Cuantificacin y estimacin de la pureza del ADN extrado mediante
Espectrofotometra.Antes de realizar la PCR debemos comprobar que el
ADN extrado est suficientemente puro y tiene pocas protenas
contaminantes. Esto se determina mediante espectrofotometra. El ADN
presenta un mximo de absorbancia a 260 nm (50 Qg/mL tienen una OD a
260=1), mientras que las protenas lo tienen a 280 nm, aunque a 260
nm tambin presentan absorbancia. Si calculamos la relacin A260/A280
podemos determinar si el ADN es ms o menos puro: A260/A280 =
1,9-1,7 ADN puro (si tiene un valor ms bajo sera necesario
purificarlo y eliminar las impurezas). Procedimiento 1) Etiquetar
un tubo eppendorf de 1,5 mL como Blanco y pipetear en l 50 QL de
agua destilada 2) Marcar otro tubo como ADN 1/5 y pipetear en l 10
QL de la disolucin de ADN y 40 QL de agua desionizada. 3) Poner el
espectrofotmetro en modo absorbancia a 260 nm 4) Cargar el Blanco
en una cubeta y pulsar el botn de blanco 5) Retirar el blanco de la
cubeta y cargar el contenido del tubo ADN 1/5 y hacer la medida de
absorbancia (el valor ideal estara entre 0,100 y 1,000) 6) Cambiar
la absorbancia a 280 nm y medir de nuevo 7) Calcular la cantidad de
ADN y su pureza: Concentracin, cc = A260*50*1/5 (Qg/mL) Cantidad
ADN = cc *50 QL (ng) Pureza
Si obtenemos un valor muy pequeo de A260 podemos hacer una nueva
medida con 50 QL de la disolucin de ADN sin disolver, que despus
recuperaramos en un nuevo tubo de 1,5 mL.
