CONFERENZE E SEMI NARI

Polipéptidos vasoactivos derivados de substratos sanguineos (•)

HÉCTOR CROXATTO

Laboratorio de Fisiologia, Univer.~itlad Cat6lica de Chile y Laboratorio de Fisiologia, Facultad de Filosofia y Educaci6n, Universidad de Chile.

El descubrimiento del proceso humoral que desencadena la renina puso en evidencia, por primera vez, que se podla generar un péptido de un sub­strato integrante de la sangre de enorme potencia vaso-constrictora, la angio­t ensina (BRAUN MENENDEZ et al., 1939; PAGE & HEL!\1ER, 1939). P osterior­mente se robustece el concepto de que la sangre es una fuente potencial muy rica en péptidos activos, al cstudiar la acci6n de la pepsina sobre las pro­teinas del plasma. En efecto, durante la hidr6lisis acida, aparece un prin­cipio, la pepsitensina, de acciones similares a la de la angiotensina (CROXATTO & CROXATTO, 1942), aparte de otros péptidos de acci6n ocit6cica intensa (pepsitocina) y antidiurética (pepsanurina) (CROXATTO, 1957). En 1949, RocHA E SILVA et al. descubren que la tripsina y ven enos de scrpientcs li­beran del plasma a un agent~ de intensa acci6n vasodilatadora, la bradi­quinina y que mas adelante result6 ser el mismo producto terminai de la acci6n dc la kalikreina sobre el plasma. Esta enzima descubierta por KRAUT et al. (1930) que se encuentra en diversos 6rganos y en la sangre, al igual que la rcnina actua sobrc una alfa 2 globulina y libera un polipéptido vasodila­tador, la kalidina (WERLE ~ BEREK, 1948) de acci6n similar a bradiquinina. Los trabajos de \VEBSTER & PIERCE (1963) finalmente mostraron que el primer producto que aparece por acci6n de la kalikreina, es el decapéptido kalidina, cl que rapidamente por acci6n enzimatica del plasma, pierde una molécula de lisina y se convierte en bradiquinina. El curso de esta reacci6n ofrecc un notable paralelismo con el de la formaci6n de angiotensin as.

Sin duda, los péptidos mejor conocidos, tanto por su rol fisiologico como por su estructura qulmica son las angiotcnsinas y las plasmakininas : bra­diquinina y kalidina. No ocurre lo mismo con otros principios que se forman al igual que las plasmakininas coruo consecueu cia de manipulaciones relati­vamente simples del suero como es la mera acidificaci6n e incubaci6n. E u

(•) Conferenza t enuta nell'Istituto Superiore di Sanità il 5 ottobre 1965 .

• hm. l sl . S1tper. San-ità ( 1966) 2, 575·598.

576 CONFERENZE E SEMINARI

efecto, al lado de las plaswakininas que puedeu o no formarsc, apareccn otros péptidos que comparten algunas propiedades de la bradiquinina o ka­lidina, pero no se identifican con ellas. Por otra parte, si bien presentan una apreciable semejanza de propiedades con las angiotensinas, no rcquieren de la intervencion de la renina para su formacion. Son en todo caso péptidos que se obtienen del plasma o del suero de todas las especies de vertebrados basta aqui estudiados y que se originan por acciones enzimaticas endogenas (CROXATTO et al. , 1963). Este articulo estara consagrado a presentar los resultados alcanzados con este grupo de substancias, péptidos que aparecen eu el proceso de incuhar suero o plasma y que en trabajos anteriores se englo­baron provisoriamente hajo el nombre de anefroten sina.

Anefrotensina. - La primera evidencia de que del suero se podia ex­traer un péptido de intensa accion vasocontrictora, con cualidades diferentes a la dc los péptidos basta entonccs descritos, se obtuvo al analizar los efectos sobre diversos preparados biologicos del sucro de rata acidifìcado (pH 3.8-4) e incubado a 38°C por 24-48 horas . La dosis de 0.1 - 0.2 ml dt• este suero incubado produce en la rata nefrectomizada un efecto hipertensor equiva­lente a 0.01 mcg de angiotensina, contraccion del utero aislado de rata (equivalente a 10-15 mU de ocitocina) (CROXATTO, PEREDA & MELLADO, 1959; CROXATTO et al., 1960). Como puede apreciarse en la Tabla l, las carac­terlsticas farmacol6gicas del suero corresponden en parte a las de las angio­tensinas y en parte a las de las plasmaquininas. Las tentativas de aislamiento y purificaci6n permiten la obtenci6n de un m ateria! que conserva las carac­terfsticas farmacologicas del suero.

Una substancia con caracteristicas semejantes fué obtenida del suero sangulnco de otras especies : hombre, perro, caballo, buey, gato, conejo, cobaya, etc. (CnOXATTO & BARNAFI, 1960). Tambien en el suero de verte­brados inferiores: a ves, anfibios, reptiles y peccs, se demostro la formacion de péptidos de cualidades similares, cada vcz que era sometido a incubacion acida. A este materia} le fué asignado el nombre genérico de anefrotensina, destacando con esta designaci6n dos de sus rasgos mas sobresalientes y carac­ter1sticos : primero, que el efecto hipertensor desencadenado por los prcpa­rados obtenidos de los distintos sueros de mamlferos a peces, es mas intenso en la rata nefrectomizada y con hipotensi6n que en el animai norma l; en segundo lugar, se ha demostrado que del suero sanguineo de :nimales nefrec­tomizados se alcanza un rendimiento de péptidos activos mucho mas alto. En el perro nefrectomizado es 5 a 6 veces superior al del suero de un animai normal (CROXATTO et al., 1963). En la rata, la difcrencia es aun mucho mayor (SAN MARTIN & RosAs, 1964). Los anticoagulantes : heparina, oxalato de sodio, no afectan el rendimiento de anefrotensina. Tampoco se altera signi­ficativamente sea con la adicìon de antitripsina dc poroto de soya o con

.;hm. l s l. Super. Sanità (19G6 ) 2 , 5 75 ·598.

CROXATTO 577

la fibrinolisina (CaoXATTO et al., 1963) o antirrcnina (RosAS, 1963) . La incu­bacion previa del su .. ro con extractos renales ·o renina aunque disminuye apreciablem enle el renùimicnto, no agota la postbilidad de formacion de péptidos vasoactivos si el suero es después acidificarlo y nuevamentc incu­bado (CaoXATTO H . B ., 1961).

T ABLA l.

Proprledades farmacologicas de Anefrotenslna, BradlquJnlna y Anglotenslna.

r------------------------------------~--------------------------------1 l Proplcdndce tar macologicu&

l 'repUI' IL C I 6 n

Presi6n A rteria/ : •

R at a Norma(

» Nefrectomizada

• + Simpaticolltico

P ollo Nonna!

' Nefrect omizado

P erro l Norma!

' N efrectomizudo

Gat o l o nn al

R ana ormai ----

Contracci6n : • •

Ut ero rat a .

Duodeno rata

Ciego rectul pollo

Anotrotonsinn l B rsdlquinlna l A ng'otenslna (cruda) '

! i! i i t

i

i

c R

c

! n i

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i t i i i

i

i

c c c

• Presion arteria! : ! = Signifìca baja; i = Su be; i ! = D epende del n ivei p re­v io de la presion ; - F alta de accion.

•• Contracci6n : C = Cont rae; R = Relaj u; - = Falta de ncci6n.

Los efcctos farmacologicos observados no pueden ser atribuidos a otros constituyentes hormonales normalmente presentes en el plasm a como adre­nalina y hormonas neurohipofisiarias, ocitocina y va soprcsina. La hipofi.­scctomla o la adren alectomla practicadas en ratas inmediatam ente antes de sangrar no afect a n las caracteristicas del suero incubado (CROXATTO & BELMAR, 1961). La gastrect omia previa en la r a ta para excluir la inter ven­c:ion del pepsinogeno de la sangre (y su activacion con la acidificacion) no modifica ni cuantitativa ni cualitativam entc los r esultados (Zu ANI C, 1960 ; C ROXATTO & BARNAF I, 1960). E ste expcrtmento era dc cspecial interés en

.·IIm. / st . .Super. Sa11 i là (1966) 2 , 57 5·598 .

578 CONFERENZE E SEMINARI

vista quc la digcsti6n del suero con pepsina, engendra una variada mczcla de polipéptidos dotados de propriedadcs diversas como son: pepsitensina, pepsitocina y pepsanurina.

El rendimiento dc anefrotensina disminuye en la sangre de animales hipofisectomizados dcspués dc varias semanas dt< practicada la ablaci6n de la hip6fisis (CORO ERO & GARCTA, l 1}64).

La formaci6n dc anefrotcnsina corresponde a la de un proceso hidro­Htico de lento desarrollo, cuya velocidad esta influenciacla por el pH y la temperatura. Para cl plasma humano el 6ptimo csta entre pH 3.8 y 4 (Cno­

XATTO H. B., 1961) sin embargo, como se discutira mas adelante, la incubacion al p H propio del plasma o suero (7 .4-8.3) no impidc una gradua l aparici6n dc principios vasoconstrictores. La t emperatura tiene una influencia m ar­cada: a 0 ° C y a temperaturas mas bajas se frena completamente la forma­ci6n de anefro tensina. El suero humano a 38°C forma seis veces mas cantidad quc a l soc y a soc la formaci6n de anefrotensina es insignificante (Cno­

XATTO H. B., 1961). El calentamiento por encima de 70° C inhibe su formaci6n. El tiempo requcrido para alcanzar la formacion maxima de anefrotensina varia scgun la especic a la cual pertencce el suero (CnOXATTO et al., 1963).

Por el mecanismo de formaci6n, por sus cltract cris ticas farma cologicas, particularmente por sus efectos diferentes sobre la presi6n arteria! d{· una rata con presi6n norma! y otra hipotensa (bloqueada con un simpaticolitico) y por cl hallazgo inesperado que tambien la bradiquinina pura ( C ROXATTO

& BELMAR, 1961 ; CROXATTO et al. , 1962) y la kalidina (ROSAS et al. , 1965) inducen cn csta ultima rata una reacci6n hiperten sora o difasica en lugar de hipotensi6n, se pudo fundamentar la sospecha que la ancfrotensina era una mczcla de dos o mas péptidos, entre los cualcs debia existir una plasmakinin.a.

El analisis cromatografico sobre hoja de papel filtro y el empleo de co­lumna cromatografica de carboximetilcelulosa, como se describira mas ade­tante, proporcionaron la evidcncia que el materia! extraido de suero de perro nefrectomizado es una mezcla de 3 a 4 fracciones vasoactivas. E stas se di­

stinguiran en nuestra descripci6n con los nombres Anh Alé!, AnB• y AnK· De éstas, las dos primeras no han sido identificadas todavia. En cambio, se tiene suficientc evidcncia p ara decir que AnB corresponde a bradiquinina y que AnK• cuya aparici6n h a sido comprobada ocasionalmentc, seria la kalidina . Por ser la A0 2 el materia! relativamente mas activo, es el que ha concentrado la mayor aten ci6n y en t orno al cual se ha acumulado un mayor numero dc datos experimentales.

M étodo de purifìcaci6n. Obtenci6n de A 111o A 02 y Anu a parti r de suero de

p erro nefrcctomizado. '_ El método seguido en sus lineas escnciales se acomoda el esqucma de la Tabla 2, y comprende una et apa de extraccion del suero bast a la obtenci6n de un polvo cristalino soluble en acido acético ( CROXATTO

A nn . I st. S uper. Sani/a (1966 ) 2 , 575·598.

CROXATTO ~79

& BARNAFI, 1960). El materia} cristalino es sometido a una doble filtraci6n preparatoria a través de senùas columnas de Sephadex G so (Figura l) y G 25 (Figura 2). El flujo se ajust6 a 5 ml por cada 6 minutos, utilizando agua

TARI..A 2.

Etapas del método de purlficacl6n de anefrotenslna.

29.6 g Anef. Cruda 9.9 lt. Suero de Perro Act.iv. presora equi v. a

594 y Ang.2 (0.02/ mg)

l + Filtracion por Gel Seph. G-50

5 mi / 6 min.

Activ. Biologica entre los vol. de eluci6n 365-4 75 mi. Total peso solido: 10.5 g. Activ. presora eq. a 424 y Ang.2 (0.04/ mg)

l + Filtraci6n por Gel Seph. G-25 (s. f.)

4,3 mi / 10 min. +

Activ. Biologica entre los vol. de elucion 185-254 mi. Activ. presora eq. a 420 y Ang.1 (0.1/ mg) • Total peso solido 4.25 g.

Cromatografia en Columna

l +

An1

Activ. Biologica entre los vol. 230 - 260 mi. Activ. presora eq. a 10,2 y Ang.1 (0.0045 mg) Peso total : 2.278 mg.

+-----------------------------Carboximetil celulosa 5 mi / 10 min.

t An2

Activ. Biol6gica entre los vol. 590-705 mi. Activ. presora e q. a 7.65 y

Ang.2 (0.346/ mg) Peso total: 221 mg.

' Anb

Activ. Biologica entre los vol. 725-750 mi. Act iv. Ocitoc.: 26.9 U. I. Peso total : 122.4 mg.

destilada como solvente y se rccogi6 el eluyente en tubos siliconados colo­cados en un colector de fracciones. La presencia de materia} activo cn cada tubo se revel6 inyectando las soluciones (0.1 - 0.2 ml) tanto cn la rata nefrectomizada como en el utero aislado de rata.

Dcspucs de esta doble filtracion, el material solido queda r educido a un 12 % del inicial (cada mg equivale a 0.1 mcg de angiotensina II) (Tabla 2) .

. lnn. ! st . .Su11er. Sanità (1966) Z, 57~·.>98 .

580 CONFERENZE E SEMINARI

Cumplida esta etapa el materia! activo recojido liofilizanùo la soluci6n correspondientc, fué somctido a una cromatografia por gradiente de eluci6n en una columna de carboximetilcelulosa (CMC) (Figura 3). La soluci6n ini-

t IO ID 40 ID IJC) 140 110 DI 157 ~ lfO

D. O. 110

1200

1400

5100

4100

4000

5200

2400

1600

eoo

Tut 20 40 6 0 8 0 100 120 14 0 150 IOC ?00

Voi m i.

Fig. l. - Filtracion por Gel Sepha· dcx G60• La curva inferior d el grafico indica la den­sidaò optica (F. 280). La parte rayada corresponde a la zona con actividaò biologica. E n la parte in­ferior se indica cl numero de los tubos y mlis abajo el volumen eluyente don­d e aparece la actividad ruiiximn.

En la parte superior estii el grafico corrcspondient e a los efectos sobre la pre­sion arteria) de 0.1 mi del liquido de cada tubo.

cial con la cual la CMC se puso cn equilibrio fué acetato dc amomo 0.01 M pH 5. Despues de introducir la anefrot ensina (500 mg) se inici6 el drenaje de la columna haciendo pasar gota a gota al recipiente que contenia la solu­ci6n de acetato de amonio 0.01 M otra soluci6n de mayor molaridad (0.3 M) y de pH 7 (Figura 3) con lo que se creaba un doble gradiente ionico y molar para provocar la eluci6n. En un colector dc fracciones se rccoji6 volumenes separados de 5 mi. El ensayo biologico en cada muestra, permiti6 establecer en el liquido eluyente la aparici6n sucesiva de 3 zonas de actividad designa­das Anh A 0 z y AnB (Figura 5) Y. ocasionalmente se observ6 cercano al punto de mas alta molaridad, otra zona de actividad AnK· La primera zona aparecc

.Ann. /st. Su]Jer. Sanità (1966) 2 , 575-598.

CROXATTO 58 l

en los volumcnes 226 ml y 261 ml con un maximo en 245 ml cuyo pH es de 4.35. La zona de actividad de An2 qued6 comprendida cntre los volumenes

Fig. 2. - Filtracion por Gel Se­phadex G.5 • La expli­cacion es s imila r a la Fignra l.

0 . 0. 2 8 0

Tub . O 2 0 40 60 80 IOO

----------~~--~------------------- 140

•~z'iJZii1-· •

D. Q 280

8000

7200

6 4 00

5600

4 800

4000

3200

2 400

1600

800

Tub. O

1/ o l. "'' ·

120 140

IOO

41 Il •• •• l? .. Il •• .. " ..

20 40. E\0 80 100 12 0 140 183 253

160

P i-! 6

5 4

3

Fig. 3. - Cromatografia cn rolumna d~ carbo­ximetikehlosn. Se indica la clensidad optica y las vnna­r iones del pH del llquirl.o elu yente.

Vol. mi. 50 150 250 350 450 550 650 750 850

Las pnrtes rayadas re p r c s e n t a n las zonas de nctividnrl. biologica: An t, Anz y AnB- Lo• nurne­ros d e la parte inferior, indican el volumen del liquido eluyente donde estu­vo el milximo de la actividad biologica para cada zona.

L.J L.__.) u An 1

An2 Anb

Voi mc:i x. oct b1ol. 2 45 €50 74 0 m i

. 1 1111. ! st . :Super. Sa1lilà ( 1966) 2, 575·598.

582 CONFERENZE E SEMINARI

589 mi y 703 mi y el punto culminante coincidio con el volumcn 650 mi con un pH 6.15; la tercera zona se extendi6 entrc los volumcnes 725 mi y 750 mi y cn la mucstra con la maxima actividad ocitocica (volumcn 738 mi) el pH fué de 6.31 (Figura 4). Eu t:l volumcn cercano a 845-860 ml se pucdc revelar a veces otra actividad biologica, cuyo maximo coincide con 850 mi (pH 6.39) de muy definido efecto ocitocico. Las soluciones correspondientes a las diversas zonas fueron liofilizadas y el acetato de amonio excluido por liofilizacion repetida. El residuo de cada fraccion fu é dosifìcado, ensayado en diversos preparados biologicos .

hl& E

l 43 41 5! 12! ~ IZI l:sl 157 141 145 14t 170 110 5 4& 52 121 124 127 1!1 IS5 Ili lofl 147 151 17!1

B.

'---125 1!0 13!1 1!7 139 142144 145 147 141 1151 1153 1!15 156 157

Fig. 4. - A. Presi6n arteria] de rata nefrectomizada. Se inyecta cada vez 0.1 mi de la soluci6n de cada tubo cuyo numero (Figura 3) aparece en la parte inferior.

B. Contraccii\n de utero aislado de rat a. Se introduce en el balio 0 .1 mi de

In soluci6n de cada tubo (Figura 3).

Cromatografia sobre papel. - Las muestras obtenidas en las distintas etapas de purificacion fueron sometidas a analisis cromatografico, para establecer si la actividad biolOgica de cada una de ellas estaba determinada por una o mas substancias. Se utilizo cromatografia descendente sobre tiras de papcl filtro (Whatman N. l) de 2.5 cm de ancho y como sistema solventf' : butano! - acido acético - agua (4 :l: 5), con una fase previa de saturacion de dos horas a la temperatura ordinaria. Despues de 24 a 26 horas las tiras eran retiradas y una vez evaporado el solvente, se investigo la ubicacion del materia! activo, utilizando la técnica de cortar .la tira de papel en seg­mentos transversales sucesivos de 0.5 a l cm de ancho. El materia! era eluldo, lavando el trozo de papel con 0.15 mi de solucion acida (HCl pH 2.5) y neu­tralizado con 0.3 ml de solucion Tyrode (p H 7 .8). Cada muestra fué ensayada y dosificada en los preparados hiolOgicos h abituales. De esta manera fué

Am1. / st . Super . Sanita (1966) 2, 575·598.

CROXATTO 583

posible establecer el Rf de cada muestra activa y demostrar que el cromato­grama de An~ contiene una unica substancia activa (Rf 0.41- 0.42) con gran efecto hipertensor y moderadamente ocitocico. AnB corresponde a una sub­stancia de mas rapida migracion en el papel (Rf 0.51) con elevada potencia ocitocica y de claros efectos hipertensores en la rata nefrectomizada, pero de accion hipotensora en la rata de presion normal. Los otros polipéptidos estudiados con este método dieron los Rf siguientes : angiotensina II, 0.65; kalidina, 0.18 y bradiquinina, 0.51. Como puede observarse, el Rf de esta ultima es exactamente el mismo que 'el establecido para AnB· Ademas, ambas substancias eluidas del papel sometidas a la accion de la pepsina y tripsina, conservan sus propiedades, pero se destruyen rapidamente con la carboxipeptidasa B; bajo luz ultravioleta, en el punto de migracwn de AnB se descubre una mancha fluorescente que como en el caso de la bra­diquinina da una reaccion caracteristica con el reactivo Jepson (modifica­cion método Sakaguchi) que delata la prescncia de arginina, con lo que se aporta un nuevo hecho en favor de que AnB seria la bradiquinina. La croma­tografia sobre papel con anefrotensina, obtenida de columna Sephadex G25

y mezclada previamente con bradiquinina pura, arroja la separacion de dos zonas de actividad, que son exactamente idénticas a las obtenidas con ane­frotensina no adicionada de bradiquinina. Los puntos en el cromatograma con la maxima actividad ocitocica tienen un Rf 0.51 en los dos casos. Ade­mas, tanto el estudio comparativo farmacologico como la accion de las enzi­mas indican una correspondéncia compl&a. El materia] AnK por su ~ompor· tamiento cromatografico (columna CMC) indice ocitocico vasopresor, coin­cidio con la kalidina, pero la escaséz de materia! no permitio proseguir la investigacion. La An~ tiene un Rf que parece estar muy cercano al de vali] 5 angiotensina I amida, de la que no se tuvo suficiente cantidad para precisar su Rf. Comparte con ella· muchas de sus propiedades y entre otras poseen un mismo indice vasopresor ocitocico; ademas ambas se destruyen con la pepsina y tripsina, elevan la presi6n arterial del pollo, pero difieren por dos caractcristicas farmacologicas; a) por su accion sobre el duodeno aislado de rata, en el que actuan en forma opuesta, la An2 produce constantemente relajaci6n, en tanto que las angiotensinas I (y tambien la II) producen con­tracci6n; b) si se miden los efectos sobre la presi6n arte1ial del pollo, inyec­tando dosis equipresoras en la rata nefrectomizada, An2 resulta 3 - 4 veces mas activa que las angiotensinas (Figura 5).

Debe seiialarse, sin embargo, que el revelado del cromatograma de A02

sea con ninhidrina, azul de bromofenol o gas cloro, permite descubrir que aparte del péptido con actividad biologica A02, existen al menos dos otros pé­ptidos con distinto Rfpero inertes frente a los preparados biologicos utilizados.

La hidrolisis acida (por 24 horas en ampollas selladas) de una muestra de A02, purificada por doble pasaje en CMC permiti6 identificar en un sistema

A nn. Isl . Super. Sanità (1966) 2, 575-598 .

584 CONFERENZE E SEMINARI

de cromatografia biùtmcn sional sobrc cl papel, los siguientes amin oacidos : lisina, histidina, arginina, aspartico, treonina, serina, glutawico, prolina, glicocola, alanina, valina, metionina, !cucina, tirosina, isoleucina. Ademas, en forma inconstante se identifico a la cist eina.

2 3 4 5 6 7

mm Hg 200 180 160 140 120

F ig. 5. - Efectos sobre la presion arteria} del pollo de las angiotensinas y de la bra· diquinina. l ) Angiotensina I, l !Lg; 2) Angiotensina II , 2 (Lg; 3) An:! 0.9 mg; 4) An t , 60 mg; 5) A112, l mg; 6) y 7) Bradiquinina, 20 y 50 mg respectiva· mente. E n la rata nefrectomizada 0.9 mg de A112 producen un efecto hiper· tensor equivalente a 0.3 (Lg de angiotensina Il.

En una mucstra enviada al Istit uto Superiore di Sanità dc Roma, se intent o por ultracentrifugacion , la determinacion del peso molccular de la substan cia, la que no fué posible precisar, pero por la difusihilidad se pudo conjeturar que el peso molecular estaria cercano a 1000. La hidrolisis de esta misma muestra con H Cl (6 N) en ampolla cerrada al vado y el analisis cuan· titativo de amiuoacidos por cl método automatico de SPACKMAN, STEIN & MoonE (1958) dio la composicion que aparece en la Tabla 3. Entre los residuos encontrados, los mas abundantes serian: lisina, treonina, glutamico, prolina. Tornando a la metionina como peso molecular minimo y manteniendo la proporcion de los residuos, el p eso molecular de la substancia seria de 10.789, lo que est aria en contradiccion con el dato de la ultracentrifugacion, por lo que se debe suponer con toda probabilidad que el materia! analizado estaria constituido por una mezcla de péptidos. Si los tres mas abundantes amino­acidos formaran parte estructural de A0 2 csta no se identificarla con ninguno de los agentes vasoconstrictores naturales descritos. Sera necesario emplear nuevos métodos de purifìcacion , para lograr separar los péptidos contami­nantes, pero basta ahora ninguna ventaja se ha logrado utilizando diversos sistemas como la cromatografia en DEAE celulosa o en a mberlita .

Recrornatografia de A 112 rnezclada con valil 5 angiotensina Il . - A 11z pu­rifìcada a través de doble pasaj e por una columna de CMC se mezclo con 15 ug de valil 5 angiotensina II y la mezcla se hizo pasar nut>vamente por otra columna de CMC en condiciones semejant es a las anteriores. Una invcsti­gacion farmacologica del liquid~ eluyente recojido en cada uno dc los tubos,

Amt. 1st. S u per. S an;tà (19GG) 2 , 575 ·598 .

CROXATTO 585

dio un resultado neto con dos picos de acti vidad . El primero, aJcanzo su punto culminante en el volumen 468 ml y d segundo en 653 ml ; éste coin­cidio con el cstablecido para el An2 de la opcracion anterior . Con esto se ex­cluyo que la valli 5 angiotensina II pudiera explicar la actividad vasopre­sora de Anz· E l csturlio del Indice vasopresor-ocitocico de las subst ancias contcnidas cn cada uno de dos picos mostro que el primero coincidia con el de valil 5 angiotensina II y que el pico emergente cn el volumen 653 ml con­serva todas las caract eristicas ùe An2 originai.

TADLA 3.

Reslduos encontrados después de hldrollzar An2 ( • ) .

Lisina . . Treonina . Glutamico. Prolina . Alanina. Leucina . Aspartico Valina . Serina . Arginina Glicocola Histidina T irosina Fenilalanina . Isoleucina Metionina Cistelna/2

Am i nonci d os

(• ) Seguo Vivaldi e Tentori.

La imposibilidad de disponer de angiotensina I nos impidio hacer un ensayo paralelo con el decapéptido. Sin embargo, los rcsultados ob tenidos cn croma tografia en papel unidos a los datos farmacologicos seiialarian que las difercncias quimicas que pucdcn cxistir entre A112 y angiot cn sina I son relativamente pequeiias. Si exist e efcctivamente gran similitud entre A

112 y el decapéptido se podria conjeturar que de la misma manera que el enzimo convert idor- del plasma transforma a la angiotensina I en angioteusina II (SKEGGS, 1960) también deberia est e ferment o producir de An2 la Iibcracion

A 11n. /s t. Super. Sanilù ( l !166) 2. 5i~hS98.

586 CONFERENZE E SEMINARI

de un componente dotado de mayor actividad ocit6cica. Ha sido estahlecido que la angiotensina I tiene una actividad ocit6cica muy inferio r a la

angiotensina II (GRoss & TuRRIAN, 1960).

AcciorL del plasma sanguineo sobre la actividad ocit6cica de A 112• - Sohrc utero aislado se investigo el efecto de valil 5 angiotensina I y de A112, tratando de precisar para cada una de ellas la dosis pr6xima al umhral. Estas dosis y otras menores se pusicron en contacto con peque.iias cantidades de sucro por breves instantes. Desde el momento de hacer las mezclas dc suero sea con A112 o con ang10tensina I , se ensayaha la potencia ocit6cica comparandola con la del péptido sin el suero, descartando previamente quc la dosis de suero empleada en la mezcla era dc por si sola incapaz de producir contracci6n en el utero. Como puede apreciarse en la Figura 6, la mezcla produce un

2 3 4 5 6 7 8

Fig. 6. - Efecto ocitocico sobre utero de rata aislado. Se introduce en el baìio: en 1,1 mU ocitocina; en 2 y 3,0.05 y 0.1 mcg de angioten­sina I; en 4, 0.01 m l su ero de rata; en 5, una mezcla de 0.05 mcg mas 0.01 ml de suero; en 6 y 7, 0.004 y 0.003 ml A112 r espeetiva­mente; en 8, una mezcla de 0.003 mi A112 miis 0.01 ml suero rata.

incremento significativo de la potencia ocit6cica que fué para A112 con. el suero 2 a 3 veces superior. Estos resultados muestran que A112 en presencia de suero al igual que la angiotensina l, engendra un producto de mayor acti­vidad ocit6cica y apoya lo afirmado mas arriba sobre la gran similitud qui­

mica t ntre el dccapéptido y Anz·

Acci6n de Jermentos proteolf.ticos sobre Anh A112, AnB·- Se ensay6 quimo­tripsina (Biochemical Corporation) pepsina y tripsina (2 X rrist.) y carho­xipeptidasa A (3 X crist.) y carhoxipeptidasa B (DFP Worthington) con 90 U/mg sobre los tres subsiratos ohtenidos separadamente por el paso a

Ann. l sl. Super. S anità (196G) 2, 575 -598 .

CROXA'ITO 587

través dé la columna CMC. En condiciones similares se estudi6 la acci6n de los fcrmentos sobre la angiotensina I y II y bradiquinina . . Mientras la pepsina se en say6 a pH 2.5 - 2.8, el resto de los fermentos se hizo actuar sobre los substracos a pH 7.2 - 7.8. La Figura 7 y la Tabla 4 muestran

. O IO

N

c 6 .005 .. E

.001

IO 30 50

C>---<l An 1 ....--..An 2 -An8

10 90

T min.

Fig. 7. - Curso de la inactiva­

cion de Ant y An2 producida por 0.5 mg de pepsina (pH 2.5) . Ana resiste el efecto del fermento. La potencia v asopresora se expresa en el log. de los micro­gramos equivalentes d e angiotensina Il.

algunos resultados que dejan en claro que A111 y A02 se inactivan con todos los ft!rmentos, cxceptuando a la carbo:xipeptidasa B. En cambio, A118 al igual que la bradiquinina resiste a la acci6n de cualquiera dosis de pepsina y de tripsina cuando se u san dosis pequeiias y tiempo de incubaci6n cortos, mientras que la carboxipeptidasa B en lnfìmas cantidades en pocos minutos inactiva a la bradiquinina (Eaoos et al., 1963) y tambien con gran rapidez ùestruyc Ann· Es notable que la acci6n inactivadora de este fermento sobre la bradiquimna y A08 se puel e d t·mostrar in vivo. La inyecci6n en la rata de l mg de carboxipcptidasa B por via intravenosa anula los cfectos circulatorios en un 80 a 100 %, tanto de la bradiquinina como dc la Ana (Figura 8), pero no disminuye las rcspuestas a la Anh A02 y angiotcnsin as.

TABLA 4.

Accl6n de fermentos proteolitlcos sobre Ant. An 2 y AnB·

Formentoa Protoollticos

(p H 2 .5·3.5) (p H 7 ·7 .B) tripsina ___ <1_>1_1_7_· _7 ._BJ ___ 1

Popsina Tripslna l Quimo· l Carboxipeptidnsa

2 x cris t. 12 >- c rist. (pll7 · 7.8) A l B (DFP)

Angiotensinas + + + + Bradiquinina + + + An1 + + + + An1 + + + + An a + + +

. l nn. f HI. Super. S conUè• ( 19G6) 2 , 575 ·598 .

5t!R CONFERENZE E SEMINARI

Acci6n biologica de A 112 • - Como se ha podido aprcciar, muchas de las a cciones de A112 coinciden con las de las angiotensinas, p articularmente aquellas observadas en los vasos y musculaturas lisa de 6rganos huecos, destacandose aquellas sobre la presion arteria]. Sin embargo, algunas diferencias pueden anotarse : A112 con dosis que son equipresoras en la rata normal, induce efectos hipertcnsores mas intensos que la angiotensina II, en la rata n efrectomizada bloqueada o no con pentolinio . Tambien comparada con la rata, en el pollo se requieren dosis relativamente m enores de A112 que dc angiotensina I o Il, pa ra producir los mismos aumentos de la presion arterial. La An'! compartc con la Angiotensina II una acci6n sobre cl coraz6n que en la rata normal se traduce en una disminuci6n discreta, p ero significativa del gasto sistolico (GROSS et al. , 1961 ; RosAs, 1965, comunicaci6n personal). Con una anc­frotcnsina sometida prcviamente a la accion dc la carboxipeptidasa B , para destruir la plasmaquinina, se obtienen caidas cua11.titativamente idénticas del débito sistolico a las de dosis equipresoras de angiotensina II. Después

mm Hq

100

80

60

2 3 4 5 6 7 8 9 IO Il 12 13 14 15

Fig. 8. - Presi6n arteria} de rata nefrectomizada. E fectos de: l) Angiotensina, 0.008 !Lg; 2) y 3) Bradiquinina, 0.5 y 1 ~; 4) y 5) An2 0.05 y 0.1 fLg; 6) Ana, 0.1 !Lg; 7) Carboxipeptidasa B, 0.75 mg; 8) y 9) Bradi­quinina l y 2 fLg; lO) A112, 0.1 ~; 11) y 15) Ana, 0.1 ~; 12) y 14) Angiot ensina, 0.08 y 0.01 !Lg; 13) Bradiquinina, 2 fLg.

de la administraci6n de un simpaticolitico (pentolinio) el fenomeno se invierte y ambos péptidos producen un igual increm ento del débito sist6lico que es proporcional a la dosis (RosAs et al. , 1965). Este aumento es menos conspicuo que el que produce la bradiquinina, la que sobretodo después del bloqueo ganglionar, produce un gran aumento del gasto sist6lico. Es el incremento de est e factor cardiaco lo que explica la aparente paradoja de que n o obstante la vasodilatacion, tanto la bradiquinina (CROXATTO & BELMAR, 1961} como la kalidina (RosAs et al., 1965) den lugar a una hipertension en la rata hipotensa.

La A112 por su acci6n sobre la red vascular y gas to cardiaco, evidente­mente se asemeja mas a las angiotensinas que a la bradiquinina.

Acci6n de A0 2 y otros péptidos sobre la funci6n de la corteza suprarrenal. -Los trabajos de los ultimos aiios, que tienden a ex altar mas el papcl de la

Anu. l sl . l;;uper. l;;anilà (11166) 2, 575·59!! .

CROXATTO 589

angiotensina sobre la descarga de la aldosterona que su efecto propiamente vascular, nos indujeron a investigar si la anefrotensina es capaz tambien de cstimular a la corteza suprarrenal. La anefrotensina de suero de rata y de perro, demostro a la hora de la inyeccion intraperitoneal un efecto mani­fiesto sobre esta ghindula a juzgar por la baja del acido ascorbico de la su­prarrenal administrada por via intraperitoneal en la dosis equivalente a 1.5 (Lg de angiotensina (BAZAES, 1960). Como mas adelante se pudo demostrar que es te efecto no se manifiesta si previamente se hace la hipofisectomfa, quedo al descubierto que la anefrotensina operaba sobre la suprarrenal por intermedio de la hipofisis y que su accion parecia explicarse por una descarga de ACTH (CROXATTO et al., 1964 b). l Podria la anefrotensina identificarse con uno de los factores de liberacion del ACTH ?

El tratamiento de la anefrotensina con acido tioglicolico proporciuno la evidencia que en el efecto observado no estaba comprometida la vaso­presina que es uno de los mas potentes agentes liberadores de ACTH. El acido tioglic6lico non afecta est e efecto estimulador ni las otras propiedades de la anefrotensina (Figura 9). Pudo apreciarse que un preparado mas puri­ficado de anefrotensina de perro dio tambien un efecto depresor del acido ascorbico (Figura 10), pero que ademas ese efccto es compartido por la bra­diquinina y la angiot ensina y al igual que cl ejercido por la an efrotensina no aparece cuanùo se administra a animales hipofisect omizados.

mg. AAf tOOg

Fig. 9. - Efecto sobre el acido ascorbico. de la gllin- 450 r+ t dula suprarrenal. Las barras y la linea centra] indican el

contenido pro medio y error standard ; la ci­fra interior, el numero de ratas utilizadas. C, grupo contro! ; An. r. cantidad inyectada equivalente a i5 mU; An. r. + thio, la misma dosis An. r . tratada previamente con thio­sorbitol ; thio, la mis ma cantidad d e thio­sorbitol empleada en la mezcla; An. p. ane­frotensina perro, equivalent e a 0.125 !J.g de angiot ensina n ; B , bradiquinina 5 mg.

400

350

300

250

200

~ t + + 50 23 23 2& 15 17

C Anr Anr tt.o AAP, B +

t) mJ thf:) CID~ SJ.I9

La renina, como era de espcrar, produce también un efect o estimulador manifiesto de la corteza que no solo afecta el contenido del acido ascorbico, sino que eleva también los corticoides totales de la san gre medidos por el método Guillcmin (GUILLEMIN et al., 1957) modificado por HEDNER (1961) . Si bien estos experimentos dejan fuera de duda que los efectos observados sobre la corteza son indirectos, tambien se ha dado la evidencia que la an­giotensina actua directamente como agente estimulador de la entrega de

. lnu. l sl. Super. Sanilà (1966) 2, 5 75· 598 . 7

590 CONFERENZE E SEMINARI

aldosterona. lnycctada en la arteria suprarrenal produce una rapida entrega de esta hormona de la glandula, tanto en perros normales hipofìsectomizados y nefrectomizados (GANONG et al., 1962) como en ovejas (BLAIR-WEST et al., 1962). Con preparados purifìcados de An2 de perro se inducen efectos muy evidentes tanto en la caida del acido ascorbico como en los niveles de corti­coides de la sangre. Es interesante que la anefrotensina de perro como tam­bien de rana y de pollo tienen un comportamicnto semejante y requieren de la hipofisis para actuar sobre la corteza suprarrenal (Figura 10).

Cort1C01des tot ales

)Jg / 100ml

50

'o

30

20

IO

14

c

Cortlcoides totates

60 }J9 1100 ml

50

'0

30

20

10

c

Ratas t~orrn.;l c:;

16 18

An P c

12

An. P. c

500

400

300

200

100

21

An P

mg AAAoo g

600

500

400

300

200

100

13

An P.

Fig. 10. - Efectos sobre el acido ascor­bico suprarrenal y contenido de corticoides totales de la sangre encontrado en el grupo contro! (C), y el inyec­tado con anefrotensina de perro (An. P.)en dosis equiva­lente a l mcg de angiotensina Il (Zamorano). En la parte &uperior, ratas normales ; en la parte inferior, ratas hipo6-sectomizadas 24 horas antes del experimento .

Sin embargo, de ningun modo estos experimentos excluyen que la An2

no pueda como la angiotensina promover mayor entrega de aldosterona por accion directa sobre la capa glomerular de la corteza suprarrenal donde se ha ubicado el sitio de elaboracion de esa hormona. E s tamhien probable que de producirse esta artivacion en la entrega de esta hormona no se obtenga necesariamente un descenso del contenido de acido ascorbico total. Investi-

.&nn. 181. Super. Sanità (1966) 2, 575·598.

........ __________ _ CROXATTO 591

gaciones en curso permiten establecer que el efccto comun observado con angiotensina y bradiquinina corresponde a un fenomeno que se puede blo­quear por morfina y que por lo tanto se verifica por intermedio del hipota­lamo y no directamente sohre la hip6fisis (ZAMORANO & CROXATTO, en preparaci6n).

Substancias hipertensoras Jormadas en el suero por incubacion a 38°C sin modificar el pH : Si bien la acidificaci6n del suero crea una condici6n 6ptima para la formaci6n y acumulaci6n progresiva de péptidos vasoactivos, tambien la simple operaci6n de dejar el suero o plasma por varias horas a 37°C, produce cambios apreciables de sus componentes por la aparici6n de un factor hipertensor, que se descubre facilmente al inyectar 0.15 a 0.3 ml de suero en una rata nefrectomizada (en èstado de hipotensi6n) (Figura 11).

l 2 3 4 5 6 7 8 9 IO

"'"' "' 150 130 IlO

90 70 50

30

2 3 5

l iO 140 I ZO 100 80 IO 40

FiK. 11. - (A izquierda): Presi6n arteriai de ratns nefrectomizadas. De 1-3, se inyecta angiotensina II (0.005, 0.01 y 0.02 f.Lg respectivamente); de 4-10 se inyectnn 0.15 mi de sueros de distintas ratas incubadas 15 boras antes 380C. (A derecha): Se inyect~ un mismo siero, incuhado n p H 8.3 (l: 0.2 mJ; 5:0.1 mi) y a p H 3.8 (2: 0.2 mi; 3:0.1 mi; 4:0.05 mi) durante 15 horas a 38oC.

Que la mera incubaci6n del plasma induce cambios profundos en los consti­tuyentes, lo demuestra el hecho de obtener menor rendimiento de anefro­tensina, después de acidificar un suero que previamente se ha dejado por algunas horas a 38°C. Este rendimiento decrece en proporci6n al tiempo preliminar de incubaci6n (CROXATTO H. B., 1961). La formaci6n de principios vasoactivos durante la incubaci6n sin modificar el pH del plasma, de acuerdo con KENNER & W ALDI:IAUSL (1964) nunca Bega a ser tan apreciable como la que se registra a pH 3.8-4 en los mismos periodos de incubaci6n (Figura 11). Resulta que en el suero en el cual no se ha modificado el pH, tanto las pla­smakininas como las angiotensinas que eventualmente se forman, serian facilmente inactivadas por las peptidasas propias del plasma, fermentos que conservan toda su integridad a pH norma!.

El principio activo tiene un efecto hipertensor que es mas fugaz que el de An2 y se debe a una subst ancia que dializa dificilmente. Tiene efecto oci­t6cico y su acci6n hipertensora en la rata con presi6n normal es pequeiia y a veces no se presenta con dosis que son n etamente hipertensoras en la rata

.Jnn. Jst. Super. Sanità (1966) 2 , 5i5·598 .

---------------...~. __

592 CONFERENZE E SEMI ' ARI

nefrectomizada o tratada con pentolinio. La hipertension parece ser produ­cida por una vasoconstriccion periférica ya que la frecuencia cardiaca no se modifica, pero no se sabe si modifica cl débito sistolico. No se puedc to­davfa adelantar datos sobre la naturaleza de este principio que parece estar relacionado con algunos de los componentes proteicos dc la sangre. Se con­sigue una purificacion parcial por filtracion a través dc Sephadex G, 00 y separar la dc otras proteinas precipitando a éstas con etano l frio de 50°; el materia! activo queda en solucion.

Su formacion no es impedida por anticoagulantes del tipo de la heparina cuando ésta se adiciona en la jeringa en el momento de la sangr.ia . Tampoco influye significativamente la fibrinolisina o la antitripsina . En presencia de EDTA disminuye significativamente su rendimiento. La ncfrectomia basta 48 horas antes de tornar la muestra, afecta solo ligeramente la formacion , lo que excluye a la renina renal como responsable del fenomeno.

Significado biologico de las anefrotensinas. - E s tambien dificil pronun­ciarse sobre la significacion fisiologica de los péptidos que se engendran du­rante la incubacion del plasma o del suero. l Corresponden a m eros artefactos o ellos .PQdrian aparecer en el torrente sanguineo en situaciones fisiol6gicas? En favor de esta segunda alternativa se puellen considerar los siguientes hechos: l o las proteinas de la sangre estan destinadas a entrar en un ciclo de slntesis y degradacion continua ((( turn over »). Entre otros organos, el riiion participa activamentc en su transformacion (SmoA, 1939: ELIASCH et al., 1955). En conejos normales, GERBI (1951) ha demostrado que el con­tenido total de protcinas y albuminas en la sangre arteria} es significativa­mente mas alto que en la sangre de la vena. La concentracion del N amino­addico y peptidico seria mas elevarla en el plasma dc la sangre de la vena renal que en el plasma arteria! (HARMS et al. , 1962). Tamhien los sistemas enzimaticos como la fìbrinolisina pueden modifìcarse por su paso por el riiion (BuLUK & FuRMAN, 1962). La cantidad de albumina plasmatica que filtra en el glomérulo no seria despreciable y gran parte de ella es m etabolizada cuando es reabsorbida en el tubulo (OLIVER, MAc DowELL&LEE, 1954). La entrcga de la renina seria una de las expresioncs mas claras del papel del riiion para actuar sobre algunos substratos proteicos del plasma ; 2o la liberaci6n de péptidos diferentes de la angiotensina o muy similares a ella, puede t ener lugar en la sangre en ausencia de renina o de otro fermento del tipo de la pepsina; 3° péptidos vasopresores similares se pueden obtener en toda la escala de vertebrados, de elasmobranquios a mamiferos, aun de sueros de animales en cuyo riiion no se ha demostrado la renina, como es el caso del anfibio caliptocephalella Gayi {ARRAU, 1963). La cantidad de anefroten sina aumenta apreciablemente cuando se hace la nefrectomia (perro, ratas) y este aumento no se evita con. la antirrenina; 40 la formacion de los poli-

Aml. l st . Super . :Sani tà (1966) 2 , 575·598.

CROXATTO 593

péptidos An1 y An2 es (aparentemente) la consecuencia de enzimas diferentes de las que se activan en la homeostasis, como por ejemplo cuando la sangre entra en contacto con superficies extraiias. Experimentos muestran que _existen en la snngre intravascular, sistemas enzimaticos suficicntemente 13.­biles que se afectan aun cuando ésta permanezca en el iuterior de los vasos. Es el caso que la simple oclusion de una vena, por algunos minutos, aumenta la capacidad fibrinolitica de la fraccion euglobi~ca del plasma y eleva tanto la poten cia antiplasmin.a como antiurokinasa (HoLEMANS, 1963) ; 50 los experimentos des tinados a cstudiar la influencia de la permanencia previa del suero a 38°C a pH norma! sobre el rendimiento ulterior de anefrotensina bajo acidificacion (pH 3.8) demuestran claramente que la sangre extra· vasada, aun evitando la coagulacion, dispone de sistemas capaces dc modi­ficar sus proprios substratos que no requier t>n de acidifìcacion para scr acti· vados. Estos camhios no resultan aparentes con los métodos electroforéticos habituales, pero se revelan claramente al investigar la formacion de péptidos con m edios biologicos; 6° la simple incubacion a p H normal, como se ha de· scrito, prueba la exist encia de lentas modificaciones de substratos proteicos que culmman con la formacion progresiva de principios vasoconstrictores. Se ha pcnsado que los mecanismos quc intervicnen en la degradaciou de estos substratos, en la aparicion y desaparicion de péptidos vasoactivos, t endrian importancia en diversas formas de hipertension (CROXATTO H., 1961; 1962).

Péptidos e hipertension arterial. - La busqueda de substancias vasoac· tivas cn la sangre ha sido" principalmente estimulada por la necesidad de identificar los agentes hnmoralcs r esponsables de la hipertension arteria!. El sis tema renina-angiotensina no parece ser , una vez establecido, el m cca­nismo culpable, después que con los m éthodos mas sensibles se ha demo· strado que ni la renina _ni la hipertensina estarian aumentadas en la hiper· tension cronica t>Xperimental o clinica (BLAQUIER, BOHR & HoOBLER, 1960 ; PALADINI & ScoRNTK, 1963; GRoss, REGOLI & ScoAcHTELIN, 1963 ; KoLET· SKY & PRITCHARD, 1963 ; FASCIO LO et al., 1964). Hacen excepcion los casos de hipertension maligna (SKECCS & KAHN, 1958). El hecho que la corteza suprarrenal sea un factor muy sensible para la a ngiotensina y que el sodio participe de una servo m ecanismo que r-ontrola el nivei de renina circulante, ha afirmado el concepto que el sist ema angiotensina estaria mas relacionado con la r«>gulacion de la aldosterona que con la mantencion del tono vascular. Por otra parte, la nefrectomia total con lo que se excluyc la fuente de renina, origina en el perro el dcsarrollo de hipertension, lo que no ocurre en el animai con los ureteres ligados. Tamhien en el sapo la nefrectomia, induce el desar· rollo de hipertcnsion arteria!. E stos experimentos han llevado a formular la hipotesis que r l riiion tendria, mas que una acci6n prohipcrtensiva, un papel inhibidor que se ha exprcsado con el término de (( rol protector )) (FASCJOLO,

. J 1111. 1st. :Su per. Sanità ( 1966) 2, 5 7 5·598.

CO:>IFE RF."'ZE E SEMI~AR I

1938). El trasplante de riiion en perros hipcrtt·nsos por n!"frectomia bilatt-ral (MuutHEAD, JoNES & STJRMA , 1956) o cn ratas con hipPrtcnsion por DCA (G6 MEZ, HoOBLER & BLAQUIER, 1960; Ro AS et al. , 1964) o el homotra­splante en pacient es con cnfermedad hipcrtcnsiva (MERRILJ. & ScHUPAK, 1964) produce una normalizacion dc la pn:sion . El rifion podria contrarrcstar los factorcs prolJipcrtcnSÌ\"OS, perO ha8ta ahora solo S\' han furmu)ado hipo­teSÌS respccto de su mccanismo. MUIRIIEAD, .loNES & STinMAN (1960) han aislado de la m édula rf'nal un principio dt: accion hipotcnsora quc contra r­rcstaria cl dcsarrollo de la hipcrtt'nsion. P ero tambicn se ha plantcado la posibilidad de qui:' el riiion podria desempeiiar e8ta a ccion protectora intcr­viniendo continuamentl:' en el ciclo metabolico de las protcinas, particular­mcntc del substratu que cn su desintegracion pucda producir péptidos vaso­activos (CROXATTO, 1962 ; RosAs, 1963). El a umento notable de péptidos vasoactivos qu(• se obtienc de todos los animales nefrectomizados podria con sti­tuir la maxima expresion no de un déficit de la funcion excretora del riiion, sino dc su capacidad m etabolica para operar sobre las protcinas circulantcs.

H ipertensi6n experirnental. - Como t entativa de cxplorar Pn la hiper­tensiou arteria) las posiblcs alteracioncs de los sistemas f'nzimaticos o dc los substratos dc la sangrc que puedcn llcvar a la furruacion de ancfrott>nsina, se han hccho determinaciones cuantitati,·as de p éptidos vasopresores l'Il

los plasm as de animales con divcrsos tipos de hipert<·nsion experimental: a) por corticoides; b) por encapsulacion del riiion con tela de rayon y c) tipo GROUMAN (1944) (ligadura del rifion en Figura 8). En el primcr tipo se ha dcmostrado quc en cl periodo avanzado, estaria a umf'ntado d substrato quc forma anefrotcnsina (RosAs & CnoXATTO, 1962) y cn un c•studio reali­zado en un grupo de 24 ratas hipcrtensas por en capsulacion renal y 21 uni­nefrcc tomizadas, sacrificadas 46 a 58 dias después de iniciado cl expcrim<'nlo, se encontro quc la incuhacion acida dP los sueros de las hipertensas, produjo un mayor rcndimiento de péptidos de accion contnictil sobre el utero aislado e hipertensora sobre ratas ncfrectomiza das (CROXATTO et al., 1964 a). El ren­dimiento promedio de substancias hipertensoras fu é equivalent P a 0.12 ±_

0.1 !J.g de angiotensina II para el grupo hipertenso y dc 0.04 :L 0.002 !J.g por ml de suero en cl control. La ùiferencia de actividad ocitocica entre a mhos sueros fu é mas acentuada, cn contrandose respcctivamentc los equiYalentcs de 350 mU y 50 mU de ocitocina por mi (CnoXATTO et al., 1964 a). l..os pro­ductos cnsayados de ambos gr~Jpos corrcspondian a extractos peptidicos no sometidos a la purificacion crom atografica y por tanto eran una mezcla dc péptidos, cn los cuales h abia sin duda, una proporcion d!' plasmakinina como era facil dcducir por el efecto bifasico sobrc la presion arteria! de ratas nor males. Estudios mas recientes, con extractos de suero sometidos a una puri­fi cacion cromatografica y tratamiento con carboxipeptiùasa B, mostraron

Amt. /st. Super . .Sa11ilà (1 066) 2 , (; 75-5118 .

CROXATTO 59 .'i

que el principal agente vasopresor era simi1ar a la A02 obtenida del suero de perro y que el componente con mayor potencia ocitocica era bradiquinina . Sin embargo, no se pudo establecer una correlacion entre d aumento de estos p éptidos y el grado dc hipertensi6n arterial. En las r atas hipertensas por ligadura en Figura 8 de un riiion y nefrectomia contralateral, cuyos extract os de suero son incubados con carboxipeptidasa B antes del ensayo biologico, para destruir las plasmaquininas, tambien se pudo apreciar un nivei de sub­strato de anefrot ensina mas alto que en las ratas controles, pero no se en con­tr6 relaci6n cnlre est e fenomeno y el grado rle hipertensi6n (SAN MAHTIN & RosAS, 1964-). Aun cuando existen alteraciones cvidentes, los estudios por ahora no permiten est ablecer con seguridad si est a a lterado en la hiperten­sion el ciclo metabolico de las proteinas circulantes en una direcci6n que lieve a una m ayor formaci6n de péptidos vasoactivos. Tampoco sabem os en que m edida estaria implicado el riiion en est e proceso.

A notaciones finales. - Las investigaciones a qui descrit as muestran la gran inest abilidad de las prot einas plasm aticas y la facilidad con que se generan p éptidos vasoactivos. Entre estos no solo aparecen bradiquinina y kalidina ; de hecho el componente vasomotor mas importante qu e aparece y se acumula durante la incuhacion acida del suero es un péptido (An2) con caract eristicas muy similares a las de la angiot ensina I. Los estudios no han permitido est ablecer si estos dos Ultimos se identifican ; co t odo caso las dife­rencias estructurales entre ellos de existir ro.o deben ser considerables, pero han de ser suficientes para explicar el porqué el fermento convertirlor, du­rante la incubaci6n no lleva la r eacci6n basta la formacion de un cuerpo màs cercano a la an giot ensina II que a la angioten sina I. Ta mbien es importante destacar que estos principios vasoconstrictores : An1 y An2 como t amhien el que se forma en el plasma incubado a pH norma l, pueden formarse sin la intervenci6n de la r enina.

Agradezco, la ayud a del numeroso p ersonal que intervino en los experimentos par t icu · la rmente de Juan R oblero y Sergio Bazaes, qu e participaron en las etapas q uimicas de la purifìcaci6n de anefrotensina . D eseo expresar m i grat itud al Dr. L.T. Skeggs (Cleveland) y al Dr . E. N icolaides (P arke Davis) p or la generosa ayuda surninistrando polipép tidos puros, a l Prof. G. B. M:arini-Bettòlo y sus colaboradores del Istituto Superiore d i Sanità, Roma, por la valiosa coop eraci6n prestad a.

Est e trabajo ba sido p arcia lmente realizado con la ayuda del R esearch Office d e la U. S. Army.

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