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1
Der Alterungsprozess roter Blutzellen und die Auftrennung der Zellen nach Alter
Seminar 1Benjamin Hanf
09.05.2012
2
- Regulationsmechanismen - O2 Transport; sehr flexibel erhöhte Abnutzung
Funktion:
Unterschiedliche Formen der RBCs Modifiziert nach Williams, 2008
3
Motivierung:
- Mögliche Beteiligung von roten Blutkörperchen (RBCs) an Thrombusbildung
- Ideales Modell für Alterungsprozesse (da keine DNA/RNA mehr)
Der Alterungsprozess roter Blutzellen und die Auftrennung der Zellen nach Alter
4
Thrombusbildung:
Thrombozyten heften sich an Kollagen-Fasern erster Verschluss
Thrombusbildung Modifiziert nach HI (High Impact)
5
Thrombusbildung:
Gerinnungskaskade: Prothrombin aktive Form Thrombin Thrombin katalysiert Umwandlung Fibrinogen Fibrin
Thrombusbildung Modifiziert nach HI (High Impact)
6
Thrombusbildung:
Fibrin: Gewebe aus maschenartigen Fäden, die RBCs einfangen
Thrombusbildung Modifiziert nach HI (High Impact)
7
Thrombusbildung:
Passive Beteiligung der RBCs?
Thrombusbildung Modifiziert nach HI (High Impact)
8
Motivierung:
- Mögliche Beteiligung von RBCs an Thrombusbildung- Erhöhter Hämatokrit
Endogenous Thrombin Potential Modifiziert nach McDonald et al., 2006
9
Motivierung:
- Mögliche Beteiligung von RBCs an Thrombenbildung- Erhöhter Hämatokrit- Durch Phosphatidylserin (PS) Fähigkeit zur Aggregation
PS-Exposition und Aggregation von RBCs Modifiziert nach Steffen et al., 2011
10
Motivierung:
- Mögliche Beteiligung von RBCs an Thrombenbildung- Erhöhter Hämatokrit- Durch Phosphatidylserin (PS) Fähigkeit zur Aggregation
PS-Exposition und Aggregation von RBCs Modifiziert nach Wagner et al., 2011
11
Kationen-Kanal
(2-wertige Kationen; Ca2+)
PGE2, LPA Ca2+
Gardos-Kanal
H 2O, K
+ , Cl-
H2O, K+, Cl-
Scra
mbl
ase
induziert
PKC
Ca2+
PS PS
Signalkaskade von RBCs Modifiziert nach Kaestner et al., 2004
12
Gardos-Kanal
Scramblase
A23187
Schrumpfen
PS-Exposition
Aggregation
Einfluss Gardos-Kanal / Scramblase auf Aggregation Modifiziert nach Kaestner et al., 2004
13
Motivierung:
- Mögliche Beteiligung von roten Blutkörperchen (RBCs) an Thrombenbildung
- Ideales Modell für Alterungsprozesse (da keine DNA/RNA mehr)
Lebenszyklus RBCs Modifiziert nach Silbernagel und Despoupolos et al., 2004
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Retikulozyt(RNA / DNA Reste)
(Hämoglobin)
Phagozytose
Max. 120 Tage
Lebenszyklus RBCs Modifiziert nach Silbernagel und Despoupolos et al., 2004
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-Dichtegradientenseparation (in vitro)
- Percoll (s.u.)- Stractan (stark verzweigtes Arabinogalaktan aus Lärchenholz)- Dextran (Polymere aus Glucose) - Serum Albumin (Protein, im Blut vorkommender Reservestoff)
-Isotopenmarkierung (in vivo)
- 14C, 51Cr…
Auftrennung nach Alter (Methoden):
16
Ein Gemisch verschieden alter Zellen (bis zu 120 Tage max. Lebensdauer, Durchschnittsalter: ca. 40 Tage), die unterschiedlich Verhaltensweisen zeigen.
Separation nach Dichte Modifiziert nach Piomelli et al., 2007
17
Schema / Dichtegradientenseparation
Percoll
- Beschichtete Silica-Partikel- Wasserlöslich- biologisch inert
Fraktion 1
Fraktion 2Fraktion 3
Fraktion 4
Fraktion 5
Dichtegradientenseparation von RBCs Modifiziert nach Wagner, 2009
18
Isotopenmarkierung
Hypertransfusion Schema Modifiziert nach Mueller et al., 1987
19
Überleben der Zellen wurde mit Isotopen-markiertem 51Cr getestet.
Künstlich gealterte Zellen: 1 Tag (7%)Normale Zellen: 15 Tage (100%)
Überlebensrate der RBCs Modifiziert nach Mueller et al., 1987
20
Effekte
Bekannt: - Redox-System - Protein 4.1 a/b- Größe
Neu: - PMA- LPA
21
Aktivität des Plasmamembran-Redoxsystems bei Erythrozytenunterschiedlichen Alters:
Effekte
RedOx-System
Ferrocyanid-Assay
Gehalt an Ferrocyanid der aufgetrennten Zellen nach Alter Wagner, 2009
22
Von Anfangs (C) ca. 70:30(b:a) zu ca. 50:50 (b:a) bei alten (H) Zellen.
Effekte
Protein 4.1 a/b
Unterschied nach Alter Bande 4.1a und 4.1b Modifiziert nach Mueller et al., 1987
23
Effekte
Größe
Häufigkeit in Größe der Zellen nach Alter Wagner, 2009
24
Effekte
Bekannt: - Redox-System - Protein 4.1 a/b- Größe
Neu: - PMA- LPA
25
Kationen-Kanal
(2-wertige Kationen; Ca2+)
PGE2, LPA Ca2+
Gardos-Kanal
H 2O, K
+ , Cl-
H2O, K+, Cl-
Scra
mbl
ase
induziert
PKC
Ca2+
A23187
Ca2+
PS PSPMA
aktiviert
Signalkaskade von RBCs Modifiziert nach Kaestner et al., 2004
0 200 400 600 800 1000FSC-H
F4PMA_tube5.014
0 200 400 600 800 1000FSC-H
F4PMA_tube5.014
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch
All 1, 9910 30000 100.00 100.00 366.69 257.88 89.38 276.32 577
M1 1, 143 9181 30.60 30.60 97.65 90.28 31.30 101.82 124
M2 143, 9910 20938 69.79 69.79 483.39 407.22 68.12 441.09 577
M3 1, 255 14550 48.50 48.50 130.39 117.40 40.39 125.21 124
M4 255, 9910 15498 51.66 51.66 588.19 539.82 54.79 532.80 577
File: F4PMA_tube5.014 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List
Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate
Gated Events: 30000 Total Events: 30000
X Parameter: FL1-H (Log)
Region Statistics
File: F4PMA_tube5.014 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List
Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate
Gated Events: 30000 Total Events: 30000
X Parameter: FSC-H (Linear) Y Parameter: FL1-H (Log)
Region Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean Px,Py
R1 29993 99.98 99.98 399.94 382.75 364.46 257.66 1, 3
100 101 102 103 104
FL1-H
F4PMA_tube5.014
0 200 400 600 800 1000FSC-H
F4PMA_tube1.001
0 200 400 600 800 1000FSC-H
F4PMA_tube1.001
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch
All 1, 9910 30000 100.00 100.00 19.31 16.40 651.77 16.40 17
M1 1, 143 29956 99.85 99.85 17.27 16.32 35.89 16.40 17
M2 143, 9910 44 0.15 0.15 1407.59 428.12 213.73 249.16 9910
M3 1, 316 29985 99.95 99.95 17.47 16.36 51.53 16.40 17
M4 316, 9910 15 0.05 0.05 3697.01 1556.64 118.75 913.98 9910
File: F4PMA_tube1.001 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List
Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate
Gated Events: 30000 Total Events: 30000
X Parameter: FL1-H (Log)
Region Statistics
File: F4PMA_tube1.001 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List
Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate
Gated Events: 30000 Total Events: 30000
X Parameter: FSC-H (Linear) Y Parameter: FL1-H (Log)
Region Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean Px,Py
R1 29996 99.99 99.99 405.63 373.13 17.99 16.38 1, 3
100 101 102 103 104
FL1-H
F4PMA_tube1.001
0 200 400 600 800 1000FSC-H
F4PMA_tube2.004
0 200 400 600 800 1000FSC-H
F4PMA_tube2.004
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch
All 1, 9910 30000 100.00 100.00 296.07 256.80 56.65 294.27 291
M1 1, 143 2879 9.60 9.60 59.88 49.01 60.98 49.58 46
M2 143, 9910 27140 90.47 90.47 321.02 306.00 48.69 305.05 291
M3 1, 119 2586 8.62 8.62 51.69 43.80 55.35 44.51 46
M4 119, 9910 27427 91.42 91.42 319.03 303.29 49.11 302.32 291
File: F4PMA_tube2.004 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List
Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate
Gated Events: 30000 Total Events: 30000
X Parameter: FL1-H (Log)
Region Statistics
File: F4PMA_tube2.004 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List
Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate
Gated Events: 30000 Total Events: 30000
X Parameter: FSC-H (Linear) Y Parameter: FL1-H (Log)
Region Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean Px,Py
R1 29997 99.99 99.99 424.46 402.88 295.11 256.71 1, 3
100 101 102 103 104
FL1-H
F4PMA_tube2.004
Standard nach 30 Minuten bei 33 a.u. -63 a.u. ggü. ~1500 a.u. bei angeregten Zellen
0‘
5‘
30‘
27
Effekte
PS-Exposition Kontrolle stark
Kontrolle: Nach alter getrennte Zellen mit starker PS-Exposition Wagner, 2009
28
Effekte
PS-Exposition Kontrolle schwach
Kontrolle: Nach alter getrennte Zellen mit schwacherPS-Exposition Wagner, 2009
29
Effekte
PS-Exposition PMA stark
PMA: Nach alter getrennte Zellen mit starker PS-Exposition Wagner, 2009
30
Effekte
PS-Exposition PMA schwach
PMA: Nach alter getrennte Zellen mit schwacher PS-Exposition Wagner, 2009
31
Effekte
PS-Exposition LPA stark
LPA: Nach alter getrennte Zellen mit starker PS-Exposition Wagner, 2009
32
Effekte
PS-Exposition LPA schwach
LPA: Nach alter getrennte Zellen mit schwacher PS-Exposition Wagner, 2009
33
Effekte
PS-Exposition Hämolyse (LPA stark)
Generelles Problem: Hämolyserate + Reaktion des Blutes auf LPA (Spenderabhängig)
Hämolyserate LPA: Nach alter getrennte Zellen mit starker PS-Exposition Wagner, 2009
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Kationen-Kanal
(2-wertige Kationen; Ca2+)
PGE2, LPA Ca2+
Gardos-Kanal
H 2O, K
+ , Cl-
H2O, K+, Cl-
Scra
mbl
ase
induziert
PKC
Ca2+
A23187
Ca2+
PS PSPMA
aktiviert
Signalkaskade von RBCs Modifiziert nach Kaestner et al., 2004
35
Fazit / Ausblick
- Effektive Methode zur Separation der Zellen nach Alter- Redoxsystem- Zellgröße- Bande 4.1 a / b
- Kein Trend in den verschiedenen Altersklassen mit PMA / LPA
- Doppelbestimmung von intrazellulären Ca2+– Gehalt und PS Exposition
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Referenzen•L. Wagner, D.B. Nguyen, A. Jung, P. Steffen, C. Wagner, L. Kaestner, T. Mueller, I. Bernhardt „Phosphatidylserine Exposure and Aggregation of Red Blood Cells“ (2011) Red Cell Club, Philadelphia •M. Osanai, H. Rembold „Entwicklungsabhängige Mitochondriale Enzymaktivitäten bei den Kasten der Honigbiene“ (1968) Max-Planck-Institut für Biochemie•S. K. Jain, „Evidence for membrane lipid peroxidation during the in vivo aging of human erythrocytes” (1988) Biochimica et Biophysica•T. Tiffert, N. Daw, Z. Etzion, R. M. Bookchin, V. L. Lew “Age Decline in the Activity of the Ca2+-sensitive K+ Channel of HumanRed Blood Cells” (2007) The Journal of General Physiology•M. K. Horne III, A. M. Cullinane, P. K. Merryman, E. K. Hoddeson “The effect of red blood cells on thrombin generation” (2006), bjh•V. Peyrou, J. C Lormeau, J. P. Hérault, C. Gaich, A. M. Pfliegger, J. M. Herbert „Contribution of Erythrocytes to Thrombin Generation in Whole Blood“ (1999) Thromb Haemost•T. J. Mueller, C. W. Jackson, M. E. Dockter, M. Morrison “Membrane Skeletal Alterations During In Vivo Mouse Red Cell Aging” (1986)J. Clin. Invest.•S. Berndl „Fluoreszente H-Aggregate von Thiazol Orange in DNA und RNA, sowie postsynthetische Klick-Ligation an DNA (2010) Dissertation Uni Regensburg•S. Piomelli, C. Seaman “Mechanism Red Blood Density Cell Aging: Relationship of Cell and Cell Age” (1993) American Journal of Hematology•H. U. Lutz, P. Stammler, S. Fasler, M. Ingold, J. Fehr „Density separation of human red blood cells on self forming Percoll R gradients: correlation with cell age” (1992) Biochimica et Biophysica•V. L. Lew, N. Daw, Z. Etzion, T. Tiffert, A. Muoma, L. Vanagas , R. M. Bookchin “Effects of age-dependent membrane transport changes on the homeostasis of senescent human red blood cells” (2012) blood•N. Mohandas, W. Groner „Cell Membrane and Volume Changes during Red Cell Development and Aging” University of California, San Francisco•L. Wagner “Untersuchung dynamischer Prozesse an der Membran humaner Erythrozyten in Abhängigkeit vom Zellalter“ (2009) Diplomarbeit Universität des Saarlandes•W. Williams, “Hem I Erythrocytes” (2008) Morphology and Physiology, www.clt.astate.edu/wwilliam/hem_i_erythrocytes_morphology_and_physiologyhtm•High Impact http://www.highimpact.com/animations/medical-animations/MED01296/ •L. Kaestner, W. Tabellion, P. Lipp, I. Bernhardt “Prostaglandin E2 activates channel-mediated calcium entry in human erythrocytes: an indication for a blood clot formation supporting process” (2004) Thromb Haemost. 2004 Dec;92(6):1269-72.•S. Silbernagel, A. Despopoulus „Taschenatlas der Physiologie“ (2007) 7. Auflage, Thieme, Stuttgart, S. 89•I. Bernhardt „Die rote Blutzelle als Modell zur Untersuchung biophysikalischer Regulationsmechanismen an biologischen Membranen “ (2003) Magazin Forschung Universität des Saarlandes
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Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit.
Gibt es Fragen?
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Nachweis einer gelungenen Separation Dichtegradientenseparation
Nachweis der RNA / DNA mittels Reagenz Retic-COUNT (Thiazol-Orange oder Polymethin)
Polymethin (ungrade Anzahl an Methin-Gruppen, Bsp. Cyanin)
- In Lösung kaum Fluoreszenz- In Kontakt mit DNA / RNA Fluoreszenzanstieg, da eingeschränkten Rotation der aromatischen Systeme um die Methingruppe
Verschiedene Enzym-Aktivitäten messbar:
Aktivität der
- Glutamic-oxalacetic transaminase (GOT)
- Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)
Alte Zellen besitzen nurnoch ca.60% Aktivität gegenüber normalen Zellen
Isotopenmarkierung Nachweis