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UNIVERSIDAD DE LA SERENA
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS
Efecto sinérgico de la alta presión hidrostática y la fracción proteolítica P1G10 sobre el crecimiento de Botrytis cinerea y la capacidad antioxidante en un jugo de uva
Tesis presentada para optar al Grado
Académico de Doctor en Ingeniería en
Alimentos y Bioprocesos
AUTOR: María José Torres Ossandón
PROFESOR PATROCINANTE: Antonio Vega Gálvez
LA SERENA, CHILE, Julio 2019
CONSTANCIA
Dr. Antonio Alex Vega Gálvez
HACE CONSTAR:
Qué, el trabajo correspondiente a la presente Tesis de Doctorado, titulada “Efecto
sinérgico de la alta presión hidrostática y la fracción proteolítica P1G10 sobre el
crecimiento de Botrytis cinerea y la capacidad antioxidante en un jugo de uva”, ha
sido realizada por Doña María José Torres Ossandón, bajo mi dirección.
Para que conste y en cumplimiento de las normativas vigentes de la Universidad de la
Serena, Chile, firmo el presente documento en La Serena, Chile a 25 julio 2019.
TABLA DE CONTENIDOS
RESUMEN ............................................................................................................................... i
ABSTRACT ............................................................................................................................ ii
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ iii
1.1. Presentación general del problema .............................................................................. iii
2. Jugo de uva: Propiedades antioxidantes y caracterización microbiológica ................. v
2.1. Botrytis cinerea el principal factor de deterioro en uvas ............................................ vii
3. Conservación de alimentos ............................................................................................... ix
3.1. Tecnología de alta presión hidrostática ......................................................................... x 3.1.1. Efecto de la alta presión hidrostática sobre los microorganismos ..................... xii
4. Agentes antifúngicos en la industria de alimentos ....................................................... xiv
4.1. Antifúngico natural: Fracción P1G10 del látex de papaya Vasconcellea
cundinamarcensis .............................................................................................................. xvi
5. Efecto sinérgico: Conservación de alimentos ............................................................. xviii
6. HIPÓTESIS ..................................................................................................................... xxi
7. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. xxi
7.1. Objetivos específicos ................................................................................................. xxi
8. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... xxii
8.1. Obtención de P1G10: Purificación del látex papaya (V. cundinamarcensis) ........... xxii
8.2. Inhibición de P1G10 con yodoacetamida (IAA) ...................................................... xxii
8.3. Determinación de la actividad antifúngica de P1G10 sobre B. cinerea ................... xxii 8.3.1. B. cinerea y condiciones de crecimiento ........................................................... xxii 8.3.2. Cinética de sobrevivencia de B. cinerea frente a P1G10 ................................. xxiii 8.3.3. Modelo de Weibull ............................................................................................ xxiv 8.3.4. Efecto de P1G10 en el crecimiento micelial de B. cinerea en medio sólido .... xxiv 8.3.5. Efecto de P1G10 en el crecimiento micelial del caldo de extracto de malta de B. cinerea .......................................................................................................................... xxv 8.3.6. Capacidad de adhesión de B. cinerea ................................................................ xxv
8.3.7. Efecto de P1G10 en la germinación de conidias y elongación del tubo germinal ...................................................................................................................................... xxv 8.3.8. Tinción de núcleos con DAPI ........................................................................... xxvi 8.3.9. Ensayo de integridad de membrana ................................................................. xxvi 8.3.10. Sensibilidad a los agentes perturbadores de la pared celular ...................... xxvii 8.3.11. Producción de especies reactivas de oxígeno ............................................... xxvii 8.3.12. PCR en tiempo real y expresión génica ......................................................... xxvii
8.4. Proceso de conservación mediante alta presión hidrostática y caracterización de la
materia prima ................................................................................................................ xxviii 8.4.1. Materia prima: Jugo de uva concentrado (JUC-64 ºBrix) ............................. xxviii 8.4.2. Recuento de mohos y levaduras de acuerdo con el método PRT-712.02-048 del Instituto de Salud Pública ISP. ................................................................................... xxix 8.4.3. Inoculación de B. cinerea en el jugo de uva ..................................................... xxix 8.4.4. Proceso de alta presión hidrostática ................................................................ xxix 8.4.5. Tratamiento combinado de APH/P1G10 ............................................................ xxx 8.4.6. Diseños experimentales ...................................................................................... xxx 8.4.7. Composición proximal ..................................................................................... xxxii 8.4.8. Análisis físico-químico ..................................................................................... xxxii 8.4.9. Flavonoides totales .......................................................................................... xxxii 8.4.11. Azúcares individuales ................................................................................... xxxiii 8.4.12. Actividad antioxidante .................................................................................. xxxiii 8.4.13. Compuestos fenólicos .................................................................................... xxxiv
8.5. Prueba de preferencia .............................................................................................. xxxv
8.6. Análisis estadístico .................................................................................................. xxxv
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ xxxvi
Sección 1: Caracterización antifúngica de P1G10 sobre B. cinerea ........................... xxxvi
9.1. Determinación de la actividad antifúngica de P1G10 sobre B. cinerea ................ xxxvi 9.1.1. Cinética de sobrevivencia y valor IC50 de P1G10 frente a B. cinerea ............ xxxvi 9.1.1. Efecto de P1G10 sobre el crecimiento y la adhesión del micelio en B. cinerea ................................................................................................................................ xxxviii 9.1.2. Efecto del P1G10 sobre la germinación de las conidias y la elongación del tubo germinal ......................................................................................................................... xli 9.1.3. Efecto del P1G10 sobre la integridad de la membrana y la pared celular. ...... xliv 9.1.4. Determinación de la expresión de genes específicos relacionados con el daño celular .......................................................................................................................... xlvi
Sección 2: Efecto de P1G10 y la alta presión hidrostática sobre un jugo de uva 64 ºBrix inoculado con B. cinerea ................................................................................................. xlviii
9.2. Determinación del efecto de P1G10 sobre el crecimiento de B. cinerea en un jugo de
uva. ................................................................................................................................ xlviii
9.3. Efecto del tratamiento de alta presión sobre B. cinerea en un JUC ............................... l
Sección 3: Determinación de parámetros fisicoquímicos y compuestos antioxidantes de un jugo de uva 64 ºBrix tratado mediante alta presión hidrostática .............................. liii
9.4. Caracterización proximal del jugo de uva 64 ºBrix ................................................... liii 9.4.1. Efecto de la alta presión sobre características fisicoquímicos y parámetros cromáticos en un JUC .................................................................................................. liii 9.4.2. Efecto de la Alta Presión Hidrostática sobre los Azúcares presentes en un JUC ....................................................................................................................................... lvi 9.4.3. Efecto del tratamiento de presurización sobre los compuestos antioxidantes presentes en un JUC ...................................................................................................... lix 9.4.4. Efecto de la alta presión sobre la composición fenólica, polifenoles, flavonoides y antocianinas totales de un JUC .................................................................................. lxi
Sección 4: Determinación del efecto combinado de APH y P1G10 sobre el crecimiento de B. cinerea en un jugo de uva ......................................................................................... lxvi
9.5. Efecto sinérgico: cinética de sobrevivencia de B. cinerea en un jugo de uva (16 ºBrix)
.......................................................................................................................................... lxvi
10.1. Determinación de parámetros fisicoquímicos, contenido de azúcares y actividad
antioxidante en un jugo de uva tratado por APH (250 MPa/4 min), P1G10 (1 mg/mL) y
APH/P1G10 ...................................................................................................................... lxx 10.1.1. Composición proximal, parámetros fisicoquímicos y cromáticos en un jugo de uva ................................................................................................................................. lxx 10.1.2. Determinación de la actividad antioxidante total de un jugo de uva .............. lxxi 10.1.3. Contenido de azúcares: Fructosa y glucosa .................................................. lxxiii
10.2. Evaluación sensorial del jugo de uva tratado mediante tratamientos combinados
........................................................................................................................................ lxxiv 10.2.1. Pruebas de preferencia .................................................................................. lxxiv
11. CONCLUSIONES ..................................................................................................... lxxvii
12. REFERENCIAS ......................................................................................................... lxxix
12. ANEXOS ......................................................................................................................... xc
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Proteínas con actividad antifúngicas frente a hongos fitopatógenos ...................... xv
Tabla 2. Diseño experimental para determinar la factibilidad del tratamiento de alta presión,
niveles decodificados de las variables ................................................................................ xxxi
Tabla 3. Diseño experimental para determinar el efecto sinérgico de alta presión hidrostática
y P1G10 ............................................................................................................................... xxxi
Tabla 4. Matriz codificada de cada diseño de experimentos .............................................. xxxi
Tabla 5. Parámetros fisicoquímicos del JUC inmediatamente después de APH (día 0) y
después del almacenamiento (día 35) .................................................................................... liv
Tabla 6. Cambios en los parámetros cromáticos (L*, a*, b*) y ∆E en un JUC tratado por
APH en día 0 y después de 35 días de almacenamiento a 4ºC ............................................... lv
Tabla 7. Contenido de fructosa y glucosa en un JUC tratrado por APH ............................ lviii
Tabla 8. Capacidad antioxidante de un JUC tratado por APH evaluado en día 0 y después de
35 días almacenamiento a 4 ºC ............................................................................................... lx
Tabla 9. Compuestos fenólicos y flavonoides totales en un JUC ......................................... lxii
Tabla 10. Perfil de compuestos fenólicos (mg/mL) en un JUC tratado mediante alta presión
hidrostática (día 0 y 35) ........................................................................................................ lxv
Tabla 11. Parámetros fisicoquímicos y cromáticos en un jugo de uva ................................ lxx
Tabla 12. Actividad antioxidante, polifenoles y flavonoides totales presentes en un jugo de
uva ....................................................................................................................................... lxxii
Tabla 13. Perfil del contenido fenólico presente en un jugo de uva tratado mediante
tratamientos combinados ................................................................................................... lxxiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1. Sintomas de infección de B. cinerea en brote y sarmiento (a). Racimo de uvas
infectadas con B. cinerea (b) ................................................................................................ viii
Fig. 2. Mercado global de alimentos presurizados en 2015. Tendencia en ventas de mercado
hasta 2025 .............................................................................................................................. xii
Fig. 3. Látex de la Papaya chilena (Vasconcellea cundinamarcensis) ............................... xvii
Fig. 4. Esclerocios y micelio de B. cinerea ......................................................................... xxiii
Fig. 5. Materia prima: jugo de uva variedad Pedro Jiménez ........................................... xxviii
Fig. 6. Modelo esquemático del funcionamiento de un equipo de alta presión hidrostática…
............................................................................................................................................... xxx
Fig. 7. Efecto de P1G10 sobre la sobrevivencia de B. cinerea. ........................................ xxxvi
Fig. 8. Efecto de P1G10 sobre el crecimiento de B. cinerea en medios sólidos. ............ xxxviii
Fig. 9. Efecto antifúngico de P1G10 sobre el crecimiento y la adhesión del micelio en B.
cinerea. .................................................................................................................................... xl
Fig. 10. Efecto de P1G10 sobre la germinación de B. cinerea…………………………………xli
Fig. 11. Efecto de P1G10 en células de B. cinerea tratadas con DAPI..............................xlix
Fig. 12. Efecto de P1G10 en la integridad de la membrana plasmática y la pared celular en
B.cinerea……………………………………………………………………………………...………xlvi
Fig. 13 Efecto de P1G10 en los niveles de ARNm de los genes nma, cas-1, hex y aox, de B.
cinerea……………………………..........................................................................................xlvii
Fig. 14. Efecto de P1G10 sobre el crecimiento de B. cinerea en un JUC…………………..xlix
Fig. 15. Recuento del crecimiento de B. cinerea en un jugo de uva concentrado (JUC)
evaluado en día 0 y después de 35 días de almacenamiento refrigerado a 4 ºC………….li
Fig. 16. Cinética de sobrevivencia de B. cinerea tratada por alta presión y la combinación
de alta presión y P1G10………………………………………………………………………….lxix
Fig. 17. Fructosa y glucosa presente en un jugo de uva tratado mediante tratamientos
combinados………………………………………………………………………………………...lxxiv
Fig. 18. Preferencia de los atributos acidez, dulzor, color y olor de un jugo de uva tratado
mediante tratamientos combinados expresado en porcentaje de preferencia…………….lxxv
i
RESUMEN
La tendencia en el consumo de alimentos saludables mínimamente procesados y sin
aditivos ha aumentado en los últimos años. Entre los productos disponibles con estas
características se destacan los jugos de frutas, en este contexto, el jugo de uva ha demostrado
ser una buena fuente de antioxidantes. Para evitar el deterioro fúngico en jugos de uva se
utilizan tratamientos térmicos, sin embargo, la aplicación de altas temperaturas puede causar
grandes cambios en las características sensoriales y compuestos antioxidantes. Una alternativa
a los tratamientos térmicos es la alta presión hidrostática (APH), un proceso de conservación
de alimentos a través de la pasteurización no térmica. No obstante, la magnitud de la alta
presión (sobre 700 MPa) puede alterar adversamente las características organolépticas de
muchos alimentos. Entre las diferentes opciones para reducir la magnitud de la presión se
encuentra el uso de antimicrobianos naturales, sustancias provenientes principalmente de
plantas. En este sentido, se ha descrito que fracciones proteolíticas (P1G10) proveniente del
látex de la papaya chilena (Vasconcellea cundinamarcensis) demostraron tener actividad
antifúngica frente a hongos del género Fusarium y Aspergillus niger. De acuerdo con lo antes
planteado, utilizar antimicrobianos naturales en combinación con la alta presión hidrostática,
permitiría reducir la intensidad de presión necesaria para inactivar microorganismos y
conseguir el mismo efecto inhibitorio que se obtiene al utilizar solo altas presiones. Por lo
tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto sinérgico de APH y la fracción
P1G10 sobre el crecimiento de Botrytis cinerea en un jugo de uva, determinar su efecto sobre
parámetros fisicoquímicos y actividad antioxidante de un jugo de uva. Los resultados
mostraron que 1 mg/mL de P1G10 inhibió en un 50% el crecimiento micelial de B. cinerea.
Por otro lado, se determinó de manera independiente el efecto inhibitorio de P1G10 y la alta
presión sobre B. cinerea inoculada en un jugo de uva 64 ºBrix (JUC), se observó que una
matriz con elevado contenido de sólidos solubles interfiere con el efecto inhibitorio de cada
tratamiento, por lo tanto, se trabajó con un jugo de uva a 16 ºBrix (JU). Se demostró que la
combinación de 1 mg/mL de P1G10 y 250 MPa/ 4 min inhibió en un 92% el crecimiento del
hongo. Además, los compuestos antioxidantes presentes en el JU presentaron una significativa
estabilidad en los frente al tratamientos aplicado. En conclusión, se demostró que el efecto
sinérgico permitió trabajar con presiones moderadas y obtener un producto de alta calidad,
estable y sensorialmente aceptable.
ii
ABSTRACT
The trend in the consumption of minimally processed healthy foods without additives
has increased in recent years. Among the products available with these characteristics are fruit
juices, in this context, grape juice has been determined to be a good source of antioxidants.
To prevent physical damage in grape juices, heat treatments are used, however, the application
of high temperatures can cause major changes in sensory characteristics and antioxidant
compounds. An alternative to heat treatments is high hydrostatic pressure (HHP), a food
preservation process through non-thermal pasteurization. However, the magnitude of the high
pressure (over 700 MPa) can adversely alter the organoleptic characteristics of many foods.
Among the different options to reduce the magnitude of the pressure is the use of natural
antimicrobials, substances mainly from plants. In this sense, it has been described that the
proteolytic fractions (P1G10) from the latex of the Chilean papaya (Vasconcellea
cundinamarcensis) were shown to have antifungal activity against fungi of the genus
Fusarium and Aspergillus niger. According to the above, using natural antimicrobials in
combination with high hydrostatic pressure would reduce the intensity of pressure necessary
to inactivate microorganisms and achieve the same inhibitory effect that is obtained by using
only high pressures. Therefore, the objective of this research was to evaluate the synergistic
effect of HHP and the P1G10 fraction on the growth of Botrytis cinerea in a grape juice,
determine its effect on physicochemical parameters and antioxidant activity of grape juice.
The results showed that 1 mg/mL of P1G10 inhibited mycelial growth of B. cinerea by 50%.
On the other hand, the inhibitory effect of P1G10 and the high pressure on B. cinerea
inoculated in a 64 ºBrix grape juice (CGJ) was independently determined, a matrix with a high
content of soluble solids interferes with the inhibitory effect of each treatment, therefore, was
work with a grape juice at 16 ºBrix (GJ). It was shown that 1 mg/mL of P1G10 and 250 MPa/4
min inhibited the growth of the fungus by 92%. In addition, the antioxidant compounds
present in the GJ have a significant stability compared to the applied treatment. In conclusion,
it was shown that the synergistic effect work with moderate pressures and was obtain a high
quality, stable and sensory acceptable product.
iii
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Presentación general del problema
Las uvas se pueden consumir como fruta fresca, deshidratadas (pasas), o puede ser
utilizada para la fabricación de vino, vinagre y jugos (Liyana-Pathirana et al., 2006). La uva
y sus derivados contienen una amplia gama de componentes polifenólicos que han demostrado
tener efectos anticancerígenos y antiinflamatorios, además de evitar el deterioro celular que
predispone a la aterosclerosis y enfermedades coronarias (Dávalos et al., 2005; Granato et al.,
2016). Los compuestos presentes en la uva y en los subproductos que proporcionan efectos
positivos para la salud son principalmente flavonoles, procianidinas, antocianinas y ácidos
fenólicos (Andrade et al., 2001; Capanoglu et al., 2013). Por otro lado, los principales
carbohidratos presentes en las uvas y en los jugos son la glucosa y fructosa (Eyduran et al.,
2015), y su concentración al igual que los compuestos bioactivos dependen principalmente de
factores como etapa de maduración de la uva, región de origen, clima, variedad, manejo
agronómico y tipo de procesamiento, por ejemplo, elaboración de vinos o jugos (Lima et al.,
2015).
Actualmente existe una demanda creciente de jugos de fruta recién exprimidos debido
a sus cualidades sensoriales y nutricionales, y la percepción de la naturaleza saludable de estos
productos es una de las principales razones para su consumo (Mert et al., 2013; Sampedro et
al., 2010). Sin embargo, productos con disponibilidad de azúcares, compuestos bioactivos y
altos valores de actividad de agua (aw) son susceptibles al crecimiento microbiano,
principalmente por microrganismos que están adaptadas a un ambiente altamente ácido (pH
< 4.0), como por ejemplo las levaduras y mohos (Kumar et al., 2018), como consecuencia el
producto presenta una vida útil limitada (Scolari et al., 2015). Para evitar el deterioro
microbiano en jugos se utilizan procesos térmicos que aseguren la inactivación de los
microorganismos presentes. Estos procesos se basan en los mecanismos de transferencia de
calor, resultando en tratamientos poco homogéneos y pérdida notable de la calidad del
producto (Kumar et al., 2018). En el caso del jugo de uva estos tratamientos pueden causar
grandes cambios en la composición y características sensoriales, como el color y sabor,
además de los compuestos antioxidantes (Daoudi et al., 2010; Mert et al., 2013).
iv
La demanda de los consumidores de frutas procesadas similares a las frutas frescas,
con alta calidad, seguridad y a un costo razonable, está creciendo. La tendencia en el
incremento del consumo de estos productos se debe en parte a la utilización de tecnologías
novedosas, no térmicas y emergentes como la alta presión hidrostática (APH). Esta tecnología
consiste en un proceso de pasteurización no térmica, que preserva la calidad nutricional, la
seguridad microbiológica y el sabor característico de los productos tratados (Sampedro et al.,
2010; Zhao et al., 2013). La aplicación de APH en jugos de uva ha permitido reducir su
deterioro debido a que disminuye o elimina a los patógenos resistentes a los ácidos,
manteniendo la estabilidad enzimática y conservando los compuestos bioactivos en el jugo
(Chang et al., 2017; Daoudi et al., 2010; Delfini et al., 1995; Donsí et al., 2010; Ferrari et al.,
2010; Juarez-Enriquez et al., 2015; Sampedro et al., 2010). El uso de presiones sobre 500 MPa
no es comercialmente conveniente ya que la complejidad y el costo de los equipos APH
aumentan proporcionalmente con la presión operativa máxima (Abera, 2019; Elamin et al.,
2015). Para que este proceso sea económicamente viable, la magnitud de la presión podría
reducirse al combinarlo con agentes antimicrobianos agregados a los productos que se
procesen, así lograr una inactivación satisfactoria y dentro de los parámetros sanitarios
permitidos (Ross et al., 2003). Se ha informado que la FDA (Food and Drug Administration:
Administración de Medicamentos y Alimentos) permite la conservación de jugos mediante un
proceso no térmico como APH, donde se requiere una reducción microbiana de 5 ciclos
logarítmicos (ICMSF, 2005).
Para evitar el deterioro en los alimentos tradicionalmente se utilizan conservantes
sintéticos los cuales han demostrado ser eficaces, sin embargo, sus aplicaciones reiteradas han
provocado la acumulación de residuos químicos en la cadena alimenticia y alimentaria, un
aumento de la resistencia microbiana y efectos secundarios en la salud humana (Mostafa et
al., 2018). Debido a esa preocupación en la última década, los esfuerzos se han centrado en
desarrollar conservantes de alimentos potencialmente más efectivos, más seguros y naturales,
un ejemplo de ello son los extractos de plantas y aceites esenciales con actividad
antimicrobiana (Aqueveque et al., 2016; Burt, 2004; Olmedo et al., 2016; Qin et al., 2010;
Soylu et al., 2010). En este contexto, se ha descrito una amplia variedad de especies de plantas
productoras de una savia lechosa llamada látex, que posee una composición diversa y no
exhaustivamente investigada, que incluye alcaloides, compuestos terpenoides y una serie de
v
proteínas (Mura et al., 2008), conocidos por presentar propiedades protectoras en las plantas
(Konno, 2011; Souza et al., 2011). Se ha demostrado el efecto antimicrobiano de las quitinasas
presentes en el látex Manihot glaziovii, mientras que las proteínas presentes en Ananas
comosus son capaces de inhibir el crecimiento de hongos filamentosos como Fusarium
verticillioides, F. oxysporum y F. proliferatum (López-García et al., 2012). Estudios recientes
mostraron que el látex de Vasconcellea Pubesces o Vasconcellea cundinamarcensis, miembro
de la familia Caricaceae común en muchas áreas de Sudamérica y principalmente en Chile,
contiene cisteína proteinasas que muestran una actividad proteolítica mayor (5-7 veces) en
comparación con enzimas de C. papaya (Teixeira et al., 2008), la purificación de este látex
resultó en un conjunto de fracciones proteolíticas llamada P1G10 (Silva et al., 2003),
presentando actividad antifúngica frente a Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani,
Rhizoctonia solani, Neurospora sp. y Aspergillus niger (Souza et al., 2011).
En consecuencia, los antimicrobianos naturales podrían utilizarse en la aplicación de
la tecnología de APH en la industria de alimentos, debido a que la intensidad de presión
necesaria para inactivar microorganismos podría reducirse agregando agentes
antimicrobianos a los productos a tratar, logrando un único efecto antimicrobiano debido a
posibles efectos sinérgicos entre los antimicrobianos y la tecnología APH (Pina-Pérez et al.,
2009).
2. Jugo de uva: Propiedades antioxidantes y caracterización microbiológica
Nuestro país se ha posicionado como uno de los grandes productores y exportadores
de uva de mesa. Sin embargo, en los últimos años las producciones y exportaciones de uva se
han visto afectadas, en distintos grados, por eventuales cambios en las condiciones climáticas;
heladas, lluvias inesperadas y meses excepcionalmente calurosos han afectado
considerablemente a los agricultores de las regiones productoras de uva (Sociedad Agrícola
del Norte SAN, María Inés Figari). Donde una consecuencia de estos eventos climáticos es la
pudrición en la fruta y la cosecha de racimos considerablemente livianos. La pudrición se debe
a un problema de índole fitopatológico, que afecta a la uva de provocando en algunas
temporadas importantes pérdidas, las que se visualizan durante la pos-cosecha y recepción de
la fruta en los mercados de destino. Frente a este panorama la agroindustria de los alimentos
vi
que maneja aquellas producciones de uva que no logran la calidad de exportación consideran
el desarrollo de otras materias primas como por ejemplo la elaboración de jugos.
Como es sabido los frutos de Vitis vinifera muestran diferentes compuestos fenólicos
en concentraciones elevadas, y la composición de estos compuestos depende de la variedad,
condiciones de cultivo, prácticas agronómicas y condiciones de almacenamiento pos-cosecha
(Lutz et al., 2011). Por lo tanto, un producto derivado de la uva, como el jugo es una
importante fuente flavonoides y otros compuestos fenólicos (Dávalos et al., 2005).
Recientemente se han demostrado los beneficios de las propiedades funcionales que esta fruta
posee a través de un gran número de estudios in vitro, in vivo, y estudios
clínicos/epidemiológicos (Granato et al., 2016; Lima et al., 2015). Las uvas y sus productos,
como mermeladas, salsas, dulces, vinos y jugos están ampliamente disponibles en todo el
mundo ya que el rendimiento de producción es relativamente alto (Fragopoulou et al., 2003).
Los beneficios del consumo de productos a base de uva han influido en diversos
mercados y su consumo se ha masificado (Granato et al., 2016). El contenido de compuestos
fenólicos en las uvas no solo aumentaría la calidad funcional del producto resultante, sino que
también podría ser útil como herramienta de comercialización (Lerm et al., 2013). Los
principales compuestos fenólicos en las uvas son los ácidos hidroxibenzoicos (gálico), los
ácidos hidroxicinámicos (cafeico), derivados del estilbeno (resveratrol), flavonoides que
incluyen antocianinas, flavan-3-ols (catequina, epicatequinas) y flavonoles (quercetina) (Lutz
et al., 2011). Se ha descrito que la piel y las semillas de la uva aportan a los subproductos
propiedades astringentes y antioxidantes (Dávalos et al., 2005; Parker et al., 2007). La
composición fenólica en los jugos de uva disponibles en el mercado varía ampliamente, al
igual que las concentraciones de los compuestos fenólicos. Siendo varios los factores que
ejercen influencia sobre la composición fenólica en el jugo de uva, destacando el proceso de
conservación y la presencia de los microorganismos provenientes de la baya de uva (Morales
et al., 2013; Silva et al., 2018). En este contexto, se han identificado en la micoflora normal
de la uva, hongos filamentosos del género Aspergillus, Penicillium y Botrytis (Morales et al.,
2006). Siendo Botrytis cinerea o moho gris el hongo más comúnmente involucrado, seguido
por las infecciones secundarias de Aspergillus niger y Penicillium spp. En vinos sea ha
descrito que estos hongos son responsables de la producción de olores desagradables,
manchas, cambios de color en vinos tintos y blancos, baja calidad en la espuma de vinos de
vii
champán y una deficiente conservación en general (Dewey et al., 2000; Dewey and Meyer,
2004). Mientras que en jugos de uva se observa decoloración, desestructuración de aromas y
dificultades en la filtración de los mostos. Por lo tanto, jugos de uva que presenten infecciones
por hongos representan un problema en la calidad del producto final.
2.1. Botrytis cinerea el principal factor de deterioro en uvas
Botrytis cinerea es un hongo patógeno ubicuo, responsable del deterioro en más de
200 especies de plantas, incluyendo uvas, frutas con carozo, bayas y vegetales. Se puede
localizar en zonas geográficas que se caracterizan por presentar condiciones climáticas
húmedas y templadas durante los meses de primavera y verano. Mientras que en periodo
invernal el hongo es capaz de sobrevivir al formar esclerocios sobre sarmientos y malezas.
Los esclerocios son estructuras de consistencia dura, ligeramente levantadas con forma y
tamaño variables, de color negro brillante. Constituyen la principal forma de supervivencia de
B. cinerea en los campos cuando las condiciones son adversas, sin embargo, el hongo también
puede mantenerse como micelio.
Con respecto a la uva, B. cinerea puede causar pérdidas económicas importantes antes
y después de la cosecha (Olmedo et al., 2016; Wang et al., 2013). El hongo infecta ya sea por
penetración directa o por heridas causadas por prácticas agrícolas y es responsable de los
daños en las frutas durante el transporte y almacenamiento, especialmente cuando las
condiciones ambientales son apropiadas para su desarrollo (Soylu et al., 2010). La presencia
de B. cinerea se observa en bayas, hojas, brotes y bastones, de los cuales las bayas son el
órgano de la uva más afectado. Los períodos críticos de infección son floración y precosecha,
desde el envero, periodo donde se produce el cambio en el color de las uvas, hasta la cosecha.
A medida que avanza la infección, en la baya se observan pequeñas manchas necróticas
redondas de color marrón rojizo, además, desplazamientos en la piel de la baya forman
hendiduras y fugas que favorecen la colonización y esporulación del hongo en la superficie
de la baya y promueve su diseminación a las bayas vecinas, formando la pudrición.
Finalmente, las bayas infectadas se deshidratan y marchitan (Latorre et al., 2015). Por otro
lado, cabe señalar que la zona de infección preferencial de B. cinerea en el racimo es variable
y dependerá del cultivo (Morales et al., 2006)
viii
Fig. 1. Sintomas de infección de B. cinerea en brote y sarmiento (a). Racimo de uvas infectadas con B. cinerea (b)
Tradicionalmente, B. cinerea está principalmente controlada por fungicidas sintéticos.
Por ejemplo, el control químico aplicado a las uvas de mesa se basa principalmente en
diferentes grupos de fungicidas (dicarboximidas, anilinopirimidinas, fenilpirroles,
carboxamidas e hidroxianilidas), con aplicaciones programadas de cuatro a seis veces durante
la temporada (Aqueveque et al., 2016) a pesar de la peligrosidad que representan los
fungicidas en la salud humana (Kast-Hutcheson et al., 2001). Por otro lado, independiente del
programa fungicida de precosecha utilizado, para permitir una mantención de calidad en la
uva después de la cosecha es indispensable el uso de anhídrido sulfuroso, cuyos objetivos son
proteger la uva de procesos oxidativos e inhibir el desarrollo de infecciones durante el
almacenamiento refrigerado y transporte.
En los últimos años, se han logrado enormes avances para mejorar las
estrategias de control sobre B. cinerea, sin embargo, aún se requiere un alto número de
aplicaciones de fungicidas debido a la naturaleza policíclica del hongo, la alta variabilidad
genética y un amplio rango de huéspedes (Latorre et al., 2015). Además, los diferentes
mecanismos de sobrevivencia de B. cinerea lo convierten en un patógeno modelo de estudio
en plantas. B. cinerea es capaz de causar importantes daños, una sola baya infectada dentro
de un envase de uva puede causar la pudrición de la fruta, afectar severamente a las
exportaciones de uva (Odepa, 2017) y al desarrollo de otras materias primas como vinos o
a b
ix
jugos. Por lo tanto, para evitar el deterioro fúngico en jugos de uva es necesario utilizar algún
tipo de tratamiento de conservación.
3. Conservación de alimentos
La industria alimentaria es un dominio cada vez más competitivo y dinámico, siendo
la conservación de los alimentos un componente fundamental en el desarrollo de la industria.
El escenario actual refleja el hecho de que una gran cantidad de personas en el mundo están
experimentando mejores niveles de vida y exigen alimentos de mayor calidad, que
proporcionen conveniencia, diversidad, vida útil suficiente, bajo contenido calórico, bajo
costo y credenciales medioambientales. Las características importantes que definen la calidad
de los alimentos, como la apariencia, textura, sabor y contenido nutricional, se ven
fuertemente afectadas por la forma en que se procesan los alimentos (Capitanio et al., 2010;
Ma and McSweeney, 2008). Algunos autores definen que el tipo de alimento que exige el
consumidor de hoy resulta de la combinación exitosa entre nuevas tecnologías de
procesamiento y los métodos actuales de almacenamiento y distribución (Ghoshal, 2018). Por
lo tanto, la industria alimentaria ha implementado varias técnicas para conservar los alimentos
y prevenir su deterioro por efecto de microorganismos (Davidson and Taylor, 2007). En este
contexto los hongos, son el principal grupo de organismos que contaminan frutas, verduras, y
otros productos alimenticios (Nieminen et al., 2008; Ribes et al., 2018a).
Entre las alternativas para controlar la contaminación por hongos en la industria de
alimentos, se destaca la aplicación de energía térmica, la tecnología más popular y
ampliamente utilizada desde la antigüedad, por otro lado se considera que los aditivos
químicos son otros métodos efectivos para controlar el deterioro de los alimentos, sin embargo
su percepción negativa por parte del consumidor (Calvo et al., 2017) ha llevado a la industria
a reemplazar los agentes sintéticos por compuestos naturales (Ribes et al., 2018a). Una serie
de nuevas técnicas de procesamiento se han desarrollado, tecnologías térmicas y no térmicas,
además del uso en conjunto de aditivos naturales, donde el enfoque principal de estas
innovaciones es aumentar la producción y la eficiencia del proceso con cambios mínimos o
nulos en las propiedades nutricionales de los alimentos, reducir el consumo de energía y
reducir la perdida de alimentos al aumentar la vida útil. Las tecnologías de procesamiento no
térmicas se han convertido en métodos de conservación prometedores, que garantizan la
x
seguridad y la extensión de la vida útil de los alimentos procesados sin comprometer la calidad
(Priyadarshini et al., 2018). Los avances en este tipo de procesamiento han permitido producir
alimentos funcionales ricos en nutrientes y seguros. Además, el uso de agentes naturales como
medio de conservación de alimentos está siendo ampliamente considerado. Entre las
sustancias con actividad antifúngica provenientes de las plantas se destacan; aceites
esenciales, compuestos fenólicos, glucosinolatos (Ribes et al., 2018a) y otros antifúngicos
como proteínas que se derivan del látex de plantas (Konno, 2011). Con respecto a las
tecnologías emergentes no térmicas podemos mencionar la conservación de alimentos
mediante la alta presión hidrostática, campo eléctrico pulsado, tratamiento de plasma frío,
procesamiento de ultrasonido, irradiación y luz UV pulsada (Ghoshal, 2018; Priyadarshini et
al., 2018).
3.1. Tecnología de alta presión hidrostática
La conservación de alimentos mediante alta presión hidrostática (APH) ha
demostrado tener un gran potencial, desde 1990 se destaca como la tecnología no térmica más
importante e innovadora utilizada para el procesamiento de alimentos (Augusto et al., 2018).
Como se observa en la Fig. 2 la tecnología de APH se ha convertido en una realidad en la
industria alimentaria y se ha extendido a todo el mundo debido a la capacidad de preservar la
calidad y seguridad de los alimentos (Buzrul, 2014). El procesamiento de alta presión es una
pasteurización no térmica que consiste en tratamientos por encima de 100 MPa (en la industria
alimentaria, este rango de presión generalmente varía entre 100 y 700 MPa). La presurización
del alimento se genera a través de la presión mecánica ejercida sobre un fluido contenido en
la máquina, generalmente agua, que transmite la presión al recipiente que contiene el producto
dentro de su embalaje, y esta presión se puede mantener durante un período de tiempo
determinado, es decir, compresión a presión objetivo, tiempo de retención a la presión objetivo
y descompresión a presión atmosférica, o la aplicación de periodos múltiples donde existe
mas de un período de exposición, es decir, compresión, tiempo de retención y descompresión,
seguido de otra compresión, tiempo de retención y descompresión (Buzrul, 2014; Buzrul and
Alpas, 2012).
Los principios básicos que determinan el comportamiento de los alimentos bajo
presión que han sido descrito son los siguientes:
xi
Principio de Le Chatelier: Cualquier fenómeno (configuración molecular, fase de
transición y reacción bioquímica o química) que resulte en una reducción de volumen es
favorecida por la presión (Augusto et al., 2018; Oey et al., 2008).
Principio del ordenamiento microscópico: A temperatura constante, un aumento de la
presión aumenta los grados de ordenamiento de las moléculas de una sustancia dada. Por lo
tanto, la temperatura aumenta a medida que aumenta la presión aplicada (entre 2 y 3 °C por
cada 100 MPa).
Principio isostático: Los productos se comprimen de manera uniforme en todas las
direcciones, y la presión se distribuye homogénea e instantáneamente independiente de la
constitución del alimento, el tamaño o geometría, y cuando se libera presión el producto
vuelve a su forma original (Balasubramaniam et al., 2015).
La tecnología de alta presión prolonga la vida de almacenamiento, mantiene los
sabores y valor nutricional. Además, extiende la vida útil y reduce la tasa de defectos en el
producto. La naturaleza de procesamiento no térmico permite que la presurización de
alimentos sea una opción de producción preferida para mantener la calidad de los alimentos.
Sin embargo, esta tecnología tiene las siguientes desventajas: la mayoría de los productos de
APH deben almacenarse y transportarse bajo refrigeración porque el tratamiento a
temperatura ambiente o refrigerada es eficaz en la reducción de más de 5 ciclos de una
variedad de patógenos vegetativos, el tratamiento de presión solo es no es suficiente para
inactivar las esporas de patógenos dañinos como Clostridium botulinum. Esta tecnología no
es aplicable a varios tipos de alimentos, como harina y productos con bajo contenido de agua
o que contengan una gran cantidad de burbujas de aire porque APH requiere el uso de agua
como medio de transferencia de presión y los productos que contienen burbujas de aire son
deformados bajo presión. El material de embalaje utilizado en APH debe tener una
compresibilidad de al menos el 15%, por lo que solo los materiales de embalaje de plástico
son adecuados. Por lo tanto, un tema importante para el crecimiento futuro de la tecnología
de alta presión en el sector alimentario es el establecimiento de leyes y regulaciones
relevantes. En los últimos años y con el posicionamiento gradual de la tecnología de los
equipos de alta presión, varios fabricantes en los Estados unidos, España, Reino Unido, Japón
y China han desarrollado la capacidad para producir equipos de APH. La tecnología alta
xii
presión ha sido ampliamente utilizada en la producción de productos cárnicos, lácteos,
marinos, además de productos a base de frutas y verduras. El mercado global de alimentos
APH alcanzó aproximadamente U$ 9,8 mil millones en 2015 y se espera que culmine con un
valor de mercado de U$ 54,77 mil millones en 2025 (Fig. 2) (Visiongain, 2015). Los
fabricantes en Europa, América del Norte y Japón han estado desarrollando activamente
productos presurizados. Cada año, aproximadamente 500.000 toneladas de productos tratados
por APH circulan en todo el mundo. Además, la tendencia de etiquetas limpias en los países
desarrollados ha impulsado el desarrollo de jugos presurizados. En el futuro, los productos de
jugo pueden tener una mayor participación de mercado que los productos de carne en el
mercado de alimentos de tratados mediante alta presión hidrostática.
Fig. 2. Mercado global de alimentos presurizados en 2015. Tendencia en ventas de mercado hasta 2025(Huang et al., 2017).
3.1.1. Efecto de la alta presión hidrostática sobre los microorganismos
La inactivación microbiana ejercida por la alta presión es afectada principalmente por
el tipo de microorganismo (bacteria, levaduras y hongos), forma (células vegetativas o
esporas, gram positivo o negativo), género, especie, cepa y fase de crecimiento (Daryaei et
al., 2016). Los mecanismos de inactivación microbiana inducida por la presión aún no se han
entendido completamente. Sin embargo, varios autores han descrito que la presión puede
Años
Vent
as (B
illone
s)
Jugos y bebidas
20%
Productos Vegetales
20%
Productos cárnicos
25%Otros 7%
Mariscos 5%
Sistema de maquila
23%
xiii
producir inactivación microbiana por varios mecanismos, donde los principales responsables
de la muerte microbiana son los cambios en la membrana celular; alteraciones en estructuras
subcelulares, como el nucloide y los ribosomas (Augusto et al., 2018). Además, la reducción
de volumen inducida por la presión resulta en la inhibición de la síntesis de proteínas y
enzimas unidas a la membrana, (por ejemplo, las ATPasas) responsables del control de los
fenómenos de transporte involucrados en la absorción de nutrientes y la eliminación de
desechos (Considine et al., 2008; Horst Ludwig, 1999; Linton and Patterson, 2000). Cambios
en la morfología de la célula y alteraciones en procesos de reproducción impiden la
supervivencia de los microorganismos (Augusto et al., 2018; Daryaei et al., 2016). En
términos de inhibición microbiana, es sabido que presiones por encima de 200 MPa inactiva
bacterias vegetativas, levaduras y los mohos. En la práctica, se utilizan presiones de hasta 700
MPa y tiempos de tratamiento de pocos segundos a varios minutos para inactivar las células
microbianas. Las esporas bacterianas, por otro lado, son altamente resistentes a la presión,
mostrando una notable tolerancia a presiones por encima de 1000 MPa a temperatura ambiente
(Terefe et al., 2014). Las levaduras y los mohos generalmente se consideran sensibles a la
presión lo que permite que este tratamiento sea efectivo para controlar el deterioro de estos
microorganismos, y aunque no estén asociados con enfermedades transmitidas por los
alimentos, son importantes en el deterioro de la calidad del alimento, especialmente en
alimentos ácidos, como los productos a base de frutas
Para definir las presiones capaces de inactivar cada grupo de microorganismos se
deben tomar varias consideraciones; el nivel de contaminación del alimento es una de ellas,
ya que la eficacia del proceso disminuye para altas concentraciones de microorganismos
(mecanismo auto protector observado entre las células). Otras consideraciones son las
características del alimento por ejemplo pH, actividad del agua (aw), acidez, presencia de
antimicrobianos, azúcar, grasa, etc, y parámetros propios del proceso como tiempo,
temperatura, número de ciclos y características del proceso previo (Georget et al., 2015). En
general los microorganismos son más susceptibles a condiciones ácidas, en presencia de
antimicrobianos y en fase de crecimiento exponencial, mientras que son más resistentes en
presencia de grasas, proteínas y un alto contenido de azúcares (Huang et al., 2014). Varias
matrices alimentarias ofrecen un efecto protector a los microorganismos, generalmente
conocido como "efecto baroprotector". Se ha reportado que las proteínas, carbohidratos,
xiv
lípidos y minerales pueden ejercer un efecto baro protector (Simpson and Gilmour, 1997).
Algunos autores han informado un importante efecto baro protector de los componentes de la
leche en Listeria monocytogenes y L. innocua (Dogan and Erkmen, 2004). La reducción de la
aw del medio mediante la adición de solutos como azúcares y sales en altas concentraciones
también pueden ejercer un efecto baro protector sobre los microorganismos. Se ha sugerido
que la reducción de la aw puede ocasionar la contracción celular y el engrosamiento de la
membrana celular de los microorganismos, reduciendo así el tamaño celular y la
permeabilidad y fluidez de la membrana (Georget et al., 2015). Por lo tanto, el efecto
antimicrobiano producido por la presión puede verse significativamente influenciado por la
composición de los alimentos. En la literatura se han propuesto diferentes enfoques
experimentales para mejorar la tasa de inactivación microbiana mediante un proceso de alta
presión. La tecnología de obstáculos es una exitosa y prometedora técnica que permite
disminuir la presión máxima necesaria para inactivar los microorganismos, mediante el uso
de combinaciones de múltiples obstáculos, por ejemplo, conservantes naturales (Donsí et al.,
2010).
4. Agentes antifúngicos en la industria de alimentos
Los conservantes de alimentos son sustancias que se agregan a los alimentos para
retardar o prevenir el deterioro causado por microorganismos u oxidación. Los conservantes
de alimentos suelen ser sustancias químicas sintéticas, como sorbatos, benzoatos, nitratos y
nitritos. Sin embargo, en los últimos años se han demostrado los riesgos de consumir estos
aditivos alimentarios sintéticos incluso por debajo de los límites recomendados según lo
definido por las agencias reguladoras, como la FDA (Ng et al., 2019). Estos riesgos en la salud
incluyen reacciones alérgicas, trastornos gastrointestinales y cáncer (Etemadi et al., 2017).
Por lo tanto, existe un gran interés en fuentes naturales, que se obtienen a partir de plantas,
animales y microorganismos (Ng et al., 2019; Ribes et al., 2018a). Los metabolitos
secundarios de las plantas son una fuente importante de sustancias bioactivas antifúngicas e
incluyen aceites esenciales, compuestos fenólicos, flavonoides y alcaloides, entre otros (Ribes
et al., 2018b). Aplicaciones con éxito demuestran el efecto de emulsiones que incorporaron
aceites esenciales para el prevenir el crecimiento de hongos en mermeladas (Ribes et al.,
2016). Mientras que entre los antifúngicos naturales de origen animal, se reportan la quitina,
xv
el quitosano y la lactoferrina (Perdones et al., 2012). Actualmente el quitosano es considerado
como un aditivo alimentario GRAS (USFDA, 2013), y su aplicación en la industria es segura
tanto para los consumidores como para el medio ambiente (Romanazzi et al., 2017). Por otro
lado, se ha descrito que el látex contenido en una amplia variedad de plantas posee moléculas
bioactivas, con propiedades antifúngicas (Konno, 2011) (ver Tabla 1). Estas moléculas de
origen proteico se denominan péptidos antimicrobianos y son un grupo extremadamente
diverso de proteínas pequeñas que se consideran juntas debido a su actividad antimicrobiana
nativa. Estas fracciones tienen un amplio espectro de microorganismos (bacterias, hongos,
virus y células tumorales), generalmente no son tóxicos y pueden cumplir con los requisitos
de seguridad alimentaria (Liu et al., 2007).
Tabla 1. Proteínas con actividad antifúngicas frente a hongos fitopatógenos
Prot./Antifúngicas Matriz de extracción Fitopatógenos Referencias
Quitinasa Piña Ananas comosus L Fusarium
oxysporum, F. solani
y Rhizoctonia solani
Taira et al.,
(2005)
Quitinasa Bulbos de Urginea
indica (Indian squill)
Fusarium oxysporum
y Rhizoctonia solani
Shenoy et al.,
(2006)
CgPep33 Ostras del Pacífico
(Crassostrea gigas)
Botrytis cinerea Liu et al., (2007)
CpOsm
Osmotin
Látex de Calotropis
procera
Fusarium solani,
Neurospora sp. y
Colletotrichum
Freitas et al.,
(2011)
CpLP Látex de Calotropis
procera
Gloeosporioides
Aspergillus niger
Souza et al.,
(2011)
Inhibidor de cisteína
proteinasa (IPC)
kiwi verde (Actinidia
deliciosa)
Alternaria radicina y
Botrytis cinerea
Popovic et al.,
(2013)
Extractos protéicos de
C. jamacaru.
Cactus Cereus
jamacaru
Colletotrichum
gloeosporioides
Mota et al.,
(2019)
xvi
4.1. Antifúngico natural: Fracción P1G10 del látex de papaya Vasconcellea cundinamarcensis
En los últimos años, varios estudios han mostrado el potencial del látex de diferentes
plantas, donde el principal componente que poseen estos fluidos son cisteína peptidasas,
generalmente se relacionan con un efecto protector en las plantas frente a insectos y hongos
(Konno, 2011; Souza et al., 2011). Entre de las plantas que producen látex se destaca la familia
Caricaceae, un grupo de vegetales de amplio interés comercial debido a la presencia de
enzimas proteolíticas en el látex de estas plantas (Bravo et al., 1994). La especie Carica
papaya es la mas estudiada y conocida, ya que de esta especie se extrae la enzima papaína,
utilizada en diversos procesos industriales (Souza et al., 2011). El látex es sintetizado por
células denominadas laticíferos y es almacenado en el citoplasma de la célula, tiene una
coloración blanca a transparente de consistencia pegajosa (Freitas et al., 2016). Cuando la
planta sufre pequeñas incisiones, las células que almacenan el látex se rompen y liberan el
contenido del citoplasma en los canales lacticíferos, conductos donde circula el látex (Freitas
et al., 2011). El látex es recolectado principalmente en los frutos debido a que los canales
lacticíferos se concentran en las capas más externas del endocarpio de la fruta verde, cuando
la exudación de látex ocurre de manera transitoria forma un coágulo alrededor del área herida,
este proceso de coagulación es de vital importancia ya que crea una barrera física contra el
ataque de depredadores. Entre los componentes presentes e identificados en el látex de
Caricaceaes se destacan las quitinasas, inhibidores de serino proteasas y una mezcla al menos
P2C2S2
Semillas de Prosopis
cineraria
Lasiodiplodia
theobromae y
Aspergillus
fumigatus
Solanki et al.,
(2018)
P1G10
CMS2MS2
Látex de Vasconcellea
cundinamarcensis
Cisteína proteinasa
purificada del látex de
Vasconcellea
cundinamarcensis
Colletotrichum
gloeosporioides
Fusarium Solani
Rhizoctonia Solani
Neurospora sp.
Aspergillus niger
Souza et al.,
(2011)
xvii
cuatro cisteínas endopeptidasas: papaína (EC 3.4.22.2), quimopapaína (EC 3.4.22.6),
caricaína (EC 3.4.22.30) y glicil endopeptidasa (EC 3.4.22.25)
El látex de Vasconcellea cundinamarcensis, otro miembro de la familia Caricaceae
común en muchas áreas de América del Sur, se ubica principalmente en la región Andina, la
cual se extiende desde Panamá hasta Chile. En el látex de V. cundinamarcensis se encuentran
carbohidratos, vitaminas, péptidos de bajo peso molecular y enzimas del grupo de cisteína
proteasas que participan en la coagulación del látex al igual que en C. papaya (Baeza et al.,
1990). Los componentes proteolíticos de V. cundinamarcensis son menos estudiados que los
componentes de C. papaya, sin embargo, existen algunos informes que describen sus
actividades proteolíticas. Se ha reportado sobre la proteinasa CC28 (Gravina de Moraes et al.,
1994), cinco isoformas de cisteína proteinasa (Gomes et al., 2005; Gravina de Moraes et al.,
1994) y la estructura primaria de dos cisteína proteinasas (CC-III, CC-I). Además, Teixeira et
al., (2008) describieron 14 isoformas de proteinasas presentes en la fracción proteolítica
P1G10, involucradas en la protección de las plantas contra los depredadores.
Fig. 3. Látex de la Papaya chilena (Vasconcellea cundinamarcensis)
Es interesante mencionar que las proteinasas en V. cundinamarcensis muestran una
actividad de cinco a siete veces mayor en comparación con las enzimas proteolíticas de C.
papaya, una consecuencia probable en respuesta a la adaptación de su hábitat (Baeza et al.,
1990; Bravo et al., 1994; Dittz et al., 2015). Además, P1G10 se le han atribuido actividades
farmacológicas, como actividad mitogénica, curación de piel en diferentes modelos de
heridas, curación de úlceras gástricas, efectos antiinflamatorios y actividad antifúngica
(Freitas et al., 2017; Salas et al., 2018; Silva et al., 2003; Souza et al., 2011). De acuerdo con
un estudio realizado por Souza et al., (2011) P1G10 exhibió una importante actividad
inhibitoria frente a Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Rhizoctonia solani,
Neurospora sp. y Aspergillus niger. En vista de esta evidencia, es relevante investigar los
xviii
efectos antifúngicos que P1G10 podría tener sobre B. cinerea. Además, que efectos podría
tener sobre una matriz alimentaria al utilizarlo como un conservante natural.
5. Efecto sinérgico: Conservación de alimentos
La conservación de casi todos los alimentos se basa en la aplicación combinada de
varios métodos de conservación, por ejemplo; calentamiento, enfriamiento, secado, curado,
etc, estos métodos se han aplicado empíricamente desde hace siglos. Sin embargo,
recientemente se han aplicado de manera inteligente utilizando la tecnología de barreras de
Leistner (Leistner, 2000, 1992). Definido como la combinación de obstáculos o tratamientos
(Singh and Shalini, 2016), con el fin de mejorar la calidad de los alimentos, sus propiedades
nutricionales y económicas, y principalmente la estabilidad microbiana (Espina et al., 2013;
Oliveira et al., 2015). La tecnología de barreras aumenta la susceptibilidad de los
microorganismos debido a que dos o mas agentes antimicrobianos pueden actuar mejor
sinérgicamente que cada uno por separado (Leitsner, 2002). Por lo tanto, los microorganismos
presentan mayor sensibilidad frente a diferentes condiciones de estrés mediante diversos
agentes físicos y químicos en comparación a condiciones normales donde presentan
resistencia. Diferentes autores han reportado acerca de la respuesta homeostática que los
microorganismos han desarrollado para resistir los efectos adversos proporcionadas por los
factores de conservación (Alzamora et al., 2018; Leistner, 2000; Singh and Shalini, 2016).
Generalmente, cuando el microorganismo detecta un estrés, se desarrollan señales que
inducen mecanismos para hacer frente al agente estresante. Se ha descrito que algunos de estos
mecanismos implican modificaciones en la expresión génica del microorganismo (Alzamora
et al., 2018). Un ejemplo de ello es la osmorregulación, cuando un microorganismo se expone
a un ambiente con una aw reducido, se extrae agua del citoplasma de la célula y se pierde la
turgencia de la membrana. La homeostasis (o equilibrio interno) se altera y el microorganismo
permanece en la fase de adaptación hasta que se restablezca el equilibrio. Por lo tanto, en la
conservación de los alimentos, la homeostasis de los microorganismos es un fenómeno clave,
debido a que, si la homeostasis de estos microorganismos se ve alterada por diferentes
factores, los microorganismos permanecerán en la fase de adaptación o incluso serán
destruidos (Alzamora et al., 2018; Leistner, 2000; Singh and Shalini, 2016).
xix
La tecnología de barreras ilustra el hecho de que complejas interacciones entre la
temperatura, aw, pH, solutos, agentes antimicrobianos, conservantes, microorganismos
competitivos entre otros, son significativas para la estabilidad microbiana de los alimentos
(Singh and Shalini, 2016). Los efectos de conservación mediante la sinergia dependerán,
además, de la matriz alimentaria que se esté empleando, siendo necesario realizar estudios
que permitan identificar cual es la secuencia de tratamientos necesarios para obtener un efecto
sinérgico (Alzamora et al., 2018). La industria alimentaria ha utilizado la tecnología de
barreras en el diseño de alimentos, al combinar la microbiología predictiva y el Análisis de
Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP). En países industrializados, el uso de la
tecnología de barreras se ha desarrollado con varios objetivos, dependiendo de cada necesidad,
por ejemplo, en las distintas etapas de la cadena de distribución, durante el almacenamiento,
procesamiento y/o envasado, entre otros (Singh and Shalini, 2016).
En la actualidad se presenta un importante desafío en el desarrollo de los procesos de
conservación de alimentos que combinan factores tradicionales de estrés microbiano, y que
además introduzcan nuevas variables de inhibición microbiana (Coutinhode Oliveira et al.,
2015). En este contexto, la utilización de un tratamiento de presión moderadamente alto (300-
400 MPa) puede causar lesiones subletales en una población microbiana, comprometiendo la
seguridad y la vida útil del producto, debido a la posible recuperación de los microorganismos
dañados durante el almacenamiento (Coutinho Oliveira et al., 2015). Sin embargo, es deseable
lograr un efecto de conservación con la aplicación de presiones moderadas, para minimizar
alteraciones en la textura, el aroma y el color de los alimentos (Alpas et al., 2003). El uso de
presiones sobre 500 MPa no es comercialmente conveniente ya que la complejidad y el costo
de los equipos de APH aumentan de manera lineal con la presión de operación máxima. Para
que este proceso sea económicamente factible, la magnitud de la presión debe reducirse a un
nivel suficiente que produzca una inactivación microbiana satisfactoria (Donsí et al. 2007). El
consumo de productos presurizados ha aumentado en los últimos años, por lo tanto, si estas
demandas continúan aumentando con la misma tasa, en los próximos años, el costo de
producción y los precios de los productos presurizados podrían disminuir (Espina et al., 2013).
Entre las alternativas que se han propuesto para disminuir la presión máxima necesaria
se destaca el uso de temperaturas moderadas en combinación con la presión, uso de pulsos
múltiples de presión en lugar de un tratamiento con un único pulso, o el uso de agentes
xx
antimicrobianos en combinación con la presión, tales como aceites esenciales, extractos
vegetales y péptidos antimicrobianos (Coutinhode Oliveira et al. 2015). En este contexto las
proteínas antifúngicas presentes en el látex de la papapa (Vasconcellea Cundinamarcencis)
son una interesante alternativa de investigación y aplicación. Por otro lado, el uso de un
antifúngico natural proveniente del látex podría aumentar la demanda de los cultivos de
papaya. La Región de Coquimbo tiene el 70% de las plantaciones de papaya del país, con un
42% de sembradíos en la comuna de La Serena. Sin embargo las plantaciones se han reducido
en un 30% desde el año 2011 (CIREN, 2015), principalmente por efectos climáticos. En el
periodo actual, los productores y el gobierno se han centrado en recuperar el cultivo de la
papaya que está en alto riesgo de desaparición, una amenaza que perjudicaría la economía
local. De acuerdo con lo antes mencionado y considerando el impacto que tiene la tecnología
de alta presión en la industria alimentaria a nivel internacional y nacional, es indispensable
encontrar nuevas estrategias, todas dirigidas a reducir el nivel máximo de presión del proceso
(Abid et al., 2014; Chang et al., 2017; Donsi et al., 2007; Espina et al., 2013).
xxi
6. HIPÓTESIS
El efecto sinérgico de la alta presión hidrostática y la fracción proteolítica P1G10
aumentan el porcentaje de inhibición sobre Botrytis cinerea y mantiene las propiedades
antioxidantes y características generales de calidad de un jugo de uva.
7. OBJETIVO GENERAL
El principal objetivo es evaluar el efecto sinérgico de la alta presión y P1G10 en un
jugo de uva, determinar los parámetros fisicoquímicos, calidad y el crecimiento de B. cinerea
7.1. Objetivos específicos
1. Determinar el efecto antifúngico del P1G10 sobre Botrytis cinerea.
2. Caracterización microbiológica y Determinación de parámetros fisicoquímicos (color,
ºbrix, pH, acidez, proximal) y de calidad (Polifenoles, flavonoides y antocianinas totales,
compuestos fenólicos y capacidad antioxidante) de un jugo de uva.
3. Aplicar P1G10 a un jugo de uva y evaluar su efecto en el crecimiento de B. cinerea,
parámetros fisicoquímicos y de calidad del jugo de uva.
4. Aplicar tratamientos APH a un jugo de uva y evaluar su efecto en el crecimiento de B.
cinerea, parámetros fisicoquímicos, funcionales y de calidad del jugo de uva.
5. Evaluar el efecto de sinérgico del tratamiento APH y el agente antifúngico en un jugo de
uva (APH/P1G10)
6. Evaluación sensorial al jugo de uva obtenido mediante efecto sinérgico (APH/P1G10)
xxii
8. MATERIALES Y MÉTODOS
8.1. Obtención de P1G10: Purificación del látex papaya (V. cundinamarcensis)
El látex de V. cundinamarcensis se recogió realizando varias incisiones longitudinales con la
ayuda de un bisturí en la superficie de la papaya verde que se encontraba en el árbol. El látex
recolectado se liofilizó y almacenó a -20 °C hasta su posterior procesamiento. Para purificar
el látex y obtener P1G10 se disolvieron tres gramos de látex seco en 20 mL de solución de
acetato de sodio 1 M que contenía L-cisteína 25 mM, DTT 5 mM y EDTA 10 mM, pH 5.0.
La mezcla se dejó en agitación moderada durante 30 min para posteriormente centrifugar a
8000 rpm y filtrar el sobrenadante (Whatman # 1, Wilmington, MA, EE. UU.), La solución
obtenida de apariencia transparente se eluyó a través de una columna de cromatografía de
Sephadex G-10 equilibrada previamente con acetato de sodio 1 M pH 5.0 a temperatura
ambiente (Mello et al., 2008). Para determinar que fracciones contenían las proteínas se midió
su absorbancia a 280 nm, el primer pico de elución que contiene la actividad amidasa
representa la fracción P1G10 (Fig. S1), posteriormente las fracciones seleccionadas fueron
concentradas en membranas Amicon (PM 10.000) y el concentrado final fue liofilizado (Silva
et al., 2003). Se determinó su actividad amidasa la cual mide la hidrólisis enzimática del
sustrato BAPNA (Nα-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride) tras incubación con
P1G10 entre 5 y 60 min a 37 ºC, como lo describe Gravina de Moraes et al., (1994).
8.2. Inhibición de P1G10 con yodoacetamida (IAA)
Para inhibir la actividad enzimática de P1G10, doscientos miligramos de P1G10
fueron disueltos en 50 mM de tampón de acetato de sodio (pH 5.0), posteriormente se
incubaron con IAA 1 mM a 25 ºC durante 1 h seguido de una extensa diálisis en agua destilada
para eliminar IAA libre, el residuo resultante se concentró por liofilización. Esta fracción se
denominó P1G10-IAA después de confirmar que la actividad residual era inferior al 10% (Fig.
S2, ver carril 1, 2, 5 y 6).
8.3. Determinación de la actividad antifúngica de P1G10 sobre B. cinerea
8.3.1. B. cinerea y condiciones de crecimiento
xxiii
Se usó un aislado B05.10 obtenido de Vitis vinifera (Alemania) como cepa de tipo
silvestre (WT) y receptora de modificaciones genéticas (Büttner et al., 1994; Quidde et al.,
1998). La cepa de B. cinerea se creció en agar de extracto malta (MEA, extracto de malta al
2% y agar al 2%), caldo de extracto malta (MEB) y agar papa dextrosa (PDA, AppliChem).
El crecimiento radial y las tasas de conidiación fueron medidos a partir de cultivos en MEA.
Se incubaron 10 µL de suspensión conidial (2.5 x 105 conidias/mL) en placas de agar MEA
durante 2 semanas a 20 °C en un fotoperiodo de 24 h (12 h de luz/12 h de oscuridad). Se
preparó una suspensión conidial en agua estéril y se filtró a través de una punta de pipeta
estéril de 5 mL que contenía lana de vidrio.
Fig. 4. Esclerocios y micelio de B. cinerea en agar PDA (a,b). Imagen (40 ×) de conidias de
B. cinerea en germinación, observados bajo microscopio de luz (Eclipse E-200) (c)
8.3.2. Cinética de sobrevivencia de B. cinerea frente a P1G10
Para evaluar el efecto de P1G10 sobre el crecimiento micelial de B. cinerea, se realizó
una cinética de sobrevivencia. Se añadieron 100 µl de suspensión de P1G10 en una placa de
microtitulación de 96 pocillos (poliestireno, JetBiofil, China) y se realizaron doce diluciones
seriadas de 8 mg /mL a 0.250 mg/mL. Más tarde, en cada pocillo que contenía P1G10 se
inoculó 100 µL de una suspensión conidial de B. cinerea (2.5 x 105 conidias/mL) y se incubó
con agitación moderada a 22 ± 1 °C en la oscuridad. Después de 72 h de incubación, el
crecimiento micelial se cuantificó mediante la determinación de OD595 nm en un lector de
placa (Victor X3 Perkin Elmer 2030).
a b c
xxiv
8.3.3. Modelo de Weibull
Los datos de inhibición experimental se ajustaron a la función de distribución de
Weibull (1) (Scholze et al., 2001). Donde c es la concentración de P1G10 (mg/mL), y α y β
son factores de escala y forma, respectivamente; β interpreta la forma de la curva de
inhibición, de modo que cuando β <1, la curva de inhibición es cóncava, cuando β> 1, la curva
de inhibición es convexa, y cuando β = 1, está presente una línea recta.
!(#) = &'( )− +,a-b. (1)
0123 = 456789:6;<=<>9?@A6;<
B=C (2)
Los siguientes índices estadísticos sirvieron para evaluar la calidad de ajuste en el modelo de
Weibull: el error cuadrático medio (RMSE), mide la desviación promedio entre los valores
observados y ajustados, dada por la ecuación (Eq. 2) Los valores pequeños de RMSE en el
modelo indican un ajuste perfecto entre los datos y el modelo "n" es el número de
observaciones y p es el número de parámetros a estimar (González et al., 2009)
8.3.4. Efecto de P1G10 en el crecimiento micelial de B. cinerea en medio sólido
La fungitoxicidad de P1G10 se evaluó usando la prueba de crecimiento radial sobre
agar de extracto de levadura de malta. P1G10 se disolvió en agua estéril a diferentes
concentraciones finales (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 mg/ml). Se añadió una alícuota de esta solución
(200 µL) a 7 mL de agar de extracto de malta y levadura. El medio en presencia o ausencia
de P1G10 se vertió en placas de Petri de 6 cm de diámetro. Luego, las placas se inocularon
con discos de agar de 0.5 cm con un micelio delgado de B. cinerea. Los cultivos se incubaron
en la oscuridad a 22 °C durante varios días. Los diámetros de crecimiento micelial se midieron
diariamente, y se calcularon los valores de inhibición. Las diferencias significativas se
evaluaron con un análisis de varianza de dos factores (prueba de Tukey, p <0.05). La
determinación de los valores de IC50 de crecimiento micelial B05.10 se determinaron a las 48
h de incubación y se analizó mediante la prueba PROBIT utilizando el MINITAB V.16
(Robles-Kelly et al., 2016).
xxv
8.3.5. Efecto de P1G10 en el crecimiento micelial del caldo de extracto de malta de B. cinerea
Este ensayo se realizó de acuerdo con la metodología descrita por Ramos et al. (2014).
Las conidias se recogieron y se lavaron con agua estéril, a continuación, la concentración se
ajustó a 2.5x105 conidias/mL en medio MEB, posteriormente 100 µL de esta suspensión fue
inoculado en la placa de 96 pocillos, complementando con 100 µL de P1G10 (1 mg/mL). El
tratamiento de P1G10 activo con la cepa B05.10 se designó B05.10+P1G10. Por otro lado, el
tratamiento denominado B05.10+P1G10 Tº se refiere a P1G10 inactivado por calor durante
40 min a 100 °C o P1G10-IAA que correspondió a P1G10 inhibido con yodoacetamida. Luego
la placa de 96 pocillos se incubó en agitación (100 rpm) a 22 ± 1 °C en la oscuridad. Después
de 72 h de incubación, el crecimiento micelial se cuantificó mediante la determinación de
OD595 nm (estación de trabajo Victor X3 Perkin Elmer 2030).
8.3.6. Capacidad de adhesión de B. cinerea
El efecto de P1G10 sobre la capacidad de adhesión de B. cinerea se determinó
utilizando una versión modificada de un protocolo desarrollado por Plaza et al. (2015).
Después de incubar los conidias (no tratados y tratados con P1G10) durante 72 horas a 22 ±
1 °C, se aspiró el medio que contenía las conidias libres, estos fueron eliminados mediante un
lavando con 200 µL de agua estéril (tres veces). Luego, las conidias restantes es decir lo que
se adhirieron a la placa, fueron teñidos con 100 µL de violeta cristal de metilo al 0.1%, y se
incubaron durante 5 minutos. Finalmente, los pocillos se lavaron tres veces con 200 µL de
agua estéril y se monitorizaron a 595 nm (estación de trabajo Victor X3 Perkin Elmer 2030).
Los valores de OD fueron proporcionales a la cantidad de biopelícula formada bajo las
condiciones mencionadas, que comprende micelio y material polimérico extracelular.
8.3.7. Efecto de P1G10 en la germinación de conidias y elongación del tubo germinal
El efecto de P1G10 sobre la germinación de conidias B. cinerea se realizó utilizando
una versión modificada de Ji and Kuc, (1996). Una suspensión de 500 µL de conidias (2.5 x
105 conidias/mL) se incubaron con 500 µL de P1G10 (1 mg/mL) en medio MEB, durante 0.
4 y 6 h a 22 ± 1 °C con agitación constante. Para ensayos de conidias sin inhibidor, P1G10 T°
y P1G10-IAA el volumen final se completó con 500 µL de medio MEB. Después del tiempo
de incubación, las conidias se lavaron dos veces con agua estéril (500 µL) y se centrifugaron
xxvi
a 12.000 rpm durante 5 minutos; el pellet obtenido se re suspendió en 100 µL de agua estéril.
Luego, 10 µL de muestra se colocaron en un portaobjetos de vidrio para ser se examinados
usando un microscopio óptico (Eclipse E-200). El porcentaje de germinación de conidias y la
longitud de los tubos germinativos se estimaron en microfotografías de cada preparación. Las
conidias se consideraron germinados cuando el tubo germinal era el doble del tamaño de los
conidias. El tubo de germen se midió utilizando el software Image J, se realizaron tres réplicas
para cada tratamiento y se contó un mínimo de 100 conidias en cada réplica.
8.3.8. Tinción de núcleos con DAPI
Para determinar si P1G10 interfiere durante la formación de núcleos en el micelio de
B. cinerea, se realizó un ensayo de tinción nuclear del cuerpo micelial con el Fluoromount G
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) (Electron Microscopy Sciences, EE. UU.). Las conidias
germinados e incubados en presencia de P1G10 (1 mg/mL) durante 6 horas se lavaron dos
veces y se re suspendieron en 100 µL de agua estéril. Se colocaron cinco microlitros de
conidias y 5 µL de DAPI en un portaobjetos de vidrio. Después de 10 minutos de incubación,
las conidias se observaron bajo un microscopio de luz con un sistema de epifluorescencia
(Eclipse E-200). Se obtuvo una microfotografía de cada preparación (0 y 6 h) y se evaluó
visualmente la tinción nuclear.
8.3.9. Ensayo de integridad de membrana
La integridad de la membrana de B. cinerea se determinó de acuerdo con el método
de Qin et al., (2010) con algunas modificaciones. Un aislado de B. cinerea se cultivó
inicialmente en MEA y se recogieron conidias y se lavaron con agua estéril. Luego, una
suspensión de 5 x 105 conidias/mL de B. cinerea fue incubada con 1 mg/mL de P1G10 o
P1G10 inhibido (P1G10 Tº o P1G10-IAA) en medio MEB durante 4 y 6 h en un agitador a
22 ± 1 °C. Las conidias en medio MEB se recogieron por centrifugación a 5.000 rpm durante
10 minutos, se lavaron dos veces con tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7.0) y se
centrifugaron a 12.000 rpm durante 2 min. Después de la suspensión, las conidias se tiñeron
con 10 µg/mL de yoduro de propidio (PI) durante 5 minutos a 30 °C. Finalmente, las conidias
se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces con el tampón para eliminar el
xxvii
colorante residual y se observaron bajo un microscopio óptico con un sistema de
epifluorescencia (Eclipse E-200).
8.3.10. Sensibilidad a los agentes perturbadores de la pared celular
La sensibilidad de B. cinerea a los agentes perturbadores de la pared celular Congo
rojo (CR, 500 µg/mL) y Calcofluor blanco (CFW, 500 µg/mL) se determinó de acuerdo con
Plaza et al., 2015). Las conidias se recolectaron y lavaron con agua estéril. Luego, la
concentración se ajustó a 2.5x105 conidias/mL. Posteriormente, se preincubaron 500 µL de la
suspensión de conidias con 500 µL de P1G10 (1 mg/mL) o P1G10 inhibido (P1G10 Tº o
P1G10-IAA) en medio MEB, durante 4 h con agitación a 22 ± 1 °C. Posteriormente, se
inocularon 20 µL de cada preparación en el medio de cultivo, previamente preparado con rojo
Congo (CR, 500 µg/mL), blanco Calcofluor (CFW, 500 µg/mL) y MEA 2%, respectivamente.
Los cultivos se incubaron en la oscuridad a 22 ± 1 °C durante 6 días. Los diámetros de los
micelios se midieron diariamente. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.
8.3.11. Producción de especies reactivas de oxígeno
La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se evaluó utilizando el kit de
ensayo ROS-GLOtm H2O2 (Promega, Madison, EE. UU.) De acuerdo con un método descrito
por Kelts et al., (2015). Las conidias (79 µL) se sembraron en placas de 96 pocillos a una
concentración de 1x105 conidias/mL/pocillo. Más tarde, cada pocillo se incubó en presencia
de 1 µL de P1G10 (1 mg/ml), 20 µL de sustrato H2O2 durante 2 h a 21 ± 1 °C. Después de
este período de incubación, se añadieron 100 µL de reactivo ROS-GLOtm a cada pocillo y se
incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. La producción de ROS se midió utilizando
un luminómetro (Tecan infinite m200pro). Se usó menadiona (0.01 mg/mL) como control
positivo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se consideraron los valores medios con al
menos una diferencia significativa (p <0.05).
8.3.12. PCR en tiempo real y expresión génica
Para el análisis de expresión génica, las conidias se inocularon en matraces
Erlenmeyer estériles con medio de levadura de malta y se cultivaron sin agitación durante 3
días a 21 ± 1 °C en presencia de 1 mg/mL de P1G10. Luego, el micelio fue extraído y molido
xxviii
con nitrógeno líquido. La extracción de ARN total y la síntesis de ADNc se realizaron de
acuerdo con el procedimiento descrito por Robles-Kelly et al., (2016). Se usaron al menos tres
preparaciones de ADNc independientes obtenidas de réplicas biológicas independientes para
el análisis. Cada gen diana se midió por triplicado y se calculó el valor medio de Ct. La
expresión de cada gen se determinó mediante el método de Livak y Schmittgen, (2001). Los
niveles de expresión se normalizaron contra el gen de referencia enzima conjugadora de
ubiquitina E2 (ubce) de acuerdo con (Silva-Moreno et al., 2016). Los cebadores para los
ensayos de PCR en tiempo real y las eficiencias de amplificación (E) se muestran en la tabla
S1 (anexos).
8.4. Proceso de conservación mediante alta presión hidrostática y caracterización de la materia
prima
8.4.1. Materia prima: Jugo de uva concentrado (JUC-64 ºBrix)
El JUC fue elaborado en la cosecha de 2017 por la Cooperativa Capel, Viña Francisco
de Aguirre S.A., Ovalle, Región de Coquimbo. Para la elaboración del jugo de uva se utilizó
la variedad Jiménez, uvas provenientes de viñedos ubicados en la región de Coquimbo.
Fig. 5. Materia prima: jugo de uva variedad Pedro Jiménez
xxix
8.4.2. Recuento de mohos y levaduras de acuerdo con el método PRT-712.02-048 del Instituto
de Salud Pública ISP.
Para determinar la presencia de mohos y levaduras se utilizaron dos técnicas de
sembrado; siembra en placa de agar en profundidad utilizando el medio de cultivo Agar Papa
Dextrosa (PDA) y siembra en placa de agar en superficie con medio de cultivo Agar Dicloran
Rosa de Bengala (DRBC). Para la siembra en PDA se adicionó 1 mL de cada dilución (mínimo
2 diluciones consecutivas) en la placa de Petri, posteriormente se vertió y agregó
inmediatamente de 20 a 25 mL de PDA que se encontraba a 47 ± 2 °C. Las placas se agitaron
suavemente con movimientos en el sentido de las agujas del reloj, posteriormente las placas
se incubaron en la oscuridad a 25 °C, en pilas de no más de 3 placas sin invertir durante 5 días
y sin tornear. Para la siembra en placa de agar en superficie DRBC, en el medio previamente
solidificado, se inoculó 0.1 mL de cada dilución (mínimo 2 diluciones consecutivas) y el
inoculo fue diseminado con un rastrillo estéril, las placas se incubaron en oscuridad a 25 °C,
en pilas de no más de 3 placas y sin invertir por 5 días sin mover.
8.4.3. Inoculación de B. cinerea en el jugo de uva
El jugo de uva fue inoculado con una suspensión conidial de B. cinerea que se ajustó
a una concentración de 1x104 conidias/mL de jugo de uva, (concentración de conidias definida
de acuerdo con estudios anteriores, donde se obtuvo un recuento similar de 1x104 conidias/mL
en jugos de uva con periodos de guarda de mas de 10 meses). De esta manera se determinó
el daño que la alta presión y el efecto sinérgico APH/P1G10 produjeron sobre el crecimiento
de las conidias en el jugo de uva.
8.4.4. Proceso de alta presión hidrostática
Previó al proceso de presurización, el JUC fue depositado en bolsas flexibles de
polietileno estériles. El proceso de presurización se llevó a cabo en equipo de alta presión
(Avure Inc., Kent, WA, EE. UU.), que posee un contenedor de carga cilíndrica de 2 L
utilizando agua como medio transmisor de presión. El nivel de presión y el tiempo de
presurización se controlaron automáticamente, el tiempo de tratamiento indicado en este
estudio no incluyó los tiempos de subida y bajada. Las muestras se presurizaron de acuerdo
los diseños experimentales correspondientes (ver Tabla 2 y 3) a temperatura ambiente (20 ±
xxx
2 °C). Las muestras control se analizaron a 0.1 MPa (presión atmosférica) y temperatura
ambiente. Los análisis de calidad se realizaron inmediatamente después del procesamiento
(día 0) y después de 35 días de almacenamiento (día 35) a 4 ± 2 ºC, todos los experimentos se
realizaron por triplicado.
8.4.5. Tratamiento combinado de APH/P1G10
Para determinar el efecto sinérgico entre la alta presión y P1G10, previó al proceso de
presurización, el jugo de uva fue inoculado con una concentración de 1x104 conidias/mL de
B. cinerea, inmediatamente después se agrego al jugo inoculado 1 mg/mL de P1G10. Una vez
realizado el proceso se presurización, la muestra tratada por APH/P1G10 se dejó incubar a 22
ºC durante 1 h y posteriormente se realizó el análisis microbiológico (recuento de B. cinerea
en agar DRBC)
Fig. 6. Modelo esquemático del funcionamiento de un equipo de alta presión hidrostática.
8.4.6. Diseños experimentales
Para determinar la factibilidad del proceso de alta presión sobre el crecimiento de B.
cinerea en un JUC se realizaron diversos ensayos, basado en un diseño multinivel factorial,
donde se presentan dos factores; tratamiento de alta presión con 3 niveles y tiempo de
presurización con 2 niveles. Por lo tanto, se llevaron a cabo 6 experimentos, que se muestran
en la Tabla 2. De acuerdo con la respuesta del efecto antimicrobiano de APH sobre B. cinerea,
se realizó una nuevo diseño multinivel factorial presentado en la Tabla 3. para determinar el
Cámara de alta presión
Fluidos de presurización (agua) Sistema de presurización de fluidos (agua)
xxxi
tratamiento sinergico de APH y P1G10 que inhibe el crecimiento de B. cinerea en un jugo de
uva. En la Tabla 4. Se muestra la matriz codificada de cada diseño de experimentos.
Tabla 2. Diseño experimental para determinar la factibilidad del tratamiento de alta presión, niveles decodificados de las variables
Niveles decodificados
Niveles codificados Presión (MPa) Tiempo (min)
-1 200 2
0 300 4
1 400
Tabla 3. Diseño experimental para determinar el efecto sinérgico de alta presión hidrostática y P1G10
Niveles decodificados
Niveles codificados Presión (MPa) Tiempo (min)
-1 100 2
0 200 4
1 250
Tabla 4. Matriz codificada de cada diseño de experimentos
Experimentos Tiempo Presión
1 -1 -1
2 -1 0
3 0 -1
4 0 0
5 1 -1
6 1 0
xxxii
8.4.7. Composición proximal
La composición proximal se determinó mediante los métodos de la Asociación de
Químicos Analíticos Oficiales (AOAC 1990). El contenido de proteína bruta se determinó
utilizando el método Kjeldahl (AOAC No. 960.52). El contenido de lípidos se analizó
gravimétricamente después de la extracción con Soxhlet (AOAC No. 960.39). El contenido
de ceniza se determinó por incineración en un horno de mufla a 550 °C (AOAC No. 923.03).
Los carbohidratos disponibles se estimaron por diferencia. El contenido de humedad se
determinó gravimétricamente (AOAC No. 934.06). Estas pruebas se llevaron a cabo para
caracterizar la materia prima y para las muestras APH/P1G10. Todas las mediciones se
realizaron por triplicado.
8.4.8. Análisis físico-químico
Los análisis fisicoquímicos medidos fueron pH, acidez titulable, sólidos solubles y
color. Para la medición de pH se utilizó un pHmetro Orion Star A320 de Thermo Scientific,
el porcentaje de acidez titulable se expresó como gramos de ácido tartárico por cada 100 mL
de jugo. Los sólidos solubles (°Brix) se midieron utilizando un refractómetro (ABBE, 1T,
Tokio, Japón) y el color de superficie se midió con un colorímetro (HunterLab, MiniScanTM
XE Plus, Reston, Virginia, EE. UU.). La diferencia de color total (ΔE) se calculó mediante la
Ecuación (3) donde midió la diferencia de color entre parámetros cromáticos L*, a* y b* de
la muestra tratada y la muestra control (0.1 MPa). Las mediciones se obtuvieron a partir de
tres réplicas, con un n=3.
∆3 = √∆FG + ∆IG + ∆JG (3)
8.4.9. Flavonoides totales
El contenido total de flavonoides se midió mediante un ensayo colorimétrico de
acuerdo con Saidani et al., (2017). El JUC se trabajo a 16 ºBrix reduciendo los sólidos solubles
con agua destilada, luego se agregó 0.5 mL de jugo a un tubo de 5 mL que contenía 2 mL de
agua destilada. En el tiempo cero, se añadieron al tubo 0.15 mL de NaNO2 (5 g/100 mL).
Después de 5 minutos, se añadieron 0.15 mL de AlCl3 (10 g/100 mL) y 6 minutos se añadió
1 mL de NaOH 1 M a la mezcla. Inmediatamente después se agregó 1.2 mL de agua destilada,
xxxiii
la solución final se agitó con cierto grado de vigor para mezclar las soluciones. La absorbancia
de la mezcla se determinó a 415 nm en comparación con el blanco el cual preparado con agua.
Los flavonoides totales se expresaron como mg equivalentes de quercetina/100 mL de jugo
8.4.11. Azúcares individuales
Para la extracción de los azúcares individuales, 3 mL de jugo a 16 ºBrix se mezclaron
con 6 mL de metanol (80%), la mezcla se agitó durante 30 minutos a 200 rpm según Djendoubi
Mrad et al., (2012) con algunas modificaciones. La muestra extraída se centrifugó durante 3
minutos y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de membrana de 0.45 µm,
posteriormente se inyectaron 10 µL de la solución filtrada en una unidad de HPLC (modelo
Perkin Elmer Flexar LC, Shelton, WA), el equipo de HPLC cuenta con un detector de índice
de refracción, que incluye una bomba LC binario Flexar, un muestreador automático Flexar
LC y un horno de columna Flexar. La separación de los azúcares se llevó a cabo utilizando
una columna Phenomenex Luna 5.2 NH2 (250 mm × 4.6 mm) a 25 ºC, la fase móvil fue
acetonitrilo:agua (82.5: 17.5 v/v) y el caudal se ajustó a 1 mL/min para una elución isocrática.
Los azúcares se identificaron por sus tiempos de retención característicos en comparación con
los estándares. Los contenidos de azúcar se expresaron en mg/100 mL de jugo de uva. Todas
las medidas se realizaron por triplicado.
8.4.12. Actividad antioxidante
La actividad antioxidante del jugo de uva se determinó mediante dos métodos; 2,2
difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) y el ensayo de capacidad de absorción de radicales de
oxígeno (ORAC). El método de DPPH se basa en la evaluación de la capacidad de eliminación
de radicales libres (Brand-Williams et al., 1995). Se mezclaron 0.1 mL de jugo a 16 ºBrix con
3.9 mL de 50 µM de DPPH en etanol al 80% (v/v). La absorbancia se midió a 517 nm,
utilizando un espectrofotómetro UV-VIS (Thermo Scientific, ORION AQUA MATE 8000,
Madison, Wisconsi, EE. UU.). El ensayo ORAC se realizó de acuerdo con (Torres-Ossandón
et al., 2015a) utilizando un lector de placas Victor X3 Multilabel Plate (Perkin-Elmer, Turku,
Finlandia). En ambos métodos se utilizó el estándar analítico Trolox para construir las curvas
de calibración. Los resultados se expresaron como equivalentes de Trolox por 100 mL de jugo
de uva (µmol TE/100 mL).
xxxiv
8.4.13. Compuestos fenólicos
Para extraer los compuestos fenólicos del jugo de uva se utilizó un método
convencional discontinuo de Moreno-Montoro et al., (2015). Se extrajeron 100 mL de jugo
con éter etílico cuatro veces, en proporción (2:1), la mezcla se agitó durante 30 min a 200
rpm. Posteriormente la muestra se evaporó al vacío a 37 ºC. El residuo seco se disolvió en 1
mL de MeOH-ácido fórmico (99:1) y se filtró a través de una membrana Waters Millipore de
0.45 mm.
Para determinar los compuestos fenólicos totales se utilizó el método de Folin-
Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965). En un tubo de 15 mL, se agregó 0.5 mL del extracto
reconstituido previamente y se agregaron 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu, la mezcla
se agitó vigorosamente. Después 5 minutos, se agregaron 2 mL de Na2CO3 (200 mg /mL),
nuevamente la mezcla se agitó con un vórtex durante 15 a 20 segundos, la mezcla se dejó
reposar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. La absorbancia se leyó a
725 nm mediante un espectrofotómetro UV-VIS (Thermo Scientific, ORION AQUA MATE
8000, Madison, Wisconsi, EE. UU.). La cuantificación se obtuvo a partir de la curva de
calibración generada con un estándar de ácido gálico, y los resultados se expresaron como mg
equivalente de ácido gálico (GAE) en 100 mL de jugo de uva.
El análisis individual de los compuestos fenólicos presentes en el extracto del jugo se
llevó a cabo en un sistema de análisis de HPLC, Agilent 1200, equipado con una bomba de
alta presión; inyector automático; un detector de red de diodos; Controlado por el software
ChemStation. La columna analítica fue un Kromasil 100-5C18 (250 X 4.6 mm; tamaño de
partícula de 5 µm) (Eka Chemical, Suecia). La velocidad de flujo fue de 0.7 mL/min y la
elución se controló a 280, 310 y 370 nm a 25 ºC. La fase móvil estaba compuesta por el
disolvente A (ácido fórmico al 0.3%, pH 2.6) y B (acetonitrilo al 100%). La elución fue la
siguiente: 0 a 16 min 87% A y 13% B; 16 a 23 min. 45% de A y 55% de B; 23 a 25 min 40%
A y 60% B; 25 a 30 min. 87% A y 13% B. Finalmente se regresa a las condiciones iniciales
en 4 min. Los extractos fenólicos y estándar se analizaron mediante comparaciones con los
tiempos de retención y luego con sus espectros, área del pico de máxima absorción de longitud
de onda. Los resultados de los compuestos fenólicos se expresaron como mg/mL de jugo,
todas las mediciones se realizaron por triplicado.
xxxv
8.5. Prueba de preferencia
Se presentaron al panel de catadores dos muestras codificadas, aparentemente iguales
pero sometidas a distintos métodos de presurización (250 MPa/4 min y 250 MPa/4
min+P1G10). Los parámetros a evaluar fueron: acidez, dulzor, color y olor. De esta manera
determinar que producto preferían los jueces según los distintos atributos evaulados.
8.6. Análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces, y cada experimento se
realizó con tres o más duplicados. El análisis de varianza de uno factor y dos factores fue
realizado en el software Statgraphics Plus® 5.1, (Statistical Graphics Corp., Herndon, EE.
UU.). La prueba de significancia se realizó con la prueba de mínima diferencia significativa
(LSD) de Fisher y la prueba de la t de Student; las diferencias se tomaron con una significancia
del 95% y 99%. La prueba de rango múltiple (MRT) incluida en el programa estadístico se
utilizó para evaluar la existencia de grupos homogéneos dentro de cada uno de los parámetros
analizados.
xxxvi
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Sección 1: Caracterización antifúngica de P1G10 sobre B. cinerea
9.1. Determinación de la actividad antifúngica de P1G10 sobre B. cinerea
Como se mencionó en este escrito P1G10 exhibió una importante actividad inhibitoria
frente a Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora
sp. y Aspergillus niger. En vista de esta evidencia, se investigó los efectos antifúngicos que
P1G10 podría tener sobre B. cinerea. Para determinar la actividad antifúngica de P1G10 se
realizaron dos ensayos una cinética de sobrevivencia de B. cinerea llevada a cabo en medio
líquido y la determinación de valor IC50 frente a B. cinerea en medio sólido, mediante estos
análisis se determinó la concentración apropiada y el efecto de la dosis de P1G10 para inhibir
el crecimiento de B. cinerea.
9.1.1. Cinética de sobrevivencia y valor IC50 de P1G10 frente a B. cinerea
Fig. 7. Efecto de P1G10 sobre la sobrevivencia de B. cinerea.(♦) representa los datos
observados. La línea continua corresponde a los valores estimados de la función de
distribución de Weibull. Las barras de error representan la desviación estándar de 5 valores
experimentales.
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
OD
595
nm
mg/mL P1G10
CalculadoExperimental P1G10
xxxvii
Los datos experimentales de OD595 asociados al crecimiento del micelio a diferentes
concentraciones de P1G10 se ajustaron a la función de distribución de Weibull. Los resultados
muestran que P1G10 exhibió una actividad inhibitoria importante contra B. cinerea en medios
sólido y líquido. Como se muestra en la Fig. 8, diferentes concentraciones de P1G10 fueron
ajustadas a la función de distribución de Weibull. La curva de sobrevivencia cóncava y su
parámetro β (0.0001) muestran un ejemplo típico de inactivación microbiana; el valor medio
ajustado de r2 y el parámetro estadístico RMSE fueron 0.961 y 0.009, respectivamente, por lo
tanto, estos valores indicaron que la función de Weibull se ajustó estrechamente a los datos
empíricos. En la Fig. 7 vemos que el crecimiento de B. cinerea se redujo al aumentar la
concentración de P1G10 y alcanzó un mínimo de aproximadamente 1 mg/mL. Mientras que
entre 1 y 8 mg/mL de P1G10, el crecimiento del hongo permaneció invariable sin una
disminución adicional (p<0.05). Este modelo proporcionó un ajuste adecuado, lo que permitió
determinar que P1G10 a 1 mg/mL redujo en un 50% el crecimiento del hongo. La función de
Weibull proporcionó una estimación ajustada de los datos experimentales y un error
cuadrático medio bajo (RMSE). Un buen ajuste de la curva de sobrevivencia es importante
para obtener estimaciones válidas del parámetro modelado (Scholze et al., 2001). El resultado
del modelo de Weibull fue apoyado por la determinación del valor IC50 en medio sólido a
diferentes concentraciones del inhibidor. La Fig. 8A muestra la cinética de inhibición del
crecimiento del micelio de B. cinerea en presencia de P1G10.
Los resultados indican que P1G10 reduce el crecimiento del micelio de B. cinerea
entre 0,08 y 0,16 mg/mL después de 48 h de incubación. Para determinar el valor IC50 de
P1G10 sobre crecimiento micelial, se realizó un análisis Probi, mostrando que el IC50 de
P1G10 capaz de reducir el crecimiento del micelio en un 50% fue 1 mg/mL (Fig. 8B). Se ha
descrito un valor IC50 similar (1.368 mg/mL) utilizando proteasas del látex de Calotropis
procera (CpLP) (Souza et al., 2011) contra Aspergillus niger. Además, los autores observaron
que la fracción CpLP era más eficaz que P1G10 frente a varios hongos, excepto A. niger,
donde P1G10 fue significativamente más activa que la CpLP, por lo tanto, la eficacia del
efecto inhibitorio de las proteasas varía según las especies de hongos (Souza et al., 2011).
De acuerdo entonces a los resultados proporcionados por el modelo de Weibull y el valor de
IC50 determinado, se aplicó 1 mg/mL de P1G10 para la determinación de los ensayos que se
xxxviii
describen a continuación, realizados con el fin de comprender los posibles mecanismos de
inhibición que P1G10 ejerce sobre B. cinerea.
Fig. 8. Efecto de P1G10 sobre el crecimiento de B. cinerea en medios sólidos. (A) Cinética
de inhibición del crecimiento a diferentes concentraciones de P1G10, 0.02, 0.04, 0.08 y 0.16
mg/mL. Cada punto representa el promedio de al menos tres experimentos independientes ±
desviación estándar. (B) Efecto de P1G10 sobre el crecimiento micelial de B. cinerea en
medio sólido a las 48 h de incubación. Diferentes letras indican las diferencias significativas
(p <0.05).
9.1.1. Efecto de P1G10 sobre el crecimiento y la adhesión del micelio en B. cinerea
Para determinar si la actividad proteolítica es responsable de la actividad antifúngica,
las proteínas presentes en P1G10 se desnaturalizaron por calor o se inhibieron con IAA
(inhibidor irreversible de enzimas proteolíticas que contienen grupos cisteína en el sitio
activo). Por lo tanto, B. cinerea fue crecido durante 72 horas a 22 ± 1 °C en medio MEB con
1 mg/mL de P1G10 o P1G10 inhibido por calor (P1G10 Tº) o con IAA (P1G10-IAA). Los
resultados mostraron que 1 mg/mL de P1G10 redujo el crecimiento del micelio ≥ 50% (Fig.
9A), mientras que la biomasa fúngica en el medio sin inhibidor o que contenía P1G10 inhibido
no se vio afectada. Este resultado mostró que la inhibición del crecimiento fúngico se suprimió
cuando P1G10 se desnaturalizó térmicamente o se trató con IAA, confirmando entonces, que
la actividad proteolítica esta relacionada con la acción antifúngica de P1G10. Similares
resultados fueron observados por Souza et al., (2011), cuando P1G10 y la fracción proteolítica
de C. procera se expusieron a desnaturalización térmica, o se trataron con IAA y E64
xxxix
(inhibidor de la cisteína proteasas), confirmando entonces que la actividad antifúngica de
P1G10 se debe a las proteasas presentes en P1G10 y no a otros compuestos presentes en la
fracción. Se ha demostrado que extractos de plantas comestibles y subproductos purificados
han mostrado actividad antimicrobiana, situación similar se ha observado en proteínas
vegetales con actividad antifúngica. En una revisión sobre los metabolitos antifúngicos que se
describen en varios extractos de plantas se destacan los péptidos (Abad et al., 2006). La acción
proteolítica no es la única respuesta provocada por las plantas para combatir patógenos; se
pueden incluir metabolitos secundarios (Abad et al., 2006) y macromoléculas como
quitinasas, ß-1,3-glucanasas y tioninas o un grupo de péptidos que participan en el fenómeno
de resistencia conocido como respuesta hipersensible (HR) (Salas et al., 2015). En el látex de
C. papaya, una especie relacionada con V. cundinamarcensis, se ha informado de pequeñas
cantidades de lisozima, ß-1,3-endoglucanasa, quitinasa, inhibidor de la serina proteasa tipo
Kunitz y glutaminil ciclasa (Azarkan et al., 2006). Las tres primeras de estas enzimas muestran
actividad antifúngica, pero aún no hemos identificado estas enzimas en V. cundinamarcensis.
Además, un análisis de SDS-PAGE y espectroscopía de masas en la fracción P1G10 no
mostraron un perfil compatible con la presencia de quitinasa o beta-1,3-endoglucanasa (>40
kDa) (Fig. S1). Aunque no podemos descartar que una pequeña parte del efecto antifúngico
observado en este estudio sea causada por una de las enzimas identificadas en C. papaya.
Mientras que experimentos independientes confirmaron la actividad antifúngica CMS2MS2,
una isoforma de proteinasa purificada encontrada en P1G10 (Souza et al., 2011).
Como se sabe, la adhesión es un atributo importante de virulencia en los hongos
fitopatógenos que asegura a la colonia en un ambiente adecuado. Las proteínas de adhesión
en B. cinerea están involucradas durante el reconocimiento y unión del hongo a tejidos del
hospedador (Cormack et al., 1999; Staab et al., 1999). Estas proteínas juegan un papel vital
en la integridad de la pared celular, la adhesión y la virulencia (González et al., 2013; Plaza
et al., 2015; Wagener et al., 2008). Para llevar a cabo este análisis, se analizaron micelios en
crecidos con 1 mg/mL de P1G10 en placas de microtitulación de poliestireno. Los micelios
se tiñeron con cristal violeta y se expusieron a una fuerza de desprendimiento para medir el
efecto de P1G10 sobre la adhesión de B. cinerea sobre la superficie de poliestireno. Los
resultados se visualizaron por microscopía de fluorescencia y mostraron que P1G10 inhibió
aproximadamente el 50% de la capacidad de adhesión de B. cinerea después de 72 h de
xl
incubación a 22 ± 1 °C (Fig. 9B y C). Este análisis reveló que la acción proteolítica de P1G10
interfiere con la capacidad de adhesión de B. cinerea a la superficie de poliestireno, mientras
que los hongos cultivados con P1G10 inactivado exhibieron una adhesión similar a B. cinerea
sin P1G10. Por lo tanto, P1G10 afectó la interacción entre las proteínas de la pared celular de
B. cinerea y la superficie de poliestireno. Se observa un efecto similar cuando células
cultivadas de mamíferos fueron crecidas con P1G10. En este último caso, los aglomerados
celulares se acumularon en el cultivo, pero se revierten al estado original tras la eliminación
de P1G10 sin efectos perceptibles en la viabilidad celular. Otros autores han informado de
una correlación entre la adhesión y la germinación en las conidias de B. cinerea (Doss et al.,
1995; Slawecki et al., 2002).
Fig. 9. Efecto antifúngico de P1G10 sobre el crecimiento y la adhesión del micelio en B.
cinerea. (A) Porcentaje de inhibición de P1G10 en el crecimiento micelial. (B) y (C). Los
micelios unidos se tiñeron con cristal violeta y se visualizaron mediante microscopía de
fluorescencia (10x). Todos los experimentos se realizaron 3 veces, con n = 6. Letras diferentes
indican diferencias significativas (p <0.05).
B05.10 B05.10 + P1G10 T° B05.10 + P1G10-IAA B05.10 + P1G10 C
A B
0
20
40
60
80
100
B05.10 B05.10 +P1G10 Tº
B05.10 +P1G10-IAA
B0510 +P1G10
% C
reci
mie
nto
mic
elia
l
a
b
aa
0
20
40
60
80
100
B05.10 B05.10 +P1G10 Tº
B05.10 +P1G10-IAA
B05.10 +P1G10
% A
dhes
ión
a
b
c
b
xli
9.1.2. Efecto del P1G10 sobre la germinación de las conidias y la elongación del tubo germinal
En nuestro estudio, la germinación y elongación del tubo germinativo de B. cinerea
se redujo en presencia de P1G10. En la Fig. 10A se observa el efecto inhibitorio de P1G10
sobre B. cinerea después de 0, 4 y 6 h incubación a 22 ± 1 °C. Las conidias se consideraron
germinados cuando el tubo germinal tenía el doble del tamaño de las conidias y luego se
calculó el porcentaje de germinación.
Fig. 10. Efecto de P1G10 sobre la germinación de B. cinerea. (A) Imagen (40 ×) de conidias
en germinación a diferentes intervalos de tiempo. (B) Porcentaje de germinación de B. cinerea
después de 4 y 6 h de incubación con P1G10 a 22 °C, respectivamente. (C) Longitud del tubo
germinal después de 6 h de incubación.
Tiempo/Tratamiento
B05.10 B05.10 + P1G10 Tº B05.10 + P1G10-IAA B05.10 + P1G10
0 h
4 h
6 h
A
CB
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6
% G
erm
inac
ión
coni
dial
Tiempo (h)
B05.10
B05.10 + P1G10 T°
B05.10 + P1G10
B05.10 + P1G10-IAA
0
5
10
15
20
25
30
35
B05.10 B05.10 + P1G10 T B05.10 + P1G10-IAA
B05.10 + P1G10
Tam
año
del t
ubo
germ
inat
ivo
(µm
)
B05.10B05.10 + P1G10 TB05.10 + P1G10-IAAB05.10 + P1G10
xlii
Como se observó anteriormente, en los experimentos de inhibición del crecimiento
del micelio, las conidias de B. cinerea sin inhibidor o tratados con P1G10 T°, o P1G10-IAA
mostraron una germinación normal después de 6 h de incubación. Mientras que se observó
una reducción significativa en la germinación de conidias tratadas con P1G10 en el intervalo
de 4 h (Fig. 10B). En la Fig. 10B se muestra una importante disminución de la germinación,
cercana al 70% después de 6 h cuando el hongo fue crecido con P1G10; mientras que la
germinación en conidias sin inhibidor o P1G10 inhibido o inactivado se mantuvo cerca del
100%. En la Fig. 10C se presenta una gráfica que indica el tamaño de los tubos germinales de
B. cinerea después de 6 h de incubación; la media de la longitud conidial fue de 26.93±3.28
μm para B05.10, 23.59±2.02 μm para B05.10+P1G10 T°, 25.25 ± 1.69 para B05.10+P1G10-
IAA y 13.86±2.80 μm para B05.10+P1G10. Una diferencia de 10 µm longitud se observó
entre las conidias crecidas con P1G10 en comparación con las conidias sin inhibidor o P1G10
inhibido o inactivado. Resultados similares se han observado en la germinación conidial de B.
cinerea y Penicillium expansum expuestos al flavonoide 5.7-dihidroxi-3.8-dimetoxiflavona
de Psaudognaphalium robustum y quitosano de crustáceos (Cotoras et al., 2011; Liu et al.,
2007. Con respecto a los núcleos de B. cinerea, se analizó una posible alteración nuclear en
conidias y micelios crecidos junto a P1G10, a través de una tinción de conidias con DAPI, un
fluorómetro que se excita en longitudes de onda UV incompatibles con células vivas (Besserer
et al., 2008). En la Fig. 11 se muestra una microfotografía de micelio de B. cinerea cultivado
durante 6 h en presencia de 1 mg/mL de P1G10. La microfotografía se obtuvo mediante
microscopía de epifluorescencia y mostró que P1G10 no afectó el número de núcleos en las
conidias. No se encontraron diferencias significativas en el número de núcleos entre las
conidias o micelios tratados o no tratados.
xliii
Fig. 11. Efecto de P1G10 en células de B. cinerea tratadas con DAPI. Las conidias de Botrytis
tratados y no tratados con P1G10 se expusieron a las concentraciones indicadas de
Fluoromount-G Dapi durante 10 min. Las imágenes representan tres experimentos
independientes
xliv
9.1.3. Efecto del P1G10 sobre la integridad de la membrana y la pared celular.
Para determinar si P1G10 produjo algún daño en la membrana de B. cinerea se realizó
un ensayo de la viabilidad celular con yoduro de propidio (PI). El yoduro de propidio es
fluorocromo impermeable a la membrana con carga positiva solo puede pasar a través de la
membrana de células estresadas, dañadas o muertas (Brul et al., 1997). Las conidias tratadas
y no tratadas con P1G10 se recogieron, se tiñeron con PI y se observaron bajo microscopia de
fluorescencia. Según se muestra en la Fig. 12A, la membrana plasmática de las conidias de B.
cinerea se vió significativamente afectada en presencia de P1G10, como podemos ver la
integridad de la membrana disminuyó en presencia de P1G10 después de 4 y 6 h de
incubación. Sin embargo, la integridad de la membrana permaneció inalterada en las conidias
incubadas sin P1G10 o P1G10 inhibido o inactivo. Nuestros datos sugieren que la integridad
de la membrana también se alteró en conidias expuestas a P1G10 a diversos intervalos de
tiempo. En consecuencia, la membrana plasmática de B. cinerea se afectó significativamente
con P1G10 (Fig. 12A). De modo similar, el quitosano induce lesiones en membrana,
disminuyendo la integridad membrana y aumentando la permeabilidad de ella en B. cinerea y
Penicillium expansum (Liu et al., 2007). Sin embargo, no está claro cómo P1G10 interfiere
con la membrana plasmática, una posibilidad podría ser que las proteasas de P1G10 actúen
degradando las proteínas de la membrana plasmática del hongo provocando su alteración, sin
embargo, se necesitan más estudios complementarios para confirmar esta posibilidad. Como
es sabido la pared celular de los hongos es responsable de dar la forma a la célula y ofrecer
protección contra condiciones ambientales perjudiciales (Costa-de Oliveira et al., 2013). Las
paredes celulares de los hongos están compuestas principalmente por manoproteínas, β-
glucano y quitina (Delgado-Silva et al., 2014).
Para evaluar si P1G10 tiene un efecto en la integridad de la pared celular, se evaluó la
sensibilidad de las conidias tratadas y no tratadas con P1G10 frente a fármacos antifúngicos,
incluido Calcofluor White (CFW) (altera el ensamblaje de las fibrillas de quitina en la pared
celular) y Rojo Congo (CR) (Altera el ensamblaje de microfibrillas de β1,3-glucano).
Podemos observar en la Fig. 12B y C que P1G10 altera la pared celular de B. cinerea. Se
muestra un aumento en la sensibilidad a CFW en las células tratadas con P1G10 que presentan
una reducción significativa en la tasa de crecimiento en el día 6 (76.6%), este patrón también
se observó en los días 3, 4 y 5. Se encontró un resultado similar en las conidias tratadas con
xlv
P1G10 y crecidos en presencia de CR, lo que confirma que la pared celular en estas células se
había visto afectada. Por lo tanto, P1G10 altera la pared celular de B. cinera provocando en
las células un aumento de la sensibilidad a los agentes perturbadores (CFW y CR), como se
muestra en la Fig. 12B y C. Se sabe que, CFW se une preferentemente a la quitina del hongo,
interfiriendo de esta manera con el ensamblaje de la pared celular, mientras que CR se une a
β1,3-glucano alterando el ensamblaje de las microfibrillas en la pared celular (Ram y Klis,
2006). Estos datos están acordes con mutantes de hongos que presentan alterada la pared
celular, ya que presentan una mayor sensibilidad a los fármacos CFW y CR, esto debido en
parte porque los mutantes presentan un aumento de la quitina en la pared. Este aumento de
quitina es debido al mecanismo de compensación del hongo para compensar la pérdida de
integridad de la pared celular (Kapteyn et al., 1997; Popolo et al., 1997). El aumento de la
susceptibilidad a CFW o CR por parte de B. cinerea, es un indicativo de los defectos en la
pared celular de las conidias tratadas con P1G10+CFW o P1G10+RC, lo que sugiere que
P1G10 también es un agente que interfiere con la integridad de la pared celular. Esta alteración
de la pared celular también puede explicar la reducida adhesión de B. cinerea tratada con
P1G10 sobre la superficie de poliestireno, mencionada anteriormente. Recientes estudios en
péptidos antimicrobianos aislados de plantas se demostraron que la quitina de la pared celular
se ha implicado como una diana fúngica para péptidos bioactivos, donde la unión del péptido
induce la permeabilización de la membrana fúngica y/o la formación de poros (Salas et al.,
2015). Péptidos antifúngicos muestran una disposición de actividad estructural particular que
involucra aminoácidos polares y neutros que se dirigen a los residuos de quitina que son
componentes abundantes de la pared celular fúngica (Yokoyama et al., 2009). Se desconoce
si los determinantes estructurales de P1G10 contienen péptidos antifúngicos potenciales, pero
un análisis estructural de las proteasas en V. cundinamarcensis cuya estructura se ha
dilucidado reveló la presencia de péptidos con potencial de formación de poros.
xlvi
Fig. 12. Efecto de P1G10 en la integridad de la membrana plasmática y la pared celular en
B. cinerea. (A) Efectos de P1G10 en la integridad de la membrana plasmática de conidias de
B. cinerea. (B) y (C) Sensibilidad de las conidias con o sin P1G10 y el crecimiento en medios
de agar con rojo Congo (CR) o Calcofluor White (CFW).
9.1.4. Determinación de la expresión de genes específicos relacionados con el daño celular
Para dilucidar un posible mecanismo que involucre la acción de P1G10 contra B.
cinerea, se estudiaron algunos genes asociados al daño celular. El primer gen analizado fue
hex que codifica la proteína principal del cuerpo de Woronin. Se ha descrito que el gen hex
aumenta su expresión junto con el daño del micelio, debido a que los cuerpos de Woronin
parecen taponar los poros septales minutos después del daño (Aguayo et al., 2011). El segundo
gen fue aox, asociado al estrés oxidativo en hongos (Honda et al., 2012; Magnani et al., 2007).
Finalmente, se analizó nma y cas-1, genes relacionados con la muerte celular programada
(PDC).
A
CB
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 4 5 6
Diá
met
ro d
e co
loni
a (m
m)
Días
B05.10RC - B05.10RC - B05.10 + P1G10 T°RC - B05.10 + P1G10RC - B05.10 + P1G10-IAA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 4 5 6
Diá
met
ro d
e co
loni
a (m
m)
Días
B05.10CFW - B05.10CFW - B05.10 + P1G10 T°CFW - B05.10 + P1G10CFW - B05.10 + P1G10-IAA
0102030405060708090
100
0 4 6
Inte
grid
ad d
e m
embr
ana
(%)
Tiempo de incubación (h)
B05.10B05.10 + P1G10 T°B05.10 + P1G10B05.10 + P1G10-IAA
xlvii
Fig. 13 Efecto de P1G10 en los niveles de ARNm de los genes nma, cas-1, hex y aox, de B.
cinerea. Todos los valores representan la media ± desviación estándar de tres experimentos
independientes con al menos tres repeticiones cada uno. Letras diferentes indican diferencias
significativas (p <0.05).
Los resultados de los experimentos de expresión génica se presentan en la Fig. 13. Los
datos muestran que hay un aumento en las transcripciones hex y aox en presencia de P1G10
en comparación con la condición de control, lo que indica un posible daño en el micelio Este
resultado está respaldado por experimentos de integridad de membrana con CFW y CR
mencionados anteriormente. Resultados similares se han reportado utilizando otros
compuestos naturales que muestran actividad antifúngica contra B. cinerea (Robles-Kelly et
al., 2016). Además, los genes asociados a la muerte celular programada, nma y cas, exhiben
un aumento de la transcripción en presencia de P1G10, lo que indica una modulación
transcripcional positiva inducida por este antifúngico natural. Por lo tanto, la evidencia sugiere
que P1G10 induce un daño significativo a B. cinerea.
xlviii
Sección 2: Efecto de P1G10 y la alta presión hidrostática sobre un jugo de uva 64 ºBrix
inoculado con B. cinerea
9.2. Determinación del efecto de P1G10 sobre el crecimiento de B. cinerea en un jugo de uva.
Como se ha demostrado en esta investigación P1G10 tiene actividad antifúngica sobre
B. cinerea, se observó que 1 mg/mL de P1G10 alteró considerablemente la membrana y la
pared celular del hongo. Sin embargo, no existen datos de la respuesta inhibitoria de P1G10
en una matriz alimentaria. Por lo tanto, para determinar si P1G10 es capaz de inhibir el
crecimiento de B cinerea en un jugo de uva (64 ºBrix), fue inoculada una concentración de
1x104 conidias/mL de B. cinerea junto a 1 mg/mL de P1G10 en un JUC durante 0, 4, 6 y 12
horas a 22 ºC. En la Fig. 14 se muestra el porcentaje del recuento ufc/mL de B. cinerea en una
muestra de jugo de uva. Se observó una disminución en el crecimiento de B. cinerea después
de 4 h de incubación en ambos JUC. Similar tendencia se observó a las 6 y 12 h de incubación,
sin embargo, el JUC que contenía P1G10 presentó un menor % de recuento de B. cinerea. Los
jugos concentrados al igual que las mermeladas, tienen características similares como el
elevado contenido de azúcares, lo que le entrega cierta estabilidad microbiológica a la matriz,
pero incluso bajo estas condiciones existen microorganismos particulares, como los mohos y
las levaduras, que pueden crecer bajo estas condiciones (Ribes et al., 2017). Por lo tanto,
aunque la tendencia indique una disminución en el crecimiento de B. cinerea en ambas
muestras, los resultados muestran que el JUC que contenía P1G10 disminuyó en un 29% mas
la sobrevivencia de Botrytis en comparación con la muestra control (JUC+B05.10). Si
relacionamos los resultados con los datos presentados en la sección 1, sabemos que P1G10
tiene un efecto significativo sobre la germinación de B. cinerea en las primeras horas de
incubación en medio malta, mientras que en el JUC este efecto significativo lo podemos ver
después de 6 h de incubación, por lo tanto, es probablemente que la matriz utilizada interfiera
de alguna manera con la fracción P1G10, debido a que las condiciones de pH y concentración
de solutos en el medio son diferentes.
xlix
Fig. 14. Efecto de P1G10 sobre el crecimiento de B. cinerea en un JUC. Todos los valores
representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes con al menos
tres repeticiones cada uno. * Indica diferencias significativas (p <0.05) entre cada tratamiento.
En la literatura son limitados los estudios disponibles sobre el uso de conservantes o
antifúngicos naturales de origen proteico en matrices alimentarias. Se ha descrito que la
lactoferrina, una glicoproteína presente en la leche, es empleada como agente antimicrobiano
en la conservación de alimentos. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones disponibles
que se presentan en la literatura muestran aplicaciones en vegetales y frutas. Wang et al.
(2013) en su estudio demostró que 100 mg/mL de lactoferrina inhibió sobre el 50% el
crecimiento de B. cinerea en plantas de tomates. Otro antifúngico de origen natural que ha
destacado debido a su actividad antifúngica contra B. cinerea es el quitosano (Ribes et al.,
2018a). Por ejemplo, se ha utilizado para prevenir el crecimiento de B. cinerea en plantas de
pepino rociando soluciones de quitosano o una mezcla de oligómeros de quitina. (Ben-Shalom
et al., 2003). La industria alimentaria por lo general utiliza el quitosano en combinación con
otros biopolímeros o sustancias antifúngicas para recubrimientos comestibles o materiales de
empaque para controlar el deterioro de los hongos en diferentes frutas (Vu et al., 2011, Ribes
et al., 2018). Otra alternativa de conservación es la utilización de emulsiones con aceites
esenciales incorporados. Muestras de mermelada con emulsiones fueron inoculadas con
0
20
40
60
80
100
0 h 4 h 6 h 12 h
% R
ecue
nto
de u
fc/m
L de
B.
cine
rea
JUC+B05.10
JUC+B05.10 + P1G10
*
l
hongos del género Aspergillus y Penicillium y se almacenaron durante 63 días a 4 °C y 25 °C.
No se observó desarrollo de moho en los días 49 y 28 para las muestras almacenadas en frío
y temperatura ambiente, respectivamente (Ribes et al., 2017). En general los estudios que
muestran los efectos antifúngicos de agentes naturales de diferentes orígenes son
prometedores, sin embargo, aún son escasos los estudios que muestren la aplicación de estos
antifúngicos en la industria alimentaria
9.3. Efecto del tratamiento de alta presión sobre B. cinerea en un JUC
La tecnología de alta presión hidrostática es un proceso establecido y utilizado para
reducir la contaminación microbiana presente en jugos de frutas (Augusto et al., 2018). En
este contexto, investigaciones sobre el efecto de APH en diferentes microrganismos han sido
ampliamente reportados. De manera general, se sabe que las formas vegetativas y las conidias
fúngicas son relativamente sensibles; mientras que las ascosporas son más resistentes
(Patterson, 2005). Sin embargo, investigaciones del efecto de la presión sobre B. cinerea aún
son limitadas. Por lo tanto, en nuestro estudio se evaluó el efecto de APH sobre B. cinerea
(1x104 conidias/mL) en un JUC no pasteurizado. Como podemos ver en la Fig. 15, se
determinó el recuento de B. cinerea a 0.1 MPa y 200, 300 y 400 MPa/2 y 4 min. En día cero
se observó que a 200 MPa/2 min el recuento de conidias disminuyó significativamente en un
29% en comparación con 0.1 MPa. En general la gráfica permite observar el significativo
efecto de todos los tratamientos de presión sobre el JUC, sin embargo, el tratamiento de 400
MPa/4 min produjo el mayor daño en el hongo, reduciendo significativamente (p <0.05) el
recuento de Botrytis en comparación con 0.1 MPa. En la literaturas se ha descrito que conidias
de B. cinerea presentes en vino Moscato se inactivaron completamente a 400 MPa/2 min
(Delfini et al., 1995). Por otro lado, Raouche et al., (2011), en su estudio con APH sobre B.
cinerea determinó que la inhibición del tratamiento a 800 MPa/5 min en un medio sólido no
fue suficiente para inactivar al hongo, indicando claramente las diferencias con respecto a
estudios que se han realizado en un medio líquido. En general la respuesta de los mohos a la
alta presión hidrostática ha sido poco estudiada, se ha reportado que esporas fúngicas
(conidias) se inactivan fácilmente a presiones de 300 (Aspergillus oryzae) o 400 MPa
(Rhizopus javanicus) a temperatura ambiente (Cheftel 1995). Goh et al. (2007) mostraron que
conidias fúngicas de Penicillium expansum, Rhizopus stolonifer y Fusarium oxysporum son
li
muy sensibles a la alta presión (600 MPa, 18–20 °C, 30–60 s). Estos autores, además,
indicaron que la estructura de las conidias sometidas a tratamiento de presión resultaron
completamente dañadas, presentando distorsión o ruptura (Goh et al., 2007). Determinar el
efecto de inhibitorio de la alta presión hidrostática depende en gran medida de la composición
del alimento. Sabemos que factores externos se pueden ajustar para reducir la resistencia de
los microorganismos a la presión. Varios componentes de los alimentos, como proteínas,
azúcares y lípidos, pueden proporcionar un efecto protector al microorganismo, al reducir la
sensibilidad de este cuando ocurre la despresurización y aumentando su resistencia a la
presión (Huang et al., 2014).
Fig. 15. Recuento del crecimiento de B. cinerea en un jugo de uva concentrado (JUC)
evaluado en día 0 y después de 35 días de almacenamiento refrigerado a 4 ºC. Todos los
valores representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes con
al menos tres repeticiones cada uno. Letras diferentes indican diferencias significativas (p
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0.1 MPa 200 MPa/2min
200 MPa/4min
300 MPa/2min
300 MPa/4min
400 MPa/2min
400 MPa/4min
Rec
uent
o B.
cin
erea
en
un J
UC
(ufc
/mL)
Día 0 Día 35
a
e
d
cdbcd
bcb
ABC C CDC
BA
lii
<0.05) entre tratamientos de APH, ausencia de letras indica que no existen diferencias
significativas entre tratamientos de APH.
Se ha demostrado que altas concentraciones de sacarosa pueden proteger las esporas
de Bacillus cereus del efecto de APH. Murchie et al., (2005) compararon los efectos de la
pasteurización en ostras y una solución tampón. Los autores concluyeron que los alimentos
sólidos brindan mayor protección a las células microbianas que los alimentos líquidos (Tassou
et al., 2007). Con respecto al día 35 de almacenamiento, observamos que nuestros resultados
presentan una disminución significativa en el recuento de conidias en todas las muestras
evaluadas en comparación con el día 0, esta diminución se asocia con las condiciones de aw
(0.769) y la elevada concentración de azúcar (64 ºBrix) en el JUC. Por lo general, los valores
óptimos de aw para el crecimiento de Botrytis oscilan entre 0.981 y 0.987 (Lahlali et al., 2007).
Mientras que una aw por debajo de 0.94, reduce severamente la germinación de B. cinerea.
Esta reducción es mayor en medios modificados con cloruro de sodio que en medios
modificados con sacarosa. Rousseau and Donèche, (2014) describieron que a una aw de 0.93
en un medio modificado con sacarosa, la inhibición en Botrytis es solo del 30%. En nuestro
estudio B. cinerea sobrevivió después de 35 días de almacenamiento refrigerado. El recuento
en la muestra control fue >103 ufc/mL de JUC, mientras que en promedio las muestras tratadas
tuvieron un recuento <103 ufc/mL. De acuerdo con el Reglamento Sanitario de los Alimentos,
el límite máximo por mL permitido es de 103, por lo tanto, en día 35 el crecimiento de B.
cinerea no fue significativo, demostrando que el hongo pierde viabilidad no solo por el
tratamiento de presurización, además, probablemente por la composición del JUC.
liii
Sección 3: Determinación de parámetros fisicoquímicos y compuestos antioxidantes de
un jugo de uva 64 ºBrix tratado mediante alta presión hidrostática
9.4. Caracterización proximal del jugo de uva 64 ºBrix
Para caracterizar la materia prima se realizó un análisis de proximal y físico químico
del JUC que se encontraba inoculado con B. cinerea (1x104 conidias/mL). Los resultados
muestran un contenido de humedad inicial de 30.7 ± 0.06% JUC, proteína 0.28 ± 0.03% JUC,
lípidos totales de 0.16 ± 0.03 % de JUC, ceniza bruta de 0.77 ± 0.02% de JUC, y los
carbohidratos disponibles (diferencia) de 65.54 ± 0.37% de JUC, acidez de 0.58 ± 0.02% de
ácido tartárico, pH de 4.03 ± 0.02 y contenido de sólidos solubles de 63.8 ± 0.29 °Brix. Estos
valores fueron similares a los reportados en la literatura (Granato et al., 2016; Lilva et al.,
1993; Sani, 2013).
9.4.1. Efecto de la alta presión sobre características fisicoquímicos y parámetros cromáticos
en un JUC
Los resultados de pH, % de acidez y sólidos solubles de las muestras control (0.1 MPa)
y las muestras tratadas con alta presión, inmediatamente después del proceso (día 0) y después
de 35 días de almacenamiento refrigerado se presentan en la Tabla 4. Los datos presentados
en este estudio se encuentran dentro del rango de resultados mostrados en la literatura
(Samoticha et al., 2017). Se observó diferencias significativas (p <0.05) en la medición del
pH en relación con 0.1 MPa y todas las muestras tratadas con alta presión hidrostática,
variaciones en el valor de pH pueden deberse a cambios conformacionales asociados con el
despliegue y la desnaturalización de proteínas (Kaur et al., 2013). Valores de acidez y sólidos
solubles de las muestras control no presentaron diferencias significativas con las muestras
presurizadas de jugo de uva, similar comportamiento se observó en uchuva y pulpa de uchuva
(Physalis peruviana L.) (Briones-Labarca et al., 2013; Torres-Ossandón et al., 2015b).
Después de 35 días de almacenamiento los sólidos solubles aumentaron significativamente en
comparación con el día 0, sin embargo, entre tratamientos incluida la muestra control no se
observaron diferencias significativas (día 35), similar comportamiento se observó a partir de
200 MPa/4 min en los resultados de acidez, mientras que los valores de pH disminuyeron
significativamente (p <0.05) en día 35.
liv
Tabla 5. Parámetros fisicoquímicos del JUC inmediatamente después de APH (día 0) y después del almacenamiento (día 35)
Tratamiento Análisis Físicoquímico
Día 0 Sólidos solubles
(°Brix) pH* Acidez
0.1 MPa 63.8 ± 0.29 4.03 ± 0.02a 0.58 ± 0.02
200 MPa/2 min 64.2 ± 0.29 3.98 ± 0.01b 0.57 ± 0.01
200 MPa/4 min 64.0 ± 0.00 3.98 ± 0.01b 0.57 ± 0.01
300 MPa/2 min 64.3 ± 0.29 4.00 ± 0.01c 0.58 ± 0.02
300 MPa/4 min 64.0 ± 0.00 4.03 ± 0.01d 0.61 ± 0.01
400 MPa/2 min 64.5 ± 0.00 4.01 ± 0.01e 0.58 ± 0.01
400 MPa/4 min 64.2 ± 0.29 3.95 ± 0.01f 0.58 ± 0.02
Día 35
0.1 MPa 66.0 ± 0.29 3.90 ± 0.01a 0.57 ± 0.02
200 MPa/2 min 66.5 ± 0.00 3.75 ± 0.01b 0.59 ± 0.07
200 MPa/4 min 66.0 ± 0.00 3.78 ± 0.02c 0.63 ± 0.02
300 MPa/2 min 66.0 ± 0.00 3.79 ± 0.01cd 0.62 ± 0.01
300 MPa/4 min 66.2 ± 0.29 3.81 ± 0.01de 0.59 ± 0.09
400 MPa/2 min 66.3 ± 0.29 3.81 ± 0.01ef 0.68 ± 0.09
400 MPa/4 min 66.0 ± 0.00 3.83 ± 0.01f 0.67 ± 0.10
adimensional
*Porcentaje de acido tartárico. Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0.05) entre
tratamientos de APH, ausencia de letras indica que no existen diferencias significativas entre tratamientos
de APH
Los atributos de color del jugo de uva 64 ºBrix fresco (0.1 MPa), tratado por APH en
día 0 y después de 35 días de almacenamiento se presentan en la Tabla 6. Los parámetros
cromáticos del jugo en la muestra control (0.1 MPa) fueron L* (47.48 ± 0.19), a* (13.42 ±
0.16) y b* (49.98 ± 0.09). Al analizar el efecto inmediato de los diferentes tratamientos de
presión sobre el color, se observan las diferencias significativas en los tres parámetros
cromáticos con respecto a la muestra de control (p <0.05), el valor mínimo de ∆E se obtuvo a
200 MPa/2 min. Con respecto al efecto de la presión en ∆E después del almacenamiento de
35 días, solo el parámetro L* redujo sus valores, lo que indica una disminución en la
luminosidad del jugo. Dependiendo del valor de ΔE, la diferencia de color entre las muestras
lv
tratadas y no tratadas pueden estimarse como no notables (0–0.5), ligeramente perceptibles
(0.5–1.5), perceptibles (1.5–3.0), bien visibles (3.0–6.0) y grandes (6.0–12.0) (Cserhalmi et
al., 2006).
Tabla 6. Cambios en los parámetros cromáticos (L*, a*, b*) y ∆E en un JUC tratado por APH en día 0 y después de 35 días de almacenamiento a 4ºC
Tratamiento L* a* b* ∆E Día 0
0.1 MPa 47.48 ± 0.19ª 13.42 ± 0.16ª 49.98 ± 0.09ª 0.0 ± 0.0
200 MPa/2 min 47.76 ± 0.28ª 14.63 ± 0.15b 49.98 ± 0.32ª 1.29 ± 0.07ª
200 MPa/4 min 43.31 ± 0.14be 15.73 ± 0.27c 54.79 ± 0.22b 6.78 ± 0.18b
300 MPa/2 min 44.53 ± 0.30c 16.07 ± 0.30d 52.94 ± 0.69cd 4.96 ± 0.62cd
300 MPa/4 min 44.14 ± 0.53cd 15.69 ± 0.29c 51.57 ± 2.32c 4.92 ± 1.09d
400 MPa/2 min 43.29 ± 0.49de 16.43 ± 0.34de 53.14 ± 0.39d 5.93 ± 0.55b
400 MPa/4 min 42.63 ± 0.28b 16.10 ± 0.59ce 51.65 ± 0.73cd 6.05 ± 0.43bc
Día 35
0.1 MPa 42.89 ± 0.47ª 15.57 ± 0.27ª 54.18 ± 0.42ac 6.61 ± 0.18ª
200 MPa/2 min 44.97 ± 0.62ab 18.39 ± 0.07b 61.71 ± 0.34b 13.39 ± 0.70b
200 MPa/4 min 47.29 ± 0.51abc 19.20 ± 0.47ac 63.36 ± 0.80c 12.57 ± 1.11b
300 MPa/2 min 50.56 ± 0.26c 18.12 ± 0.49c 58.84 ± 1.04ª 10.50 ± 1.12c
300 MPa/4 min 50.67 ± 0.64c 17.85 ± 0.36ac 58.46 ± 0.54ª 10.11 ± 0.45c
400 MPa/2 min 49.43 ± 0.13bc 15.61 ± 0.30c 54.44 ± 0.54ac 5.35 ± 0.39d
400 MPa/4 min 48.79 ± 0.40bc 16.65 ± 0.20c 54.13 ± 0.55ac 5.45 ± 0.32d
Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0.05) entre tratamientos de APH, ausencia de letras
indica que no existen diferencias significativas entre tratamientos de APH
En este estudio se observaron significativos cambios de color en todas las muestras
presurizadas, por lo tanto, los diferentes tratamientos afectaron los parámetros cromáticos
inmediatamente después de aplicar el tratamiento APH y después de 35 días de
almacenamiento, la diferencia fue mayor en los tratamientos desde 200 MPa/2 min a 300
MPa/4 min. Los parámetros a* y b* aumentaron significativamente sus valores en todos los
niveles de presión aplicados, lo que indica un aumento de color rojo y amarillo en el jugo de
uva, respectivamente Estos cambios indicaron que el color del jugo se intensifico, y perdió
luminosidad. Entre los dos parámetros cromáticos, a* y b*, la variación del valor a* es más
representativa con respecto al impacto del proceso en la apariencia de la muestra, debido a
lvi
que nos puede proporcionar información importante sobre el contenido de los pigmentos
naturales presentes en el jugo de uva 64 ºBrix.
9.4.2. Efecto de la Alta Presión Hidrostática sobre los Azúcares presentes en un JUC
Los azúcares son importantes indicadores sensoriales en la percepción del
consumidor, el contenido de azúcar de los productos generalmente se evalúa en términos de
sólidos solubles totales (SST), azúcar total y azúcares reductores. La glucosa y fructosa son
azúcares reductores simples que se encuentran en muchos alimentos. En este contexto, los
principales metabolitos primarios encontrados en las uvas y jugos son la glucosa y fructosa
(Eyduran et al., 2015). En el día 0, el análisis de azúcares medidos mediante HPLC, mostró
que la glucosa y fructosa eran los azúcares dominantes en el jugo de uva 64 ºBrix, además, se
observó presencia de sacarosa que no era significativamente cuantificable. El contenido de
glucosa y fructosa encontrado en el JUC no presurizado (0.1 MPa) fue de 342.11 ± 10.70 y
227.5 ± 8.3 mg/mL, respectivamente (Tabla 6). En general los resultados de azúcares
mostrados en la literatura tienen un contenido de sólidos solubles de 13 ºBrix a 16 ºBrix, por
lo tanto, para comparar nuestros resultados con datos presentados en la literatura, se muestran
valores de glucosa y fructosa del jugo de uva a 16 ºBrix. Se observó un contenido de 70.9 ±
2.2 mg/mL de glucosa y 47.2 ± 1.7 mg/mL de fructosa. Resultados similares fueron reportados
por Coelho et al., (2018) en jugo de uva de la variedad Isabel Precoce BRS Violeta con 108.1
mg/mL de glucosa y 92.9 mg/mL de fructosa y la variedad Isabel Precoce BRS Cora presentó
86.6 mg/mL de glucosa y 76.4 mg/mL de fructosa, ambas variedades pertenecen a la especie
Vitis labrusca L. Otro grupo de autores, Liu et al., (2006), informaron que jugos uva de V.
vinífera L. mostraron 70.2 y 73.1 mg/mL de glucosa y fructosa respectivamente en la
temporada 2003, mientras que en la temporada 2004 presentaron 72.8 mg/mL de glucosa y
74.7 mg/mL de fructosa (Liu et al., 2006). Los cambios en los azúcares inmediatamente
después del tratamiento de alta presión se presentan en la Tabla 7. En el día 0, se observó un
cambio significativo en el contenido de fructosa en el jugo de uva presurizado (p<0.05), en
comparación con la muestra control (0.1 MPa). Similar tendencia se observó en el contenido
de glucosa. Podemos observar que la proporción de glucosa/fructosa fue mayor en el día 0,
usualmente las uvas, y en consecuencia los jugos, contienen cantidades similares de fructosa
y glucosa en un rango entre 160 y 300 mg/mL de azúcares totales (Fleet y Heard, 1993). Sin
lvii
embargo, se ha descrito recientemente un aumento en la proporción de fructosa con respecto
a la glucosa en uvas (Jones et al., 2005), principalmente debido a cambios climáticos
(Tronchoni et al. 2009). Después de 30 días de almacenamiento refrigerado a 4 ± 1 ºC, las
muestras de JUC mostraron una disminución significativa (p<0.05) en el contenido de glucosa
y fructosa entre las muestras tratadas y las muestras control. En la literatura resultados de
estudios sobre cambios en los azúcares después de diferentes tratamientos de alta presión no
siempre son consistentes. Vervoort et al. (2012) informaron que la alta presión causó una
reducción significativa en la concentración de todos los azúcares (incluida sacarosa, glucosa
y fructosa) en zanahoria. Además, Liu et al., (2014) observaron una reducción de la fructosa
y la glucosa en néctar de mango, después de presurizar a 600 MPa/1 min, atribuyendo esta
disminución a la reacción de Maillard durante el tratamiento de presurización. Mientras que
Ahmed et al. (2005) y Butz et al., (2003) concluyeron que tratamientos de alta presión, no
alteraron significativamente la composición de los azúcares (sacarosa, glucosa y fructosa)
presentes en diferentes jugos de frutas. Sin embargo, durante el tiempo almacenamiento, Butz
et al., (2003) encontraron una desaparición completa de la sacarosa en muestras de jugo de
frambuesas. Por otro lado, autores han reportado acerca de un aumento de los azúcares
después del tratamiento de APH; Ghafoor et al., (2012) informaron que el ginseng rojo tratado
a 600 MPa/1 min, mostró azúcares reductores significativamente mayores después del
tratamiento. Torres-Ossandón et al., 2015 mostraron que la presurización en la pulpa de
uchuva (Physalis Peruviana L.) produjo un aumento significativo de la fructosa y glucosa a
300–500 MPa, en día 0 y en el almacenamiento. Zheng et al., (2014) reportaron que la
proporción de glucosa, fructosa y el contenido de sacarosa mostró un cambio significativo en
jugo de lichí (Litchi chinensis Sonn) cuando se presurizo a 500 MPa/2 min, por lo tanto,
posiblemente el tratamiento de alta presión puede inducir una transformación recíproca de los
azúcares. Algunas enzimas (por ejemplo, invertasa) presentes en las células de
microorganismos presentes en la matriz alimentaria pueden estar relacionadas con la
transformación recíproca de los azúcares durante el tratamiento de APH (Tronchoni et al.,
2009) (Keenan et al., 2012; Martínez-Rodríguez et al., 2014, Zheng et al., (2014). La invertasa
es una enzima altamente eficiente y específica que convierte la sacarosa en glucosa y fructosa
(Akgol, et al., 2001). Se ha descrito que el procesamiento de APH puede generar pérdida de
actividad en las enzimas, debido a cambios conformacionales en la estructura de las proteínas.
lviii
Sin embargo, si las reacciones enzimáticas tienen un cambio de volumen negativo durante la
presurización, la velocidad catalítica de estas reacciones puede aumentar. Además, la
descomposición parcial inducida por la presión podría liberar enzimas intracelulares y
aumentar las interacciones del sustrato enzimático (Ludikhuyze et al., 2003; Rastogi et al.,
2007).
Tabla 7. Contenido de fructosa y glucosa en un JUC tratrado por APH
Frucosa mg/mL Glucosa mg/mL
Tratamiento Día 0 Día 35 Día 0 Día 35
0.1 MPa 227.5 ± 8.3ac 270.3 ± 23.5ac 342.1 ± 10.7ba 286.8 ± 20.4a
200 MPa/2 min 221.5 ± 4.0a 185.5 ± 18.7b 344.8 ± 4.2b 185.2 ± 13.2b
200 MPa/4 min 261.0 ± 12.8bd 261.0 ± 12.1c 321.5 ± 15.4a 292.7 ± 11.5a
300 MPa/2 min 241.6 ± 27.1bc 300.7 ± 19.7e 362.3 ± 13.1cb 241.4 ± 10.9c
300 MPa/4 min 279.3 ± 10.5de 288.7 ± 24.1ca 374.6 ± 9.1c 287.1 ± 21.0a
400 MPa/2 min 297.9 ± 19.4e 224.8 ± 3.5d 362.2 ± 7.5cb 183.3 ± 13.9b
400 MPa/4 min 261.9 ± 6.5d 201.0 ± 28.7db 367.6 ± 18.6c 188.0 ± 9.8b
Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0.05) entre tratamientos de APH, ausencia de letras
indica que no existen diferencias significativas entre tratamientos de APH
Cuando se analizan los resultados con respecto al día 30, podemos ver que el contenido
de fructosa no se vio significativamente afectado por el tiempo de almacenamiento (p <0.05).
En contraste, el contenido de glucosa presentó una disminución significativa (p <0.05)
después de 30 días de almacenamiento. Es importante considerar las condiciones de
almacenamiento, debido a que hay reportes que observaron una disminución de la sacarosa y
el azúcar total en néctares de mango presurizados y almacenados durante 16 semanas a 4 y 25
°C, mientras que la fructosa y la glucosa aumentaron significativamente. Kimura et al. (1994)
informaron que la proporción de sacarosa residual en mermelada de fresa tratada con APH
(400–500 MPa/10–30 min) disminuyó a 0% a 25 °C durante 30 días de almacenamiento y
disminuyó a 10% a 0 °C durante el almacenamiento de 60 días. Butz et al. (2003) también
encontraron una desaparición completa de la sacarosa en puré de frambuesas tratado a 600
MPa/6 min, durante el almacenamiento 30 días a 4 °C, y solo el tratamiento de 800 MPa
permitió niveles de sacarosa residuales considerables después del almacenamiento. Por lo
tanto, dos reacciones químicas de los azúcares podrían ocurrir en los productos alimenticios
durante el almacenamiento, la reacción de inversión de la sacarosa y la reacción de Maillard
(Wang et al., 2006).
lix
9.4.3. Efecto del tratamiento de presurización sobre los compuestos antioxidantes presentes
en un JUC
Los resultados de la actividad antioxidante de un JUC presurizado, se muestra en la
Tabla 8. inmediatamente después de presurizar día 0 y después de 35 días de almacenamiento,
las muestras en estudio se midieron a través del método de eliminación de radicales libres
(DPPH) y el método basado en la eliminación de la capacidad de absorción de radicales de
oxígeno (ORAC). Los resultados de la actividad antioxidante en las muestras control (0.1
MPa) en día 0, de acuerdo con el método ORAC fue de 8803 µmol TE/100 mL JUC, mientras
que con el ensayo de DPPH se reportó 853 µmol TE/100 mL JUC. Las variaciones en los
resultados obtenidos a partir de estos ensayos pueden indicar una diferencia relativa en la
capacidad de los compuestos antioxidantes para inactivar radicales peroxil. Con respecto a
estos resultados, datos similares han sido reportado en la literatura (Lima et al., 2015;
Samoticha et al., 2017). Sin embargo se debe considerar que la actividad antioxidante de los
productos derivados de la uva puede variar, debido a su contenido y composición fenólica, los
cuales están influenciados por la cosecha, variedad de uva y condiciones climáticas, entre
otros (Dávalos et al., 2005). Otra consideración que se debe tener cuando se evalúa el efecto
de la presión sobre la actividad antioxidante es el método utilizado para su medición y el tipo
de matriz en estudio, debido a que la respuesta antioxidante variará con el tipo de alimento en
estudio (Vega-Gálvez et al., 2014).
Al analizar los resultados de los tratamientos en el día 0, se observó que la alta presión
tiene un efecto considerable sobre la actividad antioxidante, mostrando un aumento
significativo (p<0.05) a partir de 300 MPa/ 2 min de acuerdo con método ORAC, estos
resultados concuerdan con investigaciones previas donde se estudió el efecto de la presión
sobre la capacidad antioxidante en purés de tomate, zanahoria y mora; jugos de naranja y
granada (Patras et al., 2009; Varela-Santos et al., 2012). Por otro lado, los resultados obtenidos
mediante el método DPPH indican que el proceso de alta presión provocó una disminución
significativa en la actividad antioxidante con respecto a la muestra control (0.1 MPa). En
general los resultados de actividad antioxidante presentados en esta investigación son
respaldados por diferentes autores que han trabajado en jugos de frutas. Fernández García et
al., (2000) demostraron que tratamientos de 600 MPa/60°C/30 min solo afectaron ligeramente
la capacidad antioxidante de un jugo de manzana (determinada como valor TEAC), mientras
lx
que Sánchez-Moreno et al., (2006) indicaron que la actividad antioxidante medida en un puré
de tomate (determinada con método DPPH) no se vio afectada por un tratamiento de 400
MPa/25°C/15 min, los autores concluyeron que para los alimentos semisólidos, el tratamiento
de alta presión podría es un mejor tratamiento de conservación para compuestos antioxidantes,
debido a que previene la degradación derivada de la aplicación de altas temperaturas, como
se observa en tratamientos térmicos tradicionales (pasteurización/esterilización) (Ferrari et al.,
2011). En la literatura actual, se presentan diferentes reportes científicos sobre la estabilidad
de la actividad y los compuestos antioxidantes tratados por APH. Ferrari et al., (2010)
informaron que compuestos antioxidantes como antocianinas y polifenoles presentes en un
jugo de granada disminuyeron sus concentraciones con la intensidad del tratamiento, en
términos de nivel de presión y tiempo de procesamiento. Por lo tanto, niveles de presión más
altos como tiempos de procesamiento más largos causan una disminución del contenido de
antocianinas (Ferrari et al., 2011). En contraste, algunos autores han reportado que los
antioxidantes presentes en alimentos líquidos o semisólidos tienen un comportamiento
estable; vale decir, el procesamiento de alta presión aumenta o no afecta a la actividad
antioxidante de estos alimentos.
Tabla 8. Capacidad antioxidante de un JUC tratado por APH evaluado en día 0 y después de 35 días almacenamiento a 4 ºC
ORAµmol ET/100 mL JUC DPPH µmol ET/100 mL JUC
Tratamiento Día 0 Día 35 Día 0 Día 35
0.1 MPa 8504.7 ± 532.1a 2519.7 ± 201.6ae 853 ± 5.0a 587 ± 7.0a
200 MPa/2 min 5756.7 ± 84.5b 2270.5 ± 70.6b 620 ± 11.9b 572 ± 11.1a
200 MPa/4 min 5936.1 ± 69.4c 2911.7 ± 50.3c 600 ± 10.9c 537 ± 10.0b
300 MPa/2 min 7109.8 ± 107.7d 2354.4 ± 84.9ab 633 ± 7.2d 624 ± 5.7c
300 MPa/4 min 6336.7 ± 62.5e 2612.6 ± 105.4d 657 ± 8.0d 689 ± 36.1d
400 MPa/2 min 6703.7 ± 105.6f 2335.2 ± 122.1ab 670 ± 13.9e 705 ± 14.7d
400 MPa/4 min 7254.0 ± 66.4g 2554.5 ± 109.4de 666 ± 12.1f 695 ± 29.7d
Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0.05) entre tratamientos de APH, ausencia de letras
indica que no existen diferencias significativas entre tratamientos de APH
Se ha descrito que la capacidad antioxidante aumenta inmediatamente después del
tratamiento, demostrando que la presión permite una mejor extracción de los diferentes
lxi
compuestos polifenólicos, atribuyendo el aumento a la liberación de algunos componentes
antioxidantes provenientes de partículas sólidas suspendidas después de la presurización
(Ferrari et al., 2011; Patras et al., 2009). La actividad antioxidante fue significativamente
mayor (p <0.05) en el día 0 versus el día 35, lo que puede estar relacionado con la estabilidad
en los compuestos antioxidantes debido a la alta presión, como se mencionó antes, APH puede
mantener los compuestos antioxidantes según el nivel de presión y el tiempo de
mantenimiento (Di Scala et al., 2013). Se observaron tendencias similares en nuestros
resultados con datos publicados por Varela-Santos et al., (2012) en jugo de granada
presurizado y almacenado durante 35 días a 4 ºC, al igual que Barba et al., (2012) en jugo de
arándanos.
9.4.4. Efecto de la alta presión sobre la composición fenólica, polifenoles, flavonoides y
antocianinas totales de un JUC
La influencia de los diferentes tratamientos de presión sobre el contenido total de
flavonoides y pelifenoles en el JUC se muestra en la Tabla 9. Los valores de antocianinas
totales en el día 0 oscilaron entre 0.0125 ± 0.0004 mg/100 mL de JUC en la muestra control
(0.1 MPa), mientras que en las muestras presurizadas disminuyó significativamente, variando
de 0.004 a 0.007 mg/m JUC, en el día 35 el contenido de antocianinas disminuyó mas del 50%
en comparación con los resultados obtenidos en el día 0. La respuesta en el bajo contenido de
antocianinas totales observada en este estudio coincide con estudios presentados por
diferentes autores (Bermúdez-Soto and Tomás-Barberán, 2004; Lutz et al., 2011; Moreno-
Motero et al., 2015). Las antocianinas son un grupo de pigmentos con importantes propiedades
antioxidantes que determinan el color rojo en bayas de frutas. Por lo tanto, el color de la matriz
en este estudio nos permite comprender el bajo contenido de antocianinas observado, con
respecto al efecto de la presión como se mencionó antes, APH puede afectar el contenido
antocianinas, Ferrari et al., (2010) demostraron que los niveles de presión (400,500 y 600
MPa/5 min) aplicados en jugo de granada, no permitieron una inactivación irreversible de las
enzimas involucradas en la degradación de los pigmentos naturales. Por lo tanto, la actividad
residual de las enzimas junto con una pequeña concentración de oxígeno disuelto podría
causar la degradación de las antocianinas durante el almacenamiento del jugo procesado
(Zabetakis et al., 2000; Suthanthangjai et al., 2005).
lxii
Con respecto a resultados de flavonoides totales en jugos de uva reportados en la
literatura, los valores varían entre 6.72 mg EC/100 mL en jugos de uva blanca y 9.8 mg
EC/100 mL en jugos de uva roja. Mientras que en fenoles totales por Folin-Ciocalteu los
resultados oscilaron entre 12.6 mg EAG/100 mL para jugos de uva blanca y 172.8 mg
EAG/100 mL en jugo de uva roja (Moreno-Montoro et al., 2015). En día 0 nuestros resultados
mostraron que el contenido de flavonoides totales en la muestra control (0.1 MPa) fue de
99.44 ± 6.69 mg EQ/100 mL JUC. Al analizar el efecto inmediato de la presión en las muestras
de jugo de uva, se puede observar que algunos tratamientos aumentaron mientras que otros
redujeron el contenido inicial de flavonoides (P <0.05). El máximo de mg EQ/100 mL de JUC
se observó a 200/MPa/2 min. Sin embargo, este aumento no fue significativo con respecto a
la muestra control. Sobre la base de estos resultados, se puede concluir que el tratamiento con
APH mantiene los compuestos flavonoides presentes el jugo de uva. Similar tendencia se
observó para fenoles totales, donde la concentración media de polifenoles totales fue mayor
en las muestras presurizadas que en la muestra control.
Tabla 9. Compuestos fenólicos y flavonoides totales en un JUC
Flavonoides (mg EQ/100 mL) Folin-Ciocalteu (mg EAG/100 mL)
Tratamiento Día 0 Día 35 Día 0 Día 35
0.1 MPa 99.44 ± 6.49ad 117.86 ± 3.35a 268.6 ± 9.15a 360.6 ± 23.07a
200 MPa/2 min 102.34 ± 3.16a 110.36 ± 2.26b 416.6 ± 18.20b 326.0 ± 9.44bf
200 MPa/4 min 99.56 ± 3.15a 109.00 ± 2.65b 344.9 ± 2.46c 302.4 ± 16.33bc
300 MPa/2 min 83.76 ± 3.00b 109.57 ± 2.11b 304.1 ± 26.04d 290.0 ± 15.09cd
300 MPa/4 min 94.27 ± 1.40cd 112.98 ± 3.29b 305.7 ± 17.85d 395.7 ± 20.56e
400 MPa/2 min 99.22 ± 3.61ad 110.14 ± 3.74b 320.1 ± 11.97dc 336.5 ± 7.70af
400 MPa/4 min 91.60 ± 1.36c 110.70 ± 3.18b 427.0 ± 11.00b 271.5 ± 11.82d
Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0.05) entre tratamientos de APH, ausencia de letras
indica que no existen diferencias significativas entre tratamientos de APH
Se ha descrito que los fenoles parecían ser relativamente resistentes a la presión, de acuerdo
con Barba, Esteve, & Frigola, (2013) los fenoles totales presentes en jugos de arándanos
aumentaron significativamente (13-27%) después de 200 MPa durante 5-15 minutos y 24%
después de 400 MPa durante 15 minutos. Varela-Santos et al., (2012), observaron en jugo de
granada un aumento en el contenido de fenoles totales, entre 3.38% y 11.99% en muestras
tratadas a 350 MPa y 550 MPa, respectivamente, en comparación con la muestra no tratadas
lxiii
en el día 0, similar respuesta en el contenido total de polifenoles observaron Ferrari et al.
(2010) en jugo de granada y Corrales et al., (2008) en subproductos de uva, relacionando este
aumento con una mayor capacidad de extracción de algunos de los componentes antioxidantes
después del procesamiento a alta presión (Cao et al., 2011). En día 35, el contenido de
flavonoides totales en las muestras tratadas presentó un aumento significativo en comparación
con la muestra control (0.1 MPa). Por otro lado, en general la aplicación de APH redujo el
contenido de polifenoles totales (p<0.05), observando un aumento significativo solo a 300
MPa/ 4 min. En su estudio de almacenamiento, Varela-Santos et al., (2012), mostraron un
aumento de los polifenoles totales en jugo de granada presurizado en los primeros días de
almacenamiento, sin embargo, después de 7 días de almacenamiento este contenido
disminuyó y se mantuvo constante hasta el final del periodo, mientras que las muestras de
jugo de granada no tratadas disminuyeron significativamente durante el almacenamiento.
Como se ha descrito por diferentes autores los principales compuestos fenólicos en las
uvas son los ácidos hidroxibenzoicos (por ejemplo, gálicos), los ácidos hidroxicinámicos (por
ejemplo, cafeico) y los derivados del estilbeno (por ejemplo, resveratrol), mientras que los
flavonoides incluyen antocianinas, flavan-3-ols (por ejemplo, catequina, procianidinas) y
flavonoles (por ejemplo, quercetina) (Lutz et al., 2011). En nuestro estudio se identificaron
ocho especies fenólicas; ácido galico, ácido protocatecuico, ácido vanílico, ácido cafeico, p-
cumarico, tyrosol, ácido ferúlico y ácido elagico, además de dos flavonoides; catequina y
quercitina. La composición fenólica del jugo de uva 64 ºBrix se muestra en la Tabla 10. En
general, nuestros resultados se encuentran respaldados por diferentes trabajos científicos
(Lima et al., 2015; Moreno-Montoro et al., 2015; Silva et al., 2018). Sin embargo, es
importante considerar varios factores que ejercen influencia sobre la composición fenólica de
los jugos de uva, entre ellos el método de elaboración y conservación (Silva et al., 2018). Los
compuestos fenólicos que presentaron una mayor concentración fueron tirosol, catequina,
ácido protocatecuico y ácido gálico. En su estudio Moreno-Montero et al., (2015) demostraron
que la concentración de diferentes compuestos fenólicos fue significativamente mayor en los
jugos de uva blanca en comparación con jugos de uva roja, esta diferencia fue mayor en el
ácido m-hidroxibenzoico y el ácido p-cumárico.
Cuando se analiza el efecto de la presión sobre los compuestos fenólicos encontrados
en el jugo de uva, observamos que en general no se existen diferencias significativas (p <0.01)
lxiv
con la muestra control (0.1 MPa), sin embargo, el ácido p-cumárico y tyrosol, que presentaron
una disminución significativa (p <0.01) en los tratamientos a partir de 300 MPa/2 min. En
contraste a este comportamiento se observó un aumento en la concentración de ácido
protocatecuico y catequina. Este comportamiento en los resultados tiene directa relación con
el aumento de los polifenoles totales mostrados anteriormente, como se mencionó antes la alta
presión permite una mayor capacidad de extracción de algunos de los componentes
antioxidantes (Patras et al., 2009). Se observó que el perfil de compuestos fenólicos después
de 35 días de almacenamiento se conservó completo, todos fenoles presentes en el día 0 se
encontraron en día 35. En general, los resultados de las muestras tratadas mediante APH no
presentaron una disminución significativa (p<0.01), por el contrario, se observó un aumento
a partir de 300 MPa/4 min. Al igual que en día 0, este comportamiento en los datos se relaciona
con los resultados de polifenoles y particularmente de flavonoides totales presentados
anteriormente, donde se mostró un aumento cercano al 15% en las muestras presurizadas en
el día 35. En diferentes estudios se han mostrado los resultados de compuestos bioactivos
sometidos a tratamientos de alta presión, demostrando un aumento de estas sustancias
bioactivas cuantificables, debido principalmente a la ruptura celular y la desnaturalización de
proteínas agregadas a estos compuestos, es decir, el proceso de alta presión aumenta la
extracción y exposición molecular. Sin embargo, este aumento podría no correlacionarse con
la biodisponibilidad de estas sustancias. Además, la estabilidad de estos compuestos podría
reducirse cuando se compara con la estabilidad de un jugo sin procesar debido a la pérdida de
su barrera física (estructura celular) (Augusto et al., 2018). Por otro lado, otros autores indican
que la preservación de los compuestos bioactivos mediante alta presión es similar a los
productos frescos. Por lo tanto, la discrepancia entre los resultados puede atribuirse a la falta
de homogeneidad entre los procedimientos y los métodos utilizados para medir la presencia
residual de estos compuestos. La diversidad de la matriz alimentaria y la concentración de
compuestos bioactivos también son responsables de la variedad en los resultados descritos en
la literatura científica
lxv
Tabla 10. Perfil de compuestos fenólicos (mg/mL) en un JUC tratado mediante alta presión hidrostática (día 0 y 35)
Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0.01) entre tratamientos de APH, ausencia de letras indica que no existen diferencias significativas
entre tratamientos de APH
1
Tratamientos Día 0 0.1 MPa 200 MPa/2 min 200 MPa/4 min 300 MPa/2 min 300 MPa/4 min 400 MPa/2 min 400 MPa/4 min Ácido Gálico 0.12 ± 0.00a 0.12 ± 0.01a 0.12 ± 0.00a 0.12 ± 0.02a 0.12 ± 0.01a 0.11 ± 0.01a 0.11 ± 0.01a Ácido Protocatecuico 0.15 ± 0.01a 0.20 ± 0.03b 0.17 ± 0.00ab 0.16 ± 0.01ab 0.16 ± 0.01ab 0.17 ± 0.02ab 0.16 ± 0.01ab Ácido Vanilico 0.05 ± 0.00a 0.06 ± 0.01b 0.05 ± 0.00a 0.04 ± 0.00a 0.04 ± 0.00a 0.05 ± 0.00a 0.04 ± 0.00a Ácido Cafeico 0.05 ± 0.00ab 0.05 ± 0.01a 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.00ab 0.05 ± 0.00ab 0.05 ± 0.00ab 0.04 ± 0.00b Ácido p-coumarico 0.07 ± 0.00ab 0.08 ± 0.01a 0.07 ± 0.00ab 0.06 ± 0.00ab 0.06 ± 0.00b 0.07 ± 0.00ab 0.06 ± 0.01b Tirosol 0.48 ± 0.03a 0.51 ± 0.03a 0.42 ± 0.00b 0.40 ± 0.01b 0.41 ± 0.01b 0.41 ± 0.02b 0.38 ± 0.02b Ácido Ferulico 0.05 ± 0.00a 0.07 ± 0.01b 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.00a 0.04 ± 0.00a Ácido Elágico 0.05 ± 0.00ab 0.06 ± 0.00a 0.05 ± 0.00ab 0.05 ± 0.00ab 0.05 ± 0.00ab 0.05 ± 0.00ab 0.05 ± 0.00b Catequina 0.42 ± 0.01a 0.50 ± 0.05b 0.53 ± 0.04b 0.53 ± 0.05b 0.55 ± 0.05b 0.55 ± 0.07b 0.52 ± 0.03ab Quercetina 0.10 ± 0.00a 0.14 ± 0.02b 0.13 ± 0.01ab 0.11 ± 0.00ab 0.11 ± 0.00a 0.12 ± 0.01ab 0.12 ± 0.01ab Día 35 Ácido Gálico 0.05 ± 0.00a 0.06 ± 0.01a 0.06 ± 0.00a 0.14 ± 0.01b 0.16 ± 0.01bc 0.18 ± 0.01d 0.16 ± 0.01cd Ácido Protocatecuico 0.18 ± 0.02ab 0.22 ± 0.03a 0.20 ± 0.01ab 0.17 ± 0.01b 0.19 ± 0.01ab 0.20 ± 0.03ab 0.19 ± 0.01ab Ácido Vanilico 0.06 ± 0.01ab 0.08 ± 0.01b 0.07 ± 0.01abc 0.05 ± 0.00ac 0.09 ± 0.01c 0.09 ± 0.01c 0.09 ± 0.01c Ácido Cafeico 0.05 ± 0.01ac 0.07 ± 0.00b 0.05 ± 0.00c 0.06 ± 0.00abc 0.06 ± 0.01abc 0.06 ± 0.00b 0.07 ± 0.00b Ácido p-coumarico 0.08 ± 0.01ac 0.10 ± 0.00b 0.08 ± 0.01ac 0.08 ± 0.00a 0.09 ± 0.00abc 0.10 ± 0.01bc 0.10 ± 0.00bc Tirosol 0.32 ± 0.05abc 0.38 ± 0.06a 0.35 ± 0.01ab 0.32 ± 0.01abcd 0.24 ± 0.01d 0.27 ± 0.02cd 0.28 ± 0.03bcd Ácido Ferulico 0.05 ± 0.00a 0.04 ± 0.01ab 0.03 ± 0.00b 0.04 ± 0.00ab 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.01a Ácido Elágico 0.05 ± 0.01a 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.00a 0.05 ± 0.00ab 0.06 ± 0.01b 0.05 ± 0.00ab Catequina 0.45 ± 0.03a 0.54 ± 0.04b 0.47 ± 0.02ab 0.45 ± 0.03a 0.43 ± 0.03a 0.40 ± 0.03a 0.30 ± 0.03c Quercetina 0.17 ± 0.02a 0.18 ± 0.02a 0.19 ± 0.01a 0.16 ± 0.02a 0.19 ± 0.02a 0.24 ± 0.00b 0.20 ± 0.00b
lxvi
Sección 4: Determinación del efecto combinado de APH y P1G10 sobre el crecimiento de B. cinerea en un jugo de uva
9.5. Efecto sinérgico: cinética de sobrevivencia de B. cinerea en un jugo de uva (16 ºBrix)
La inactivación microbiana es uno de los principales objetivos de la aplicación de la
tecnología de alta presión. Las características, como el tipo de microorganismo, grupo de
alimentos y estructura de los alimentos, son factores que influyen directamente sobre la
inactivación microbiana (Daher et al., 2017). De acuerdo con diferentes estudios, el
tratamiento de alta presión hidrostática inactiva bacterias vegetativas, levaduras y mohos a
presiones por encima de 250 MPa (Huang et al., 2014). Sobre la base de los resultados
mostrados anteriormente es este estudio, sabemos que ha 400 MPa/4 min se observó un
crecimiento de B. cinerea cercano al 40% en el jugo de uva concentrando. Por lo tanto y
considerando que 400 MPa es una presión moderadamente elevada que debería inhibir el
crecimiento del hongo, es probable que la estructura del jugo interfiera con el tratamiento de
presurización. En general, la estructura de los alimentos es un factor importante que afecta la
proliferación de los microorganismos y la extensión de la vida útil del alimento (Daher et al.,
2017). En base a lo mencionado anteriormente, se plantea disminuir la concentración del jugo
a 16 ºBrix, nivel mínimo de ºBrix para jugos de fruta reconstituidos según CODEX STAN
247-2005.
En la Fig. 16 se observa el comportamiento de las ufc/mL de B. cinerea frente a la
presión (APH) y a la presión en conjunto con P1G10 (1 mg/mL) (APH+P1G10). Los
resultados indican que a partir de 100 MPa/2 min existe diferencia entre el efecto logrado por
APH actuando sola y la combinación de dos obstáculos, presión y P1G10, mostrando una
reducción en la sobrevivencia de B. cinerea. Esta tendencia en los resultados se observa en
toda la cinética, sin embargo, solo a 250 MPa/4 min el efecto fue significativo. Para disminuir
la variabilidad en los recuentos se realizaron las replicas en días separados, no obstante, para
que las conidias de B. cinerea inoculadas tuviesen el mismo tiempo de crecimiento, se
utilizaron diferentes conjuntos de conidias provenientes de una misma placa, crecidas de
acuerdo con la programación de los experimentos. Los resultados en el tratamiento a 250
MPa/4 min indican un porcentaje de crecimiento del 22% para APH mientras que para
APH+P1G10 este valor fue de un 8%. De acuerdo con el Reglamento Sanitario de los
Alimentos, el límite máximo por mL permitido es de 103 ufc/mL, en términos de porcentajes
lxvii
este valor de crecimiento debe ser < al 10%. Por lo tanto, el tratamiento que permitió un
recuento de B. cinerea menor al 10% en el jugo de uva fue la combinación de P1G10 y 250
MPa/ 4 min, mostrando una reducción significativa de B. cinerea en el jugo de uva. Este
resultado nos permitió demostrar el efecto sinérgico entre P1G10 y APH. Se debe destacar
que la expresión "efecto sinérgico" se utiliza cuando la acción inhibitoria de la combinación
de los obstáculos es mayor que la adición de cada uno aplicado por separado (Pina-Pérez et
al., 2009). Como se ha evidenciado en este trabajo P1G10 tiene un efecto antifúngico sobre
B. cinerea. Por otro lado, de manera independiente se demostró el efecto inhibitorio de la alta
presión y P1G10 en un jugo de uva, sin embargo, la inactivación alcanzada no era la suficiente
de acuerdo con el nivel crítico de sobrevivencia del hongo. En consecuencia, estos resultados
respaldan la respuesta del efecto sinérgico demostrado en este estudio.
En la literatura diferentes trabajos han demostrado un efecto sinérgico sobre el
crecimiento microbiano utilizando la tecnología de altas presiones y antimicrobianos
naturales. Como se ha descrito la aplicación de alta presión produce lesiones subletales en el
caso de bacterias, siendo la membrana un sitio primario de daño ejercido por la presión (Yuste
et al., 2004), por lo tanto, células con la membrana dañada pueden mostrar una mayor
sensibilidad a los antimicrobianos (Espina et al., 2013). Zhao et al., 2013 en su estudio
desmostró que 100 UI/mL de nisina tuvo un efecto sinérgico en la inactivación de bacterias
aerobicas totales en jugo de pepino cuando se combinó con 400 MPa/4 min y 500 MPa/2 min.
Además, estos autores evaluaron el tratamiento sinergico mecionado antes en hongos y
levaduras, ellos observaron que los niveles crecimiento de hongos y levaduras estuvieron por
debajo del límite de detección. Por lo tanto, para determinar el nivel de daño que producen
estos tratamientos combinados en hongos y levaduras se debe trabajar con menores niveles de
presión. En general estudios del efecto de tratamientos combinados en hongos son limitados,
los principales trabajos reportados se han descrito en bacterias. Qi et al. (2011) demostraron
que la población de Bacillus subtilis se redujo cuando se sometió a un tratamiento 500 MPa
durante 15 min y nisina (200 IU/mL). Por otro lado, Somolinos et al., (2008) estudiaron que
tratamientos de altas presiones inactivaron células de Echericha coli y Listeria
monocytogenes cuando se combinó el tratamiento con citral y carvacrol, respectivamente.
En general los estudios que utilizan altas presiones en tratamientos combinados establecen
un nivel de presión que inflija un grado mínimo de inactivación
lxviii
microbiana, pero sí, un daño subletal máximo a las células tratadas. Como se discutió en
la sección 2, sabemos que 400 MPa/ 4 min no inhibió el crecimiento de B. cinerea en un
JUC, sin embargo, cuando se redujo la concentración de azúcares en el jugo a 16 ºBrix,
presiones de 300 MPa/ 2 y 4 min inactivaron completamente el hongo (dato no mostrado).
Estos resultados coinciden con diferentes estudios que muestran el comportamiento de
hongos y levaduras sometidos a tratamientos de presiones hasta 300 MPa (Augusto et al.,
2018). En base a estos resultados, en nuestro estudio el nivel de presión utilizado fue
moderado (presiones < a 400 MPa). Debido a que la sensibilidad del Botrytis a la alta
presión se encontraba en el rango de 200 a 300 MPa. Por otro lado, la inactivación
microbiana por APH es más compleja en un alimento que en un sistema de agua o tampón,
debido a que los medios ricos en nutrientes contienen sustancias que pueden brindar
protección contra daños o nutrientes esenciales que permitan la recuperación del
microrganismo (Espina et al., 2013). En este contexto se ha descrito que el pH del medio
es un factor que interfiere en la respuesta del microorganismo al tratamiento sinérgico.
Estudios demuestran que una reducción en el pH del medio provoca un aumento
progresivo de la sensibilidad celular a la presión (Espina et al., 2013). En nuestro estudio
el pH de las muestras en jugo de uva en promedio fue de 4.00 ± 0.02, pH optimo de
crecimiento para B. cinerea (Martínez, M.A. y Moreno, Z.Y., 2008). Por lo tanto, el efecto
antimicrobiano del tratamiento combinado de APH/P1G10 fue el principal agente que
daño a B. cinerea en el jugo de uva.
Con respecto a P1G10 y de acuerdo con los resultados mostrados en este estudio,
sabemos que P1G10 daña la membrana y pared celular de Botrytis. En la literura se han
descrito varios mecanismos de acción de proteínas antifúngicas; estos mecanismos pueden
incluir la degradación de la pared fúngica, la formación de poros de la membrana, daño a
los ribosomas y la inhibición de la síntesis de ADN y ARN (Ramos et al., 2014; Mendieta
et al., 2006).
lxix
Fig. 16. Cinética de sobrevivencia de B. cinerea tratada por alta presión y la combinación
de alta presión y P1G10. Todos los valores representan la media ± desviación estándar de seis
experimentos independientes con al menos dos repeticiones cada uno. * Indica diferencias
significativas (p <0.05)
La estructura fundamental de las membranas es la bicapa de fosfolípidos, que forma una
barrera estable entre dos compartimentos acuosos. Además de los fosfolípidos y los
carbohidratos, contienen proteínas que son responsables de llevar a cabo varias funciones,
incluido el transporte selectivo de moléculas y el reconocimiento célula-célula. Algunas
membranas pueden contener hasta un 50% de proteínas en peso (Nelson 2009). Por lo
tanto, las peptidasas pueden degradar las proteínas de la membrana alterando su
permeabilidad, permitiendo el flujo incontrolado de sustancias a través de la célula
(Ramos et al., 2014). De acuerdo con la evidencia presentada, es probable que las conidias
de B. cinerea que sobrevivieron al tratamiento de APH fueron potencialmente dañados e
inactivados por P1G10, debido a que la presión utilizada en el tratamiento combinado no
afecto a la actvidad antifúngica de P1G10 (datos no mostrados). Como se ha demostrado
en este estudio, un protocolo de procesamiento basado en la tecnología de obstáculos que
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.1 MPa 100 MPa/2 min
100 MPa/4 min
200 MPa/2 min
200 MPa/4 min
250 MPa/2 min
250 MPa/4min
% R
ecue
nto
de u
fc/m
L d
e B.
Cin
erea
en
JU 1
6º
Bri
x
APHAPH+P1G10
*
lxx
combine APH con P1G10 para la conservación de jugos de uva permite la reducción de
la intensidad del tratamiento de presión aplicado, y por lo tanto podría disminuir los costos
iniciales y de mantenimiento además de aumentar la vida útil de un equipo de
presurización.
10.1. Determinación de parámetros fisicoquímicos, contenido de azúcares y actividad antioxidante en un jugo de uva tratado por APH (250 MPa/4 min), P1G10 (1 mg/mL) y APH/P1G10
10.1.1. Composición proximal, parámetros fisicoquímicos y cromáticos en un jugo de uva
Tabla 11. Parámetros fisicoquímicos y cromáticos en un jugo de uva
Parámetros
físicoquímicos (mL/100 mL)
Tratamientos
0.1 MPa P1G10 250 MPa/4 min 250 MPa/4
min+P1G10 Humedad 80.56 ± 0.36 80.42 ± 0.21 80.80 ± 0.16 80.78 ± 0.10 Lípidos 0.08 ± 0.05a 0.20 ± 0.08c 0.05 ± 0.00b 0.20 ± 0.07c Proteínas 0.46 ± 0.07 0.47 ± 0.05 0.46 ± 0.04 0.46 ± 0.04 Ceniza 0.15 ± 0.02 0.13 ± 0.05 0.16 ± 0.02 0.14 ± 0.03 Carbohidratos3 18.66 ± 0.35 18.51 ± 0.21 18.54 ± 0.1 18.60 ± 0.55 Acidez2 0.13 ± 0.01 0.12 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.12 ± 0.01 º Brix 15.60 ± 0.50 15.50 ± 0.25 15.80 ± 0.50 15.30 ± 0.50 pH 3.45 ± 0.01 3.46 ± 0.01 4.03 ± 0.01 3.96 ± 0.01 aw
1 0.980 ± 0.011 0.987 ± 0.010 0.976 ± 0.010 0.987 ± 0.003 L* 64.50 ± 0.05a 65.56 ± 0.32d 65.88 ± 0.23b 62.52 ± 0.15c a* -0.05 ± 0.03a -0.68 ± 0.03d 0.97 ± 0.02b -0.25 ± 0.02c b* 14.15 ± 0.21 11.96 ± 0.76 12.55 ± 5.30 11.47 ± 0.12 ∆E 28.36 ± 0.80 26.78 ± 4.39 28.52 ± 1.69
1adimensional. 2Porcentaje de acido tartárico. 3por diferencias. Letras diferentes indican diferencias
significativas (p <0.05) entre tratamientos de APH, ausencia de letras indica que no existen diferencias
significativas entre tratamientos de APH
Los resultados de la composición proximal del jugo de uva se presentan en la Tabla 11. En
general los datos presentados se encuentran dentro del rango de resultados mostrados en la
literatura (Samoticha et al., 2017). Un aumento significativo se observó en el contenido de
lxxi
lípidos en las muestras que contenían P1G10, similar tendencia mostró el contenido de ceniza.
Valores de acidez, pH y sólidos solubles no presentaron diferencias significativas en el jugo
de uva tratado en comparación con la muestra control (0.1 MPa).
Los cambios en la luminosidad (L*), enrojecimiento (a*), amarillez (b*) después de
los tratamientos de APH, P1G10 y APH/P1G10 del jugo de uva se muestran en la Tabla 11.
El valor de ∆E que mostró la mayor diferencia significativa se observó en las muestras que
APH/P1G10, valores b* L* y a* fueron significativamente más bajos en comparación con la
muestra control (0.1 MPa). La disminución en los valores de color en las muestras tratadas
con APH están en línea con las observaciones anteriores de Huang et al. (2013), sin embargo,
es probable que la adición de P1G10 al jugo de uva generara una acumulación de partículas
que formen una estructura translúcida con forma de gelatina que podría hacer que el jugo
pareciera más claro.
10.1.2. Determinación de la actividad antioxidante total de un jugo de uva
Los resultados de la actividad antioxidante de un jugo de uva, se muestra en la Tabla
12. Los resultados se expresaron a través del método de eliminación de radicales libres
(DPPH) y el método basado en la eliminación de la capacidad de absorción de radicales de
oxígeno (ORAC). Se observo en las muestras control (0.1 MPa) de acuerdo con el método
ORAC 2450.8 µmol TE/100 mL JU, mientras que con el ensayo de DPPH se reportó 117.4
µmol TE/100 mL JU. Con respecto al contenido de flavonoides y polifenoles totales, se
mostró 19.9 mg EQ/100 mL JU y 100.3 EAG/100 mL JU, respectivamente.
Cuando analizamos el efecto de los diferentes tratamientos aplicados en el jugo de
uva, se observó un aumento significativo (p<0.05) de la actividad antioxidante, evidenciado
en la respuesta del método DPPH y el contenido de flavonoides.
Por otro lado, de acuerdo con el método ORAC, el jugo que contenía solo P1G10
disminuyó significativamente la capacidad antioxidante del jugo de uva en comparación con
la muestra control (0.1 MPa), mientras que en el total de polifenoles se observó una
disminución significativa (p<0.05) en el tratamiento de APH.
lxxii
Tabla 12. Actividad antioxidante, polifenoles y flavonoides totales presentes en un jugo
de uva
Tratamientos ORAC µmol
ET/100 mL JU DPPH µmol
ET/100 mL JU mg EQ/100
mL JU mg EAG/100
mL JU
0.1 MPa 2450.8 ± 90.8ª 117.4 ± 1.4ª 19.9 ± 1.3ª 100.3 ± 3.8ª P1G10 1790.8 ± 152.3c 134.8 ± 1.4d 24.1 ± 0.6cd 80.6 ± 5.7d 250 MPa/4 min 2277.0 ± 87.6b 131.9 ± 1.2b 23.3 ± 0.3b 65.4 ± 6.9b 250 MPa/4 min+P1G10 2233.8 ± 148.8b 127.0 ± 2.8c 22.8 ± 0.3b 88.0 ± 2.3c
Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0.05) entre tratamientos de APH, ausencia de letras
indica que no existen diferencias significativas entre tratamientos de APH
Como se ha descrito en la sección 3, el tratamiento de APH permite conservar la
actividad antioxidante y los compuestos antioxidantes presentes en el jugo de uva, por
ejemplo, el contenido total de antioxidantes en un jugo de arándano presurizado es similar o
superior al valor estimado para un jugo fresco, demostrando con estos resultados que en el
rango de 200 a 400 MPa, el tratamiento de APH modifica principalmente el mecanismo de
degradación de los compuestos antioxidantes al afectar las moléculas involucradas en la
cinética de la reacción, como las enzimas (Barba et al., 2013).Sin embargo, no sabemos como
es la respuesta de P1G10 frente a la actividad antioxidante del jugo de uva. Con el fin de
sustentar los resultados, se analizó el contenido fenólico del jugo de uva sometido a los
diferentes tratamientos. Se observa en la Tabla 13. que los diferentes compuestos fenólicos
analizados en el JUC se encontraron en un jugo de uva de 16 ºBrix.
Con respecto al efecto de los tratamientos aplicados en el jugo de uva, en términos
generales se mostró una disminución significativa en los diferentes compuestos fenólicos en
comparación con las muestras control, sin embargo, esta reducción fue mayor en las muestras
tratadas con APH. Sabemos que actividad proteolítica explica completamente la acción
antifúngica de P1G10, sin embargo, Souza et al. (2011) demostraron una reversión parcial del
crecimiento fúngico en fracciones de P1G10 tratadas con IAA, sugiriendo que además de las
proteinasas, las proteínas del látex no proteolíticas adicionales pueden mostrar actividad
antifúngica. Por lo tanto, se podría atribuir este aumento o conservación de los compuestos
antioxidantes en el jugo de uva, a posibles moléculas que se encuentren en la mezcla de
proteinasas de P1G10, como sabemos P1G10 es purificado a través de una columna de
lxxiii
Sephadex - G10 donde el límite de tamaño de exclusión de las proteínas es < 700 Da (Sigma-
Aldrich).
Tabla 13. Perfil del contenido fenólico presente en un jugo de uva tratado mediante tratamientos combinados
Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0.05) entre tratamientos de APH, ausencia de letras indica que no existen diferencias significativas entre tratamientos de APH
En la literatura se han encontrado diferentes péptidos de fuentes alimenticias con
capacidad antioxidante, y sus propiedades bioactivas han sido ampliamente estudiadas,
especialmente proteínas derivadas de alimentos de origen animal y algunas proteínas
vegetales como el cáñamo, el arroz y el maní (Sun et al. 2012; Choonpicharn et al. 2014; Kong
et al. 2007; Zhao et al. 2012; Tang et al. 2009; Jamdar et al. 2010). Sus propiedades bioactivas
se relacionaron en gran medida con la especificidad enzimática, el grado de hidrólisis, la
composición de aminoácidos, la estructura y la hidrofobicidad (Sarmadi and Ismail, 2010)
10.1.3. Contenido de azúcares: Fructosa y glucosa
El análisis de los azúcares presentes en el jugo de uva mostró la presencia de la glucosa
y fructosa en todas las muestras tratadas. Como se observa en la Fig. 17., los cambios en los
azúcares después de aplicar los diferentes tratamientos APH, P1G10 y APH/P1G10, muestran
una disminución significativa (p <0.05) en el contenido de fructosa en el jugo de uva en
comparación con la muestra no tratada (0.1 MPa). Mientras que en la glucosa los cambios
Tratamientos
0.1 MPa 250 MPa/4 min
250 MPa/4 min+P1G10 P1G10
Ácido Gálico 32.02 ± 2.83a 26.42 ± 1.56b 30.23 ± 2.39ab 31.82 ± 2.77a Ác. Protocatecuico 38.54 ± 3.03a 28.69 ± 1.87b 32.25 ± 2.83b 33.04 ± 3.11b Ácido Vanílico 12.77 ± 0.51a 9.70 ± 0.23b 10.76 ± 0.95b 12.63 ± 0.94a Ácido Caféico 13.59 ± 0.56a 10.93 ± 1.24b 12.38 ± 1.35ab 12.19 ± 1.43ab Ácido p-cumarico 15.14 ± 0.51a 11.54 ± 0.74c 12.20 ± 0.71bc 13.46 ± 0.78b Tirosol 37.51 ± 3.59a 29.82 ± 1.67ab 34.39 ± 3.39ab 34.84 ± 4.48b Ácido Ferulico 12.93 ± 0.64a 10.53 ± 0.67b 11.08 ± 0.63b 11.55 ± 1.19ab Ácido Elágico 15.21 ± 1.08a 12.45 ± 1.17b 11.71 ± 1.02b 11.91 ± 1.60b Catequina 240.40 ± 20.9a 178.11 ± 14.7b 199.82 ± 10.65ab 212.51 ± 13.62ab Quercetina 37.90 ± 2.72a 28.44 ± 3.11b 26.50 ± 2.11b 33.70 ± 1.88a
lxxiv
asociados con el efecto de los tratamientos fueron menos agresivos, una disminución
significativa de glucosa se observó con el tratamiento de APH, mientras que el tratamiento
combinado de APH/P1G10 en el contenido de glucosa fue significativamente superior a la
muestra control (0.1 MPa). En términos de relación glucosa/fructosa en el jugo de uva, no
tenemos claro si P1G10 tuvo algún efecto en esta determinación. Sin embargo, en general se
observan tendencias similares a los resultados obtenidos de fructosa y glucosa en el JUC.
Fig. 17. Fructosa y glucosa presente en un jugo de uva tratado mediante tratamientos
combinados. Todos los valores representan la media ± desviación estándar de tres
experimentos independientes con al menos tres repeticiones cada uno. Letras similares indican
las diferencias significativas entre tratamientos de APH, ausencia de letras indica que no
existen diferencias significativas entre tratamientos de APH
10.2. Evaluación sensorial del jugo de uva tratado mediante tratamientos combinados
10.2.1. Pruebas de preferencia
La prueba de preferencia fue realizada por diferentes juces que determinaron el nivel
agrado de cuatro parametros (sabor, olor, acidez y color) de dos muestras aparentemente
iguales y desconocidas. Mediante una evaluación de escalas hedónicas, con puntuación de 1
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
0.1 MPa P1G10 250 MPa/4 min 250 MPa/4 min +P1G10
Con
teni
do d
e A
zúca
res J
U
mg/mL Fructosa mg/mL Glucosaa
A b
c
b
B
AB C
lxxv
a 9, donde 1 era altamente agradable y 9 altamente desagradable, se esperaba conocer qué
muestra preferían los jueces según los distintos atributos presentados.
La preferencia fue expresada como el porcentaje de jueces que eligieron la muestra
correspondiente como preferida según el atributo evaluado. En la Fig. 18 se observa que el
jugo de uva sometido a 250 MPa/4 min+P1G10 tuvo una mayor preferencia en los atributos
acidez, dulzor y olor. El atributo color tuvo mayor preferencia en el jugo tratado solo por
APH. De acuerdo con los resultados en los parametros de color, se observó una baja
luminosidad en el jugo de uva obtendio por tratamientos combinados (250 MPa/4
min+P1G10), probablemente esa caracteristica en la luminosidad afecto la prefencias de los
jueces. La tecnología de altas presiones permitir producir jugo listos para beber, mostrando al
consumidor productos innovadores con atributos de frescura/natural y colores de aspecto
natural, aspectos que todos los consumidores valoran en la actualidad (Deliza et al., 2005).
Fig. 18. Preferencia de los atributos acidez, dulzor, color y olor de un jugo de uva tratado
mediante tratamientos combinados expresado en porcentaje de preferencia
Estudios de la evaluación sensorial en productos sometidos a tratamiento de APH aún son
escasos. Polydera et al., (2005) y Barros-Marcellini (2006), investigaron el efecto sobre los
0
10
20
30
40
50
60
70
Acidez Dulzor Color Olor
% P
refe
renc
ia
250 MPa/ 4 min250 MPa/ 4 min + P1G10
lxxvi
atributos sensoriales en jugo de tomate, puré de guayaba y jugo, compuestos aromáticos
presentes en pulpa de fresa, jugo de naranja y jugo de piña, respectivamente.
En general, los trabajos que han mostrado el efecto de la presión sobre los atributos
sensoriales, concluyen una baja alteración en las propiedades sensoriales del producto después
del proceso de presurización.
Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral apoyan la hipótesis que existe un efecto
sinérgico entre alta presiones y P1G10 para inhibir el crecimiento de B. cinerea. Además,
estos dos tratamientos, tanto por separado como en conjunto no afectan las propiedades
fisicoquímicas y los compuestos antioxidantes presentes en el jugo de uva, por lo tanto, el
producto obtenido utilizando ambos tratamientos fue de alta calidad, estable y sensorialmente
aceptable.
lxxvii
11. CONCLUSIONES
1. Presentamos por primera vez el efecto antifúngico de P1G10 contra B. cinerea, siendo
1 mg/mL, la concentración más efectiva, esta fracción proteolítica inhibió el
crecimiento micelial, la capacidad de adhesión, la germinación de conidias y el
alargamiento del tubo germinal de B. cinerea. Además, P1G10 provocó un daño
celular masivo en la membrana plasmática y la pared celular en B. cinerea.
2. El efecto inhibitorio combinado de la alta presión y P1G10 sobre el crecimiento de B.
cinerea en un jugo de uva fue dependiente de los sólidos solubles presentes en el jugo.
Los resultados muestran que una matriz con un alto contenido de sólidos solubles (64
ºBrix) interfiere en la acción antimicrobiana ejercida por la alta presión. Sin embargo,
el tratamiento combinado de APH/P1G10 sobre un jugo de uva a 16 ºBrix mostró que
el crecimiento de B. cinerea no superó el 10% de sobrevivencia.
3. La combinación de alta presión a 250 MPa/4 min y 1 mg/mL de P1G10 en un jugo de
uva a 16 ºBrix inhibió el crecimiento de B. cinerea en un 90%, esta inhibición fue
mayor con respecto a los tratamientos individuales, indicando que existe un efecto
sinérgico de los tratamientos.
4. Presiones entre 200 y 300 MPa no afectó significativamente la estabilidad de los
compuestos antioxidantes como es el método ORAC, el contenido de polifenoles y
flavoniodes totales y el perfil de compuestos fenólicos. Indicando que la estabilidad
de los compuestos antioxidantes en el jugo de uva se mantiene a pesar de las altas
presiones utilizadas.
5. En un análisis cualitativo y cuantitativo del contenido fenólico en el jugo de uva se
identificaron ocho especies fenólicas; ácido galico, ácido protocatecuico, ácido
vanílico, ácido cafeico, p-cumarico, tyrosol, ácido ferúlico y ácido elágico, además de
dos flavonoides; catequina y quercitina. Nuestros resultados muestran que el jugo de
uva variedad Pedro Jiménez es una buena fuente de antioxidante.
6. P1G10 no produjo cambios significativos sobre los parámetros fisicoquímicos,
contenido de azúcares y compuestos antioxidantes del jugo de uva. Por lo tanto, la
utilización de este compuesto como antifúngico en el jugo de uva no alteraría las
propiedades del jugo
lxxviii
7. Este estudio da un respaldo científico para la utilización de compuestos naturales junto
a otras tecnologías en ingeniería en alimentos para desarrollar alimentos naturales sin
aditivos sintéticos para el control microbiológico de éstos.
8. Finalmente se concluye que el efecto sinérgico permite trabajar a presiones moderas,
lo cual permitiría reducir los costos de mantención de los equipos de alta presión y
por lo tanto aumentar su vida útil.
lxxix
12. REFERENCIAS
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xc
12. ANEXOS
Hoja de cata (preferencia)
Fecha: ________________ Nombre: __________________________________ I.- A continuación se le presentan las siguientes muestras codificadas, indique para los diferentes atributos cual prefiere: 1.- Acidez
2.- Dulzor
3.- Color
4.- Olor
II.- Sitúe en la siguiente tabla, según cuánto le agraden, los productos que acaba de evaluar.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Altamente agradable 2 Muy agradable 3 Moderadamente agradable 4 Ligeramente Agradable 5 Ni agradable ni desagradable 6 Ligeramente desagradable 7 Moderadamente desagradable 8 Muy desagradable 9 Altamente desagradable ¿Qué atributo ha influido más en su elección? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________
xci
Fig. S1. Perfil cromatográfico del látex de papaya (Vasconcellea cundinamarcensis) en una
columna Sephadex G-10.
Fig. S2. SDS-Page electroforesis de P1G10-IAA y P1G10. Las proteinas desnaturalizadas
por temperatura (30 µg) fueron cargadas en cada una de las líneas. Línea 1-4; P1G10
desde el stock 1 y líneas 5-8 desde stock 2.
Fraction N°
0 20 40 60 80 100
A 28
0
0
20
40
60
80
100
P1
P1G10
P2
P2G10
xcii
Tabla S1. Primers usados en este estudio.
Primer
Sequence
(5' - 3')
Tm
ºC
Efficiency qPCR
Primers
Bchex Forward tctacttcaacgaggcttc 57 99
Reverse caccagattgaccgaaaac
Bcnma Forward atgatcggcaccaacggcgt 57 98
Reverse caaaggtcgatcgagtggcaa
Cas-1 Forward atggaggctatggagcacca 57 97
Reverse gcaacaccgctcatatcacct
Bcaox Forward tgcatgtactgcacctacaccatcg 57 99
Reverse gacggatcgaaaaatctcg
UbCE Forward catcaactccaacggaagca 57 100,6
Reverse tcggtcggtcttgtaaacgt
