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Ronéo n°6 /14
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UE1 Biologie Cellulaire Dr Jérôme Larghero Le 30/10/2012, de 10h30 à 12h30 Ronéotypeur : Adrien Gillibert Ronéolectrice : Élise Casassus
Cours n°8 Thérapies cellulaires et médecine
régénérative
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Plan du cours
I. Thérapie cellulaire et cellules souches hématopoïétiques 1. Principe 2. Sources de cellules souches hématopoïétiques 3. Utilisation des cellules souches hématopoïétiques
II. Médecine régénérative
1. Le sang de cordon 2. Les cellules souches mésenchymateuses 3. Les cellules embryonnaires
III. Les limites à l’utilisation des cellules souches
1. Les limites réglementaires 2. Les limites biologiques
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Introduction : La thérapie cellulaire est l’utilisation de cellules vivantes manipulées ou modifiées à des fins thérapeutiques. Des dispositions réglementaires fixent les modalités d’organisation de la thérapie cellulaire.
Ces produits de thérapie cellulaire ou d’ingénierie cellulaire et tissulaire contiennent des cellules ou tissus d’origine humaine, animale ou les deux, mais peuvent être associés à des substances supplémentaires comme des biomolécules, des substances chimiques, supports ou des matrices.
Ces cellules ou tissus peuvent être viables ou non viables mais possèdent des
propriétés lui permettant de réparer, régénérer ou remplacer un tissu humain. Il faut savoir qu’aujourd’hui, en dehors du champ de l’hématologie, nous ne sommes pas capable de complètement réparer un tissu humain.
Ces produits sont différents du sang, donc rien à voir avec la transplantation
sanguine que ce soit sur un plan d’application thérapeutique ou sur un plan réglementaire. De même ils sont évidemment différents de la transplantation d’organe qui est une technique en elle même.
Les produits doivent donc répondre à des standards de qualité, de sécurité, de traçabilité tout en respectant la réglementation européenne relative aux médicaments de thérapie innovante. Les champs d’applications de la thérapie cellulaire :
• nombreux types de cellules utilisables : embryonnaires, souches fœtales, souches d’organes adultes, adultes spécialisées, etc.
• modalités de traitement : allogreffe (donneur et receveur différents), autogreffe (donner pour soi même), xénogreffe (donneur d’origine animal)
• il faut distinguer les applications validées (hématologie, grands brûlés, diabète de type I) des applications non validées (stade d’essai clinique dont on ne connaît pas l’efficacité réelle)
Les différents types de cellules utilisables pour les thérapies cellulaires sont :
• Les cellules totipotentes, (œuf fécondé) elles n’ont pas d’utilisation thérapeutique pour le moment
• Les cellules pluripotentes majoritairement représentées par les cellules souches embryonnaires et les cellules iPS
• Les cellules multipotentes, plutôt des cellules adultes avec, par exemple, les cellules souches hématopoïétique
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I. Les thérapies cellulaires et les cellules souches hématopoïétiques :
1. Principe :
Le premier stade de la thérapie est le traitement par chimiothérapie, il s’agit du traitement pré greffe. L’objectif est de tuer un maximum de cellules tumorales.
Allogreffe : le patient doit être conditionné avant de recevoir la greffe, il va donc subir une chimiothérapie associée ou non à une radiothérapie. À ce stade le patient est en rémission, il n’est quasiment plus possible de détecter des cellules tumorales : il s’agit du meilleur moment pour injecter les cellules souches hématopoïétiques prélevées chez le donneur, directement dans la moelle du patient. La moelle du malade devrait par la suite être capable de reconstituer une hématopoïèse correcte.
Autogreffe : dans ce cas on prélève les propres cellules souches du patient après le traitement pré greffe. On continue le protocole de chimiothérapie et on lui injecte ses cellules après la deuxième phase de chimiothérapie.
Cependant après la deuxième phase de chimiothérapie, le patient est en aplasie. L’objectif est de le maintenir dans cette phase le moins longtemps possible. En effet une aplasie entraine une anémie, une diminution des plaquettes et des globules blancs. Donc au moment de la greffe ces patients sont très fragiles, susceptibles aux infections et aux saignements. Il faut donc injecter un maximum de CSH pour diminuer le temps d’aplasie : plus le nombre de CSH est important, plus vite l’hématopoïèse se remettra en place.
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2. Sources de cellules souches hématopoïétiques (CSH) :
a. Moelle osseuse :
C’est dans la moelle osseuse que l’on trouve les CSH de façon préférentielle et notamment dans ce que l’on appelle les niches hématopoïétiques. Dans ces niches, on trouve plein d’autres types cellulaires. Lorsque l’on prélève la moelle osseuse, on ne prélève pas uniquement les CSH mais aussi
tous les autres types cellulaires que l’on peut trouver dans la moelle osseuse.
Ces prélèvements se font au bloc opératoire, après une anesthésie générale du donneur. On prélève avec un système de trocart, la moelle est à l’intérieur de l’os et il faut le traverser. On prélève dans les crêtes iliaques environ 1,5l de moelle osseuse.
b. Sang périphérique :
Autre système, aujourd’hui encore plus utilisé que le prélèvement de moelle osseuse bien que relativement récent : Il s’agit de la greffe de cellules souches périphériques.
On a mit au point des techniques permettant de détacher les CSH de leur support dans la moelle osseuse, elles vont ainsi passer directement dans le sang périphérique.
On utilisera ensuite le système de cytaphérèse, capable de prélever d’un côté le sang périphérique, de séparer les globules blancs (dans lesquels seront les CSH) du plasma et des globules rouges qui sont réinjectés de l’autre côté au donneur.
C’est un système très intéressant puisque d’une part moins traumatique que le prélèvement de moelle osseuse, et d’autre part on prélève seulement 300mL qui sont largement plus concentré en CSH que dans le litre de molle osseuse.
Cependant, comme expliqué précédemment il n’existe qu’un faible nombre de CSH à l’état basal dans le sang périphérique. Avant la cytaphérèse, il est donc nécessaire d’effectuer une technique de mobilisation : utilisation d’une chimiothérapie aplasiante, de facteurs de croissances (G-CSF++) ou les deux en même temps.
Mais le protocole sera différent s’il s’agit d’une allogreffe (donneur sain, donc utilisation seul, de facteur de croissance) ou s’il s’agit d’une autogreffe (donneur malade, donc utilisation de chimiothérapie seule, ou combinée à des facteurs de croissances).
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c. Sang de cordon ombilical ou sang placentaire :
Cette source de CSH a été identifiée en 1988. Le but est de récupérer des CSH relativement nombreuses dans le cordon ombilical. Le prélèvement n’est absolument pas douloureux pour le nouveau né. Le système est très simple, on ponctionne directement dans la veine ombilicale, et juste par gravité le sang du cordon va descendre. Le sang de cordon ombilical à des intérêts multiples :
• Mise en place de banque de sang de cordon ombilical : les greffons de sang de cordon sont cryopréservés, et seront ainsi disponible pour un receveur potentiel à tout moment et partout dans le monde. Le délai entre le diagnostique et la greffe peut donc être nettement plus court dans ce cas.
• Immaturité des CSH qui régénèrent la moelle osseuse : elles sont moins nombreuses, mais plus immatures et prolifèrent donc beaucoup plus.
• Immaturité des cellules immunocompétentes (grosso modo les lymphocytes) : intérêt dans la maladie du greffon contre l’autre.
Dans les cas d’allogreffe, il existe un conflit entre les cellules du donneur et les
cellules du receveur. On a vu qu’en prélevant la moelle osseuse, on prenait les CSH, mais aussi tout le reste, c’est à dire des lymphocytes. Par conséquent en injectant la moelle osseuse, les lymphocytes du donneur vont reconnaître le receveur comme étant du non soi. Ils vont alors s’activer et chercher à détruire les cellules du receveur : c’est ce que l’on appelle la maladie du greffon contre l’autre.
Donc si les lymphocytes sont moins matures, ils sont moins actifs et il y aura moins de réaction du greffon contre l’autre. On parle d’effet GVH !
On a vu tout à l’heure que l’on greffait des patients qui ont certes une masse tumorale diminuée, mais pas totalement détruite. Le problème du lymphocyte d’un donneur normal c’est que il provoque un effet GVH, mais quand il s’active il peut aussi s’activer contre les cellules tumorales résiduelles. C’est l’intérêt majeur des lymphocytes : l’effet GVL, le greffon contre la leucémie.
Il existe donc une balance permanente à essayer de gérer l’effet GVH, délétère de la greffe, et l’effet GVL, bénéfique, du greffon contre la leucémie. Il faut essayer de diminuer l’un (GVH) tout en essayant de pas trop diminuer l’autre (GVL).
L’inconvénient du sang de cordon est que l’on peut en prélever qu’environ
100mL, il y a donc moins de CSH que dans 1,5L de moelle par exemple. Par conséquent, au début de la greffe de sang de cordon, on ne greffait que des enfants, mais deux techniques on permit l’utilisation plus fréquente du sang de cordon sur des adultes :
• greffe de deux sangs de cordons différents, plus ou moins HLA compatibles au même receveur
• expansion du sang de cordon : amplification des CSH du sang de cordon en laboratoire grâce à un processus en plusieurs étapes : on prélève le sang de cordon, on isole les CSH que l’on amplifie ensuite avec des facteurs de croissances et cytokines permettant leur prolifération. On obtient un nombre conséquent de CSH, mais les cellules obtenues commencent à engager un processus de différenciation en culture, et seront donc moins capable de restaurer l’hématopoïèse.
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C’est une révolution dans la greffe de CSH de l’adulte : on a pu greffer des malades qui n’avaient ni donneur intra familiaux, ni donneur X, ce qui est relativement fréquent puisqu’on le retrouve dans 30% des cas.
3. Utilisations des allogreffes et autogreffes :
Ce sont des approches thérapeutiques différentes mais les indications en autogreffe et allogreffe sont différentes.
Comme vu précédemment, la problématique de la chimiothérapie est l’aplasie. L’intérêt de l’autogreffe est de réinjecter les CSH prélevées avant la chimiothérapie pour que la phase d’aplasie soit la plus courte possible. On ne cherche donc pas forcément à utiliser l’autogreffe pour remplacer une moelle malade. Il s’agit en réalité plus souvent d’un support à l’utilisation de chimiothérapie très forte dose avec la possibilité en plus de faire plusieurs cycles de ces chimiothérapies à forte dose.
En revanche pour l’allogreffe, le but est de remplacer une moelle malade. Elle est donc quasi exclusivement le traitement des maladies hématologiques malignes ou non, puisque l’on peut greffer aussi bien des leucémies, que des drépanocytoses ou hémopathies de ce type.
II. Médecine régénérative : 1. Le sang de cordon : « chemin efficace vers la guérison » :
On a vu que le sang de cordon ombilical est source de CSH, mais pas
uniquement. En effet on peut trouver plein d’autres types cellulaires même s’il est aujourd’hui utilisé de manière quasi exclusive en hématologie pour l’allogreffe.
On peut en particulier trouver dans le sang de cordon des acronymes de cellules souches mésenchymateuses, des progéniteurs endothéliaux qui peuvent potentiellement être utilisés dans des applications de médecine régénératrice. Il faut savoir que toutes ces applications relèvent d’indications non validées.
Certains on mit en évidence des cellules qui ressembleraient aux cellules souches embryonnaires, le sujet est controversé puisque seulement deux équipes ont réussi à les trouver et aucun preuve scientifique n’a été proposé. A l’heure actuelle il existe de nombreux travaux utilisant des cellules du sang de
cordon ombilical. Voici un exemple dans le domaine de la régénération cardiaque : A gauche on observe les animaux contrôles chez qui on a provoqué un infarctus du myocarde : la fonction cardiaque diminue. A droite les animaux qui ont reçu les cellules souches mésenchymateuses qui récupèrent une fonction cardiaque. La greffe de cellule sur ce modèle permet de penser qu’elle améliore l’activité cardiaque.
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Il s’agit d’une des applications parmi des milliers d’autres possibles, mais n’ont pas encore été validées en clinique. Toutefois, des protocoles ont été mis en place chez l’homme en particulier dans les maladies ischémiques :
Chez des patients atteints de cette pathologie, on a injecté des cellules souches mésenchymateuses isolées depuis du sang de cordon. Quelque temps après la greffe, on peut observer une réapparition de la vascularisation avec des améliorations cliniques notables.
Il s’agit d’applications non validées, mais cela nous laisse entrevoir ce dont on pourrait être capable dans plusieurs années, pour ces patients qui auraient dû subir une amputation.
Petite parenthèse sur l’esprit critique : exemple d’un essai proposé chez des jeunes ayant un diabète de type I. Un protocole a été mis en place à partir de sang de cordon autologue. Concrètement on cryopréserve le sang de cordon pour un potentiel diabète de type I à venir. L’idée est de réinjecter le sang de cordon au moment ou l’enfant développe son diabète : les cellules souches devraient permettre de reformer des ilots de Langerhans ou améliorer la prolifération de ceux déjà existant. Evidemment cette idée ne repose sur aucune donné scientifique.
Ils ont quand même réussi à monter un essai avec uniquement une injection de sang de cordon en cas de diabète : aucun conditionnement pré greffe, aucun critère pour le diagnostique en dehors du diabète de type I.
Evidemment les résultats sont négatifs, nous sommes incapable de discerner les courbes des patients traités de celles des non traités. Il n’y a aucune amélioration suite au traitement.
Mais la conclusion retenue par l’entreprise de cet essai est : l’injection de sang de cordon est faisable et bien tolérée ! Heureusement l’éditorial du journal ayant publié l’étude précise : « les résultats sont négatifs et la présente étude donne un signal très négatif sur l’utilisation à venir de sang de cordon autologue dans cette pathologie. »
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Le sang de cordon ombilical est donc au centre de questions éthiques et sujet à de nombreux débats. Il faut retenir que lorsque l’on parle de banque de sang de cordon aujourd’hui il s’agit d’un usage uniquement allogénique.
On peut toutefois prélever dans un contexte intrafamilial sous conditions très
particulières : Exemple : un premier enfant nait, il développe tôt une leucémie, il est traité. La
maman est enceinte d’un deuxième enfant. On peut proposer de prélever le sang de cordon du deuxième pour soigner le premier. Il faut savoir que les banques de sang de cordon à usage autologue sont interdites en France.
2. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) :
Le sang n’est pas le seul intérêt du cordon ombilical. Le « tuyau » en lui même est très utile puisqu’il contient beaucoup de cellules souches mésenchymateuses.
Le cordon est constitué de ce que l’on appel la Gelée de Wharton (tissu
conjonctif entourant veines et artères ombilicales) qui est très riche en CSM. Il existe deux façons de récupérer ces cellules :
• Un protocole de digestion enzymatique détruit la gelée et permet de récupérer les CSM
• Déposer le cordon directement dans une boite de pétrie et attendre que les cellules aillent toutes seules coloniser la boîte. C’est la technique la plus utilisée étant donné qu’elle est très simple.
Ces CSM du cordon ombilical ont divers avantages pour des applications de
médecine réparatrice : • Plus faciles à prélever que dans la moelle osseuse • Prolifèrent mieux • Capacités de sécrétion de cytokines et facteurs de croissance plus
importante que celles de la moelle osseuse Ces cellules ont de nombreuses applications qui font d’elles un intérêt majeur :
• Elles sont multipotentes et possèdent donc de multiple possibilités de différenciation : os, cartilage, muscle, adipocyte…
• Elles synthétisent beaucoup de cytokines et facteurs de croissance qui peuvent avoir un rôle trophique important pour les cellules que l’on cherche à réparer
• Elles sont aussi capables de réguler la réponse immunitaire Elles peuvent donc être très utiles dans deux domaines importants :
• les capacités de différenciation permettent de réparer de nombreux tissus différents
• les maladies auto immunes et l’activation lymphocytaire
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Par exemple ici un cas de sclérodermie systémique sévère : maladie auto immune résistante à tous les traitement. Après injection de CSM on observe une forte amélioration notamment au niveau de la réparation cutanée.
Autre exemple important notamment dans le domaine de l’allogreffe et la maladie du greffon contre l’autre :
On voit que le sujet, après une allogreffe, développe une maladie du greffon contre l’autre très importante, résistante aux traitements immunosuppresseurs, aux corticoïdes. On lui injecte alors des CSM : on observe une diminution frappante de la maladie du greffon contre l’autre.
3. Les cellules embryonnaires :
On commence à vouloir utiliser ce type de cellule dans des protocoles de
médecine réparatrice. Ce qui a du sens étant donné que ces cellules sont capables de donner naissance à tous les autres types cellulaires.
Pour le moment peu de chose se font réellement, seulement deux essais cliniques ont été autorisés aux Etats Unis sur des cellules dérivés de cellules souches embryonnaires. En effet ces cellules à l’état indifférenciées sont inutilisables chez l’homme puisqu’elles donnent 100% de tératocarcinome. On utilise donc uniquement des cellules différenciées à partir de cellules souches embryonnaires :
• Société Geron : Injection de cellules neuronales chez un patient atteint de lésion à la moelle, un seul patient greffé puis arrêt des études par faillites de l’entreprise.
• Société Advanced Cell Therapy : greffe de cellule de l’épithélium pigmentaire rétinien, avec des améliorations notables de l’acuité visuelle pour un ou deux patients.
Les cellules iPS sont complètements crées en laboratoire. On n’en retrouve donc
pas à l’état physiologique. Elles ont été découvertes par un chercheur japonais : Yamanaka, prix Nobel de médecine 2012.
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La thérapie cellulaire ne se limite pas à l’injection de cellules. On utilise de plus en plus des thérapies cellulaires associées à des biomatériaux. Voici un exemple très intéressant :
Le patient n’a plus de mandibule suite à un accident. Cette étude associe beaucoup d’éléments : le travail par ordinateur, le travail des biologistes cellulaires, le travail d’ingénieurs, le travail de spécialistes des biomatériaux :
1. Ils reconstruisent par ordinateur la surface lésée 2. Mise au point d’un biomatériau compatible (ici os + biomolécule) 3. Préparation du biomatériau avec l’os autogène et les biomolécules 4. Mise en place d’une vascularisation du biomatériau par maturation dans le
muscle grand dorsal du patient 5. Installation du greffon au niveau de la mandibule
Cet exemple illustre très bien l’utilisation des produits issus de l’ingénierie
tissulaire : cellules ou tissus issus de l’ingénierie tissulaire, associés à des substances supplémentaires comme des biomolécules, biomatériaux, substances chimiques ou matrices, dans le but est de régénérer, réparer ou remplacer un tissu humain.
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III. Les limites à l’utilisation des cellules souches : 1. Les questions réglementaires :
L’utilisation des cellules souches est régulée en France par les lois de bioéthiques de 2004 et 2011 :
Cependant, il est possible d’obtenir des dérogations dans un cadre ultra réglementé de projets d’études et de recherches sur les cellules embryonnaires uniquement pour : des protocoles de recherche, l’importation et l’exportation, la conservation et le stockage.
Cette autorisation est délivrée par l’agence de la biomédecine pour 5 ans avec des conditions drastiques en France.
Le sang de cordon ombilical est lui aussi très réglementé, surtout depuis 2011 puisqu’avant il était considéré comme un résidu opératoire. Pour faire simple le sang de cordon ombilical est aujourd’hui au même niveau que la moelle osseuse et le sang périphérique. Ce n’est donc plus un déchet opératoire, mais un tissu à finalité thérapeutique : la greffe de CSH allogénique.
Il existe des autorisations des maternités, des unités de thérapie cellulaire et des banques de sang de cordon qui gèrent les prélèvements effectués dans les maternités. Il existe aujourd’hui une dizaine de banques de sang de cordon et environ 80 maternités associées à celles ci :
• Si le prélèvement se fait dans une maternité qui n’est pas autorisée, la peine encourue est de 2 ans d’emprisonnement et 30 000 euros d’amende.
• En cas d’exportation de sang de cordon sans autorisation, la peine encourue est de 5 ans d’emprisonnement et 75 000 euros d’amende.
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2. Les questions relevant du domaine de la biologie :
Il n’existe pas vraiment de législation sur les iPS et leur dérivation aujourd’hui. Les questions importantes sur la biologie des cellules souches relèvent des directives sur les médicaments de thérapies innovantes. Il y a donc toute une problématique qui est posée pour des médicaments liés aux cellules, à l’ingénierie tissulaire et à la thérapie génique :
• utilisation autologue, allogénique ou xénogénique. • problème des réponses immunitaires • variabilité des cellules, sénescence, apoptose, dose, modalités d’injection
On a donc à la fois une problématique de biologie des cellules et une problématique de contrainte réglementaire.
a. Problème lié à l’allogénie et à l’autologue :
Le système HLA est très polymorphe ce qui limite l’utilisation de l’allogénique. Il serait donc préférable de faire de l’autologue, mais quand on est un industriel on préfère une utilisation plus large et donc allogénique.
On cherche donc à s’affranchir du problème HLA, d’ou des recherches sur les CSM grâce à leurs propriétés immunosuppressives, de sécrétions de facteurs solubles, de différenciation facile. Sauf que même si elles sont immunosuppressives elles sont reconnues comme étrangères lors de la greffe et peuvent donc être rejetées.
b. Le problème de la réponse immunitaire :
Dans la réponse immunitaire, on a vu le problème de la maladie du greffon contre l’autre avec l’effet GVL et GVH. On peut aussi avoir une réponse immunitaire dirigée contre des produits thérapeutiques annexes utilisés pour faire le greffon.
Exemple du sérum de veau fœtal, très souvent utilisé comme milieu de culture permettant une prolifération des cellules. Il existe des cas de patients qui développent des anticorps anti sérum de veau fœtal, des anticorps contre les biomolécules (comme des facteurs de croissances par exemple). Il existe aussi un risque lié aux prions puisque le sérum vient du veau.
c. Le niveau de manipulation :
On a vu que pour la greffe de CSH, la préparation des greffons n’était pas si compliquée que ça. Les manipulations les plus courtes dans ce cas ne durent pas plus de 3h, 4h voire une journée. Ce sont des manipulations dites « simples ».
Il existe des manipulations qui sont elles complexes. Les CSM elles, nécessitent 3 semaines d’amplification. Plus on complexifie le niveau de manipulation, plus on complexifie le protocole de thérapie cellulaire et plus on complexifie le médicament de thérapie innovante mis en place.
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d. La variabilité : Elle joue un rôle très important dans la réussite de la mise en place d’un médicament de thérapie innovante :
• La variabilité interindividuelle, très importante, qui ne peut pas toujours être expliquée
• La variabilité lié à l’âge • La variabilité lié à la pathologie
e. Les altérations génomiques :
Elles sont un des grands problèmes de l’utilisation des cellules souches embryonnaires dans des protocoles thérapeutiques chez l’homme.
Certaines de ces lignées de cellules souches embryonnaires ont une grande capacité à acquérir des anomalies chromosomiques diverses et variées.
Ce problème est aussi valable pour les cellules iPS, il n’existe même pas de corrélation entre les méthodes utilisées pour les reprogrammer et le nombre d’altération génomique.
Enfin ce problème n’est pas réservé aux cellules souches embryonnaires et aux iPS. Il existe aussi des problèmes d’altération génomique même chez des cellules issues de sang de cordon ombilical. Ces altérations sont très probablement liées au milieu de culture.
f. Pharmacodynamie :
Il existe une réflexion autour des voies d’injections, les doses cellulaires et les fonctions in vivo. Il existe de nombreux travaux aujourd’hui sans avoir de réponse exact.
C’est une grosse difficulté de mise en place des protocoles de thérapie cellulaire. Pour l’instant on est rendu à tester une dose et observer l’efficacité thérapeutique.
Conclusion :
Ces produits cellulaires sont des systèmes extrêmement complexes : • Elles sont dépendantes de leur environnement avec des spécificités
d’espèce et de pathologie • Elles réagissent à leur environnement • Elles peuvent devenir hétérogènes en culture, on peut avoir des cellules non
désirées après plusieurs semaines de culture à cause de différenciation par exemple
• Elles peuvent migrer • Elles sont fragiles et parfois mortelles, ce qui pose problème sur leur injection
direct ou l’utilisation associée de biomatériaux. Tous ces problèmes ont pour conséquence la mise en place d’une réglementation.
