De los orgenes a la actualidad

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/docs.php?curso=206

Tcnica Instrumental

La herramienta analticade mayor importancia

Componentes bsicos

Controlde flujo

Fasemvil

Introduccinde muestra

Columna Deteccin

Registroy proceso

Horno

C

PROCESO CROMATOGRAFICO

La fase mvil fluye a lo largo del lecho cromatogrfico en contacto con la fase estacionaria.

COLUMNA

COLUMNA

FASE MVIL FASE MVIL FASE MVIL

PROCESO CROMATOGRAFICO

La fase mvil fluye, arrastrando consigo los solutos.

Los solutos se reparten entre ambas fases

MuestraFaseestacionariaFase

mvil

AL ALIMENTAR LA MUESTRA AL SISTEMA, LOS SOLUTOS SE REPARTEN ENTRE LAS DOS FASES.

PROCESO CROMATOGRAFICO

Fase mvil

Fase estacionaria

t0Fase mvil

Fase estacionaria

t0

PROCESO CROMATOGRAFICO

LAS MOLECULAS DE SOLUTO EN FASE ESTACIONARIA SE ESTANCAN

LAS MOLECULAS EN FASE MOVIL AVANZAN CON ELLA

Fase mvil

Fase estacionaria

t1Fase mvil

Fase estacionaria

t1

PROCESO CROMATOGRAFICO

LA VELOCIDAD DEL SOLUTO VARIA INVERSAMENTE CON LA AFINIDAD POR LA FASE ESTACIONARIA.

F. mvil

F. estacionaria

SEPARACION DE SOLUTOS

LOS COMPONENTES CON CONSTANTES DE REPARTO DIFERENTES SE SEPARARN.

Fase mvil

Fase estacionaria

t0

SEPARACION DE SOLUTOS

Fase mvil

Fase estacionaria

t1

Fase mvil

Fase estacionaria

t2

Fase mvil

Fase estacionaria

t3

Dimensiones de la Columna L = Largo de columna (cm, mm) dc = dimetro interno (mm, m) df = espesor de pelcula de fase (m) dp = dimetro de partcula (m) Vo = volumen muerto (ml)

Velocidad y flujo de fase Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por

unidad de tiempo, medido a la salida de la columnay a temperatura ambiente (ml/min)

Velocidad de fase mvil = u = distancia mediarecorrida por la fase movil en una unidad de tiempo(cm/seg)

2F r u =

Tiempo Muerto (t0) El tiempo que tarda en eluir un soluto que no

interacciona con la fase estacionaria. El tiempo que se necesita para renovar totalmente

la fase mvil de la columna. to = Vo / Fo

TIEMPO DE RETENCIN tr = Tiempo transcurrido al momento de eluir el

mximo de concentracin del soluto. Vr = volumen de retencin = volumen de fase mvil

gastado al momento de eluir el mximo deconcentracin del soluto.

Vr = tr Fo

TIEMPO DE RETENCIN

tiempo

sea

l

tr

to

Constante de Reparto Equilibrio de reparto:Solutofm Solutofe

Cociente de las concentraciones del soluto. Solutoen la fase estacionaria entre soluto en fase mvil

KSoluto

Solutofe

fm

=

Ecuacin de la RetencinVr = Vo + KVe

El volumen de retencin de un soluto es la suma delas contribuciones del tiempo que estuvo en fasemvil (Vm) y en fase estacionaria (KVe).

K V VV

r o

e=

Tiempo de Retencin Corregido

tiempo

sea

l

trtr

to

Factor de Capacidad Cociente de la cantidad de soluto en fase

estacionaria entre la cantidad en fase mvil.

=kn

nsoluto

soluto

fe

fm

FACTOR DE CAPACIDAD

tiempo

sea

l

trtr

to

==

k tt

t tt

r

o

r o

o

Factor de Capacidad

Medida de la retencin del soluto. Indica que tan lejos del tiempo muerto eluye este.

= =k K V

Vt t

te

o

r o

o

Area y Altura del Pico

tiempo

Alt

ura

Area

Ancho del Pico

tiempo

sea

l

Alt

ura

A

ltur

a

wb

w0.5

En mediciones manuales w0.5 es mucho mas precisoque wb

PLATO TEORICO

tiempo

Alt

ura

A

ltur

a

tr

wb

w0.5

sea

l

N tw

r

b=

2

16

Definicin ms conocida:

PLATO TEORICO

tiempo

Alt

ura

A

ltur

a

tr

wb

w0.5

sea

l Varias frmulas:

22 2

0.5

16 5.545 2r r r

b

t t tN

Areaw wAltura

= = =

Altura del Plato Terico H = Altura equivalente a un plato terico.

H LN

=L

H

Eficiencia Cromatogrfica H mide la eficiencia de la columna cromatogrfica. Entre mas pequeo sea H, el sistema es ms

eficiente. ( mayor nmero de platos tericos pormetro.

Para una misma longitud se logra mayor poder de separacin con una menor H.

Separacin de Solutos

tiempo

Sea

l

wb,2

=ttr

r

,

,

2

1

to

tr,2tr,1

wb,1

SELECTIVIDAD

La selectividad muestra las diferencias de afinidad por los solutos de las fases involucradas.

Indica el potencial de separacin de esos solutos en el sistema, pero no mide la separacin real.

= = =

KK

kk

t - t0t - tor

r

2

1

2

1

2

1 1,

,

tr,2tr,1

wb,2wb,1

( )( )

Rt t

w ws

r r

b b=

+, ,

, ,

2 1

1 21

2

RESOLUCINRs = 0.8

Rs = 1.0

Rs = 1.5

Rs = 2.0

RESOLUCIN Tres son los factores que influyen en la resolucin

cromatogrfica: retencin, selectividad yeficiencia:

R kk a

Ns

retencin selectividad eficiencia

=

+

1

14

RESOLUCINSolo controlando la retencin ...

... la selectividad ...

... y la eficiencia ...

... se logra una buena separacin.

RESOLUCIN Y RETENCIN

Rs

0 2 4 6 8 10k

75%

3

90%

RESOLUCIN Y SELECTIVIDAD

Rs

0 2 4 6 8 10

Zona de trabajo usual

RESOLUCIN Y EFICIENCIA

N0 20,000 40,000 60,000 80,000 10

Rs

x

1.4 x

N1 2N1 10 N1

3.2 x

RESOLUCIN Y EFICIENCIA A mayor nmero de platos tericos, mejor

separacin. La separacin mejora apreciablemente solo si el

aumento en N es de varios ordenes de magnitud. Los aumentos pequeos no son importantes, p. ej.

duplicar el largo de columna duplica el tiempo deanlisis y solo mejora en 40% la resolucin.

Las mejoras notables solo se logran mejorando lastcnicas cromatogrficas.

Tiempo total de anlisis y resolucin

( )( )

t Rk

kHu

t s=

+

161

122 3

2

ANLISIS MAS RPIDOS SI: Rs pequea, como se busca separar : 1.5 Rs 2. >> 1. k chica, para separar : 3 k 6. Se logran altas eficiencias (H pequeo) a

velocidades altas de fase mvil.

Eficiencia Cromatogrfica

H = f (ensanchamiento de la banda)

multicanales difusin

resistencia a la transferencia de masa

LH NBH A C uu

A B

C

=

= + +

= ==

Efecto Multicanales y/o Eddy

2 pA d=

Difusin axial

Transferencia de masa en la FMmovimiento

2 m

DB

u u

=

Ensanchamiento de la banda

Transferencia de masa en la FE

2

21

ae

e

t ukH

k D

= +

Transferencia de masa en fase mvil

2p

mm

d uC u

D

=

Transferencia de masa

Transferencia de masa en la FMestancada

( )( )( )

2 2

2

1

30 1 1

psm

M

k d uH

k yD

+=

+

Ecuacin de Van Deemter

( )( )( )

22 2 2

2

12 2 2

1 30 1 1

p pm ap

e m M

d u k d uD t ukH d

u k D D k yD

BH A C uu

+ = + + + + + +

= + +

Efecto del dimetro de partcula

Digestin de enolasa.Efecto del tamao de partculaen N y P

Columnas Tubo de acero inoxidable, vidrio o capilar de slice

fundida

Dimensiones

Longitud: 25 a 300 mm

Dimetro: 25 m a 100 mmTamao de partcula: 1.7 a 10 m

Tipos de CL

Cromatografa de intercambio inico

Adsorcin: lquido-slido

Particin: lquido-lquido

Cromatografia en fase normal

Cromatografia en fase inversa

Cromatografia de exclusin por tamao

Empaques de UHPLC Images of current 1.9um particles

Cromatografa de fase inversa

FE

Slica qumicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4 tetrametil, C2 dimetl

FM

Mezclas: agua/disolventes orgnicos H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)

Cromatografa de fase inversa

Efecto solvofbico fuerte: Parte apolar de la molcula del soluto es mayor

% C en la FE es mayor

Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)

Fase mvil Disolventes grado cromatogrfico

Agua de 18 m Baja viscosidad

No vlatil

Miscibilidad

Filtrada

Sin oxgeno disuelto (degasificada)

Fuerza del eluyente

Viscosidad del eluyente

Anlisis Isocrtico

Fase inversa, 10% CH3CN

Anlisis Isocrtico

Fase inversa, 80% CH3CN

Anlisis Isocrtico

Fase inversa, 50% CH3CN

Anlisis por gradienteGradiente exponencial de acetonitrilo

T t

Elucin por gradiente

Detectores Indice de refraccin

Ultravioleta-Visible

Fluorescencia

Electroqumico

Radioactividad

Infrarrojo

Espectrmetro de masas

Protenas por 2D nano UPLC

Cromatogramas de digestin de E. Coli

Fabricantes de Equipo HPLC Agilent Technologies Beckman Coulter Cecil Instruments Dionex Corp Hitachi PerkinElmer, Inc. Shimadzu Scientific Instruments Thermo Fisher Scientific Varian, Inc. Waters Corporation

Columnas para HPLC Agilent Technologies AkzoNobel Beckman Coulter Dionex Corp Merck KGaA Micro-Tech Phenomenex SGE Analytical Science Shimadzu Scientific Instruments Shodex Sigma-Aldrich Thermo Fisher Scientific Tosoh Corporation Varian, Inc. Waters Corporation W. R. Grace and Company (Vydac)

Cromatografa de Lquidos de Alto y Ultra Alto RendimientoSlide Number 2Componentes bsicosSeparacin CromatogrficaPROCESO CROMATOGRAFICOPROCESO CROMATOGRAFICOPROCESO CROMATOGRAFICOPROCESO CROMATOGRAFICOPROCESO CROMATOGRAFICOSEPARACION DE SOLUTOSSEPARACION DE SOLUTOSDefinicionesDimensiones de la ColumnaVelocidad y flujo de faseTiempo Muerto (t0)TIEMPO DE RETENCINTIEMPO DE RETENCINConstante de RepartoEcuacin de la RetencinTiempo de Retencin CorregidoFactor de CapacidadFACTOR DE CAPACIDADFactor de CapacidadArea y Altura del PicoAncho del PicoPLATO TEORICOPLATO TEORICOAltura del Plato TericoEficiencia CromatogrficaSeparacin de SolutosSELECTIVIDADSELECTIVIDADRESOLUCINRESOLUCINRESOLUCINRESOLUCINRESOLUCIN Y RETENCINRESOLUCIN Y SELECTIVIDADRESOLUCIN Y EFICIENCIARESOLUCIN Y EFICIENCIATiempo total de anlisis y resolucinVan DeemterSlide Number 43H = f (ensanchamiento de la banda)Efecto Multicanales y/o EddyDifusin axialEnsanchamiento de la bandaTransferencia de masa en fase mvilTransferencia de masaEcuacin de Van DeemterEfecto del dimetro de partculaDigestin de enolasa.Efecto del tamao de partculaen N y DPColumnas en HPLCSlide Number 54Slide Number 55ColumnasTipos de CLEmpaques de UHPLCSlide Number 59Slide Number 60Cromatografa de fase inversaCromatografa de fase inversaFase mvilFuerza del eluyenteViscosidad del eluyente Gradiente de ElucinAnlisis IsocrticoAnlisis IsocrticoAnlisis IsocrticoAnlisis por gradienteSlide Number 71Elucin por gradienteDetectoresSlide Number 74Protenas por 2D nano UPLC Cromatogramas de digestin de E. ColiFabricantes de Equipo HPLCColumnas para HPLC