyectado al cultivo pasadas 5h de haber iniciado la curva de infección.
A partir de esto es posible concluir que existe un periodo de latencia de 3h en el cual, el fago aunque está presente en el medio, no lisa las células bacterianas. Esto es posible
corroborarlo observando la curva de concentración de glucosa mostrada en la Figura 8, en
donde se puede observar que el sustrato no disminuye con la misma velocidad después de 8h en el cultivo con fago que en el cultivo sin fago.
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46
Figura 6. Absorbancia en el tiempo para P.aeruginosa P1. .( ) Control. ( ) Cultivo infectado
Figura 7. Concentración de células en el tiempo para P.aeruginosa P1. .( ) Control. ( ) Cultivo infectado
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Figura 8. Concentración de glucosa en el tiempo para P.aeruginosa P1.( ) Control. ( ) Cultivo infectado
Indicando de esta manera que después del periodo de latencia la población de células
bacterianas se reduce de tal manera que no hay microorganismos que consuman la misma
cantidad de sustrato que en el medio que no fue infectado con fagos. La figura 9 muestra los resultados de las mediciones de absorbancia en el tiempo para P.
aeruginosa M 1C.1. Para el cultivo con fagos se puede observar que aunque sigue la misma
tendencia que la curva de absorbancia para el cultivo libre de fagos, la velocidad de crecimiento es menor en todos los instantes de tiempo después de 5 h, momento en el que el
fago es inyectado al cultivo. En la figura 10 se observan los perfiles obtenidos para la
concentración de células en el medio. Es posible observar que después de 5h la
concentración de bacterias es menor en todos los puntos para el cultivo con fago que para el
cultivo sin fago. Sin embargo el crecimiento de la población bacteriana continúa. A partir
de esto es posible decir que el fago está causando una reducción en la tasa de crecimiento
de las bacterias, sin embargo la velocidad de infección no es suficiente para reducir la población al mínimo como es deseable.
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48
Los resultados anteriores se pueden corroborar a partir de la curva de concentración de
glucosa en el tiempo para este sistema, la cual se muestra en la figura 11. Es posible notar
como para las células que pertenecen al cultivo libre de fago, la concentración de sustrato
disminuye constantemente. Para las células infectadas con fago, la glucosa disminuye
lentamente después de 5h y al final del experimento se puede considerar constante,
indicando de esta manera que existe una cantidad menor de microorganismos que
consumen sustrato en el cultivo infectado, en cada instante de tiempo después de la inyección del fago. Esto sugiere una vez más la reducción en la velocidad de crecimiento de
las células infectadas.
Figura 9. Absorbancia en el tiempo para P.aeruginosa M1C.1 . ( ) Control. ( ) Cultivo infectado
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Figura 10.Concentración de células en el tiempo para P.aeruginosa M1C.1. ( ) Control. ( )Cultivo
infectado.
Figura 11. Concentración de glucosa en el tiempo para P.aeruginosa M1C.1. ( ) Control. ( ) Cultivo
infectado
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50
7.2. PROCES O DE INGEN IERÍA REVERS A
En las tablas 4 y 5 se muestran los parámetros cinéticos obtenidos para los modelos después
de haber realizado el proceso de optimización mediante recocido simulado usando el
“System biology toolbox” de MATLAB® (Schmidt y Jirstrand, 2006). Para P.aeruginosa
M 1C.1 no se evaluaron los modelos 5 y 6 dado que en el sistema real no se observa
periodo de latencia después del cual se activa el fago. Como solo se tienen datos de curva
de crecimiento sin fago, los datos relacionados con este se tomaron de Jain et al (2006).
Tabla 4. Parámetros cinéticos estimados para el proceso de infección viral en P.aeruginosa P1
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Tabla 5. Parámetros cinéticos estimados para el proceso de infección viral en P.aeruginosa M1C.1
Con el fin de verificar los resultados anteriores, se corrió cada uno de los modelos con los
parámetros cinéticos hallados previamente usando un ODE45 (Rungekutta de cuarto orden)
en M ATLAB® mediante el “system biology tool box”
A continuación se muestran los perfiles obtenidos para los modelos que tuvieron un mejor ajuste para cada sistema: Para P.aeruginosa P1, el modelo 6 muestra los mejores resultados
dada la tendencia y orden de magnitud de los datos. Lo mismo ocurre con el modelo 2 para
P.aeruginosa M 1C.1. Los demás perfiles resultantes se muestran en el Anexo 1. Los datos
representados por puntos son los datos experimentales, la línea continua son los datos
arrojados por la simulación.
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Figura 12. Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de concentración de células
no infect adas para P.aeruginosa P1.
Figura 13. Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de concentración de células
infectadas para P.aeruginosa P1.
Figura 14. Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de densidad de fago libre
para P.aeruginosa P1.
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Figura 15. Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimental es de concentración de
sustrato para P.aeruginosa P1.
Observando los perfiles resultantes del modelo 6 en comparación con los datos in vivo, los
cuales se muestra en las figuras12, 13, 14 y 15, se puede concluir que en el sistema fago-P.aeruginosa P1, las células infectadas y no infectadas crecen a diferentes tasas y que
existe un periodo de latencia después del cual el fago es activado.
Figura 16. Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración de células
no infect adas para P.aeruginosa M1C.1.
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54
Figura 17. Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración de células
infectadas para P.aeruginosa M1C.1.
Figura 18. Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de densidad de fago libre
para P.aeruginosa M1C.1
Figura 19. Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimental es de concentración de
sustrato para P.aeruginosa M1C.1.
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Observando los perfiles resultantes para el modelo 2, los cuales se muestran en las figuras
16, 17, 18, 19, y comparándolos con los datos obtenidos experimentales para el sistema
fago –P.aeruginosa M1C.1 es posible concluir que este modelo describe
aproximadamente el comportamiento del sistema real sugiriendo de esta manera que
células infectadas y no infectadas tienen la misma velocidad de crecimiento, pero que la
presencia del fago hace que esta disminuya en comparación con un sistema que no ha sido
infectado con fagos.
Estos resultados se corroboraron calculando los mínimos cuadrados entre los datos de la
simulación y los datos experimentales, como se muestra en las tablas 6 y 7.
Tabla 6. Cálculo de los mínimos cuadrados para los modelos 1-6 . P.aeruginosa P1
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56
Tabla 7. Cálculo de los mínimos cuadrados para los modelos 1-4 . P.aeruginosa M1C.1
Para determinar cual modelo se aproxima más al comportamiento de los resultados in vivo,
se tuvo en cuenta los resultados obtenidos para las variables medidas directamente del
experimento: Células no infectadas y concentración de sustrato. A partir de esto se pudo corroborar que el modelo 6 es el que mejor describe el comportamiento del sistema para
P.aeruginosa P1 y el modelo 2 es una aproximación al comportamiento del sistema para
P.aeruginosa M 1C.1
El hecho que para cada una de las cepas P.aeruginosa estudiadas se haya encontrado un
modelo diferente que describe el comportamiento del sistema real, sugiere que hay una
diferencia en la dinámica de infección entre diferentes cepas de una sola bacteria. Una posible explicación a esto se encuentra en Jarrell and Kropinski (1981), en donde se
realizó un estudio a la composición de los lipopolisacáridos, LPS (moléculas que juegan el
rol más importante en el reconocimiento de bacteriófagos), de membrana de diferentes
cepas de P.aeruginosa. Se determinó que la composición de los LPS difería para cada cepa.
También se realizó curva de infección con el mismo fago y con las mismas condiciones de
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57
cultivo, usando cepas diferentes de P.aeruginosa. Para cada sistema se obtuvieron,
distintas concentraciones de células infectadas y de fago en el medio. Estos resultados
llevan a decir que diferencias en la composición y por lo tanto de estructura de los LPS,
juegan un papel crucial en la actividad receptora de estas macromoléculas, lo cual influye
directamente en la dinámica de infección viral.
Los resultados obtenidos por el estudio anterior y los del presente trabajo llevan a una
posible conclusión: El proceso infectivo en diferentes cepas de P. aeruginosa difiere
signif icativamente, lo cual hace que el sistema fago-bacteria tenga un comportamiento
disímil, siendo la principal causa la diferencia de composición de los receptores virales
entre las cepas.
IQ‐2009‐I‐3
58
8. CONCLUS IONES .
Se realizó la determinación de los parámetros cinéticos de infección viral utilizando los
datos experimentales de curva de infección de dos diferentes cepas de P.aeruginosa, de los
cuales se sacó información de células infectadas, no infectadas y concentración de sustrato.
Los datos relacionados con la densidad de fago libre fueron generados in silico a partir de
cada modelo.
Fueron encontrados perfiles de la variación en el tiempo de la población de células
infectadas, no infectadas, densidad de fago libre y concentración de sustrato, durante el
proceso infectivo, con el f in de verificar los parámetros encontrados. De esto fue posible
concluir que el modelo 6 describe acertadamente el comportamiento real del sistema fago-
P.aeruginosa P1. El modelo 2 se aproxima al comportamiento in vivo del sistema fago-
P.aeruginosa M 1C.1
El hecho que para cada uno de los sistemas estudiados exista un modelo diferente que
describa el sistema in vivo, quiere decir que existe una diferencia significativa en el
comportamiento y dinámica de infección entre diferentes cepas de P.aeruginosa.
La determinación de los parámetros cinéticos de la interacción fago-bacteria tiene una
profunda implicación en la fago-terapia, ya que con el correcto entendimiento de la
dinámica de infección, es posible desarrollar y optimizar estrategias de tratamiento con fagos que sean eficaces para combatir bacterias patógenas.
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9. RECOMENDACIONES .
Para tener un correcto entendimiento del proceso de la dinámica de infección es
pertinente no solo el uso de una aproximación determinística, sino también
desarrollar modelos estocásticos y realizar análisis de incertidumbre mediante álgebra de intervalos para así poder determinar el efecto del ruido o de la
incertidumbre en el cálculo de parámetros.
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10. REFERENCIAS
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11. ANEXOS
ANEXO 1. PERFILES OBTENIDOS PARA P.aeruginosa P1.
Los datos representados por puntos son los datos experimentales, la línea continua son los
datos arrojados por la simulación.
Modelo 1.
Resultados del Modelo 1 en comparación con los datos experimentales de concentración de células no
infectadas para P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 1 en comparación con los datos experimentales de concentración de células infect adas
para P.aeruginosa P1.
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Resultados del Modelo 1 en comparación con los datos experimentales de concentración de fago libre para
P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 1 en comparación con los datos experimental es de concent ración de glucos a para
P.aeruginosa P1.
Modelo 2.
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Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración de células no
infectadas para P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración de células
infectadas para P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimental es de concentración de fago libre para
P.aeruginosa P1.
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71
Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimental es de concent ración de glucos a para
P.aeruginosa P1.
Modelo 3
Resultados del Modelo 3 en comparación con los datos experimentales de concentración de células no
infectadas para P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 3 en comparación con los datos experimentales de concentración de células infect adas
para P.aeruginosa P1.
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Resultados del Modelo 3 en comparación con los datos experimentales de concentración de fago libre para
P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 3 en comparación con los datos experimental es de concent ración de glucos a para
P.aeruginosa P1.
Modelo 5
Resultados del Modelo 5 en comparación con los datos experimentales de concentración células no infect adas
para P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 5 en comparación con los datos experimentales de concentración células in fect adas
para P.aeruginosa P1.
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Resultados del Modelo 5 en comparación con los datos experimentales de concentración fago libre para
P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 5 en comparación con los datos experimental es de concent ración de glucos a para
P.aeruginosa P1.
Modelo 6
Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de concentración de células no
infectadas para P.aeruginosa P1.
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Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de concentración de células infect adas
para P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de densidad de fago libre para
P.aeruginosa P1.
Resultados del Modelo 6 en comparación con los datos experimentales de concentración de sustrato para
P.aeruginosa P1.
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ANEXO 2. PERFILES PARA P.aeruginosa M1C.1.
Los datos representados por puntos son los datos experimentales, la línea continua son los
datos arrojados por la simulación.
Modelo 1.
Resultados del Modelo 1 en comparación con los datos experimentales de concentración de células no
infectadas para P.aeruginosa M1C.1.
Resultados del Modelo 1 en comparación con los datos experimentales de concentración de células infect adas
para P.aeruginosa M1C.1.
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Resultados del Modelo 1 en comparación con los datos experimentales de concentración de fago libre para
P.aeruginosa M1C.1.
Resultados del Modelo 1 en comparación con los datos experimentales de concent ración de glucosa para
P.aeruginosa M1C.1.
Modelo 2.
Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración de células no
infectadas para P.aeruginosa M1C.1.
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Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración de células infect adas
para P.aeruginosa M1C.1.
Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de densidad de fago libre para
P.aeruginosa M1C.1
Resultados del Modelo 2 en comparación con los datos experimentales de concentración de sustrato para
P.aeruginosa M1C.1.
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Modelo 3.
Resultados del Modelo 3 en comparación con los datos experimentales de concentración de células no
infecadas para P.aeruginosa M1C.1.
Resultados del Modelo 3 en comparación con los datos experimentales de concentración de células infecadas
para P.aeruginosa M1C.1.
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79
Resultados del Modelo 3 en comparación con los datos experiment ales de concentración de fago libre para
P.aeruginosa M1C.1.
Resultados del Modelo 3 en comparación con los datos experimentales de concentración de glucosa para
P.aeruginosa M1C.1.
Modelo 4.
Resultados del Modelo 4 en comparación con los datos experiment ales de concentración de células no
infectadas para P.aeruginosa M1C.1.
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80
Resultados del Modelo 4 en comparación con los datos experimentales de concentración de células infect adas
para P.aeruginosa M1C.1.
Resultados del Modelo 4 en comparación con los datos experiment ales de concentración de fago libre para
P.aeruginosa M1C.1.
Resultados del Modelo 4 en comparación con los datos experimentales de concent ración de glucosa para
P.aeruginosa M1C.1.
