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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA
AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA
TESIS PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA
AGROPECUARIA
TEMA: “EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL
MUCÍLAGO DE CACAO (Theobroma cacao L.) EN LA
OBTENCIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO”.
AUTORAS:
VERA SIGCHA, CINTHYA SOBEYDA
ZAMBRANO MORA, IVETHE ALEJANDRA
DIRECTORA: Ph.D SANCHEZ LLAGUNO, SUNGEY NANEY
SANTO DOMINGO
2018
ii
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA SANTO DOMINGO
CERTIFICACIÓN
PROF. Ph.D. SUNGEY NAYNEE SANCHEZ LLAGUNO, DOCENTE INVESTIGADORA
DE LA CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA CERTIFICA: En calidad de
Directora del Proyecto de Investigación “EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS
DEL MUCÍLAGO DE CACAO (Theobroma cacao L.) EN LA OBTENCIÓN DE
ALCOHOL ETÍLICO”
Previo a la obtención del título de Ingenieras Agropecuarias de la autoría de las Señoras
CINTHYA SOBEYDA VERA SIGCHA y IVETHE ALEJANDRA ZAMBRANO MORA,
informo que este trabajo de investigación luego de ingresado al sistema anti-plagio URKUND,
reporto el porcentaje del 7%, para lo cual adjunto a continuación el reporte respectivo.
Santo Domingo, 18 de diciembre del 2018
Atentamente,
Sungey Naynee Sánchez Llaguno Ph.D.
Directora de Proyecto de Investigación
iii
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA SANTO DOMINGO
AUTORÍA DE RESPONSABILIDAD
Nosotros, CINTHYA SOBEYDA VERA SIGCHA con cedula de identidad Nº 220009993-1
y IVETHE ALEJANDRA ZAMBRANO MORA con cedula de identidad Nº 070477083-3
declaramos que este trabajo de “EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL
MUCÍLAGO DE CACAO (Theobroma cacao L.) EN LA OBTENCIÓN DE ALCOHOL
ETÍLICO”, ha sido desarrollado considerando los métodos de investigación existente, así
como también se ha respetado los derechos intelectuales de terceros considerándose en las citas
bibliográficas.
Consecuentemente declaramos que este trabajo es de nuestra autoría, en virtud de ello nos
declaramos responsables del contenido, veracidad y alcance de la investigación mencionada.
Santo Domingo, 18 de diciembre del 2018
_________________________________ _____________________________________
CINTHYA SOBEYDA VERA SIGCHA IVETHE ALEJANDRA ZAMBRANO MORA
C.I. 220009993-1 C.I. 070477083-3
iv
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA SANTO DOMINGO
AUTORIZACIÓN
Nosotros, CINTHYA SOBEYDA VERA SIGCHA y IVETHE ALEJANDRA
ZAMBRANO MORA, autorizamos a la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE publicar
en la Biblioteca virtual de la Institución el presente trabajo de titulación “EVALUACIÓN DE
LAS CARACTERÍSTICAS DEL MUCÍLAGO DE CACAO (Theobroma cacao L.) EN
LA OBTENCIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO”, cuyo contenido, ideas y criterios son de
nuestra autoría y responsabilidad.
Santo Domingo, 18 de diciembre del 2018
_________________________________ ___________________________________
CINTHYA SOBEYDA VERA SIGCHA IVETHE ALEJANDRA ZAMBRANO MORA
C.I. 220009993-1 C.I. 070477083-3
v
DEDICATORIA
A Dios por brindarme la salud y sabiduría para culminar esta meta propuesta.
Dedico todo mi esfuerzo, dedicación y empeño aplicados en esta etapa a mi adorada hija
Nahomi, por ser mi motor de superación.
A mis queridos abuelitos maternos Juan y Fanny por su cariño y apoyo incondicional durante
todo mi proceso de formación académica.
A mi madre Elizabeth y hermanos por su amor, por creer en mí y motivarme constantemente.
A mi esposo Rodrigo y a su familia, por su compresión, aliento y por acompañarme durante
este difícil camino.
A mis amigos por todas las anécdotas y experiencias compartidas.
Mi triunfo es de ustedes. Los amo.
Cinthya.
vi
DEDICATORIA
A Dios por ofrecerme día a día la vida y permitirme cumplir todos mis sueños.
A mi querida hija, ya que es el motivo de mi lucha diaria y mi inspiración para continuar con
todos mis objetivos y ofrecerle un gran ejemplo.
A mi esposo que me ha apoyado durante esta fase y me ha brindado su amor incondicional.
A mi madre que siempre ha cuidado de mí y me ha brindado su amor y apoyo, por ser mi
ejemplo a seguir y demostrarme que siempre se debe luchar por nuestros sueños y nuestros
seres queridos.
A mis abuelitos Margoth y Luis por haber estado a mi lado desde mi infancia, demostrándome
su amor y cariño hasta ahora.
A mi padre y mi hermano por siempre estar pendientes de mí y mi familia.
A mis suegros y mi cuñada por haberme incluido en su familia con cariño y por brindarme su
apoyo incondicional a lo largo de estos años.
A todos mis familiares y amigos que han formado parte de mi vida a lo largo de las diferentes
etapas, que me han servido de apoyo y aprendizaje.
Alejandra.
vii
AGRADECIMIENTO
A nuestra Directora de tesis PhD. Sungey Sánchez, por el aporte de sus conocimientos
científicos y entrega incondicional en la elaboración este trabajo investigativo.
Al Ph.D Juan Neira, por su tiempo, ayuda constante e interés en todas las fases de nuestra tesis.
A la Familia Ibarra Anchundia, por facilitarnos la materia prima, por su apoyo y calidad
humana.
A la Ing. Katty Medina por su paciencia y ayuda en la fase de laboratorio.
A los docentes Ing. Patricio Vaca e Ing. Vinicio Uday por su aporte en el perfeccionamiento de
nuestro trabajo investigativo.
Al Dr. Gelacio Gómez por sus importantes conocimientos impartidos y sobre todo por la
excelente persona que demostró ser.
A nuestras amigas Nataly, Estefania, Mary Carmen, Nelly, Angie y nuestro amigo David por
su amistad, cariño y confianza, por cada momento compartido, por haber hecho ameno este
largo camino.
Cinthya y Alejandra
viii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
CERTIFICACIÓN ..................................................................................................................... ii
AUTORÍA DE RESPONSABILIDAD ..................................................................................... iii
AUTORIZACIÓN ..................................................................................................................... iv
DEDICATORIA ......................................................................................................................... v
DEDICATORIA ........................................................................................................................ vi
AGRADECIMIENTO .............................................................................................................. vii
RESUMEN ............................................................................................................................ xviii
SUMMARY ............................................................................................................................ xix
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1
II. REVISIÓN DE LITERATURA ......................................................................................... 3
2.1 CACAO ........................................................................................................................ 3
2.1.1 Variedades ................................................................................................................. 3
2.1.1.1 Cacao nacional ....................................................................................................... 3
2.1.1.2 Cacao CCN – 51 ..................................................................................................... 4
2.2 MUCÍLAGO DE CACAO ........................................................................................... 4
2.2.1 Composición físico química del mucílago de cacao ................................................. 5
2.2.2 Usos del mucílago de cacao. ..................................................................................... 6
2.2.3 Rendimiento del mucílago de cacao. ......................................................................... 6
2.2.4 Rendimiento del mucílago de cacao en etanol. ......................................................... 7
2.3 FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. ........................................................................... 7
2.3.1 Levaduras presentes en las fermentaciones de cacao. ............................................... 7
2.3.2 Bacterias ácido lácticas (BAL) presentes en las fermentaciones de cacao. .............. 8
2.3.3 Bacterias ácido acéticas (BAA) presentes en las fermentaciones de cacao. ............. 9
ix
III. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 10
3.1 UBICACIÓN DEL ÁREA DE INVESTIGACIÓN ................................................... 10
3.1.1 Ubicación Política ................................................................................................... 10
3.1.2 Ubicación Ecológica ............................................................................................... 10
3.1.3 Ubicación Geográfica .............................................................................................. 11
3.2 MATERIALES ........................................................................................................... 12
3.2.1 Caracterización física de las mazorcas de cacao. .................................................... 12
3.2.2 Determinación de Solidos Solubles. ........................................................................ 12
3.2.3 Determinación de pH. ............................................................................................. 12
3.2.4 Determinación de Acidez. ....................................................................................... 13
3.2.5 Determinación de Proteína ...................................................................................... 13
3.2.6 Determinación de ceniza ......................................................................................... 14
3.2.7 Determinación de materia seca y humedad ............................................................. 14
3.2.8 Determinación de grasa ........................................................................................... 14
3.2.9 Determinación de densidad ..................................................................................... 15
3.2.10 Determinación de Grados Alcohólicos ................................................................. 15
3.2.11 Recuento e identificación de poblaciones microbianas. ........................................ 15
3.2.12 Pruebas toxicológicas para determinar la presencia de metanol en el alcohol
etílico. ............................................................................................................................... 16
3.3 MÉTODOS ................................................................................................................. 16
3.3.1 Obtención de la Materia Prima ................................................................................ 16
3.3.2 Diseño Experimental ............................................................................................... 17
3.3.2.1 Factores y niveles del experimento ...................................................................... 17
3.3.2.2 Tratamientos a comparar. ..................................................................................... 17
3.3.2.3 Tipo de diseño ...................................................................................................... 18
x
3.3.2.4 Repeticiones ......................................................................................................... 18
3.3.2.5 Características de la unidad experimental ............................................................ 18
3.3.3 Análisis estadístico .................................................................................................. 18
3.3.3.1 Esquema de análisis de varianza .......................................................................... 18
3.3.4 Variables a medir .................................................................................................... 19
3.3.4.1 Análisis Físico de las mazorcas de Cacao ............................................................ 19
3.3.4.2 Determinación de pH del mucílago y vino ........................................................... 20
3.3.4.3 Determinación de sólidos solubles del mucílago y vino ...................................... 20
3.3.4.4 Determinación de acidez titulable del mucílago y vino ....................................... 20
3.3.4.5 Determinación de proteína del mucílago ............................................................. 21
3.3.4.6 Determinación de ceniza del mucílago ................................................................ 23
3.3.4.7 Determinación de humedad y materia seca del mucílago .................................... 24
3.3.4.8 Determinación de grasa del mucílago .................................................................. 25
3.3.4.9 Determinación de densidad del mucílago ............................................................ 26
3.3.4.10 Determinación del rendimiento del vino y alcohol etílico ................................. 27
3.3.4.11 Determinación de grados alcohólicos del vino y alcohol etílico. ....................... 28
3.3.4.12 Recuento e identificación de poblaciones microbianas. ..................................... 28
3.3.4.13 Pruebas toxicológicas para determinar la presencia de metanol en el alcohol
etílico. ............................................................................................................................... 37
3.3.4.14 Análisis de Metanol. ........................................................................................... 38
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................... 40
4.1 Caracterización física de las mazorcas de cacao. ....................................................... 40
4.2 Caracterización físico – química del mucílago de cacao ........................................... 41
4.3 Recuento de poblaciones microbianas ....................................................................... 43
4.4 Identificación de levaduras y bacterias presentes en el mucílago de cacao. ............. 44
xi
4.5 Análisis de varianza de la variable rendimiento de la obtención de vino. ................. 46
4.6 Análisis de varianza de la variable grados alcohólicos de la obtención de vino. ....... 47
4.7 Análisis de varianza de la variable Sólidos solubles de la obtención de vino. .......... 48
4.8 Análisis de varianza de la variable contenido de metanol de la obtención de alcohol
etílico. ............................................................................................................................... 49
4.9 Análisis de varianza de la variable pH de la obtención de vino. ................................ 50
4.10 Análisis de varianza de la variable acidez titulable de la obtención de vino ........... 51
4.11 Análisis de varianza de la variable rendimiento de la obtención de alcohol etílico. 52
4.12 Análisis de varianza de la variable grados alcohólicos de la obtención de alcohol
etílico. ............................................................................................................................... 53
4.13 Prueba de significancia de Tukey del Factor A para la obtención del vino. ............ 54
4.14 Prueba de significancia de Tukey del Factor B para la obtención del vino. ............ 55
4.15 Prueba de significancia de Tukey del Factor C para la obtención del vino. ............ 57
4.16 Prueba de significancia de Tukey de la interacción AxBxC para la obtención del
vino. .................................................................................................................................. 58
4.17 Prueba de significancia de Tukey del Factor A para la obtención del alcohol etílico.
.......................................................................................................................................... 61
4.18 Prueba de significancia de Tukey del Factor B para la obtención del alcohol etílico.
.......................................................................................................................................... 62
4.19 Prueba de significancia de Tukey del Factor C para la obtención del alcohol etílico.
.......................................................................................................................................... 63
4.20 Prueba de significancia de Tukey de la interacción AxBxC para la obtención del
alcohol etílico. .................................................................................................................. 65
4.21 Análisis Económico .................................................................................................. 68
V. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 70
xii
VI. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 73
VII. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 74
xiii
Índice de tablas
Tabla 1. Composición de la pulpa de las semillas del cacao. ..................................................... 5
Tabla 2. Composición físico química del mucílago del cacao Nacional y CCN-51. ................. 5
Tabla 3. Subproductos del cacao con referencia a una productividad anual de 750 kg de cacao
seco por hectárea. ......................................................................................................... 6
Tabla 4. Recursos necesarios para la caracterización física de las mazorcas de cacao. ........... 12
Tabla 5. Recursos necesarios para la determinación de Sólidos solubles en el mucílago de
cacao y vino de mucílago de cacao. ........................................................................... 12
Tabla 6. Recursos necesarios para la determinación del pH en el mucílago de cacao y vino de
mucílago de cacao. ..................................................................................................... 12
Tabla 7. Recursos necesarios para la determinación de acidez en el mucílago de cacao y vino
de mucílago de cacao. ................................................................................................ 13
Tabla 8. Recursos necesarios para la determinación de proteína en el mucílago de cacao...... 13
Tabla 9. Recursos necesarios para la determinación de ceniza en el mucílago de cacao. ....... 14
Tabla 10. Recursos necesarios para la determinación de materia seca y humedad del mucílago
de cacao. ..................................................................................................................... 14
Tabla 11. Recursos necesarios para la determinación de grasa del mucílago de cacao. .......... 14
Tabla 12. Recursos necesarios para la determinación de densidad del mucílago de cacao. .... 15
Tabla 13. Recursos necesarios para la determinación de grados alcohólicos en el vino de
mucílago de cacao y alcohol etílico de mucílago de cacao. ....................................... 15
Tabla 14. Recursos necesarios para el recuento e identificación de poblaciones microbianas.15
Tabla 15. Recursos necesarios para la realización de pruebas toxicológicas para determinar la
presencia de metanol en el alcohol etílico. ................................................................ 16
Tabla 16. Factores y niveles a probar. ...................................................................................... 17
Tabla 17. Tratamientos a comparar. ......................................................................................... 17
xiv
Tabla 18. Esquema del análisis de varianza. ............................................................................ 18
Tabla 19. Caracterización física de las mazorcas de cacao. ..................................................... 40
Tabla 20. Caracterización físico – química del mucílago de cacao. ........................................ 41
Tabla 21. Recuento de poblaciones microbianas del mucílago de cacao. ................................ 43
Tabla 22. Resultados de las pruebas de identificación de bacterias. ........................................ 44
Tabla 23. Análisis de varianza de la variable rendimiento de la obtención de vino. ............... 46
Tabla 24. Análisis de varianza de la variable grados alcohólicos de la obtención de vino. ..... 47
Tabla 25. Análisis de varianza de la variable Sólidos solubles de la obtención de vino. ........ 48
Tabla 26. Análisis de varianza de la variable contenido de metanol de la obtención de alcohol
etílico. ......................................................................................................................... 49
Tabla 27. Análisis de varianza de la variable pH de la obtención de vino. .............................. 50
Tabla 28. Análisis de varianza de la variable acidez titulable de la obtención de vino. .......... 51
Tabla 29. Análisis de varianza de la variable rendimiento de la obtención de alcohol etílico. 52
Tabla 30. Análisis de varianza de la variable grados alcohólicos de la obtención de alcohol
etílico. ......................................................................................................................... 53
Tabla 31. Prueba de significancia de Tukey del Factor A para la obtención del vino. ............ 54
Tabla 32. Prueba de significancia de Tukey del Factor B para la obtención del vino. ............ 55
Tabla 33. Prueba de significancia de Tukey del Factor C para la obtención del vino. ............ 57
Tabla 34. Prueba de significancia de Tukey de la interacción AxBxC para la obtención del
vino. ............................................................................................................................ 58
Tabla 35. Prueba de significancia de Tukey del Factor A para la obtención del alcohol etílico.
.................................................................................................................................... 61
Tabla 36. Prueba de significancia de Tukey del Factor B para la obtención del alcohol etílico.
.................................................................................................................................... 62
xv
Tabla 37. Prueba de significancia de Tukey del Factor C para la obtención del alcohol etílico.
.................................................................................................................................... 63
Tabla 38. Prueba de significancia de Tukey de la interacción AxBxC para la obtención del
alcohol etílico. ............................................................................................................ 65
Tabla 39. Flujo de caja de la investigación .............................................................................. 68
Tabla 40. Análisis costo-beneficio. .......................................................................................... 69
xvi
Índice de figuras
Figura 1. Ubicación geográfica donde se desarrolló la investigación. ..................................... 11
Figura 2. A. Colonia (20X) B. Bacilos Gram positivos (1000X) de Lactobacillus plantarum 32
Figura 3 A. Colonia (20X) B. Bacilos Gram positivos (1000X) de Lactobacillus brevis ....... 33
Figura 4 A. Colonia (20X) B. Cocobacilos Gram positivos (1000X) de Leuconostoc
mesenteroides ........................................................................................................ 33
Figura 5. A. Colonia (20X) B. Bacilos Gram negativos (1000X) de Gluconobacter spp. ...... 34
Figura 6 A. Colonia (20X) B. Bacilos Gram negativos (1000X) de Acetobacter spp. ............ 34
Figura 7. A. Colonia (20X) B. Células (1000X) de Saccharomyces cerevisiae ...................... 35
Figura 8. A. Colonia (20X) B. Células (1000X) de Hanseniaspora uvarum ........................... 35
Figura 9. Colonia (20X) B. Células (1000X) de Candida utilis .............................................. 36
Figura 10. A. Colonia (20X) B. Células (1000X) de Candida tropicalis ................................ 36
Figura 11. A. Colonia (20X) B. células (1000X) de Candida boidinii .................................... 36
Figura 12. Coloración de la prueba de metanol con reactivo de Shiff. .................................... 38
Figura 13. Reconocimiento por el ensayo con yodo. ............................................................... 38
Figura 14. Resumen de las poblaciones microbianas encontradas en el mucílago de cacao ... 43
Figura 15. Levaduras aisladas e identificadas en el mucílago de cacao. ................................. 44
Figura 16. Bacteria (Gluconobacter spp) aislada e identificada del mucílago de cacao. ........ 44
Figura 17. Resumen de los resultados de las variables que tuvieron diferencia significativa en
el Factor A. ............................................................................................................ 54
Figura 18. Resumen de los resultados de las variables que tuvieron diferencia significativa en
el Factor B. ............................................................................................................ 56
Figura 19. Resumen de los resultados de las variables que tuvieron diferencia significativa en
el Factor C. ............................................................................................................ 57
Figura 20. Gráfico de control de calidad de acidez titulable del vino. ..................................... 59
xvii
Figura 21. Resumen de los resultados de las variables que tuvieron diferencia significativa en
la interacción AxBxC. ........................................................................................... 60
Figura 22. Resumen de los resultados de las variables que tuvieron diferencia significativa en
el Factor A. ............................................................................................................ 61
Figura 23. Resumen de los resultados de las variables que tuvieron diferencia significativa en
el Factor B. ............................................................................................................ 63
Figura 24. Resumen de los resultados de las variables que tuvieron diferencia significativa en
el Factor C. ............................................................................................................ 64
Figura 25. Resumen de los resultados de las variables que tuvieron diferencia significativa en
la interacción AxBxC. ........................................................................................... 66
Figura 26. Gráfico de control de calidad de metanol en la obtención de alcohol etílico. ........ 68
xviii
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue evaluar las características físico químicas del mucílago de cacao
con el fin de evitar el desperdicio y lograr aprovecharlo convenientemente en la elaboración de
alcohol etílico. Se utilizó un esquema trifactorial (Variedades: CCN-51 y Nacional;
Microorganismos fermentativos: Flora natural y Levadura; Pasteurización: Pasteurizado y Sin
pasteurizar) conducido en un D.B.C.A. Se procedió a extraer las almendras de las mazorcas de
cacao para la obtención del mucílago de las mismas; posteriormente se procedió a acondicionar
el mucílago con las variables a evaluar, se colocó en botellas de color oscuro y se dejó fermentar
21 días. Después de transcurrido este tiempo se procedió a filtrar el mismo para evitar
problemas con la destilación y a continuación se inició a destilar a 75°C por aproximadamente
2 horas. Como resultado de los tratamientos aplicados, según el análisis estadístico con la
prueba de Tukey se obtuvo que hay diferencia significativa entre la interacción triple en la
variable porcentaje de rendimiento, siendo el mejor tratamiento la interacción de Cacao
Nacional + Levadura + Pasteurización con un rendimiento de 19,49%, y el tratamiento más
bajo siendo la interacción de Cacao CCN-51 + Flora Natural + Pasteurización con un 16,39%
de rendimiento. La variable grados alcohólicos no mostró diferencia significativa en la
interacción triple, encontrándose en un rango entre 42,33 °GL y 50°GL. Los análisis de rastro
de metanol fueron negativos para todos los tratamientos, siendo el producto apto para el
consumo humano.
PALABRAS CLAVE
CACAO
MUCÍLAGO
ALCOHOL ETÍLICO
MICROORGANISMOS
GRADOS ALCOHÓLICOS
xix
SUMMARY
The objective of this work was to evaluate the physical and chemical characteristics of the cocoa
mucilage in order to stop the waste and achieve it conveniently in the production of ethyl
alcohol. A trifactorial scheme was used (Varieties: CCN-51 and National, Fermentative
Microorganisms: Natural Flora and Yeast, Pasteurization: Pasteurized and Unpasteurized)
conducted in a D.B.C.A. The almonds were extracted from the cocoa pods to obtain their
mucilage; Subsequently, the mucilage was conditioned with the variables to be evaluated and
placed in dark colored bottles and allowed to ferment for 21 days. After this time elapsed, it
was filtered to avoid problems with the distillation and then it was started to distill it at 75 ° C
for approximately 2 hours. As a result of the treatments applied, according to the statistical
analysis with Tukey test, it was found that there is a significant difference between the triple
interaction in the variable percentage of yield, being the best treatment the interaction of
National Cacao + Yeast + Pasteurization with a yield of 19.49%, and the lowest treatment being
the interaction of Cacao CCN-51 + Natural Flora + Pasteurization with a 16.39% yield. The
variable alcoholic degrees showed no significant difference in the triple interaction, being in a
range between 42.33 ° GL and 50 ° GL. Methanol trace analyzes were negative for all
treatments, the product being suitable for human consumption.
KEYWORDS:
COCOA
MUCILAGE
ETHYL ALCOHOL
MICROORGANISMOS
ALCOHOL DEGREES
1
“EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL MUCÍLAGO DE CACAO
(Theobroma cacao L.) EN LA OBTENCIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO”.
I. INTRODUCCIÓN
El cacao es el producto ecuatoriano de exportación tradicional con una relevante historia en
el capital del país. Incluye alrededor de 100 000 familias de productores. La encuesta nacional
de empleo, desempleo y subempleo realizado por el INEC en marzo de 2016 establece que el
5% de la Población Económicamente Activa (PEA) nacional se encuentra en el sector cacaotero
y el 15% de la PEA rural (Pino, Aguilar, & Sisalema, 2018).
Las industrias únicamente se han concentrado en procesar la almendra para elaborar
diferentes productos, sin embargo, no han aprovechado de manera adecuada su mucílago o más
conocido como baba de cacao.
En Santo Domingo el líquido exudado proveniente de los granos de cacao es eliminado en
el momento de cura o fermentación y posterior secado, eliminando así un gran recurso que los
agricultores podrían utilizar para obtener mayores ingresos, ya que este líquido posee muchas
características favorables tal como lo menciona (Álvarez, Pérez, & Lares, 2002) ya que aparte
de influir en proceso de fermentación y en la formación de las sustancias precursoras del sabor
y aroma del chocolate, también se lo puede industrializar en diversos productos como vino,
vinagre, mermelada y etanol (alcohol etílico).
Un punto importante a considerar es que el desarrollo de nuevos productos a partir del uso
integral del cacao, a más de generar ingresos extras a los productores de cacao, contribuye con
el crecimiento industrial de nuestro país y al mismo tiempo, crear fuentes de trabajo,
2
optimizando la gran cantidad de este producto, al mismo tiempo de generar información local
para el sector agroindustrial en desarrollo.
Por este motivo la presente investigación pretende evaluar las características físico químicas
del mucílago de cacao (Theobroma cacao L.) para la obtención de alcohol etílico; además de
determinar las características del etanol obtenido a partir de dos variedades de cacao (CCN-51
y Nacional), evaluar la influencia de los microorganismos fermentativos y el tratamiento de
pasteurización en el proceso de obtención de alcohol etílico y determinar el costo de producción
del etanol elaborado a partir del mucílago de cacao; para de esta manera contribuir con el
aprovechamiento del mucílago, darle mayor valor agregado y diversificar el uso de otras partes
constitutivas del cacao como lo es el exudado de las semillas.
3
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 CACAO
El cacao es una fruta de origen tropical, este árbol posee flores pequeñas y pétalos largos,
su fruto es leñoso de forma alargada, emerge en la copa de los árboles y debajo de sus ramas.
Dependiendo del tipo de cacao pueden ser de color amarillo, blanco, verde o rojo. El grano está
cubierto de una pulpa rica en azúcar denominada baba o mucílago (MA&CAO Exportadora
Agrícola, 2017).
2.1.1 Variedades
2.1.1.1 Cacao nacional
El cacao fino y de aroma tiene particularidades específicas de aroma y sabor indagadas
por los fabricantes de chocolate. Constituye únicamente 5% de la producción mundial de cacao.
Ecuador, por su ubicación geográfica y su riqueza en recursos naturales, es el productor por
excelencia de Cacao Arriba fino y de aroma (63% de la producción mundial) proveniente de la
variedad Nacional cuyo sabor ha sido renombrado durante siglos en el mercado internacional.
Se estima que un 75% de las exportaciones de cacao es fino de aroma mientras que el restante
25% corresponde a otras variedades como el CCN51 (Castillo, 2018).
4
2.1.1.2 Cacao CCN – 51
Castro investigó desde 1952 las diversas variedades del grano, en definitiva obtuvo la
del tipo 51, sus iniciales significan Colección Castro Naranjal, posee características como alta
tolerancia a las enfermedades, alta productividad y calidad (Simbioti-k, 2016).
Los frutos poseen una coloración rojiza en su estado de desarrollo, además almacenan grandes
cantidades de grasa (Anecacao, 2015).
2.2 MUCÍLAGO DE CACAO
El mucílago o baba de cacao como es conocida comúnmente es una pulpa aromática que
cubre las semillas la cual proviene de sus tegumentos. La pulpa mucilaginosa se conforma de
células esponjosas parenquimatosas, que contienen células de savia ricas en azúcares (10-13%),
pentosas (2-3%), ácido cítrico (1-2%), y sales (8-10%) (Luzuriaga, 2012).
Alaniz, Arvizú, & González, 2012 mencionan que el mucílago es una sustancia
adherente, generalmente diáfana, que contiene el cacao. Es un producto de origen vegetal, de
peso molecular elevado, superior a 200000 g/gmol.
5
2.2.1 Composición físico química del mucílago de cacao
En la tabla 1 presenta los datos de composición de la pulpa de las semillas de cacao
antes y después de la fermentación.
Tabla 1. Composición de la pulpa de las semillas del cacao.
Antes de la fermentación Después de la fermentación
Agua 82 - 87% 45 - 47%
Sacarosa 12% 0%
Ácido cítrico 1 - 2% 0,5%
Pectina 1 – 1,5% -
pH 3,7 6,5
Alcohol etílico - 0,5%
Ácido acético - 1,6%
Fuente: (Luzuriaga, 2012).
En la tabla 2 se presenta los datos de composición físico química del mucílago del cacao
Nacional y CCN-51 de un ensayo realizado en la cuidad de Quevedo- Ecuador.
Tabla 2. Composición físico química del mucílago del cacao Nacional y CCN-51.
Parámetros Nacional CCN-51
Acidez (%) 0,71 0,91
pH (%) 3,7 3,87
°Brix (%) 15 16
Humedad (%) 82,5 80,5
Proteína (%) 0,87 0,38
Densidad (g/cm3) 1,044 1,076
Fuente: (Vallejo, y otros, 2016).
6
2.2.2 Usos del mucílago de cacao.
El exudado tiene un sabor tropical, ha sido usado para hacer los siguientes productos:
jalea de cacao, alcohol y vinagre, nata y pulpa procesada. La pulpa puede ser consumida fresca
en forma de jugos o "batidos". Además, la pulpa se puede preservar por congelación y ser
utilizada para dar sabor a helados y yogures (Marquéz & Salazar, 2015).
Tabla 3. Subproductos del cacao con referencia a una productividad anual de 750 kg de cacao
seco por hectárea.
Subproductos Rendimientos
Miel de cacao 200 L
Jalea 150 kg
Vinagre 180 L
Destilados 25 L
Pulpa 300-400 L
Jugo congelado 300-400 L
Néctar 600- 800 L
Mermelada 200-300 L
Fuente: Ortiz & Jaimes, 2005.
2.2.3 Rendimiento del mucílago de cacao.
El exudado del mucílago del cacao que no es aprovechado por la almendra para su
fermentación natural, representa el 59% del peso total del grano seco (Balladares, 2016).
Aproximadamente 40 litros de pulpa se pueden obtener de 800 kilos de semillas frescas
(Marquéz & Salazar, 2015).
Según (Vallejo, y otros, 2016) existe un rendimiento de más de 70 litros de material
mucilaginoso por tonelada de cacao.
7
2.2.4 Rendimiento del mucílago de cacao en etanol.
Según el estudio realizado por Balladares, 2016 Si consideramos que la producción total
de cacao seco de Ecuador en el 2014, fue de 240 000 TM y el 59% de esa cantidad es mucílago
no empleado por la almendra para su fermentación; entonces, 141 600 TM de lixiviado de cacao
se quedan en campo. Esa cantidad de subproducto del beneficio del cacao, equivale a 12 320
TM de azúcares reductores.
Tomando en cuanta una eficiencia de conversión, de tan solo el 60% durante la
fermentación, esos azúcares presentes en el lixiviado, producirían 1 261 450 galones de etanol
hidratado (4- 5% de agua) (Balladares, 2016).
2.3 FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA.
La fermentación alcohólica es un proceso biológico, en el cual un azúcar fermentable es
convertido en alcohol etílico y CO2, mediante la gestión de bacterias, o levaduras.
Generalmente se usa Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen la cual convierte
un 90% del azúcar en cantidades equimolares de alcohol y dióxido de carbono. Teóricamente
de 100 gramos de glucosa se obtiene 48,90% de CO2 y 5,10% de alcohol etílico (Carrillo &
León, 2006).
2.3.1 Levaduras presentes en las fermentaciones de cacao.
El mucílago es rico en carbohidratos y tiene un pH bajo, en esos contextos se favorece el
desarrollo de levaduras. En la primera fase aparecen entre cinco y seis especies diferentes de
levaduras, que luego desaparecen dejando su lugar a Hanseniaspora guilliermondii Pijper, que
es la levadura sobresaliente durante las primeras 24 horas. Candida silvae Vidal-Leir. & Uden,
8
Antonie van Leeuwenhoek, Candida zemplinina y Candida diversa Y. Ohara, Nonom. &
Yunome ex Uden & H.R. Buckley son levaduras que se encuentran frecuentemente en las
fermentaciones en bandejas, probablemente por la mayor concentración de oxígeno en ese tipo
de fermentación. Se reporta que a las 36-38 horas dominan Saccaromyces cerevisiae Meyen ex
E.C.Hansen y Pichia membranaefaciens Hansen, que se encuentra al final de la fermentación;
Candida krusei Berkhout y Hanseniaspora guilliermondii Pijper, en las fermentaciones en
bandejas, y predomina también Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen (Salazar,
2017).
Las levaduras llevan a cabo el proceso de fermentación, transformando los azúcares
sencillos del mucílago o pulpa en etanol, degradando la pectina, y eliminando el ácido cítrico,
lo que trae como consecuencia una disminución de la acidez. Por otro lado, la sociedad de
levaduras consume el oxígeno, instaurando un ambiente anaerobio que beneficia el desarrollo
de bacterias lácticas (Wacher, 2011).
2.3.2 Bacterias ácido lácticas (BAL) presentes en las fermentaciones de cacao.
Las especies aisladas con más frecuencia en las fermentaciones de cacao son:
Lactobacillus brevis E.B. Fred, W.H. Peterson y J.A. Anderson, Lactobacillus plantarum
Bergey y Lactobacillus fermentum Beijerinck.
Lactobacillus: son bacterias Gram positivas en forma de bacilos, son estrictamente
fermentativos con requerimientos nutricionales complejos. Son anaerobios y anaerobios
facultativos.
Leuconostoc: son bacterias Gram positivas en forma de cocobacilos, anaerobias facultativas,
dispuestas en pares y cadenas. Es un género predominante entre las BAL encontrado en plantas.
9
L. mesenteroides subsp. Mesenteroides es el género que principalmente se aísla en los alimentos
fermentados de origen vegetal, es generalmente el primer organismo en crecer y ser sustituido
por lactobacilos más tolerantes al ácido.
Las BAL son cocos o bacilos Gram positivos, no móviles y no generan esporas. Son
catalasa negativa y oxidasa negativa (Salazar, 2017).
2.3.3 Bacterias ácido acéticas (BAA) presentes en las fermentaciones de cacao.
Las BAA son bacterias Gram negativas pertenecientes a la familia Acetobacteraceae,
aeróbicas estrictas, no formadoras de esporas, con forma elipsoidal o de bacilo que pueden
presentarse aisladas, en pares o en cadenas. Entre los géneros pertenecientes a esta familia se
encuentran: Granulibacter, Acidomonas, Asaia, Kozakia, Neoasaia, Swaminathania,
Saccharibacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter y Acetobacter. Son oxidasa negativas y
catalasa positivas, a excepción de Acetobacter peroxydans Beijerinck, la cual es catalasa
negativa (Salazar, 2017).
10
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 UBICACIÓN DEL ÁREA DE INVESTIGACIÓN
3.1.1 Ubicación Política
País: Ecuador
Provincia: Santo Domingo de los Tsáchilas
Cantón: Santo Domingo
Parroquia: Luz de América
Sector: km 35 Vía Quevedo
3.1.2 Ubicación Ecológica
Zona de vida: Bosque húmedo Tropical
Altitud: 224 msnm
Temperatura media: 24,6 º C
Precipitación: 2860 mm año
Humedad relativa: 85%
Heliofanía: 739 horas luz año
Suelos: Francos Arenoso
Fuente: Estación Agro Meteorológica “Puerto Ila” Vía Quevedo km 34.
11
3.1.3 Ubicación Geográfica
Figura 1. Ubicación geográfica donde se desarrolló la investigación.
Latitud: 00° 24´ 36"
Longitud: 79° 18´ 43"
Altitud: 270 msnm
12
3.2 MATERIALES
3.2.1 Caracterización física de las mazorcas de cacao.
Tabla 4. Recursos necesarios para la caracterización física de las mazorcas de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Muestras
Balanza Cinta métrica
Vaso de precipitación de 500ml
Mazorcas de cacao
3.2.2 Determinación de Sólidos Solubles.
Tabla 5. Recursos necesarios para la determinación de Sólidos solubles en el mucílago de cacao
y vino de mucílago de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Muestras
Refractómetro Pisetas Mucílago de cacao
Vino de mucílago de cacao
3.2.3 Determinación de pH.
Tabla 6. Recursos necesarios para la determinación del pH en el mucílago de cacao y vino de
mucílago de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Muestras
Potenciómetro Vaso de precipitación de 200 ml. Mucílago de cacao
Vino de mucílago de cacao
13
3.2.4 Determinación de Acidez.
Tabla 7. Recursos necesarios para la determinación de acidez en el mucílago de cacao y vino
de mucílago de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Reactivos Muestras
Potenciómetro
Agitador
Plancha térmica
magnética
Equipo de titulación
Vaso de precipitación
de 200 ml.
NaOH 0,1N
Agua destilada
Mucílago de cacao
Vino de mucílago de cacao
3.2.5 Determinación de Proteína
Tabla 8. Recursos necesarios para la determinación de proteína en el mucílago de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Reactivos Muestras
Balanza analítica sensible al
0.1mg.
Unidad digestora.
Sorbora o colector/extractor
de humos (unidad scrubber
y bomba de vacío de
circulación de agua).
Unidad de destilación
FISHER DESTILLING.
Plancha de calentamiento
con agitador magnético.
Tubos de
destilación.
Matraz Erlenmeyer
de 250 ml.
Gotero.
Mortero.
Ácido sulfúrico
concentrado
96%(d=1,84).
Solución de
Hidróxido de Sodio
al 35%.
Solución de Ácido
Bórico al 2%.
Solución de Ácido
Clorhídrico 0,1 N
(HCL) debidamente
Estandarizada.
Tabletas
Catalizadoras.
Indicador Kjeldahl.
Mucílago de
cacao
14
3.2.6 Determinación de ceniza
Tabla 9. Recursos necesarios para la determinación de ceniza en el mucílago de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Reactivos Muestras
Mufla Crisoles.
Desecador.
Agua destilada Mucílago de cacao.
3.2.7 Determinación de materia seca y humedad
Tabla 10. Recursos necesarios para la determinación de materia seca y humedad del mucílago
de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Reactivos Muestras
Desecador.
Estufa.
Balanza analítica.
Cajas Petri Mucílago de cacao.
3.2.8 Determinación de grasa
Tabla 11. Recursos necesarios para la determinación de grasa del mucílago de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Reactivos Muestras
Balanza.
Estufa.
Vasos Beacker para grasa.
Aparato Golfish.
Vasos de recuperación del
solvente.
Desecador.
Dedales de Extracción.
Portadedales.
Mortero.
Probeta de 100 ml.
Pisetas.
Pipetas.
Papel Filtro.
Espátula.
Pinza Universal.
Algodón liofilizado.
Éter di etílico Mucílago de
cacao
15
3.2.9 Determinación de densidad
Tabla 12. Recursos necesarios para la determinación de densidad del mucílago de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Reactivos Muestras
Baño maría.
Balanza analítica.
Picnómetro. Agua destilada. Mucílago de cacao
3.2.10 Determinación de Grados Alcohólicos
Tabla 13. Recursos necesarios para la determinación de grados alcohólicos en el vino de
mucílago de cacao y alcohol etílico de mucílago de cacao.
Equipos Materiales/Insumos Muestras
Alcoholímetro Probeta de 200 ml Vino de mucílago de cacao
Alcohol etílico de mucílago de cacao
3.2.11 Recuento e identificación de poblaciones microbianas.
Tabla 14. Recursos necesarios para el recuento e identificación de poblaciones microbianas.
Equipos Materiales/Insumos Reactivos Muestras
Incubadora.
Autoclave.
Cámara de flujo
laminar.
Microscopio
Tubos de ensayo.
Láminas Petri Film.
Mecheros
Asas metálicas.
Portaobjetos
Cubreobjetos
Medio de cultivo PDA.
Medio de cultivo Manitol.
H2O2 (Agua oxigenada)
KOH
Agua destilada
Azul de metileno
Safranina
Aceite de inmersión.
Alcohol-acetona
Mucílago
de cacao.
16
3.2.12 Pruebas toxicológicas para determinar la presencia de metanol en el alcohol
etílico.
Tabla 15. Recursos necesarios para la realización de pruebas toxicológicas para determinar la
presencia de metanol en el alcohol etílico.
Materiales/Equipos Reactivos Muestras
Vasos de precipitación.
Balanza analítica.
Pipeta automática.
Puntas desechables
Permanganato de potasio 1%.
Ácido sulfúrico puro.
Ácido oxálico
Ácido sulfúrico
Fuxina bisulfatada (reactivo de Shiff).
Yodo.
Hidróxido de sodio.
Alcohol etílico de
mucílago de cacao
Metanol.
3.3 MÉTODOS
3.3.1 Obtención de la Materia Prima
Para la obtención del mucílago se procedió a recolectar mazorcas de cacao de la variedad
nacional y CCN-51 de la Finca de la familia Ibarra ubicada en Puerto Limón; se recolectaron
las mazorcas lo más uniformes posibles en apariencia y madurez. Se recolectó la cantidad de
mazorcas necesarias para completar 1,5 L de exudado por cada tratamiento y se procedió a la
extracción de las semillas del interior y se colocaron en sacos que permitieron que pueda
escurrir el mucílago de los mismos. Los sacos se colocaron en un escurridero armado
artesanalmente con bloques y madera de manera inclinada; al final se colocaron tachos limpios
para almacenar el mucilago. Al siguiente día se procedió a recolectar el mucílago y almacenarlo
en botellones limpios para ser llevados al laboratorio de agrobiotecnología de la Universidad
17
de las Fueras Armadas ESPE ubicado en el km 35 de la vía Santo Domingo – Quevedo, donde
se realizaron las evaluaciones correspondientes y la aplicación de los tratamientos.
De las mazorcas recolectadas para la extracción del mucílago se seleccionaron 20 de
cada variedad para evaluar las características físicas de las mismas en el laboratorio.
3.3.2 Diseño Experimental
3.3.2.1 Factores y niveles del experimento
Tabla 16. Factores y niveles a probar.
Factores Niveles
Variedades de cacao (A) A1= Nacional
A2= CCN-51
Microorganismos Fermentativos (B)
B1= Flora Natural
B2= Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
Pasteurización (C) C1= Pasteurizado
C2= Sin pasteurizar.
3.3.2.2 Tratamientos a comparar.
Tabla 17. Tratamientos a comparar.
Tratamiento Código Descripción
T1 A1B1C1 Cacao Nacional + Flora Natural + Pasteurizado.
T2 A1B1C2 Cacao Nacional + Flora Natural + Sin pasteurizar.
T3 A1B2C1 Cacao Nacional + Levadura + Pasteurizado.
T4 A1B2C2 Cacao Nacional + Levadura+ Sin pasteurizar.
T5 A2B1C1 Cacao CCN-51 + Flora Natural + Pasteurizado.
T6
T7
T8
A2B1C2
A2B2C1
A2B2C2
Cacao CCN-51 + Flora Natural + Sin pasteurizar.
Cacao CCN-51 + Levadura + Pasteurizado.
Cacao CCN-51 + Levadura + Sin pasteurizar.
18
3.3.2.3 Tipo de diseño
El diseño experimental que se utilizó fue un esquema trifactorial (2X2X2) conducido
en un D.B.C.A.
3.3.2.4 Repeticiones
El experimento se conformó de ocho tratamientos con tres repeticiones, obteniendo
veinticuatro unidades experimentales.
3.3.2.5 Características de la unidad experimental
La unidad experimental estuvo conformada por 1L de mucílago para cada repetición.
3.3.3 Análisis estadístico
3.3.3.1 Esquema de análisis de varianza
El esquema del análisis de la varianza se presenta en la tabla 18.
Tabla 18. Esquema del análisis de varianza.
Fuente de Variación Grados de Libertad
Variedad A-1 1
Microorganismos fermentativos B-1 1
Pasteurización
Variedad x Microorganismos fermentativos
C-1
(A-1)(B-1)
1
1
Variedad x Pasteurización (A-1)(C-1) 1
Microorganismos fermentativos x Pasteurización (B-1)(C-1) 1
Variedad x Microorganismos fermentativos x
Pasteurización (A-1)(B-1)(C-1) 1
Error Experimental 16
Total 23
19
3.3.3.2 Análisis funcional
Se realizó la prueba de significancia de Tukey al 5 %.
3.3.4 Variables a medir
3.3.4.1 Análisis Físico de las mazorcas de Cacao
Se evaluaron 20 mazorcas de cada variedad (Nacional y CCN-51), midiendo las siguientes
variables:
Largo de las mazorcas: Se midió utilizando una cinta métrica de un extremo a otro en
forma longitudinal de la mazorca.
Diámetro: Se midió utilizando una cinta métrica, rodeando la mazorca por la mitad de
forma transversal para obtener su circunferencia; luego se determinó el diámetro
utilizando la fórmula:
d: C/π
Dónde:
d: diámetro
C: circunferencia
Peso de las partes constitutivas de la mazorca: Se procedió a evaluar el peso de las
partes de la mazorca individualmente, primero se tomó el peso total de la mazorca y se
procedió a separar la cascara, el maguey y las semillas húmedas para pesar cada una de
ellas individualmente.
20
Número de semillas por mazorca: Después de pesar las semillas de la mazorca se
procedió a contabilizar el número de las mismas.
3.3.4.2 Determinación de pH del mucílago y vino
Se realizó el procedimiento siguiendo las indicaciones de la NTE (INEN 0389, 1986).
Se verifico el correcto funcionamiento del potenciómetro.
Se midió 25 ml de muestra y se colocó en un vaso de precipitación, luego se añadió 100
cm3 de agua destilada, se agitó suavemente hasta que las partículas quedaron
uniformemente suspendidas.
Luego se determinó el pH por lectura directa, introduciendo los electrodos del
potenciómetro en el vaso de precipitación con la muestra, cuidando que estos no toquen
las paredes del recipiente.
3.3.4.3 Determinación de sólidos solubles del mucílago y vino
Se colocó de dos a tres gotas de la muestra en el prisma fijo del refractómetro y
se procedió a leer la cantidad de sólidos solubles totales en grados Brix.
3.3.4.4 Determinación de acidez titulable del mucílago y vino
Se realizó de acuerdo a los procedimientos para la determinación de acidez titulable por el
método potenciométrico de referencia para conservas vegetales según la NTE (INEN 0381,
1986).
21
a) Se colocó 25 cm3 de la muestra en un matraz volumétrico de 250 cm3 y se diluyo a
volumen con agua destilada previamente hervida y enfriada, mezclando perfectamente
la solución y sumergir los electrodos en la muestra.
b) Rápidamente se añadió de 10 a 50 cm3 de la solución 0,1 N de hidróxido de sodio,
agitando hasta alcanzar pH 6, determinado con el potenciómetro.
c) Se continuar añadiendo lentamente solución 0,1 N de hidróxido de sodio hasta obtener
pH 7; luego, adicionando la solución 0,1 N de hidróxido de sodio en cuatro gotas por
vez, registrando el volumen de la misma y el pH obtenido después de cada adición, hasta
alcanzar pH 8,3 aproximadamente.
d) Por interpolación se estableció el volumen exacto de solución 0,1 N de hidróxido de
sodio añadido, correspondiente al pH 8,1 y se procedió a realizar los cálculos siguientes
para obtener el resultado:
𝐴 = (𝑉1𝑁1𝑀)10
𝑉2
Siendo:
A = g de ácido en 1 000 cm3 de producto.
V1 = cm3de NaOH usados para la titulación de la alícuota.
N1 = normalidad de la solución de NaOH.
M = peso molecular del ácido considerado como referencia.
V2 = volumen de la alícuota tomada para el análisis.
3.3.4.5 Determinación de proteína del mucílago
Para la determinación de proteína en el mucílago se basó en la metodología descrita por
la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC 920.105, 1990).
22
Preparación De La Muestra
Como el mucílago es un producto líquido primero se procedió a concentrar la muestra
eliminando la mayor cantidad de humedad posible poniéndola en la estufa por
aproximadamente 72 horas y finalmente se obtuvo una miel semisólida que facilitó la
realización del análisis de proteína.
Digestión
Se pesó 0,3g de muestra y colocó en el micro- tubo – digestor.
Se añadió al micro-tubo una tableta catalizadora y 5ml de ácido sulfúrico concentrado
y se colocaron los tubos digestores con las muestras en el block-digest con el colector
de humo funcionando.
Se realizó la digestión a temperatura de 350ºC a 400ºC Tiempo de 1 a 2 Horas.
Al finalizar el líquido tiene un color verde o azul; se dejó enfriar la muestra a
temperatura ambiente.
Destilación
En cada micro- tubo se adicionó 15ml de agua destilada y se colocó el micro-tubo y el
matraz de recepción con 10 g /1,2 L de agua.
Se encendió el sistema y adicionó 30 ml de hidróxido d sodio al 40%.
Se recogió aproximadamente 200 ml de destilado, se retiró el sistema de accesorios y
apagar.
Titulación
Al destilado se le aumentaron 3 gotas del indicador y se procedió a titular con ácido
clorhídrico 0,1N utilizando un agitador mecánico.
23
Se registró el volumen de ácido consumido y se realizaron los siguientes cálculos:
%𝑷𝑩(𝑽𝑯𝑪𝑰 − 𝑽𝒃) ∗ 𝟏, 𝟒𝟎𝟏 ∗ 𝑵𝑯𝑪𝑳 ∗ 𝑭
𝒈. 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒓𝒂
Siendo:
1,401= Peso atómico del Nitrógeno
NHCL= Normalidad del ácido clorhídrico
VHCI = Volumen del ácido clorhídrico
F = Factor conversión 6,25
Vb= Volumen blanco (0,3)
3.3.4.6 Determinación de ceniza del mucílago
Se realizó de acuerdo a los procedimientos de la NTE (INEN 520, 1980).
Como muestra se utilizó la miel de mucílago que se realizó en el laboratorio.
Se calienta el crisol de porcelana vacío en la mufla ajustada a 550 ± 15°C, durante 30
min. Se dejó enfriar en el desecador y pesó con aproximación al 0,1 mg.
Se colocó al crisol en la balanza y pesó 5 g de la muestra.
Se colocó el crisol con su contenido en la mufla a 550 ± 15°C hasta obtener cenizas de
un color gris claro; si la muestra no mostraba el color deseado se agregaban unas gotas
de agua destilada y se procedía a homogenizar la muestra en los crisoles y eliminar la
humedad colocándolos sobre una estufa; luego se volvía a colocar en la mufla hasta que
toda la muestra muestre el color deseado de forma homogénea.
Se sacó de la mufla el crisol con la muestra, se dejó enfriar en el desecador y se procedió
a pesar tan pronto alcanzó la temperatura ambiente, con aproximación al 0,1 mg.
24
Cálculos:
% 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 =𝐶3 − 𝐶1
𝐶2 − 𝐶1𝑋100
Dónde:
C1= masa del crisol vacío en gramos.
C2= masa del crisol con la muestra en gramos.
C3= masa del crisol con las cenizas en gramos.
3.3.4.7 Determinación de humedad y materia seca del mucílago
Humedad:
Se colocó un vaso de precipitación en la balanza y registro el peso del mismo (m1), a
continuación, se colocó 200 ml del mucílago y se registró el peso del mismo (m2).
Se coloca la muestra en la estufa a 105 °C por 72 horas. Registrar como (m3).
Cálculos:
% ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =𝑚2 − 𝑚3
𝑚2 − 𝑚1𝑥100
Dónde:
m 1: masa de la capsula vacía y de su tapa, en gramos.
m 2: masa del vaso de precipitación con la muestra antes del secado, en gramos.
m 3: masa de la capsula con tapa más la muestra desecada, en gramos.
25
Materia seca:
La materia seca se determinó restándole el porcentaje de humedad obtenido a 100.
3.3.4.8 Determinación de grasa del mucílago
Como muestra se utilizó la miel de mucílago que se realizó en el laboratorio.
Se secaron los vasos beakers en la estufa a 100°C ±, por el tiempo de una hora, luego se
los transfirió al desecador y se pesó con aproximación al 0,1 mg cuando alcanzó la
temperatura ambiente.
Se pesó aproximadamente 2 g de muestra sobre un papel filtro y se colocó en el interior
del dedal, taponando con suficiente algodón hidrófilizado, luego se introdujo en el
portadetal.
Se colocó el dedal y su contenido en el vaso beaker y se llevó a los anillos metálicos del
aparato de golfish.
Se adicionó en el vaso beaker 40 ml de solvente, al mismo tiempo abrir el reflujo de
agua.
Se colocó el anillo en el vaso y se llevó a la hornilla del aparato golfish, ajustando al
tubo refrigerante del extractor. Se levantó la hornilla y graduar la temperatura a 55°C
Cuando existe sobre presión abrir las válvulas de seguridad dos a tres veces.
El tiempo óptimo para la extracción de grasa es de cuatro horas, mientras tanto se
observa que el éter no se evapore caso contrario se colocara más solvente.
Terminada la extracción, se bajó con cuidado los calentadores y se retiró
momentáneamente el vaso con el anillo; Se sacó el portadetal con el dedal y colocó el
vaso recuperar del solvente.
26
Se levantaron los calentadores y dejó hervir hasta que el solvente este casi todo en el
vaso de recuperación, no quemar la muestra.
Se bajó los calentadores y retiró los beaker, con el residuo de la grasa y el solvente.
El vaso con la grasa se llevó a la estufa a 105°C hasta completar la evaporación del
solvente durante 30 minutos, luego se dejó enfriar hasta temperatura ambiente en el
desecador, se pesó y registró.
Se calculó el extracto etéreo por diferencia de pesos con la siguiente fórmula:
𝑮 =𝑾𝟐 − 𝑾𝟏
𝑾𝟎𝒙 𝟏𝟎𝟎
G = Porcentaje de grasa
W0= Peso de la muestra
W1= Peso del vaso beaker vacio
W2= Peso del vaso más la grasa
3.3.4.9 Determinación de densidad del mucílago
Se realizó de acuerdo con el procedimiento según la NTE (INEN 391, 1986).
Se pesó el picnómetro completamente limpio y seco con aproximación al 0,1 mg.
Se llenó el picnómetro con agua destilada (recientemente hervida y enfriada hasta 15°-
18°C) hasta la marca respectiva, evitando la formación de burbujas de aire.
Se colocó la tapa y sumergió el picnómetro en el baño de agua a 20° ± 0,5°C, durante
30 min.
Se retiró el picnómetro del baño y se sacó exteriormente por completo y pesarlo con
aproximación al 0,1 mg.
27
Se vació, secó y limpió cuidadosamente el picnómetro y se colocó en él la muestra hasta
la marca respectiva, evitando la formación de burbujas de aire; tapar y sumergir el
picnómetro en el baño de agua a 20° ± 0,5°C, durante 30 min.
Se retiró el picnómetro del baño, se secó cuidadosamente por la parte exterior y pesó
con aproximación al 0,1 mg.
Cálculos:
La densidad relativa a 20/20°C se determina mediante la ecuación siguiente:
𝑑 =𝑚3 − 𝑚1
𝑚2 − 𝑚1
Siendo:
d = densidad relativa a 20/20°C.
m1 = masa del picnómetro vacío, en g.
m2 = masa del picnómetro con agua, en g.
m3 = masa del picnómetro con la muestra, en g.
3.3.4.10 Determinación del rendimiento del vino y alcohol etílico
Para el rendimiento del vino se midió los ml iniciales de mucilago que se puso a
fermentar en las botellas, y después se midió los ml finales del vino obtenido y se utilizó
la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de rendimiento:
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑐í𝑙𝑎𝑔𝑜 𝑎 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑟
𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑛𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙𝑋100
Para el rendimiento del alcohol etílico se midió los ml iniciales de vino que se puso a
destilar, y después se midió los ml finales del alcohol etílico obtenido y se utilizó la
siguiente fórmula para calcular el porcentaje de rendimiento:
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑛𝑜 𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑡𝑖𝑙𝑎𝑟
𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑐𝑜ℎ𝑜𝑙 𝑒𝑡𝑖𝑙í𝑐𝑜𝑋100
28
3.3.4.11 Determinación de grados alcohólicos del vino y alcohol etílico.
Se determinó de acuerdo con el procedimiento de la NTE (INEN 340, 1994).
Se procedió a colocar la muestra preparada en la probeta perfectamente limpia y seca.
Se limpió y secó cuidadosamente el alcoholímetro y se introdujo suavemente en la
probeta con la muestra, manteniéndolo así durante 10 minutos.
Se dejó en reposo hasta que desaparezcan las burbujas de aire que se forman en el seno
del líquido y se efectuó la lectura en el alcoholímetro, considerando el nivel real del
líquido y no la elevación del menisco, utilizando una lupa, si fuera necesario.
3.3.4.12 Recuento e identificación de poblaciones microbianas.
Inoculación en lámina Petri film.
Se preparó la muestra (mucílago de cacao CCN-51 y Nacional, pasteurizado y en estado
natural), en base a la diluciones 10 -3 y 10-2 .
Se procedió a inocular (levaduras y bacterias), transfiriendo 1 ml del inóculo a la
superficie de la lámina de Petri film.
Se deslizó cuidadosamente hacia abajo la película con el fin de evitar que queden
burbujas atrapadas.
Se colocó el difusor encima del inóculo, el círculo dentado limitará el área por la que se
extienda el inóculo.
Sé aplicó suavemente presión sobre el difusor para distribuir uniformemente el inóculo
sobre la totalidad del área circular.
Se retiró el difusor y se esperó 1 minuto para que el gel solidifique.
29
Se incubó el Petri film de bacterias a 37°C y el de levaduras a 24°C por 48 horas.
Transcurrido este período se procedió a efectuar el conteo.
El número de microorganismos se calculó con la siguiente fórmula según (Yousef &
Carlstrom, 2003).
𝑅𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝑈𝐹𝐶
𝑚𝑙) =
𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎𝑠 𝑑𝑢𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎𝑠
𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑥 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎
Preparación e Inoculación de medios de cultivos.
Preparación de Medio de Cultivo Manitol (para Bacterias).
a. Se pesó 22,2 g de Manitol para preparar 200ml del medio.
b. Se disolvió en agua destilada hirviendo.
c. Se homogenizó la mezcla utilizando un agitador magnético.
d. Se embotelló el medio y se esterilizó para evitar la proliferación de
contaminantes con la ayuda de la autoclave (121 ° C) durante 20 minutos.
e. Una vez estéril en la cámara de flujo laminar se repartió el medio de cultivo
en placas de Petri estériles y se dejó en reposo para que se solidifique.
Preparación de Medio de Cultivo PDA (para Levaduras).
a. Se pesó 7,8g de PDA para preparar 200ml de medio de cultivo.
b. Se disolvió en agua destilada hirviendo.
c. Se homogenizó la mezcla utilizando un agitador magnético.
30
d. Se embotelló el medio y se esterilizó para evitar el desarrollo de
contaminantes con la ayuda de la autoclave (121 ° C) durante 20 minutos.
e. Una vez estéril en la cámara de flujo laminar se repartió el medio de cultivo
en placas de Petri estériles y se dejó en reposo para que se solidifique.
Inoculación en los medios de cultivos.
a. La siembra se efectuó en la cámara de flujo laminar previamente esterilizada,
se flameó el asa de siembra y se dejó que se enfríe al aire.
b. Se levantó la lámina Petri film y se introdujo el asa en el gel.
c. Se procedió a sembrar en el medio de cultivo moviendo el asa en zigzag
hacia el centro de la caja.
d. Se selló la caja Petri y se procedió a incubar (bacterias a 37°C y levaduras a
24°C) por 24 horas.
Identificación de los microrganismos aislados.
Identificación de bacterias.
Prueba Catalasa
Esta prueba se realizó en base al procedimiento según (Olmos, Fuentes, Nieto, &
Ramos, 2010).
a) Se depositó una colonia en un porta objetos.
b) Se añadió una gota del reactivo (peróxido de hidrógeno).
c) Se efectuó la lectura en 10-20 segundos
31
d) Se realizó la interpretación de resultados:
Positivo: formación de burbujas
Negativo: no formación de burbujas o muy escasa producción tras 20 segundos.
Prueba Oxidasa con KOH
Esta prueba se realizó en base al procedimiento según (Lagunas & Vega, 2013):
Se colocó sobre un porta objeto una gota de KOH al 3 %.
Con el asa se recolectó muestras de las colonias bacterianas en estudio, se mezcló
con la gota de KOH, con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos.
Interpretación: Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, la prueba
es positiva e indica que se trata de bacterias Gram negativas. Si al separar el asa no se
forma hebra, la prueba es negativa, e indica que las bacterias son Gram positivas.
Tinción de Gram
Se transfirió una porción de la colonia bien aislada desde la placa sembrada y se
mezcló con una gota de agua destilada (usando un asa de platino) en el
portaobjetos del microscopio.
Se mezcló y difundió la masa bacteriana con ayuda de un asa.
Se dejó secar la extensión al aire.
Se fijó la extensión con calor pasando el portaobjetos sobre la llama de un
mechero.
Se ejecutó la tinción de Gram como sigue:
32
a. Se cubrió la extensión con cristal violeta (Tinción primaria). Se lavó
suavemente la extensión una vez teñida (después de 60 segundos).
b. Se inundó la extensión con la solución de yodo de Gram y se lavó con agua
destilada tras 60 segundos de tratamiento.
c. Se lavó con un decolorante (mezcla de cetona y alcohol) durante 2- 3 segundos
y luego se enjuagó con agua destilada.
d. Se cubrió la extensión con safranina (tinción segundaria) durante 60 segundos
y luego se lavó con agua destilada.
Se examinó al microscopio de 100X la extensión del portaobjetos.
Se anotó la interpretación de la tinción Gram. Las células Gram positivas
aparecen de un color azul y las Gram negativas con color de rosado a rojo, se
observó la forma y tinción características de cada cepa. Estos resultados fueron
comparados con el ensayo realizado por (Salazar, 2017), con el tema
Aislamiento y caracterización de microorganismos durante el proceso de
fermentación de Theobroma cacao L.
Bacterias Ácido Lácticas
Figura 2. A. Colonia (20X) B. Bacilos Gram positivos (1000X) de
Lactobacillus plantarum B. (Salazar, 2017).
33
Figura 3 A. Colonia (20X) B. Bacilos Gram positivos (1000X) de
Lactobacillus brevis E.B. Fred, W.H. Peterson y J.A.
Anderson. (Salazar, 2017).
Figura 4 A. Colonia (20X) B. Cocobacilos Gram positivos (1000X) de
Leuconostoc mesenteroides Tsenkovskii, & van Tieghem.
(Salazar, 2017).
34
Bacterias Ácido Acéticas
Figura 5. A. Colonia (20X) B. Bacilos Gram negativos (1000X) de
Gluconobacter spp. Henneberg. (Salazar, 2017).
Figura 6 A. Colonia (20X) B. Bacilos Gram negativos (1000X) de Acetobacter
spp. Beijerinck. (Salazar, 2017).
Identificación de levaduras.
Transfiera una porción de la colonia a una gota de agua destilada sobre un
portaobjeto de microscopio.
Emulsione y extienda la muestra y fije al calor la extensión resultante.
Haga una tinción simple (es decir, con cristal violeta) durante 60 segundos.
35
Examine las células utilizando lentes 100X con aceite de inmersión.
Los resultado observados fueron comparados con el ensayo realizado por
(Salazar, 2017), con el tema Aislamiento y caracterización de microorganismos
durante el proceso de fermentación de Theobroma cacao L.
Levaduras
Figura 7. A. Colonia (20X) B. Células (1000X) de Saccharomyces cerevisiae
Meyen ex E.C.Hansen. (Salazar, 2017).
Figura 8. A. Colonia (20X) B. Células (1000X) de Hanseniaspora uvarum
Berkhout. (Salazar, 2017).
36
Figura 9. Colonia (20X) B. Células (1000X) de Candida utilis Lodder &
Kreger-van. (Salazar, 2017).
Figura 10. A. Colonia (20X) B. Células (1000X) de Candida tropicalis
Berkhout. (Salazar, 2017).
Figura 11. A. Colonia (20X) B. células (1000X) de Candida boidinii R.
(Salazar, 2017).
37
3.3.4.13. Pruebas toxicológicas para determinar la presencia de metanol en el
alcohol etílico.
Preparación de la Fuxina bisulfatada (reactivo de Shiff).
Se realizó según la metodología del documento “Pruebas de identificación del metanol y
etanol” de (Aguilar, 2016)
Se pesó 0,1 g de fucsina básica, en un vaso de precipitación de 250 ml.
Se disolvió en 37,5 ml de agua destilada, a 80 °C.
Se enfrió la mezcla.
Se agregó 1,5 g de bisulfito de sodio y se procedió a disolver.
Se agregó 0,75 ml de ácido clorhídrico concentrado y se procedió a agitar.
Se aforó a 50 ml con agua destilada.
Reacción de SCHIFF:
Se realizó según la metodología del documento “Pruebas de identificación del metanol y
etanol” de (Aguilar, 2016).
A 1 ml de la muestra se le añadió 1ml de permanganato de potasio al 1%, después
de mezclar se adiciono cinco gotas de ácido sulfúrico puro (98%) y se dejó reposar
por tres minutos.
Se añadió 10 gotas de solución saturada de ácido oxálico; la mezcla adquiere un
color madera que se decolora totalmente luego de agregarle nuevamente cinco gotas
de ácido sulfúrico puro (98%).
38
Finalmente, se le añadió 1ml de fuxina bisulfatada (reactivo de Shiff), con lo cual
se produce un intenso color violeta en caso positivo, tal como ve en la Figura 12.
Figura 12. Coloración de la prueba de metanol con reactivo de Shiff.
Fuente: (Aguilar, 2016).
Ensayo con yodo e hidróxido de sodio:
Se realizó según la metodología del documento “Pruebas de identificación del metanol y
etanol” de (Aguilar, 2016).
Añadimos 10 gotas de la muestra directamente en un tubo de ensayo y añadimos 25
gotas de yodo y 10 gotas de hidróxido de sodio al 1%. Se movió el tubo de ensayo
con suavidad y esperó 2 minutos.
Después se observaron los cambios en las muestras, el etanol retendrá un color
amarillento, mientras que el metanol se pondrá de manifiesto una vez más; tal como
se observa en la Figura 13.
Figura 13. Reconocimiento por el ensayo con yodo.
Fuente: (Aguilar, 2016).
39
3.3.4.14 Análisis de Metanol.
Los análisis de metanol se realizaron en el Laboratorio de Análisis y Aseguramiento de la
Calidad Multianalityca Cía. Ltda, en la ciudad de Quito, el cual cuenta con el Servicio de
Acreditación Ecuatoriano (SAE) como Laboratorio Acreditado bajo la norma NTE ISO/IEC
17025. El método utilizado para efectuar dichos análisis fue por Cromatografía de Gases,
los resultados fueron interpretado en base a la Norma (INEN 0362, 2014) en donde estable
los requisitos de Bebidas alcohólicas: Aguardiente de caña rectificado.
40
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Caracterización física de las mazorcas de cacao.
Tabla 19. Caracterización física de las mazorcas de cacao.
Parámetro
analizado CCN-51
Desviación
estándar Nacional
Desviación
estándar
Largo (cm) 29,05 1,93 21,9 1,68
Diámetro (cm) 10,87 1,79 10,65 2,24
Peso total (kg) 0,95 0,13 0,73 0,16
Peso semillas kg) 0,26 0,03 0,15 0,03
Peso maguey (kg) 0,04 0,01 0,01 0,00
Peso cáscara (kg) 0,65 0,11 0,56 0,13
N° de semillas 54,85 7,02 43,75 5,07
En la tabla 19 se muestra las variables físicas de las mazorca de cacao de las dos
variedades evaluadas, el peso del maguey en la variedad CCN-51 representa el 4,21% de peso
total de la mazorca que fue de 0,95 kg, mientras que en el cacao Nacional representa el 1,36%
del peso total de la mazorca que fue de 0,73 kg en promedio, la cáscara de la variedad CCN-51
equivale al 68,46% del peso total, y el del cacao Nacional al 76,71%, en cuanto al peso de la
semillas en la variedad CCN-51 se estima un porcentaje del 27,37%, y en el cacao Nacional se
tiene un 20,54% del peso total de la mazorca, de estos porcentajes según (Balladares, 2016) la
almendra seca, representa apenas el 6,2% en base seca del peso total de la mazorca, mientras
que diferencia lo constituyen los desechos agrícolas que en nuestro país poco o nulo
aprovechamiento tienen.
41
4.2 Caracterización físico – química del mucílago de cacao
Tabla 20. Caracterización físico – química del mucílago de cacao.
Parámetro
analizado Unidad Nacional CCN-51
Acidez titulable % 0,49 0,5
pH 3,63 3,22
Proteína % 1,7 1,2
Ceniza % 3,96 1,88
Humedad % 85,74 81,76
Materia Seca % 14,26 18,24
Grasa % 0,17 0,125
Sólidos solubles ° Brix 15 18
Densidad g/cm3 1,03 1,06
En la variable evaluada acidez titulable se observa que no existe diferencias entre las
dos variedades, teniendo el cacao Nacional 0,49% y el cacao CCN-51 0,5%; aunque estos
valores se encuentran por debajo de los obtenidos por (Vallejo Torres, y otros, 2016) que
presentó en su estudio un valor de 0,71% para el cacao Nacional y 0,91% para el CCN-51. En
cuanto al valor de pH los mismos autores presentaron valores de 3,7 para cacao Nacional y 3,
87 para el CCN-51, siendo mayor a los valores obtenidos en el presente estudio, en el que se
obtuvo valores de 3,63 en cacao Nacional y 3,22 en CCN-51. El cacao Nacional registró 85,74%
de humedad mientras que el CCN-51 tuvo un valor de 81,76%; estos datos no se diferencian
mucho de los obtenidos por (Vallejo Torres, y otros, 2016) en su investigación, ya que
presentaron valores de 82,5% para Nacional y 80,5% para CCN-51.
Con respecto a la variable contenido de proteína el valor obtenido del cacao Nacional
de 1,7% difiere con el resultado obtenido por (Vallejo Torres, y otros, 2016) con un valor de
42
0,87% para esta variedad; y la el cacao CCN-51 con un valor de 1,2% no concuerda con el valor
obtenido en la investigación de (Quimbita & Rodríguez, 2008) con un valor de 0,28%. Este
valor bajo se debe a que según (Medina & Pagano, 2003) las frutas prácticamente no contienen
proteínas. El porcentaje que poseen es mínimo y corresponde con algunas enzimas que
intervienen en la maduración de determinadas frutas, en los aromas, en las alteraciones de los
tejidos del vegetal y las modificaciones del color.
El valor obtenido para la variedad Nacional en ceniza de 3,96% es mucho mayor al valor
de 0,72% obtenido por (Arguello, 2015), mientras que el valor de 1,88% del cacao CCN-51 no
difiere mucho con el valor de 1,5% obtenido por (Quimbita & Rodríguez, 2008); Esta variación
según (Medina & Pagano, 2003) se debe a que el porcentaje de cenizas está asociado al
contenido mineral y en general depende del manejo agronómico del cultivo.
El contenido de grasa obtenido para la variedad Nacional con 0,17% y la variedad CCN-
51 con 0,125% se encuentran cercanos a los datos obtenidos por (Luzuriaga, 2012) con 0,1%
para CCN-51 y con (Arguello, 2015) que obtuvo 0,08% para Nacional.
En cuanto a la variable sólidos solubles obtenidos concuerda con (Vallejo Torres, y
otros, 2016) en la variedad Nacional con 15° Brix, y con (Villavicencio, 2018) en la variedad
CCN-51 con un valor de 17° Brix.
El análisis de densidad realizado concuerda con (Vallejo Torres, y otros, 2016), con un
valor para la variedad Nacional de 1,044 y el obtenido fue de 1,03; mientras que la variedad
CCN-51 expresa un valor de 1,076 y el obtenido en la investigación fue de 1,06.
43
4.3 Recuento de poblaciones microbianas
Tabla 21. Recuento de poblaciones microbianas del mucílago de cacao.
Bacterias (UFC/ml) Levaduras (UFC/ml)
Pasteurizado Sin pasteurizar Pasteurizado Sin pasteurizar
Nacional 1325 125350 3500 6350
CCN51 2275 65950 0 175
Bacterias Levaduras
Figura 14. Poblaciones microbianas encontradas en el mucílago de cacao
Como se observa en la figura 14 las muestras que se sometieron al proceso de
pasteurización tuvieron menor cantidad de colonias bacterianas y de levaduras; en el caso de la
variedad CCN-51 pasteurizado no se encontró presencia de levaduras en absoluto. esto puede
deberse a que las bacterias resisten más el calor que las levaduras, según (RENALOA, 2014) la
temperatura más conveniente para la multiplicación de levaduras es de 25 a 27°C, por lo que
no resiste temperaturas sensiblemente superiores, ya que a 55ºC suspende su actividad de vida
y a 60ºC muere la célula de la levadura.
1325
125350
2275
65950
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
Pasteurizado Sin pasteurizar
UFC
/ml
Nacional CCN51
3500
6350
0 1750
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Pasteurizado Sin pasteurizar
UFC
/ml
nacional CCN51
44
4.4 Identificación de levaduras y bacterias presentes en el mucílago de cacao.
Levaduras:
Nacional sin pasteurizar Nacional pasteurizado CCN-51 sin pasteurizar
Saccharomyces cerevisiae H.
Saccharomyces cerevisiae H.
Hanseniaspora uvarum S.
Figura 15. Levaduras aisladas e identificadas en el mucílago de cacao.
Bacterias:
Tabla 22. Resultados de las pruebas de identificación de bacterias.
Nacional sin
pasteurizar
Nacional pasteurizado CCN-51 sin pasteurizar CCN-51 pasteurizado
Bacilos
Gram –
Catalasa positiva
Oxidasa negativa
Bacilos
Gram –
Catalasa positiva
Oxidasa negativa
Bacilos
Gram –
Catalasa positiva
Oxidasa negativa
Bacilos
Gram –
Catalasa positiva
Oxidasa negativa
Gluconobacter spp Gluconobacter spp Gluconobacter spp Gluconobacter spp
Figura 16. Bacteria (Gluconobacter spp) aislada e identificada del mucílago de cacao.
45
En la figura 15 se muestran las levaduras observadas bajo el microscopio; se determinó
que la variedad Nacional sin pasteurizar y pasteurizada contiene levaduras Saccharomyces
cerevisiae H y la variedad CCN-51 sin pasteurizar contiene Hanseniaspora uvarum S, no se
encontraron levaduras o mohos en la variedad CCN-51 pasteurizada. La identificacion de las
bacterias se determino comparando con las figuras 7 y 8 obtenidas de la investigacion
“Aislamiento y caracterización de microorganismos durante el proceso de fermentación de
cacao” según (Salazar, 2017). De la misma manera se identificó la bacteria Gluconobacter spp
que se muestra en la figura 16 contenida en todas las muestras de estudio, también se realizaron
pruebas bioquímicas para determinar a qué género pertenecen las bacterias aisladas y las
posibles especies a las cuales podrían corresponder y al ser observadas al microscopio se
comparó con la figura 5 como guía para su identificación.
Según (Salazar, 2017) en el mucílago de cacao es común encontrar Bacterias acido lácticas y
Bacterias acido acéticas junto con diferentes levaduras; pero en la investigación no se encontró
presencia de BAL al momento de realizar el análisis, es posible que esto se deba a que durante
el proceso de la fermentación, el recuento total de microorganismos presentes en la masa de
pulpa de cacao aumenta durante las primeras 24-36 horas y luego se estabiliza o se reduce
gradualmente dependiendo del microorganismo; y según con el estudio realizado por (Salazar,
2017), se encontró que las BAL cumplían con esta generalidad, mientras que las levaduras y
las BAA al cuarto día aumentaban su población.
46
4.5 Análisis de varianza para la variable rendimiento de la obtención de vino.
Tabla 23. Análisis de varianza para la variable rendimiento de la obtención de vino.
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Razón-F P-valor
A: Variedades 27,74 1 27,74 4,22 0,0592
B: Microorganismos 0,24 1 0,24 0,04 0,8512
C: Pasteurización 12,04 1 12,04 1,83 0,1975
Repetición 0,88 2 0,44 0,07 0,9359
AB 19,08 1 19,08 2,90 0,1106
AC 4,68 1 4,86 0,74 0,4045
BC 0,08 1 0,08 0,01 0,9129
ABC 2,67 1 2,67 0,41 0,5345
Error 92,07 14 6,58
Total 159,65 23
Coeficiente de
variación
2,68
En la tabla 19 se observa que no existe diferencia significativa en el Factor A
(variedades), el Factor B (microorganismos fermentativos), el Factor C (pasteurización), las
repeticiones ni las interacciones A*B, A*C, B*C y A*B*C.
47
4.6 Análisis de varianza de la variable grados alcohólicos de la obtención de vino.
Tabla 24. Análisis de varianza de la variable grados alcohólicos de la obtención de vino.
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Razón-F P-valor
A: Variedades 28,17 1 28,17 9,17 0,0090*
B: Microorganismos 0,67 1 0,67 0,22 0,6484
C: Pasteurización 20,17 1 20,17 6,57 0,0225*
Repetición 0,52 2 0,26 0,08 0,9191
AB 0,00 1 0,00 0,00 >0,9999
AC 13,50 1 13,50 4,40 0,0546
BC 0,67 1 0,67 0,22 0,6484
ABC 0,67 1 0,67 0,22 0,6484
Error 42,98 14 3,07
Total 107,33 23
Coeficiente de
variación
18,28
Existe diferencia significativa en el Factor A (variedades) y el Factor C (pasteurización);
mientras que no existe diferencia significativa para el Factor B (microorganismos), las
interacciones A*B, B*C, A*C, A*B*C y las repeticiones.
48
4.7 Análisis de varianza para la variable Sólidos solubles de la obtención de vino.
Tabla 25. Análisis de varianza de la variable Sólidos solubles de la obtención de vino.
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Razón-F P-valor
A: Variedades 12,04 1 12,04 28,59 0,0001*
B: Microorganismos 3,38 1 3,38 8,01 0,0133*
C: Pasteurización 3,38 1 3,38 8,01 0,0133*
Repetición 0,27 2 0,14 0,32 0,7302
AB 2,04 1 2,04 4,85 0,0449*
AC 0,04 1 0,04 0,10 0,7577
BC 0,37 1 0,37 0,89 0,3614
ABC 2,04 1 2,04 4,85 0,0449*
Error 5,90 14 0,42
Total 29,46 23
Coeficiente de
variación
6,86
Existe diferencia significativa en el Factor A (variedades), el Factor B
(microorganismos), el Factor C (pasteurización), en la interacción A*B y A*B*C; mientras que
no existe diferencia significativa para, las interacciones A*C, B*C, y las repeticiones.
49
4.8. Análisis de varianza para la variable contenido de metanol de la obtención de
alcohol etílico.
Tabla 26. Análisis de varianza de la variable contenido de metanol de la obtención de alcohol
etílico.
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Razón-F P-valor
A: Variedades 75,30 1 75,30 6394,23 <0,0001*
B: Microorganismos 2,13 1 2,13 180,89 <0,0001*
C: Pasteurización 21,30 1 21,30 1808,87 <0,0001*
Repetición 0,01 2 0,008 0,33 0,7272
AB 37,38 1 37,38 3173,95 <0,0001*
AC 38,79 1 38,79 3293,75 <0,0001*
BC 0,32 1 0,32 27,54 <0,0001*
ABC 5,58 1 5,58 473,67 <0,0001*
Error 0,16 14 0,01
Total 180,96 23
Coeficiente de
variación
1,66
De acuerdo con la tabla 26 existe diferencia significativa para el Factor A, Factor B,
Factor C, la interacción AB, AC, BC y ABC; mientras que para la repetición no existe
diferencia significativa.
50
4.9 Análisis de varianza para la variable pH de la obtención de vino.
Tabla 27. Análisis de varianza para la variable pH de la obtención de vino.
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Razón-F P-valor
A: Variedades 0,03 1 0,03 14,47 0,0019*
B: Microorganismos 0,0012 1 0,0012 0,64 0,4381
C: Pasteurización 0,0002 1 0,0002 0,11 0,7473
Repetición 0,0019 2 0,00094 0,50 0,6192
AB 0,03 1 0,03 14,47 0,0019*
AC 0,01 1 0,01 5,29 0,0373*
BC 0,0015 1 0,0015 0,80 0,3874
ABC 0,0045 1 0,0045 2,40 0,1436
Error 0,0314 0,0019
Total 0,10 23
Coeficiente de
variación
1,15
Existe diferencia significativa en el Factor A (variedades), en la interacción A*B y A*C;
mientras que no existe diferencia significativa para el Factor B (microorganismos), el Factor C
(pasteurización), la interacción B*C y A*B*C.
51
4.10 Análisis de varianza para la variable acidez titulable de la obtención de vino
Tabla 28. Análisis de varianza para la variable acidez titulable de la obtención de vino.
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Razón-F P-valor
A: Variedades 0,01 1 0,01 1,12 0,3077
B: Microorganismos 0,01 1 0,01 0,65 0,4333
C: Pasteurización 0,05 1 0,05 4,07 0,0632
Repetición 0,0006 2 0,0003 0,03 0,9748
AB 0,0001 1 0,0001 0,01 0,9110
AC 0,13 1 0,13 11,06 0,0050*
BC 0,0038 1 0,008 0,33 0,5750
ABC 0,03 1 0,03 2,90 0,1107
Error 0,16 14 0,01
Total 0,40 23
Coeficiente de
variación
8,71
Como se observa en la Tabla 23 existe diferencia significativa en la interacción A*C;
mientras que para el Factor A, Factor B, Factor C, interacción A*B, B*C y A*B*C y las
repeticiones no existe diferencia significativa.
52
4.11 Análisis de varianza para la variable rendimiento de la obtención de alcohol etílico.
Tabla 29. Análisis de varianza para la variable rendimiento de la obtención de alcohol etílico.
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Razón-F P-valor
A: Variedades 4,82 1 4,82 5,60 0,0329*
B: Microorganismos 0,15 1 0,15 0,17 0,6851
C: Pasteurización 3,68 1 3,68 4,28 0,0575
Repetición 6,48 2 3,24 3,77 0,0591
AB 2,71 1 2,71 3,15 0,0897
AC 2,86 1 2,86 3,32 0,0006*
BC 16,83 1 16,83 19,56 0,0977
ABC 0,03 1 0,03 0,04 0,8481
Error 12,04 14 0,86
Total 49,61 23
Coeficiente de
variación
5,17
Existe diferencia significativa en el Factor A (variedades), en la interacción A*C;
mientras que no existe diferencia significativa para el Factor B (microorganismos), el Factor C
(pasteurización), las repeticiones y la interacción B*C, A*B y A*B*C
53
4.12 Análisis de varianza para la variable grados alcohólicos de la obtención de alcohol
etílico.
Tabla 30. Análisis de varianza para la variable grados alcohólicos de la obtención de alcohol
etílico.
Fuente de variación Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Razón-F P-valor
A: Variedades 40,04 1 40,04 4,59 0,0503*
B: Microorganismos 9,38 1 9,38 1,07 0,3177
C: Pasteurización 40,04 1 40,04 4,59 0,0503
Repetición 15,08 2 7,54 0,86 0,4429
AB 35,04 1 35,04 4,01 0,0449*
AC 1,04 1 1,04 0,12 0,7349
BC 0,04 1 0,04 0,0048 0,9459
ABC 1,04 1 1,04 0,12 0,7349
Error 122,25 14 8,73
Total 263,96 23
Coeficiente de
variación
6,32
Existe diferencia significativa en el Factor A (variedades) y en la interacción A*B;
mientras que el Factor B, el Factor c, las repeticiones y las interacciones A*C, B*C y A*B*C
no muestran diferencia significativa.
54
4.13 Prueba de significancia de Tukey del Factor A para la obtención del vino.
Tabla 31. Prueba de significancia de Tukey del Factor A para la obtención del vino.
Factor A % Rendimiento Grados
alcohólicos
Sólidos solubles pH Acidez titulable
A1 Nacional 96,74±2,76 (A) 8,50±2,20 (B) 8,75±0,89 (B) 3,83±0,037 (A) 1,26±0,074 (A)
A2 CCN-51 94,59±2,76 (A) 10,67±2,20 (A) 10,17±0,89 (A) 3,76±0,037 (B) 1,21±0,074 (A)
Grados alcohólicos pH
Sólidos solubles
Figura 17. Efecto de las variedades sobre los grados alcohólicos (A), pH (B) y contenido de
sólidos solubles (C).
CCN-51 Nacional
Gráfico Caja y Bigotes
5
6
7
8
9
10
11
°GL
VariedadesCCN-51 Nacional
Gráfico Caja y Bigotes
3,6
3,7
3,8
3,9
4
Ph
Variedades
CCN-51 Nacional
Gráfico Caja y Bigotes
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
Gra
do
s B
rix
Variedades
A B
C
10,67
8,5 3,83
3,76
8,75
10,17
55
En la figura 17, se presenta el resumen de los resultados de las variables que tuvieron
diferencia significativa en el Factor A, mediante la prueba Tukey al 5%, con respecto a la
variable Grados Alcohólicos del vino de mucílago de cacao de las variedades analizadas, el
cacao Nacional presenta 8,5 °GL, mientras que el cacao CCN-51 obtuvo 10,17 °GL, dichos
valores se encuentran dentro del rango establecidos por la (INEN 0374, 2015) para bebidas
alcohólicas (vino) la cual menciona un mínimo de 5 °GL y un máximo 18 °GL.
En la variable pH la variedad con mayor numero fue la Nacional, que obtuvo un
valor de 3,83, mientras que CCN-51 expresó un pH menor de 3,76; esto se debe a que la
variedad Nacional tenía un pH inicial alto, por lo que no se utilizó bicarbonato de sodio para
corregirlo y que este dentro del rango de 3,6 a 4 necesario para iniciar el proceso de
fermentación; mientras que la variedad CCN-51 tenía un pH por debajo de lo necesario por lo
que se adicionó bicarbonato de sodio a todos los tratamientos.
4.14 Prueba de significancia de Tukey del Factor B para la obtención del vino.
Tabla 32. Prueba de significancia de Tukey del Factor B para la obtención del vino.
Factor B % Rendimiento Grados
alcohólicos
Sólidos
solubles
pH Acidez titulable
B1 Flora
natural
95,77±2,76 (A) 9,42±2,20 (A) 9,08±0,89 (B) 3,80±0,037 (A) 1,22±0,074 (A)
B2 Levadura 95,57 ±2,76 (A) 9,75±2,20 (A) 9,83±0,89 (A) 3,78±0,037 (A) 1,26±0,074 (A)
56
Sólidos solubles
Figura 18. Efecto de los microorganismos fermentativos sobre el contenido de solidos
solubles.
Los tratamientos con flora natural como microorganismos de fermentación obtuvieron un
valor menor de 9,08° Brix como contenido de sólidos solubles en comparación con los
tratamientos en los que se utilizó levadura que obtuvieron un valor mayor de 9,83° Brix; estos
se debe a que en los tratamientos con flora natural se encuentra mayor diversidad de
microorganismos como (Saccharomyces cerevisiae H y Hanseniaspora uvarum S), y en los
tratamientos con levadura solo se encuentra Saccharomyces cerevisiae H, lo que concuerda con
lo citado por (Lucero, 2015) donde manifiesta que la disminución en los sólidos solubles se
debe a la transformación de azúcares solubles a etanol y CO2; siendo las levaduras las
responsables de esta transformación en fermentación alcohólica y además menciona que en
ocasiones el nivel de azúcar en el mosto es tan elevado que combinado con el alcohol que va
produciéndose durante la fermentación llega a matar las levaduras antes de transformarlo en su
totalidad, resultando en un vino con nivel sustancial de azúcar residual, lo que concuerda con
los resultados obtenidos, ya que el nivel alto de grados Brix dio como resultado un mayor nivel
de grados alcohólicos.
Flora Natural Levadura
Gráfico Caja y Bigotes
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
Gra
do
s B
rix
Microorganismos
9,08
9,83
57
4.15 Prueba de significancia de Tukey del Factor C para la obtención del vino.
Tabla 33. Prueba de significancia de Tukey del Factor C para la obtención del vino.
Factor C % Rendimiento
Grados
alcohólicos
Sólidos
solubles
pH Acidez titulable
C1 Pasteurizado 94,96±2,76 (A) 10,50±2,20 (A) 9,08±0,89 (B) 3,79±0,037 (A) 1,19±0,074 (A)
C2
Sin
pasteurización
96,38 ±2,76 (A) 8,67±2,20 (B) 9,83±0,89 (A) 3,79±0,037 (A) 1,28±0,074 (A)
Grados alcohólicos Sólidos solubles
Figura 19. Efecto de la pasteurización en los grados alcohólicos (A) y el contenido de sólidos
solubles (B).
En lo que respecta a la variable sólidos solubles se obtuvo un valor mayor para los
tratamientos Sin pasteurización con un valor de 9,83°Brix y para los tratamientos pasteurizados
un valor menor de 9,08°Brix ; esto es debido a que al pasteurizar el mucilago se logró una
mayor concentración de solidos solubles y se utilizó una menor cantidad de azúcar para corregir
los grados Brix necesarios para la fermentación, mientras que a los tratamientos sin pasteurizar
se les añadió una cantidad mayor de azúcar.
Pasteurizado Sin pasteurizar
Gráfico Caja y Bigotes
5
6
7
8
9
10
11
°GL
PasteurizaciónPasteurizado Sin pasteurizar
Gráfico Caja y Bigotes
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
Gra
do
s B
rix
Pasteurización
A B
8,67
10,50
9,83
9,08
58
4.16. Prueba de significancia de Tukey de la interacción AxBxC para la obtención del
vino.
Tabla 34. Prueba de significancia de Tukey de la interacción AxBxC para la obtención del vino.
Variedades Microorganismos Pasteurización Rendimiento Grados
alcohólicos
Sólidos
solubles
pH Acidez
titulable
Cacao
Nacional
Flora Natural Pasteurizado 98,87 A 10,00 A 8,67 CD 3,80 AB 1,10 A
Cacao
Nacional
Flora Natural Sin pasteurizar 97,60 A 6,67 A 8,67 CD 3,80 AB 1,39 A
Cacao
Nacional
Levadura Pasteurizado 95,60 A 10,33 A 8,00 D 3,90 A 1,18 A
Cacao
Nacional
Levadura Sin pasteurizar. 96,40 A 7,00 A 9,67 ABCD 3,81 AB 1,37 A
Cacao CCN-
51
Flora Natural Pasteurizado 92,37 A 11,00 A 9,00 BCD 3,79 AB 1,27 A
Cacao CCN-
51
Flora Natural Sin pasteurizar. 95,23 A 10,00 A 10,00 ABC 3,81 AB 1,12 A
Cacao CCN-
51
Levadura Pasteurizado. 94,50 A 10,67 A 10,67 AB 3,69 B 1,21 A
Cacao CCN-
51
Levadura Sin pasteurizar. 96,27 A 11,00 A 11,00 A 3,74 B 1,26 A
Según el análisis estadístico se determinó que no existe diferencia significativa en la
interacción de las Variedades + Microorganismos + Pasteurización para las variables
rendimiento, grados alcohólicos y acidez titulable, estando las dos últimas variables dentro del
rango establecido por NTE (INEN 0374, 2015) para vino de frutas, como se muestra en el
gráfico de control de calidad para la variable acidez titulable.
59
Figura 20. Gráfico de control de calidad de acidez titulable del vino.
Sólidos solubles
11 10,6710 9,67
9 8,67 8,678
0
2
4
6
8
10
12
Sinpasteurizar
Pasteurizado Sinpasteurizar
Sinpasteurizar
PasteurizadoPasteurizado Sinpasteurizar
Pasteurizado
Levadura Levadura Flora Natural Levadura Flora NaturalFlora NaturalFlora Natural Levadura
CCN-51 CCN-51 CCN-51 Nacional CCN-51 Nacional Nacional Nacional
grad
os
bri
x
A ABABC ABCD
BCDCD CD
D
A
60
pH
Figura 21. Efecto de la interacción entre las variedades, los microorganismos fermentativos y
pasteurización en el contenido de sólidos solubles (A) y pH (B).
La interacción que obtuvo un mayor contenido de sólidos solubles con un valor de
11°Brix fue CCN-51 + Levadura + Sin pasteurizar y la que obtuvo un valor menor con 8° Brix
fue la interacción entre Nacional + Levadura + Pasteurizado. Según (Lucero, 2015) la
fermentación alcohólica se detiene al momento que las levaduras dejan de convertir los azúcares
en alcohol porque ya no se encuentran azúcares en el medio o porque han sido inactivadas por
la concentración del alcohol presente, es por esto que la interacción que tuvo mayor contenido
de sólidos solubles también presento un valor mayor en el contenido de grados alcohólicos y
además contenía dos tipos de levaduras fermentativas (Saccharomyces cerevisiae H. y
Hanseniaspora uvarum S.), en comparación con la interacción que obtuvo menor cantidad de
solidos solubles y menor cantidad de grados alcohólicos que contenía solo un tipo de levaduras
fermentativas (Saccharomyces cerevisiae H.).
3,9
3,81 3,81 3,8 3,8 3,793,74
3,69
3,5
3,55
3,6
3,65
3,7
3,75
3,8
3,85
3,9
3,95
Pasteurizado Sinpasteurizar
Sinpasteurizar
Pasteurizado Sinpasteurizar
Pasteurizado Sinpasteurizar
Pasteurizado
Levadura Levadura FloraNatural
FloraNatural
FloraNatural
FloraNatural
Levadura Levadura
Nacional Nacional CCN-51 Nacional Nacional CCN-51 CCN-51 CCN-51
% p
H
A
AB AB AB AB ABB
B
B
61
La variable pH presentó diferencia significativa, siendo el tratamiento más bajo la
interacción entre Variedad CCN-51 + levadura + pasteurizado con un valor de 3,69 y el
tratamiento más alto fue la interacción entre la variedad Nacional + levadura + pasteurizado
con un valor de 3,90.
4.17 Prueba de significancia de Tukey del Factor A para la obtención del alcohol etílico.
Tabla 35. Prueba de significancia de Tukey del Factor A para la obtención del alcohol etílico.
Factor A % Rendimiento Grados
alcohólicos
Contenido de
metanol (mg/100cc)
A1 Nacional 18,40 ± 0,75 (A) 45,50 ± 1,83 (A) 4,79 ± 0,07 (A)
A2 CCN-51 17,51 ± 0,75 (B) 48,08 ± 1,83 (A) 8,33 ± 0,07 (B)
Porcentaje de rendimiento Contenido de metanol
Figura 22. Efecto de las variedades en el porcentaje de rendimiento (A) y contenido de
metanol (B).
CCN-51 Nacional
Gráfico Caja y Bigotes
13
15
17
19
21
% R
en
dim
ien
to
Variedades
CCN-51 Nacional
Gráfico Caja y Bigotes
0
2
4
6
8
10
Meta
no
l
Variedades
A B
18,40
17,51
4,79
8,33
62
La variedad con mayor porcentaje de rendimiento final de alcohol etílico fue Nacional
con un rendimiento de 18,4%, mientras que CCN-51 obtuvo un porcentaje de rendimiento de
17,51%; lo que difiere de los resultados obtenidos por (López, 2013) en donde manifiesta que
el mayor rendimiento de alcohol etílico a partir de destilado de mucílago fermentado es de la
variedad CCN-51 con un porcentaje de 25% de rendimiento.
En cuanto al contenido de metanol la variedad con mayor valor fue CCN-51 con 8,33
mg/100cc y la más baja fue Nacional con 4,79 mg/100 ml; ambos valores se encuentran dentro
del rango establecido por la NTE (INEN 0362, 2014), que es de 10 mg/100 ml para poder ser
para consumo humano.
4.18 Prueba de significancia de Tukey del Factor B para la obtención del alcohol etílico.
Tabla 36. Prueba de significancia de Tukey del Factor B para la obtención del alcohol etílico.
Factor B % Rendimiento Grados alcohólicos Contenido de
metanol (mg/100cc)
B1 Flora natural 18,03 ±0,57 (A) 47,42 ± 1,83 (A) 6,26 ± 0,07 (A)
B2 Levadura 17,88 ± 0,57 (A) 46,17 ± 1,83 (A) 6,85 ± 0,07 (B)
63
Contenido de metanol
Figura 23. Efecto de los microorganismos fermentativos en el contenido de metanol.
Existe diferencia significativa entre los microorganismos utilizados en la variable
contenido de metanol, siendo la Levadura la que obtuvo mayor valor con 6,85 mg/100ml,
mientras que los tratamientos con Flora natural obtuvieron el menor valor con 6,26 mg/ 100 ml.
(Cuenca & Collay, 2015) manifiestan que el metanol en los vinos suele estar en pequeña
proporción, siendo en las bebidas destiladas donde aumenta su concentración, debido a ser
volátil. Ambos valores de contenido de metanol se encuentran dentro del rango establecido para
el alcohol etílico de consumo humano.
4.19 Prueba de significancia de Tukey del Factor C para la obtención del alcohol etílico.
Tabla 37. Prueba de significancia de Tukey del Factor C para la obtención del alcohol etílico.
Factor C % Rendimiento Grados alcohólicos Contenido de
metanol (mg/100cc)
C1 Pasteurizado 17,56 ± 0,57 (A) 48,08 ± 1,83 (A) 5,61 ± 0,07 (A)
C2 Sin pasteurización 18,35 ± 0,57 (A) 45,50 ± 1,83 (A) 7,50 ± 0,07 (B)
Flora Natural Levadura
Gráfico Caja y Bigotes
0
2
4
6
8
10
Meta
no
l
Microorganismos
6,85
6,26
64
Contenido de metanol
Figura 24. Efecto de la pasteurización en el contenido de metanol.
Los tratamientos sin pasteurización obtuvieron el mayor contenido de metanol con 7,5
mg/100 ml y los tratamientos que se sometieron a un proceso de pasteurización tuvieron un
valor menor de 5,61 mg/100 ml; ambos valores se encuentran dentro de lo establecido por la
Norma (INEN 0362, 2014) para consumo humano.
Pasteurizado Sin pasteurizar
Gráfico Caja y Bigotes
0
2
4
6
8
10
Meta
no
l
Pasteurización
5,61
7,50
65
4.20 Prueba de significancia de Tukey de la interacción AxBxC para la obtención del
alcohol etílico.
Tabla 38. Prueba de significancia de Tukey de la interacción AxBxC para la obtención del
alcohol etílico.
Variedades Microorganismos Pasteurización Rendimiento Grados
alcohólicos
Contenido de
metanol
(mg/100cc)
Cacao Nacional Flora Natural Pasteurizado 17,23 (AB) 49,00 (A) 2,92 (B)
Cacao Nacional Flora Natural
Sin
pasteurizar 19,07 (A) 45,67 (A) 8,55 (F)
Cacao Nacional Levadura Pasteurizado 19,49 (A) 45,00 (A) 2,22 (A)
Cacao Nacional Levadura
Sin
pasteurizar. 17,83 (AB) 42,33 (A) 5,45 (C)
Cacao CCN-51 Flora Natural Pasteurizado 16,39 (B) 48,33 (A) 7,48 (E)
Cacao CCN-51 Flora Natural
Sin
pasteurizar. 19,46 (A) 46,67 (A) 6,09 (D)
Cacao CCN-51 Levadura
Pasteurizado. 17,16 (AB) 50,00 (A) 9,84 (G)
Cacao CCN-51 Levadura
Sin
pasteurizar. 17,03 (AB) 47,33 (A) 9,91 (G)
66
Porcentaje de Rendimiento
Contenido de metanol
Figura 25. Efecto de la interacción entre las variedades, los microorganismos fermentativos y
pasteurización en el porcentaje de rendimiento (A) y contenido de metanol (B).
19,49 19,46 19,07 17,83 17,23 17,16 17,03 16,39
0
5
10
15
20
25
Pasteurizado Sinpasteurizar
Sinpasteurizar
Sinpasteurizar
PasteurizadoPasteurizado Sinpasteurizar
Pasteurizado
Levadura FloraNatural
FloraNatural
Levadura FloraNatural
Levadura Levadura FloraNatural
Nacional CCN-51 Nacional Nacional Nacional CCN-51 CCN-51 CCN-51
%
A A AAB AB AB AB B
2,222,92
5,456,09
7,488,55
9,84 9,91
0
2
4
6
8
10
12
PasteurizadoPasteurizado Sinpasteurizar
Sinpasteurizar
Pasteurizado Sinpasteurizar
Pasteurizado Sinpasteurizar
Levadura Flora Natural Levadura Flora NaturalFlora NaturalFlora Natural Levadura Levadura
Nacional Nacional Nacional CCN-51 CCN-51 Nacional CCN-51 CCN-51
mg/
10
0cc
C
BA
D
E
F
G G
A
B
67
En la interacción entre los tres factores no se encontró diferencia para la variable grados
alcohólicos, encontrándose valores desde 42,33°GL y 50°GL, estando dentro del rango para
valores de aguardiente según (INEN 362, 2007), que indica que el grado alcohólico mínimo
para aguardiente de consumo humano es de 30°GL y el máximo de 50°GL.
La variable porcentaje de rendimiento presentó diferencia significativa, siendo el mejor
tratamiento la interacción entre variedad Nacional + levadura + pasteurizado con 19,49% y la
interacción entre variedad CCN-51 + flora natural + pasteurizado con el menor porcentaje de
rendimiento con 16,39%, valores que se encuentran dentro del rango en un estudio similar de
obtención de alcohol etílico de mucilago de cacao realizado por (López, 2013), donde obtuvo
un valor de 25% de rendimiento para CCN-51 y de 17,55% para Nacional.
Los resultados de porcentaje de rendimiento obtenido están relacionados con los
resultados de contenido de metanol, ya que la interacción entre variedad Nacional + levadura +
pasteurizado que obtuvo el mayor porcentaje de rendimiento también obtuvo el menor valor en
contenido de metanol con 2,22 mg/100 ml; mientras que la interacción CCN-51 + levadura +
sin pasteurizar y CCN-51 + levadura + pasteurizado que obtuvieron los valores más altos de
contenido de metanol se encuentran entre los que obtuvieron menor porcentaje de rendimiento;
sin embargo todos los tratamientos se encontraron por debajo del límite máximo permitido por
la NTE (INEN 0362, 2014) que es de 10 mg/100 ml, como se muestra en la figura 26.
68
Figura 26. Gráfico de control de calidad de metanol en la obtención de alcohol etílico.
4.21 Análisis Económico
Tabla 39. Flujo de caja de la investigación
Descripción Unidad Cantidad Costo unitario
($)
Costo total
($)
Tachos para recolección del
mucílago Unidad 2 10,5 21
Plástico Metros 10 0,78 7,8
Botellones de plástico (6L) Unidad 8 0,25 2
Botellas de plástico (1L) Unidad 24 0,1 2,4
Fundas negras Unidad 4 0,3 1,2
Azúcar Kg 1,5 1 1,5
Levadura Sobres 4 0,2 0,8
Bicarbonato Sobres 5 0,2 1
Botellas de vidrio Unidad 24 0,6 14,4
Globos Unidad 24 0,1 2,4
Placas Petri film Unidad 70
Transporte Unidad 40
Análisis de Metanol Unidad 179,2
Subtotal 343,7
Ingresos del ensayo
Etanol de mucílago de cacao 500ml 10 8,25 82,5
69
Tabla 40. Análisis costo-beneficio.
Inversión Ganancia/ha Ganancia Neta
mes 1-2 343,7 395,2 51,5
mes 3-4 154,9 395,2 240,3
mes 5-6 154,9 395,2 240,3
mes 7-8 154,9 395,2 240,3
mes 9-10 154,9 395,2 240,3
mes 11-12 154,9 395,2 240,3
Como se observa en la tabla 40 en el primer bimestre de instalación del proyecto ya se
obtienen una ganancia neta de $51,50; a partir del segundo bimestre ya no se toman en cuenta
los costos de los materiales para la recolección de materia prima porque estos son reutilizables,
por lo que la ganancia neta aumenta a $240,3 que el agricultor obtendrá adicional a la venta de
las almendras de cacao; por lo que la investigación representa una alternativa viable.
70
V. CONCLUSIONES
Factor A (Variedades)
En la caracterización del mucílago de cacao se determinó que la variedad Nacional y CCN-
51 presentan similitudes en cuanto a acidez titulable, pH, grasa y densidad; mientras que
tienen mayor diferencia en cuanto a contenido de proteína, ceniza, humedad y solidos
solubles.
En la obtención del vino a partir de mucílago de cacao se determinó según la prueba de
Tukey al 5% que no existió diferencia para las variables porcentaje de rendimiento y acidez
titulable; pero si hubo diferencia para el contenido de sólidos solubles, grados alcohólicos
y pH; siendo la variedad Nacional la que presentó un grado alcohólico menor con 8,5 °GL,
mientras que el cacao CCN-51 obtuvo 10,17 °GL.
Se acepta la hipótesis alternativa, y se concluye que las diferentes variedades de cacao si
influyen en las características del alcohol etílico a partir de mucílago de cacao; siendo la
variedad Nacional la que obtuvo mejores resultados tanto en rendimiento como en bajo
contenido de metanol.
Factor B (Microorganismos)
En la obtención del vino a partir de mucílago de cacao se determinó que no existió
diferencia para las variables porcentaje de rendimiento, acidez titulable, grados
alcohólicos y pH, pero si hubo diferencia para el contenido de sólidos solubles, siendo
71
los tratamientos a los que se les adiciono levadura los que obtuvieron mayor contenido
de solidos solubles.
Se acepta la hipótesis alternativa y se concluye que los diferentes microorganismos
fermentativos si influyen en las características del alcohol etílico a partir de mucílago
de cacao; siendo la flora natural con la que se obtienen menor contenido de metanol.
Factor C (Pasteurización)
En la obtención del vino a partir de mucílago de cacao se concluye que no existió
diferencia para las variables porcentaje de rendimiento, acidez titulable, y pH, pero si
hubo diferencia para el contenido de sólidos solubles y grados alcohólicos siendo los
tratamientos sin pasteurización los que obtuvieron mayor contenido de solidos solubles
y los tratamientos pasteurizados los que obtuvieron mayor grado alcohólico.
Se acepta la hipótesis alternativa y se concluye que la pasteurización si influyen en las
características del alcohol etílico a partir de mucílago de cacao; siendo los tratamientos
pasteurizados con los que se obtienen menor contenido de metanol.
Interacción ABC (Variedades x Microorganismos x Pasteurización).
Los diferentes factores aplicados en la investigación para la obtención de alcohol etílico a
partir del mucilago de cacao presentan diferencias de acuerdo con la prueba de Tukey al 5%
para las variables de porcentaje de rendimiento de alcohol etílico y contenido de metanol,
72
mientras que para la variable grados alcohólicos no se encontró diferencias entre los
tratamientos aplicados.
El mejor tratamiento para optimizar la obtención de alcohol etílico a partir del mucílago de
cacao fue el T3 (Cacao Nacional + Levadura + Pasteurizado), ya que obtuvo el mayor
porcentaje de rendimiento con 19,49% y el menor contenido de metanol con 2,22mg/100ml;
por lo que el proceso de pasteurización permite obtener un producto final de mejor calidad.
73
VI. RECOMENDACIONES
Realizar una adecuada recolección de la materia prima, ya que esto influye en el contenido
de microorganismos y en la contaminación que puede tener el mucilago. Debido a que este
subproducto no es comúnmente utilizado no existen infraestructuras adecuadas para la
recolección del mismo en las fincas, por lo que es importante implementar el ingenio de los
agricultores al momento de realizar esta práctica.
En el proceso de destilación se debe controlar la temperatura en todo momento para evitar
que se reduzca y se empiece a destilar metanol, y evitar que aumente demasiado ya que
podría filtrarse agua y disminuir la calidad de alcohol etílico a obtener.
Para una disminución del contenido de metanol en el producto final se debe profundizar en
el proceso del destilado y en los microorganismos fermentativos que se pueden usar para
este proceso.
74
VII. BIBLIOGRAFÍA
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![DISSERTAÇÃO DE MESTRADO IMPLEMENTAÇÃO DE …repositorio.ufrn.br:8080/jspui/bitstream/123456789/15798/1/MarcioB... · V S Volume de lama [m 3] V T Volume total (soma dos volumes)](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/5baaa44209d3f221798ceb52/dissertacao-de-mestrado-implementacao-de-v-s-volume-de-lama-m-3-v-t-volume.jpg)