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mk2006-2007Design des amorces
Recherche et optimisation des amorces pour la PCR
Les amorces doivent être spécifiques, stables et compatibles
Etape cruciale de la réussite de la PCR
mk2006-2007Design des amorces
Amorce gauche et amorce droite
5 ' 3 '
A m orce d roite (an tisen s) 3 ' 5 '
5 '3 '
A m orce gauch e (sen s)3 '5 '
Séquen ce iden tiqueà la séquen ce 5 -3 ' com plém en t in verse
de la séquen ce 5 '-3 '
Séquen ce cible
Peut être déterminé à l’aide de SMS2
Sequence Manipulation Suite 2
mk2006-2007Design des amorces
Zone d’hybridation unique
L’amorce doit s’hybrider avec une seule zone de l’ADN matrice
5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT……………………CGACATCGCCGTCGTACCCGTCGTCCGTCGGG-3’
Amorce spécifique
Amorce non spécifique
Il est nécessaire d’établir la carte d’hybridation des amorces avec l’ADN matrice
Résultat obtenu avec Sequence Manipulation Suite 2
EXEMPLE
|||||||||||| 5’-CGACGGACGACG-3’
5’-CGACGGCGATGT-3’||||||||||||
5’-CGACGGCGATGT-3’||||||||||||
mk2006-2007Design des amorces
Spécificité de l’amorce
L’amorce doit être spécifique du gène ou de l’espèce recherchée. Elle ne doit pas s’hybrider avec un ADN contaminant
Pour le vérifier on peut réaliser un alignement local avec BLAST
5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’
Amorce gauche utilisée pour détecter Salmonella sp
*Letters in Applied Microbiology 2003, 36, 217–221
EXEMPLE
mk2006-2007Design des amorces
Longueur des amorces
La longueur de l’amorce influe sur la température de fusion (Tm), la température d’hybridation (Ta) et la spécificité
En général 18-30 nucléotides
Spécificité et Tm augmentent avec la longueur
mk2006-2007Design des amorces
Composition des amorces
La composition en bases de l’amorce influe sur la température de fusion (Tm), la température d’hybridation (Ta) et la spécificité
En général compris entre 40-60%
La Tm augmente avec le %GC
Il faut éviter les zones riches en AT ou en CG, la répartition des bases doit être de préférence aléatoire
mk2006-2007Design des amorces
Détermination du Tm et Ta
Tm = 4 . (nG + mC) + 2 . (pA + qT)
Tm = 81,5 + 16,6 . Log([M+]) + 0,41 . (%GC) – 675 / L
+ΔHTm= - 273,15 +16,6 .Log[M ]
ΔS+R .Ln (C/4)
Règle de Wallace
Règle tenant compte de la longueur et les sels monovalents (M)
Méthode thermodynamique (nearest-neighbour base model)
Ta = 0,3 . Tm(amorce) + 0,7 . Tm(amplicon) - 14,9
Melting temperature
Annealingtemperature
Liens pour détermination Tm par différentes méthodes
Méthode la plus précise car elle tient compte de la séquence (forces d’empilement des bases) et pas uniquement du %GC
mk2006-2007Design des amorces
Stabilité de l’extrémité 3’
La stabilité de l’extrémité 3’ conditionne une bonne initiation de la polymérisation.
5’ 3’ 5’3’
Extrémité 3’ stable Extrémité 3’ instable
On privilégie la présence de quelques bases GC en 3’, mais pas en grand nombre car on risque de provoquer des fixations non spécifiques
5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT……………………CGACATCGCTCGTCCGTCGGTCGTCCGTCGGG-3’
5’-CGACGGACGAGCG-3’|||||||||||||
GCG-3’|||
5’-CGACGGACGA
False priming
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Dimères et épingles à cheveux
Les amorces ne doivent pas s’autohybrider (self-dimer) ni s’hybrider entre elles (dimer), ni former des structures en
épingles à cheveux (hairpin)
La stabilité de ces structures est évaluée par le G.
Liens pour analyser les primers (Netprimer)
mk2006-2007Design des amorces
Compatibilité des amorces
Les amorces doivent avoir des Ta procheset par conséquent des Tm proches
La différence des Ta ne doit pas excéder 2 à 3 °C
mk2006-2007Design des amorces
Exercice
Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium dans GENBANK
Recherche d’amorces simples et vérification de leur qualité
Recherche d’amorces optimisées avec Primer3
Recherche d’amorces optimisées avec PerlPrimer
mk2006-2007Design des amorces
Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium
mk2006-2007Design des amorces
Résultats
mk2006-2007Design des amorces
Séquence du gène invA de Salmonella typhimurium
Séquence du gène au format FASTA
>gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA)GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTG TGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCAACATTT
Séquence cible à amplifier (300 nt)
mk2006-2007Design des amorces
Amorces non optimisées
>gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA)GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCAACATTT
Amorces déduites des séquences en amont et en aval
5’-TTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’
Amorce gauche
5’-CCGCCAATAAAGTTCACAAA-3’
Amorce droite
mk2006-2007Design des amorces
Analyse de l’amorce gauche avec Netprimer
Mauvaise amorce : formation d’épingle,
de dimères
mk2006-2007Design des amorces
Analyse de l’amorce droite avec Netprimer
Pas d’épingle, pas de dimères
Mais Tm très différent de l’amorce gauche
mk2006-2007Design des amorces
Recherche d’amorces avec Primer3
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm
mk2006-2007Design des amorces
Résultats avec Primer3
Légende
****** cible >>>>>> amorce gauche <<<<<< amorce droite
Plusieurs couples d’amorces sont proposés
On remarque que le logiciel a trouvé d’autres amorces
plus optimisées mais pas à la même position
mk2006-2007Design des amorces
Recherche d’amorces avec PerlPrimer
Il s’agit d’un logiciel libre téléchargeable
Copier/coller la séquence
Définir la région à amplifier
Recherche des amorces
Visualisation et analyse des amorces
Visualisation de la séquence et des amorces
mk2006-2007Design des amorces
Résultats avec PerlPrimer
On peut réaliser un Blast directement pour vérifier la
spécificité des amorces
Analyse de la qualité des amorces
mk2006-2007Design des amorces
Résultats de l’analyse avec Blast
Les primers choisies s’alignenent en
uniquement avec des séquences provenant
de Salmonella