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TD design d’amorces PCR : criblage de clones recombinants par PCR Objectif : Choisir deux amorces (ou « primers ») permettant d’amplifier une portion de gène désirée afin de vérifier la présence d’un plasmide recombinant pGEM 3Z / luc dans des clones bactériens transformés étalés sur un milieu de sélection. Les clones présents sur une boîte de Pétri après transformation peuvent être de deux natures :

- ils sont dits « transformants » s’ils ont intégré un plasmide ne contenant pas la cassette insérée dans le plasmide ;

- ils sont dits « recombinants » s’ils contiennent un plasmide ayant inséré le gène d’intérêt.

Outre le criblage des clones par analyse du profil de restriction de l’ADN plasmidique, une autre approche, plus rapide, par PCR, peut être envisagée. Dans ce cas, la recherche d’amorces constitue la première étape. Deux démarches sont possibles : 1- Réaliser une PCR ciblée sur l’insert cloné dans le vecteur recombinant. 2- Réaliser une PCR utilisant des amorces universelles spécifiques du vecteur.

Stratégie de clonage du gène luc dans pGEM-3Z

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Première approche : réalisation d’une PCR ciblée sur le gène luc. 1- Sur le site du NCBI, rechercher la fiche correspondant au plasmide pGEM-luc. 2- Noter son numéro d’accès : X………………… 3- À partir de cette fiche d’information, repérer la séquence correspondant au gène de la luciférase. En déduire la taille du gène luc. 4- Télécharger ou copier-coller la séquence nucléique du gène luc au format FASTA dans votre compte-rendu (décocher la case « Show reverse complement puis cliquer sur « Update View »). Préciser l’orientation de la séquence et la position des codons START et STOP. 5- Accéder au logiciel Primer3 6- Coller la séquence du gène luc dans la fenêtre prévue à cet effet. 7- Imposer les paramètres suivants :

- Nom de la séquence (gène luc) ; - Taille des produits de PCR (entre 301 et 400 pb) ; - Taille des amorces et Tm : conserver les paramètres optimaux par défaut.

8- Analyser le rôle des différents paramètres configurés par défaut. 9- Cliquer sur « Pick primers ». 10- Analyser et copier-coller le résultat dans votre rapport (sans copier la séquence).

Organisation du logiciel Primer 3 version 0.4.0.

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Deuxième approche : réalisation d’une PCR utilisant les amorces universelles du vecteur pGEM-3Z. 1- Sur le site du NCBI, rechercher la fiche correspondant au plasmide pGEM-3Z. 2- Noter son numéro d’accès : X………………… 3- Télécharger ou copier-coller la séquence nucléique du plasmide au format FASTA (dans un nouveau fichier) et au format brut (dans votre compte-rendu). 4- Repérer dans la fiche au format GenBank, le nom et la position des amorces universelles pour ce plasmide. 5- Écrire la séquence de ces deux amorces (5’-3’). NB : par convention :

- l’amorce sens ou « primer FORWARD » (FWD) à une séquence identique au brin codant (5’-3’) ;

- l’amorce antisens ou « primer REVERSE » (REV) a une séquence complémentaire au brin codant.

6- Positionner (à l’aide de flèches colorées) les amorces sur la séquence d’ADN du vecteur au format brut en précisant leur nom et leur orientation (5’-3’). Faire apparaître sur cette même séquence les sites de restriction SacI et BamHI, ainsi que le fragment éliminé lors du clonage. 7- Calculer la taille de l’amplicon dans le cas d’un vecteur non recombinant. 8- En vous aidant du schéma en page 1, calculer la taille de l’amplicon dans le cas d’un vecteur recombinant sachant que l’insert luc a été cloné par les enzymes BamHI et SacI. 9- En utilisant Primer3, retrouver la taille de l’amplicon non recombinant et la température d’hybridation des deux amorces. Attention, la séquence d’ADN fournie doit être continue entre les deux amorces. Copier et coller le résultat dans votre compte-rendu. 10- Le choix des deux amorces est-il valide ? 11- Quel est l’intérêt de la seconde approche par rapport à la première ?

Approche 1 Approche 2