contribuţii la cercetarea chimico-toxicologică a alcoolului metilic

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “GR. T. POPA”

FACULTATEA DE FARMACIE

CONTRIBUŢII LA CERCETAREA

CHIMICO-TOXICOLOGICĂ

A ALCOOLULUI METILIC

Rezumatul tezei de doctorat

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC,

PROF. DR. FARM. ELENA BUTNARU

DOCTORAND

BIOLOG PRINCIPAL DOINA (BEJAN) MOALEŞ

IAŞI, 2011

2

CUPRINS

Pag.

1. Introducere 1

1.1. Motivarea alegerii temei

1.2. Obiectivele tezei de doctorat

1

2

A. STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

2. Metanolul. Istoric 4

2.1. Obţinerea metanolului 4

2.1.1. Obţinerea metanolului prin distilarea lemnului

2.1.2. Obţinerea metanolului din gazul de sinteză

5

5

3. Structură. Proprietăţi fizico-chimice 6

3.1. Structură

3.2. Proprietăţi fizice

3.3. Proprietăţi chimice

6

7

7

4. CONSIDERAŢII ASUPRA RISCULUI LA METANOL

10

5. Ecotoxicitatea metanolului 13

5.1. Surse naturale

5.2. Surse antropice

5.3. Circuitul metanolului în apă

5.4. Circuitul metanolului în atmosferă

5.5. Circuitul metanolului în condiţii anaerobe

5.6. Securitatea şi gestionarea metanolului

5.7. Prevederi referitoare la deşeurile de metanol

5.8. Metode de eliminare din mediu

13

14

15

16

16

16

17

18

6. Toxicitatea metanolului 19

6.1. Etiologia intoxicaţiilor

6.2. Toxicocinetică

19

19

6.2.1. Pătrundere. Absorbţie. Distribuţie

6.2.2. Biotransformarea metanolului. eliminare

19

19

6.2.2.1. Oxidarea metanolului la aldehidă formică

6.2.2.2. Oxidarea aldehidei formice la acid formic prin

intermediul formaldehid dehidrogenazei

6.2.2.3. Biotransformarea acidului formic la dioxid de carbon

şi apă prin intermediul folaţilor

20

23

24

6.3. Toxicodinamie

6.4. Factori care influenţează toxicitatea alcoolului metilic

25

26

6.4.1. Factori genetici

6.4.2. Factorii fiziologici

6.4.3. Ritmul circadian

6.4.4. Interacţiuni cu alte substanţe

26

26

27

27

3

6.4.5. Existenţa efectului cumulativ

6.4.6. Factori dependenţi de mediu

27

29

6.5. Simptomatologia în intoxicaţia cu metanol 30

6.5.1. Simptomatologia în intoxicaţia acută

6.5.2. Simptomatologia în intoxicaţia cronică

6.5.3. Aspecte ale intoxicaţiei metanolice în sarcină

6.5.4. Leziuni anatomo-patologice

30

31

31

32

6.6. Tratamentul intoxicaţiei metanolice 32

6.6.1. Etapele tratamentului

6.6.2. Antidoturi specifice

32

33

7. Prezenţa metanolului şi a altor congeneri volatili cu potenţial toxic în

băuturile alcoolice

36

7.1. Toxicitatea principalilor congeneri volatili ce se regăsesc în distilatele

alcoolice

38

7.1.1. Toxicitatea alcoolului etilic

7.1.2. Toxicitatea aldehidei acetice

38

40

7.2. Toxicitatea altor congeneri volatili 40

7.2.1. Toxicitatea acetatului de etil

7.2.2. Toxicitatea acidului acetic

7.2.3. Toxicitatea alcoolilor amilici

30

40

41

8. Metode de analiză a alcoolului metilic 42

8.1. Metode calitative

8.2. Determinarea calitativă a metanolului din băuturile alcoolice

8.3. Metode de determinare cantitative

42

44

44

8.3.1. Dozarea metanolului din probe biologice

8.3.2. Determinarea cantitativă a metanolului din distilatele

alcoolice prin metoda colorimetrică

8.3.4. Dozarea metanolului din aer

44

46

46

8.4. Determinarea metanolului prin gaz-cromatografie (GC) 48

8.4.1. Metode de determinare a metanolului din sânge prin gaz-

cromatografie (GC)

8.4.2. Determinarea metanolului din băuturi alcoolice spirtoase prin

GC

49

50

B. CONTRIBUŢII PERSONALE

9. Dezvoltarea şi validarea unei metode de determinare a metanolului prin

gaz-cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS)

53

9.1. Protocol de lucru

9.2. Dezvoltarea metodei

9.3. Validarea metodei

53

56

63

9.3.1. Liniaritatea

9.3.2. Limita de detecţie

9.3.3. Limita de cuantificare (LQ)

9.3.4. Intervalul (domeniul de lucru)

9.3.5. Precizia

63

68

69

69

70

9.3.5.1. Repetabilitatea

9.3.5.2. Precizia intermediară

71

72

4

9.3.5.3. Reproductibilitatea 73

9.3.6. Acurateţea (Exactitatea) 74

9.4. Concluzii referitoare la determinarea metanolului prin GC-MS

75

10. Aplicabilitatea metodei de determinare a metanolului prin GC-MS 76

10.1. Obiectivele studiului

10.2. Protocol de lucru

10.3. Rezultate şi discuţii

76

76

78

10.3.1. Determinarea metanolului din distilatele alcoolice naturale

10.3.2. Determinarea concentraţiei etanolice din distilatele alcoolice

natural

10.3.3. Determinarea concentraţiei metanolului faţă de concentraţie

etanolului

10.3.4 Determinarea prin gaz-cromatografie cuplată cu spectrometrie

de masă a altor toxici volatili prezenţi în distilatele alcoolice

87

82

90

105

10.3. Concluzii

116

11. Dezvoltarea şi validarea unei metode de determinare cantitativă a

metanolului din probe biologice prin GC-MS

119


11.2. Dezvoltarea metodei

11.3. Validarea metodei

119

119

122

11.3.1. Liniaritatea




11.3.5. Precizia

122

126

126

127

127

11.3.5.1. Repetabilitatea


127

129

11.3.6. Acurateţea (Exactitatea) 130

11. 4. Concluzii referitoare la determinarea metanolului din sânge prin

GC-MS

132

12. Aplicarea metodei GC-MS la determinarea cantitativă a metanolului

din probe biologice provenite de la animale de experienţă

134


12.2. Material şi metodă

134

134

12.2.1. Aparatura şi condiţiile de lucru

12.2.2. Protocol de lucru

12.2.3. Animalele de laborator

134

134

125

12.2.3.1. Particularităţi anatomo-fiziologice

12.2.3.2. Comportamentul animalelor de experienţă

12.2.3.3. Organizarea laboratorului de cercetare

12.2.3.4. Factori habituali

12.2.3.5. Alimentaţia animalelor de laborator

12.2.3.6. Stabilirea dozelor şi calea de administrare a

metanolului la animalele de laborator

12.2.3.7. Recoltarea probelor de sânge

12.2.3.8. Rezultate şi discuţii

136

136

137

137

138

138

139

140

12.3. Simptomatologia observată la iepurii din rasa „Olandez cenuşiu” 142

12.4. Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge şi probe biologice la

iepuri din rasa „Olandez cenuşiu” (DL50). Observarea simptomatologiei

148

5

12.4.1. Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge 148

12.4.1.1. Stabilirea şi administrarea dozei de metanol DL100

la iepurii din rasa „Olandez cenuşiu”

12.4.1.2. Recoltarea probelor biologice


12.4.1.4. Simptomatologia intoxicaţiei metanolice acute cu

doză de metanol (DL100) la iepurii din rasa “Olandez

cenuşiu”

148

148

149

151

12.4.2. Determinarea concentraţiei de metanol prin GC-MS din

organe şi ţesuturi la iepuri din rasa „Olandez cenuşiu”

154

12.4.2.1. Protocolul de lucru


12.4.2.3. Concluzii

154

154

164

12.5. Determinarea concentraţiei de metanol în cazul intoxicaţiilor letale.

Prezentare de caz

167

12.5.1. Prezentarea cazului nr. 1.

12.5.2. Prezentarea cazului nr. 2

12.5.3. Concluzii

167

170

175

13. Incidenţa intoxicaţiilor letale cu alcool metilic din unele judeţe din

România (2005–2010)

177

13.1. Studiu statistic al intoxicaţiilor letale pentru toate judeţele

13.2. Studiu statistic al intoxicaţiilor letale pentru fiecare judeţ în parte

13.3. Concluzii

177

178

187

14. CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE

DE CERCETARE

188

15. BIBLIOGRAFIE

198

ANEXA 1

STADIUL CUNOAŞTERII

1. INTRODUCERE

1.2. OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT

În contextual actual generat de importanţa elucidării mecanismului de acţiune a

metanolului asupra organismului uman, cât si de importanţa testelor toxicologice în cazul

intoxicaţiilor metanolice, prezenta teză de doctorat îşi propune următoarele obiective:

Validarea unei metode GC-MS de determinare şi cuantificare a metanolului din

6

distilatele alcoolice.

Determinarea concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale prin metoda

GC-MS.

Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice

naturale.

Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentraţiei metanolice din probe

biologice, respective sânge şi ţesuturi.

Aplicarea metodei de determinare a metanolului din probe biologice într-un studiu

pe animale de laborator, respective pe iepuri, care cuprinde:

Evaluarea dinamicii intoxicaţiei metanolice analizând prin GC-MS probele de

sânge recoltat de la iepuri la interval prestabilite, în cazul administrării unei doze DL50 de

metanol.

Evaluarea stării de sănătate şi dinamica intoxicaţiei metanolice prin analiza GC-MS

a probelor de sânge în cazul administrării animalelor de metanol DL100.

Studierea variaţiei concentraţiei metanolice din ţesuturile animalelor de experienţă,

concentraţie determinată prin GC-MS.

Aplicarea metodei de determinare a concentraţiei de metanol din probe biologice

GC-MS, pe subiecţi umani (prezentări de caz).

Evaluarea statistică a numărului de cazuri de intoxicaţii letale din unele judeţe din

România.

7

CONTRIBUŢII PERSONALE

9. DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINARE A

METANOLULUI PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU

SPECTROMETRIE DE MASĂ

Obiective:



Progresele realizate în stabilirea compoziţiei unor amestecuri complexe au fost

posibile datorită perfecţionării în ultimele decenii a tehnicilor cromatografice şi în special a

cromatografiei de gaze.

Datorită variabilităţii mari a substanţelor care compun un distilat din produse naturale

apare evidentă necesitatea utilizării unor detectori universali care să ofere un semnal analitic

pentru oricare din compuşii separaţi. Sensibilitatea, precizia şi adaptabilitatea la coloanele

capilare, au făcut ca spectrometrul de masă sa devenea cel mai utilizat tip de detector în

analiza probelor necunoscute multicomponenţiale separate prin cromatografie de gaze iar

spectrele de masă obţinute sa constituie un punct de plecare foarte important în elucidarea

structurilor chimice deci şi a proprietăţilor fizico – chimice şi farmacologice.

9.2. DEZVOLTAREA METODEI

Toate determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip

Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies

5975C inert MSD ca sistem de detecţie. Faza mobilă utilizată este constituită din heliu, cu un

debit de 1 mL/minut.

Astfel, au fost efectuate determinări iniţial pe o coloană nepolară (DB 5 MS, cu

următoarele dimensiuni: 30 m lungime x 0,25 mm diametru intern şi 0,25 µm grosimea

filmului depus pe pereţii interni ai coloanei). În urma analizei unei probe etalon ce conţine

metanol şi etanol se observă faptul că timpii de retenţie corespunzători celor doi compuşi sunt

relativ apropiaţi 1,539 minute pentru metanol şi 1,615 minute pentru etanol.

Fig. 9.1. Separarea metanolului de etanol pe coloană HP 5 MS

8

Acest fapt nu este foarte important în situaţia în care cei doi alcooli se află în cantitate

mică în proba analizată, în schimb, dacă etanolul se află în concentraţie mare, există riscul ca

picul corespunzător etanolului să mascheze picul metanolului. Din acest motiv, în urma

consultării literaturii de specialitate (U.S. Pharmacopeia – Cromatographic Columns 2009-

2010)şi a datelor tehnice privind coloanele utilizate în cromatografia de gaze ne-am oprit în

cele din urmă la o coloană cromatografică Zebron – Phenomenex, de tip YB-WAXplus (cu

următoarele dimensiuni: 60 m lungime x 0,25 mm diametru intern şi 0,25 µm grosimea

filmului depus pe pereţii interni ai coloanei).

Fig. 9.2. Separarea metanolului de etanol pe coloană ZB-WAXplus

Analizând cromatograma obţinută se observă că timpul de retenţie pentru metanol este

de 6,650 iar pentru etanol este de 7,712. Dacă se ia în considerare şi lăţimea la bază a celor

două picuri (0,049 pentru metanol şi 0,117 pentru etanol) s-a calculat rezoluţia între aceste

două picuri, de 12,795, deci metoda este selectivă.

Am efectuat analize pentru mai multe rapoarte de splitare, anume 1/10, 1/50, 1/100 şi

1/1000. Analizând datele experimentale obţinute am considerat că raportul optim de splitare

este de 1/50.

În continuare, pentru picul cu valoarea timpului de retenţie 6,697 se înregistrează

spectrul de masă şi acesta se compară cu spectrele din biblioteca de spectre. Aşa cum se

observă din figura 9.7, pentru picul cu timpul de retenţie 6,697, după compararea spectrală se

obţine identitatea compusului corespunzător, în cazul de faţă metanolul.

9

Fig. 9.7. Compararea spectrului de masă al compusului din probă cu cele din baza de date

(biblioteca de spectre de masă Wiley)

Un alt aspect avut în vedere îl constituie verificarea purităţii picului. Acest lucru este

opţional în analiza cromatografică. Puritatea picului poate fi definită ca fiind un factor de

prag, sub care se pot pune întrebări cu privire la precizia rezultatelor.

În urma tuturor acestor experimente am stabilit condiţiile experimentale optime de

lucru:

cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A; injector automat tip Agilent

Technologies 7683 B Series; detector spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C

inert MSD; coloană cromatografică Zebron – Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60

m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm);

faza mobilă: heliu, cu un debit de 1 mL/minut;

volum injecţie de 0,1 µl; raport splitare 1 / 50; temperatura injectorului: 250C;

gradient temperatură în compartimentul coloanei: 50C, 20 minute, apoi temperatura

creşte cu 10C/min până la 250C unde este menţinută constantă încă 5 minute;

temperatura sursei MSD: 230C; temperatura cvadrupolului MSD: 150C;

modul de achiziţie a spectrelor: SCAN (urmărirea tuturor liniilor din spectrul de

masă);

domeniul de masă urmărit: 15 – 500 unităţi atomice de masă;

interpretarea rezultatelor obţinute: Agilent Technologies ChemStation software.

9.3. VALIDAREA METODEI

9.3.1. Liniaritatea

Reactivi utilizaţi în studiul liniarităţii:

etanol de puritate cromatografică (Merck);

metanol de puritate cromatografică (Merck);

apă bidistilată.

soluţiile standard: la un volum de 0,5 mL metanol se adaugă 5 mL etanol şi 4,5 mL

apă. Concentraţia în metanol s-a calculat ţinând cont de densitatea acestuia, conform relaţiei

în care:

d - densitatea metanolului (0,791 g/mL);

v – volumul de metanol luat în lucru (0,5 mL)

V – volumul final (10 ml)

metanol în 03955,010

5,0791,0/

V

vdmLg (5)

solvent – amestec de etanol şi apă în raport volumic de 1 / 1.

Din soluţia standard (39550 g/mL) s-au preparat soluţii de lucru prin diluare cu

solvent.

Pornind din aceeaşi soluţie stoc, s-au preparat un număr de 3 seturi de soluţii de lucru

pentru studiul linearităţii pe intervalul de concentraţie 4,94375 – 19775 g/mL. Fiecare din

aceste probe au fost analizate în condiţiile menţionate şi, din cromatogramele obţinute, s-a

determinat aria picurilor corespunzătoare metanolului.

În figura 9.9 se prezintă dreapta de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de

determinare a metanolului.

10

Fig. 9.9 Dreapta de calibrare la determinarea metanolului prin GC-MS

Tabelul 9.3 Calculul statistic al dreptei de regresie

Coeficient de corelaţie ( r) 0,9982

Coeficient de regresie ( r2 ) 0,9963

Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 1523112,271

Intercept 1569486,174

Pantă 4877,4

S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picului în

funcţie de concentraţia injectată). Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 –

19775 g/mL). Ecuaţia dreptei de regresie obţinute s-a calculat prin metoda celor mai mici

pătrate: Arie = 4877,4 x Concentraţia (g/mL) + 1569486,174

Analizând datele experimentale obţinute se observă că există două domenii de

liniaritate diferite, pe domeniul 4,9 – 2768,5 g/mL şi respectiv 2768,5 – 19775 g/Ml.

Arie pic = 6500,4 x Concentraţia - 11680

R2 = 0,9982

Arie pic = 4685,8 x Concentraţia + 3601973,7

R2 = 0,9980

0

20000000

40000000

60000000

80000000

100000000

120000000

140000000

0 5000 10000 15000 20000 25000

Concentraţie (ug/mL)

Ari

e p

ic

Fig. 9.10. Domenii de liniaritate la determinarea metanolului prin GC-MS

Tabelul 9.5. Calculul statistic al regresiei

Domeniu de concentraţie (g/mL) 4,9 – 2768,5 2768,5 – 19775

Coeficient de corelaţie ( r) 0,9991 0,9990

Coeficient de regresie ( r2 ) 0,9982 0,9980

11

Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 288313,9 1243540,6

Intercept -11679,5 3601973,7

Pantă 6500,4 4685,8

Concentraţia (g/mL) = 6500,4

11679,5 Arie

4685,8

3601973,7 Arie

Pe domeniul 4,9 – 2768,5 g/mL ecuaţia curbei de calibrare este:

Arie pic = 6500,4 x Concentraţia – 11679,5

Pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL ecuaţia curbei de calibrare este:

Arie pic = 4685,8 x Concentraţia + 3601973,7.

9.3.2. Limita de detecţie (LD) LD = 146,4 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 g/mL, respectiv LD = 875,8 g/mL

pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL.


LQ = 443,5 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 g/mL, respectiv LQ =

2653,9 g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL


Având în vederea aceasta faptul că distilatele prezintă valori ale concentraţiei în etanol

foarte diverse, am considerat oportun să alegem ca interval de lucru: 3559,5 – 9887,5 g/mL;

9.3.5. Precizia metodei

9.3.5.1. Repetabilitatea analizei. Precizia sistemului

Tabelul 9. 8. Repetabilitatea injecţiei (Precizia sistemului)

Nr. Determinării Arie pic

1 29181942

2 29366891

3 29827788

4 29884137

5 29351896

Media 29522531

SD 313560,9

RSD 1,0621 %

Având în vedere valoarea deviaţiei standard relative obţinute (RSD = 1,0621%), se

poate afirma că la determinarea prin cromatografie de gaze a metanolului, sistemul este

precis.

Repetabilitatea analizei (precizia metodei)

Tabelul 9.9. Precizia metodei de determinare a metanolului prin GC-MS

Nr.det. Concentraţie teoretică Arie pic Concentraţie calculată %

12

(g / mL) (g / mL)

1

3559,5

19987590 3496,9 98,2

2 19941825 3487,1 98,0

3 20100442 3521,0 98,9

4

5932,5

29254146 5474,4 92,3

5 29754916 5581,3 94,1

6 29672735 5563,8 93,8

7

9887,5

49055098 9700,2 98,0

8 49372967 9768,0 98,7

9 49365475 9766,4 98,7

Date statistice

Media 96,7

SD 2,5735

RSD 2,6601

Deviaţia standard relativă are o valoare mai mică de 5%, respectiv, (RSD) este de

2,6601 % pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL;


Tabelul 9.10. Precizia intermediară de determinare a metanolului prin GC-MS

Nr.det. Concentraţie teoretică

(g / mL) Arie pic

Concentraţie calculată

(g / mL) %

1

3559,5

19970889 3493,3 98,1

2 20112781 3523,6 99,0

3 20071228 3514,7 98,7

4

5932,5

29390148 5503,5 92,8

5 29763692 5583,2 94,1

6 29757259 5581,8 94,1

7

9887,5

48931933 9673,9 97,7

8 48513789 9584,7 96,8

9 48538743 9590,0 96,9

Date statistice

Media 96,5

SD 2,2511

RSD 2,3336

Deviaţia standard relativă obţinută are o valoare mai mică de 5%, (RSD) este de

2,3336 % pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL.

9.3.5.3. Reproductibilitatea

Normele elaborate de ICH (International Conference of Harmonization) definesc

reproductibilitatea ca o precizie interlaboratoare în studii de colaborare. Deoarece nu am avut

posibilitatea de a aplica metoda şi în alte laboratoare, reproductibilitatea nu a fost studiată.

9.3.6. Acurateţea (Exactitatea)

Tabelul 9.11. Exactitatea metodei de determinare a metanolului prin GC-MS

Nr.det. Concentraţie teoretică

(g / mL) Arie pic

Concentraţie calculată

(g / mL) Regăsire %

1 3559,5

19922628 3483,0 97,9

2 19934729 3485,6 97,9

13

3 19925152 3483,5 97,9

4

5932,5

29292047 5482,5 92,4

5 29298045 5483,8 92,4

6 29489809 5524,7 93,1

7

9887,5

48660751 9616,0 97,2

8 48587881 9600,5 97,0

9 48858334 9658,2 97,6

Date statistice

Regăsire medie 95,9

Minim 92,4

Maxim 97,9

Regăsirea medie în studiul exactităţii metodei de determinare a metanolului prin

cromatografie gaze cuplată cu spectrometrie de masă are valoarea de 95,9% pe intervalul 92,4

– 97,9%. Având în vedere faptul că, pentrui metodele cromatografice se acceptă un interval de

± 10%, rezultă că metoda este exactă.

9.4. CONCLUZII REFERITOARE LA DETERMINAREA METANOLULUI PRIN GC-MS

Cromatograf de gaze tip Agilent Tehnologes 7890 A, detector spectrometru de masă

tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană Zebron – Phenomenex, tip ZB-WAXplus

(lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm), fază

mobilă heliu cu un debit de 1 mL/min.

gradient de temperatură în compartimentul coloanei: 50C timp de 20 minute, apoi

temperatura creşte cu 10C/min până la 250C unde este menţinută constantă încă 5

minute;

volumul de soluţie injectată este de 0,1 L şi un raport de splitare de 1 / 50 în portul

de intrare al injectorului ce are temperatura de 250C; temperatura sursei MSD de 230C şi

cea a cvadrupolului MSD de 150C;

identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală faţă de biblioteca

de spectre Wiley.

S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picului în

funcţie de concentraţia injectată). Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 –

19775 g/mL).





Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 146,4 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5

g/mL, respectiv LD = 875,8 g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL) şi limita de

cuantificare (LQ = 443,5 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 g/mL, respectiv LQ = 2653,9

g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL) .

A fost stabilit intervalul de lucru: 3559,5 – 9887,5 g/mL;

Pentru estimarea preciziei s-au determinat:

repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) - RSD - 1,0621 %;

repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD - 2,6601 %

precizia intermediară – RSD - 2,3336 %

Exactitate - regăsire medie de 95,9% pe intervalul 92,4 – 97,9% pe domeniul

2768,5 – 19775 g/mL.

14

10. APLICABILITATEA METODEI DE DETERMINARE A METANOLULUI PRIN

CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ

Obiective:

Determinarea concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale prin

metoda GC-MS.

Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice

naturale.

10.2. PROTOCOL DE LUCRU

S-au analizeazat un numar de 98 de probe de distilate alcoolice naturale, care

constitue produse rezultate in urma distilarii amestecurilor de macerate de fructe (mere, pere,

prune, struguri ), macerate simple de prune sau struguri (tescovină). Aceste produse de

distilare denumite ţuică sau rachiu se regăsesc în toată ţara. Reţetele după care se prepară nu

au o specificitate aparte, acestea ţinând de “reteta personală” a celor care prepara aceste

produse, având astfel un caracter artizanal.

Probele au fost analizate conform metodei de determinare a metanolului din distilatele

alcoolice prin GC-MS utilizand acelaşi aparat şi aceiaşi parametri de lucru.

10.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII

10.3.1. Determinarea metanolului din distilatele alcoolice naturale

Probele au fost prelevate din zona Moldovei în perioada 2007 – 2009. Majoritatea

probelor provin din judeţul Bacău respectiv 82 de probe celelelte 16 probe provin din alte

şapte judeţe.

Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS s-au pus în evidenţă două

probe ca fiind sub limita de determinare şi una sub limita de cuantificare.

Cele 95 de probe prezintă concentraţii ale metanolului (g/mL distilat ) cuprinse între

499,5 - 8316,0 g/mL distilat. Vaoarea medie cea mai mare regăseşte în distilatele din prune,

respectiv 3320,46 g/mL distilat . Media cea mai scăzută a concentraţiei metanolului în

g/mL distilat se observă în probele de distilat alcoolic prelucrate din tescovină.

Fig. 10. 3. Variaţia valorii medii a concentraţiei metanolului (g/mL distilat)

funcţie de natura distilatelor

15

Regulamentul CEE 1014/90 şi STP 57 – 92 prevede că valoarea concentraţiei de

metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru.

Pentru raportarea concentraţiei metanolului faţă de 100 mL etanol anhidru s-a determinat

conţinutul în etanol pentru fiecare probă de distilat în parte, cu o metoda, conform legislatiei

in vigoare.

10.3.3. Determinarea concentraţiei metanolului faţă de concentraţia de etanol

Raportând concentraţia de metanol g/mL distilat la concentrţia de etanol din probele

analizate, s-au obţinut valori între 0,12 – 2,3 g/ 100 mL etanol anhidru, dintre care:

19 probe au valori ale concentrţiei metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100

mL alcool etilic anhidru), din care:

6 probe cu valori ale concentraţiei in metanol peste limită, distilate din

tescovina, reprezentand 6,12% din totalul probelor analizate.

7 probe cu valori ale concentraţiei alcoolului metilic peste limita admisă,

provenite din amestec de fructe, îsemnând 7, 14% din totalul probelor de

distilat analizate.

6 probe cu valori ale concentraţiei metanolului peste limitele admise

reprezintă 6,12% din totalul probelor de distilate.

Din calculul concentraţiei medii a metanolului din probele de distilat analizate în

funcţie de materialul din care au fost prelucrate se observă :

0.41

0.58

0.92

0.48

0.62

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Amestec f ructe Altele Prune Tescovina Toate

Concentraţiamedie a metanolului la 100 mL etanol anhidru

Fig. 10.6. Variaţia valorii medii a concentraţiei metanolului ( g/100 mL etanol anhidru)

funcţie de natura distilatelor

1.35

1.85 1.92

1.44 1.48

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Comanesti (BC) Blăgeşti (BC) Straoani (BC) Panciu (VN) Altele

Concentraţia medie a metanoluluila 100 mL etanol anhidru

Fig. 10.9. Concentraţia medie pentru localităţile de provenienţă a distilatelor analizate care

au valori ale metanolului (la 100 mL etanol anhidru)

peste limitele admise de STAS-urile în vigoare

16

În funcţie de provenienţa probelor cu valori ale concentraţiei metanolice peste limita

admisă se constată că distilatele din Localitatea Străoani Jud. Bacău (figura 10.9.) prezintă cea

mai mare medie a concentraţiei de metanol la 100 mL etanol anhidru, respective 1,92 g/100

mL etanol anhidru. Valoarea aceasta este urmată de valoarea concentraţiei medii a metanolului

din distilatele provenite din Localitatea Blăgeşti Jud. Bacău cu 1,85 g/100 mL etanol anhidru.

10.3.4 Determinarea prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă a

altor toxici volatili prezenţi în distilatele alcoolice

În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele probelor de

distilate naturale s-au identificat o serie de compuşi volatili denumiţi congeneri (Jung A.,

2010). Aceştia au fost identificaţi prin metoda SCAN comparându-se timpii de retenţie cu

datele din bibliotecile spectrale. Concentraţia acestora se calculează raportând aria picului ce

corespunde fiecărui compus detectat şi identificat, faţă de aria totală a picurilor detectate.

Concentraţia în mL/total congeneri a compuşilor volatili detectaţi si identificaţi s-a calculat

raportându-se procentul de arie al fiecăruia la concentraţia în volume a etanolului,

concentraţie ce a fost obţinută anterior .

În urma centralizării acestor date, s-a constatat că o parte din compuşii identificati se

regăsesc mult mai des în probele de distilate faţa de alţii. Astfel s-a efectuat un calcul statistic

privind frecvenţa detectării acestor compuşi, calcul care este prezentat în tabelul 10.13. Acest

tabel prezintă compuşii care au fost detectaţi în mai mult de 50 de determinări, valoarea

maximă, medie şi minimă a ariei procentuale din total compuşi volatili, a volumului (mL / mL

distilat) cât şi numărul de probe în care s-au detectat.

Tabelul 10.13. Compuşi detectaţi care au mai mult de 50 determinări

Compus detectat Area %

mL/100

mL

distilat

Nr.

1,4,7,10,13,16-Hexaoxacyclooctadec

Maxima 0,67 0,31

57,00 Media 0,20 0,08

Minima 0,03 0,01

12-Crown-4 / 12-Crown-5

Maxima 0,64 0,31

55,00 Media 0,21 0,09

Minima 0,21 0,09

Acetat de etil

Maxima 2,56 1,07

71,00 Media 1,04 0,45

Minima 0,23 0,09

Acetic acid

Maxima 2,49 0,88

73,00 Media 0,84 0,34

Minima 0,05 0,02

Alcool izoamilic

Maxima 1,56 0,87

96,00 Media 0,78 0,34

Minima 0,03 0,01

Ethanol

Maxima 99,01 69,80

98,00 Media 95,88 41,61

Minima 92,48 10,90

Ethanol, 2-(1-methylethoxy)-

Maxima 0,47 0,23

61,00 Media 0,17 0,07

Minima 0,47 0,23

Methanol Maxima 1,60 0,77

98,00 Media 0,73 0,30

17

Minima 0,16 0,05

96%

1% 3%EtanolMetanolCongeneri

Fig. 10.13. Ponderea etanolului şi metanolului faţă de congeneri (% valori medii)

Din totalul compuşilor volatili detectaţi 96% reprezintă etanol, 3% alţi compuşi

volatili şi 1 % alcool metilic. Faţă de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul

reprezintă 1,04%

10.3. CONCLUZII

În vederea determinării concentraţiei de alcool metilic şi a prezenţei compuşilor

volatili în distilatele alcoolice naturale, s-au analizat un număr de 98 de probe de distilate

alcoolice naturale care provin din zona Moldovei. Determinarea concentraţiei metanolului şi

a compuşilor volatili din distilatele alcoolice naturale s-a efectuat prin GC - MS, conform

metodei. Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS s-au pus în evidenţă două

probe ca fiind sub limita de determinare şi una sub limita de cuantificare.

Cele 95 de probe prezintă concentraţii ale metanolului (g/mL distilat) cuprinse între

499,5 g/mL distilat şi 8316,0 g/mL distilat.

Regulamentul CEE 1014/90 şi STP 57 – 92 prevede că valoarea concentraţiei de

metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru. Pentru

raportarea concentraţiei metanolului faţă de 100 mL etanol anhidru s-a determinat conţinutul

în etanol.


analizate, s-au obţinut valori între 0,12 – 2,3 g/ 100 mL etanol anhidru, dintre care:

- 19 probe au valori ale concentraţiei metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100

mL alcool etilic anhidru), din care în funcţie de materialul din care s-au distilat sunt:

Tescovină - 6 probe

amestec de fructe - 7 probe

prune - 6 probe

Din calculul concentraţiei medii a metanolului din probele de distilat analizate care au

concentraţia metanolică peste limita admisă în funcţie de materialul din care au fost prelucrate

se observă :

valoarea medie cea mai mare a concentraţiei metanolice se regăseşte în

probele de distilate provenite din macerarea şi distilarea prunelor, respectiv

1,67 g/100 mL etanol anhidru;

valoarea medie cea mai scăzută o întâlnim la probele provenite din distilarea

amestecurilor de fructe de 1.38 g/100 mL etanol anhidru.

valoarea medie generală pe cele 19 probe de distilat cu concentraţii metanolice

peste limita admisă este de 1,51 g/100 mL etanol anhidru.

În funcţie de provenienţa probelor cu valori ale concentraţiei metanolice peste

18

limita admisă se constată că cele mai multe provin din Comăneşti Jud. Bacău respectiv 7

probe, reprezentând 36% din totalul probelor, cele mai putine probe provenind din Panciu Jud.

Vrancea şi Străoani Jud. Bacău cu câte 2 probe şi un procent de 11%.

În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele

probelor de distilate naturale s-au identificat o serie de compuşi volatili denumiţi congeneri.

Din totalul compuşilor volatili detectaţi 96% reprezintă etanol, 3% alţi compuşi

volatili şi 1 % alcool metilic. Faţă de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul

reprezintă 1,04% .

11. DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINAREA

CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN

CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ

Obiective:



Intoxicaţiile metanolice de diferite etiologii, dar cu precădere cu etiologie alcoolică,

constituie cauza multor urgenţe medicale, dar şi a multor decese (Şorodoc L., 2009).

Important în acest sens este ca diagnosticul cu privire la natura toxicului la care a fost expus

pacientul să fie pus cât mai prompt pentru administrarea unei scheme de tratament adecvate.

În acest sens s-a încercat elaborarea şi validarea unei metode de determinare a metanolului din

produsele biologice într-un timp scurt şi eficient. Prin această metodă s-a avut în vedere

analizarea din punct de vedere calitativ şi cantitativ a metanolului din sânge, dar şi din organe,

în cazul examenului toxicologic pe cadavru.

11.2. DEZVOLTAREA METODEI

Pentru a realiza separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a metanolului din

probe biologice prin cromatografie de gaze, cuplată cu spectrometrie de masă, au fost

efectuate iniţial o serie de teste, obligatorii de altfel, pentru a stabili condiţiile experimentale

optime de analiză (Dorneanu V., 2003, Lazăr D., 2000).

Toate determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip

Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies

5975C inert MSD ca sistem de detecţie. Faza mobilă utilizată este constituită din heliu, cu un

debit de 1 mL/minut.

În ceea ce priveşte alegerea coloanei staţionare folosite s-a avut în vedere

determinarea metanolului din distilate alcoolice astfel, ca fază staţionară a fost utilizată o

coloană polară Zebron – Phenomenex, de tip YB-WAXplus (60 m x 0,25 mm; 0,25 µm).

Portul de intrare al injectorului se află la o temperatură de 250C. Cantitatea de probă

injectată este de 1 L cu un raport de splitare de 1/50.

Faza mobilă - heliu (debit 1 mL/min).

Programul de temperatură porneşte de la 50C (temperatură menţinută constantă timp

de 16 minute) şi creşte la 250C cu o viteză de 25C.

În ceea ce priveşte sistemul de detecţie, parametrii de lucru sunt următorii:

temperatura sursei MS: 230C;

temperatura quadrupolului: 150C;

mod de achiziţie (SIM – Single Ion Monitoring) - mod de lucru: SIM, ionii

înregistraţi fiind cei cu raportul M/Z = 15, 29, 31 şi 32;

detecţie oprită între minutul 12 şi 15 (interval de timp necesar pentru eliminarea apei

din probă).

19

Fig. 11. 2. Cromatograma unei soluţii ce conţine metanol (provenienţă – intestin)

Fig. 11.3. Spectrul de masă al picului cu timpul de retenţie 6,755

Fig. 11.4. Compararea spectrului de masă al compusului din probă

20

În ceea ce priveşte modul de preparare a probelor pentru izolarea alcoolului metilic,

acestea au fost prelucrate prin distilare conform metodei Cordebard

11.3. VALIDAREA METODEI

11.3.1. Liniaritatea

Pentru evaluarea liniarităţii s-a avut în vedere un necesar de minim 5 valori ale

concentraţiei pentru cel puţin trei serii de soluţii de substanţe standard de diferite concentraţii

(de regulă concentraţia de interes ± 20 până la 50% pentru valorile extreme de concentraţie (

Yowomo M., 2005, Roman L., 1998).

Reactivi necesari:

metanol de puritate cromatografică (Merck);

apă bidistilată;

soluţiile standard.

În ceea ce priveşte pregătirea standardelor de lucru s-a procedat astfel:

Pentru calculul concentraţiei în metanol se are în vedere densitatea metanolului (d) în

mg/mL (0,791), volumul de metanol şi volumul final al probei.

Astfel, pentru prepararea standardelor de lucru s-a lucrat în modul următor: un volum

(v) de 0,5 mL metanol a fost amestecat cu un volum de 9,5 mL sânge obţinându-se un volum

total (V) de 10 mL soluţie stoc (ST 1) a cărei concentraţie se calculează folosind formula

următoare:

0,791 0,50,03955 g/mL=39550 g/mL

10

d v

V

Din soluţia astfel obţinută au fost preparate prin diluare cu sânge soluţii de diferite

concentraţii. Aceste soluţii au fost supuse distilării conform modului descris.

Pornind din aceeaşi soluţie stoc, s-au preparat un număr de 3 seturi de soluţii de lucru

pentru studiul linearităţii pe intervalul de concentraţie 4,94 – 19775,00 g/mL. Fiecare din

aceste probe au fost analizate în condiţiile menţionate şi, din cromatogramele obţinute, s-a

determinat aria picurilor corespunzătoare metanolului.

Se reprezintă grafic variaţia ariei medii în funcţie de concentraţie şi se determină

intervalul de concentraţie pentru care această variaţie este liniară. Se trasează dreapta de

regresie pentru acest interval şi se determină coeficientul de corelaţie (r), deviaţia standard a

pantei dreptei de regresie (s) şi ecuaţia dreptei ce redă modificarea ariei picului în funcţie de

concentraţie:

Arie pic = a x Concentraţia + b

a = panta, b = intercept

În figura 11.5. se prezintă dreapta de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de

determinare a metanolului.

21

Arie pic = 7041,6 x Concentraţia + 6137,3

R2 = 0,9994

0

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

0 2000 4000 6000 8000

Ari

e p

ic

Concentraţie (ug / mL)

Fig. 11.5. Dreapta de calibrare la determinarea metanolului prin GC-MS-SIM

Tabelul 11.3. Calculul statistic al dreptei de regresie

Coeficient de corelaţie ( r) 0,9997

Coeficient de regresie ( r2 ) 0,9994

Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 297196,35

Intercept 6137,3

Pantă 7041,6

Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 – 19775 g/mL sânge sau

1,65 – 6591,67 g / mL distilat).


Utilizând datele obţinute la studiul liniarităţii se obţine:

LD = 139,3 μg/mL


Estimarea LQ s-a realizat pe baza erorii standard a dreptei de regresie şi a pantei

dreptei de regresie.

LQ = 422,1 μg/mL


A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3 – 6591,67 g/mL distilat respectiv 417,9 –

19775,01 g/mL sânge.

11.3.5. Precizia


repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determinări,

valoarea deviaţiei standard relative (RSD) fiind de 0,8748 %;

repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluţii independente la trei

nivele de concentraţie diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de

4,6811 % pe domeniul 263,67 – 527,33 g/mL distilat;

precizia intermediară pentru trei soluţii independente la trei nivele de concentraţie

diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de de 4,1078 % pe

22

domeniul 263,67 – 527,33 g/mL distilat;

11.3.6. Acurateţea (Exactitatea)

Pentru estimarea exactităţii s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe

la trei nivele de concentraţie diferite obţinându-se o regăsire medie de 98,0% pe intervalul

93,2 – 102,8%.

11.4 CONCLUZII REFERITOARE LA DETERMINAREA CANTITATIVĂ A

METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN GC-MS.

» cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A; detector spectrometru de

masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană cromatografică Zebron –

Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a

filmului de 0,25 µm); injector automat tip Agilent Technologies 7683 B Series;

» faza mobilă: heliu, cu un debit de 1 mL/minut;

» volum injecţie de 1 µl; raport de splitare 1 / 50;

» temperatura injectorului: 250C;

» gradient temperatură în compartimentul coloanei: 50C (temperatură menţinută

constantă timp de 16 minute) şi creşte la 250C cu o viteză de 25C.

» temperatura sursei MSD: 230C; temperatura cvadrupolului MSD: 150C;

» modul de achiziţie a spectrelor: SIM (urmărirea liniilor din spectrul de masă cu

raportul M/Z = 15, 29, 31 şi 32);

» interpretarea rezultatelor obţinute: Agilent Technologies ChemStation software.

S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns. Funcţia de răspuns este liniară pe

domeniul studiat (4,9 – 19775 g/mL sânge sau 1,65–6591,67 g/mL distilat). Ecuaţia dreptei

de regresie obţinută (în cazul exprimării concentraţiei pe mL distilat) s-a calculat prin metoda

celor mai mici pătrate.

Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 139,3 g/mL) şi limita de cuantificare

(LQ = 422,1 g/mL).

A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3–6591,67 g/mL distilat respectiv 417,9 –

19775,01 g/mL sânge;


repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) – RSD - 0,8748 %;

repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD - 4,6811 %

precizia intermediară – RSD - 4,1078 %

Pentru estimarea exactităţii - regăsire medie 98,0 % pe intervalul 93,2 – 102,8 %.

12. APLICABILITATEA METODEI GC-MS LA DETERMINAREA CANTITATIVĂ A

METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PROVENITE DE LA ANIMALE DE

EXPERIENŢĂ

Obiective :

1. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge în cazul injectării de

metanol cu doza de DL50 la iepuri din rasa “Olandez cenuşiu” şi observarea

simptomatologiei intoxicaţiei.

2. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge şi organe în cazul

injectării de metanol cu doza de DL100 la iepuri din rasa „Olandez cenuşiu” şi observarea


Pentru studierea absorbţiei, acumulării toxicului, s-a optat pentru testarea toxicităţii

metanolului pe organismul animal, în conformitate cu legislaţia în vigoare. Acest studiu s-a

23

efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Animală din cadrul Universităţii “V. Alecsandri”

Bacău, Facultatea de Biologie, pe un lot de iepuri. Rasa utilizată în vederea cercetării a fost

„Iepurele cenuşiu olandez”. Studiile pe animale sunt supuse legislaţiei în vigoare respectiv

OG. 37/2002 cu privire la protecţia animalelor folosite în scopuri ştiinţifice sau în scopuri

experimentale aprobată cu L 471 /2002.

12.2. MATERIAL ŞI METODĂ

Metoda a fost testată pe mai multe tipuri de probe biologice (sânge, ţesut), efectuate pe

acelaşi aparat şi aceiaşi parametri utilizaţi la validarea metodei.

Pentru ca probele de sânge şi ţesuturi să poată fi analizate prin GC-MS, au fost

prelucrate prin distilare (metoda Cordebard).

DETERMINAREA VARIAŢIEI CONCENTRAŢIILOR DE METANOL ÎN SÂNGE ÎN

CAZUL INJECTĂRII DE METANOL CU DOZA DE DL50 LA IEPURI DIN RASA

„OLANDEZ CENUŞIU” ŞI OBSERVAREA SIMPTOMATOLOGIEI INTOXICAŢIEI

12.2.3.6. Stabilirea dozelor şi modul de administrare a metanolului la animalele de

experienţă

Lotul experimental a fost compus din cinci femele de iepuri aparţinând rasei

„Olandez cenuşiu”. Acestea prezintă o masă corporal cuprinsă între 2000 şi 2400 g. Din punct

de vedere anatomo–fiziologic, sunt mature având vârsta de şase luni. Dozele de alcool

metilic care s-au administrat în vederea inducerii intoxicaţiei metanolice au fost stabilite faţă

de literatura de specialitate (Roe O., 1982, Silverman J., 2002, Ciudin E., 2004).

Administrarea dozei s-a efectuat intraperitoneal. S-a optat pentru acest gen de

administrare deoarece doza de administrat este mai mică, iar posibilitatea de administrare

orală a toxicului era destul de scăzută ţinând cont de comportamentul sensibil al iepurelui.

Administrarea intravenoasă a metanolului ar fi indus necroza endovenoasă, ceea ce ar fi

periclitat atât sănătatea animalului pe durata experimentului cât si deprecierea locurilor de

elecţie în vederea recoltării sângelui pentru analiză. Pentru fiecare exemplar s-a calculat doza

de administrare în funcţie de masa corporală.

Tabelul 12. 4. Doza de metanol DL50 calculată pentru lotul experimental de iepuri,

conform masei corporale

Nr. Masă corporală g Doză administrată DL50

1. 2000 4,8 mL

2. 2400 5,5 mL

3. 2300 5,3 mL

4. 2200 5,1 mL

5. 2000 4,8 mL

12.2.3.7. Recoltarea probelor în urma administrării metanolului în doză DL50 la

iepurii din rasa „Olandez cenuşiu”

Probele de sânge s-au recoltat din vena femurală, la următoarele intervale:

I – 75 minute,

II – 195 minute,

III – 375 minute.


24

Din rezultatele obţinute în urma analizei sângelui recoltat la intervale prestabilite, se constată ca

cea mai scăzută concentraţie la prima serie de recoltări, respectiv la 75 de minute s-a înregistrat la

iepurele numărul 1, cu o valoare de 0,69 mg/mL şi cea mai crescută la iepurele numărul 3 cu 0,95 mg /

mL. La a doua serie de recoltări, la 195 de minute, valoarea cea mai mică s-a înregistrat la iepurele nr. 5

( 0,75 mg /mL), valoarea cea mai mare înregistrându-se la iepurele nr. 3 cu 1,02 mg/mL. Seria a treia de

recoltări se evidenţiază cu 0,68 mg/mL reprezentând valoarea cea mai mică şi 0,89 mg/mL, reprezentând

valoarea cea mai crescută.

Fig. 12.1. Reprezentarea grafică a valorilor concentraţiei metanolice

din probele de sânge recoltate în prima etapă

Conform acestor valori este evident că în minutul 75 metanolul nu era complet în

circuitul metabolic, vârful concentraţiei regăsindu-se în minutul 195, ţinând cont că în

minutul 375 concentraţiile erau deja în descreştere. În prima parte a metabolismului creşte

concentraţia cu 0,012 mg/mL pe minut, de la minutul 75 până la minutul 195 e înregistrează o

creştere extreme de lentă de 0,0002 mg/mL pe minut ca panta descendentă sa se exprime cu o

descreştere de 0,0004 mg/mL. Se poate spune că dacă absorbţia este foarte rapidă

metabolismul este extrem de lent.

12.3. SIMPTOMATOLOGIA ÎNTOXICAŢIEI METANOLICE ÎN URMA ADMINISTRĂRII

DE METHANOL ÎN DOZĂ DL50 LA IEPURII DIN RASA “ OLANDEZ CENUŞIU”

Pe parcursul derulării experimentului s-au urmărit o serie de parametri fiziologici şi s-

au făcut observaţii referitoare la simptomatologia intoxicaţiei metanolice

La primul interval de recoltare la 75 de minute sensibilitatea la metanol a fost minimă.

Simptomatologia intoxicaţiei metanolice s-a concretizat la toţi subiecţii practic la cel de-al

doilea interval de recoltare, respectiv la 195 de minute de la injectare. La a treia recoltare la

intervalul de 375 de minute toţi subiecţii prezentau aceiaşi simptomatologie, respective

somnolenţă, dezechilibru motor, dificultăţi de deplasare, manifestată cu precădere la

membrele inferioare posterioare prin imposibilitatea de coordonare şi mişcare, stare general

de relaxare.

25

212.4

272.4

240.6231

0

50

100

150

200

250

300

0 75 195 375

Pu

lsu

ri/m

inu

t

Minute

Fig. 12. 4. Variaţia în timp a pulsului mediu

ca simptomatologie observată după administrarea DL50

Evoluţia valorilor pulsului este diferită de la individ la individ, în medie valoarea cea

mai crescută raportându-se la minutul 75 de la administrarea metanolului, având o evoluţie

descendentă în raport cu evoluţia concentraţiei metanolice regăsită în probele de sânge

recoltate pe intervalele prestabilite. Această evoluţie atât a concentraţiei metanolice

determinată din sânge cât şi a simptomatologiei denotă faptul că toxicitatea metanolului are

un caracter individualizat în funcţie de fiecare subiect.

12.4. DOZAREA METANOLULUI PRIN GC-MS DIN SÂNGE ŞI PROBE BIOLOGICE LA

RASA DE IEPURI“OLANDEZ CENUŞIU” (DL100).

Observarea simptomatologiei intoxicaţiei.

12.4.1. Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge a

A doua etapă a experimentului s-a desfăşurat la un interval de 72 de ore de la

încheierea primei etape pe aceiaşi subiecţi. S-a optat pentru un astfel de interval între cele

două serii de experimente pentru ca organismul subiecţilor să elimine complet metanolul şi

produşii de metabolism ai acestuia şi starea de sănătate să revină la normal pentru a nu

denature simptomatologia intoxicaţiei metanolice. În acest interval iepurii au fost hrăniţi şi

hidrataţi corespunzător normelor de hrană şi îngrijire, urmârindu-se îndeaproape

comportamentul pentru a depista eventualele deficienţe sau afecţiuni. După 72 de ore iepurii

prezentau o stare de sănătate bună şi un comportament normal.

12.4.1.1. Stabilirea şi administrarea dozei de metanol DL 100 la iepurii din rasa “

Olandez cenuşiu”

A doua doză administrată a constituit o doză letală DL100, doză calculată în funcţie

de masa corporală a fiecărui subiect.

Tabelul 12.9. Cantitatea de metanol DL100 administrat la iepurii

din rasa „Olandez cenuşiu” în funcţie de masa corporală

Nr. Masă corporală g Doză administrată DL100

1. 2000 9,6 mL

2. 2400 11,0 mL

3. 2300 10,6 mL

4. 2200 10,2 mL

26

5. 2000 9,6 mL

12.4.1.2. Recoltarea probelor biologice

Recoltarea probelor de sânge în vederea determinării metanolului s-a efectuat în două

serii, a câte 5 mL, prima serie la 75 de minute, a doua serie în momentul decesului subiectului

testat.

seria 1 – la 75 minute de la expunere,

seria 2 – în momentul decesului subiectului testat.

12. 4.1.3. Rezultate şi discuţii

Rezultatele privind concentraţia de methanol din sângele recoltat în cea de-a doua

etapă a experimentului sunt exprimate în tabelul 12.11., intervalul de timp la care s-a făcut

recoltarea respective, prima probă la 75 de minute şi a a doua probă la momentul decesului,

cât şi valorile concentraţiei metanolice obţinute prin analiza GC-MS.

Tabelul 12.11. Valorile concentraţiei metanolului determinat în sânge la iepuri

în cazul intoxicaţiei acute cu DL100 (4,8 mL/kg corp)

Greutate

corporală

(g)

Subiecţii

Doza

DL100

metanol

(mL)

75

minute

Metanol determinat în sânge

(mg/mL) în momentul decesului

105 160 180 200

2000 1 9,6 1,08 1,55

2400 2 11 1,76 1,82

2300 3 10,6 1,77 1,76

2200 4 10,2 1,39 1,31

2000 5 9,6 1,29 1,23

Din datele etalate în tabelul 12.11. se observa că la 75 de minute de la administrarea

dozei de metanol DL100, valorile concentraţiei metanolului în sânge sunt variabile, cea mai

mică valoare fiind înregistrată la subiectul nr. 1, cu 1,08 mg/mL faţă de cea mai mare valoare

înregistrată la subiectul 3 cu o valoare de 1,77 mg/mL.

Fig. 12.5. Variaţia concentraţiei de metanol din probele de sânge înainte şi după exitus

27

În cazul valorilor concentraţiilor metanolice determinate din sânge în momentul

decesului subiecţilor, se constată de asemeni o mare fluctuaţie de valori, care ţin de factorii

individuali şi de intervalul de timp la care s-a produs decesul. Faţă de perioada de

supravieţuire de la administrarea metanolului până la deces, cel mai mult a supravieţuit

subiectul nr. 2 cu 200 de minute, cel mai puţin supravieţuind subiectul nr. 3 cu 105 minute.

Variaţia cea mai mare dintre valoarea concentraţiei metanolice în viu şi valoarea

concentraţiei metanolice la deces a fost înregistrată la subiectul nr. 1 care la 75 de minute de

la injectarea cu metanol avea o concentraţie metanolică de 1,08 mg/mL şi în momentul

decesului de 1,55 mg / mL, diferenţa dintre cele două valori acumulându-se în 85 de minute.

Calculându-se o rată de acumulare pentru cei cinci iepuri, din momentul injectării până la

minutul 75, metanolul a avut o rată de acumulare cuprinsă între 0,014 - 0,023 mg/mL/minut.

12.4.1.4. Simptomatologia întoxicaţiei metanolice acute cu doză de methanol

DL100 la iepurii din rasa “ Olandez cenuşiu”

Concomitent cu recoltarea probelor de sânge s-au făcut observaţii privind

simptomatologia intoxicaţiei acute provocate de metanolul injectat intraperitoneal la iepurii

de experienţă pentru DL100 (4,8 mL/Kg corp). După 75 de minute de la injectarea a

metanolului DL100 se observă apariţia somnolenţei, dezechilibrului motor, a stării de relaxare,

a urechilor lăsate, ochi exoftalmici, puls filiform, la toţi subiecţii testaţi. Dacă la doza de

metanol DL50 simptomatologia intoxicaţiei la 75 de minute de la administrarea metanolului

era prezentă cu simptome uşoare la 60 % dintre subiecţi, la o administrare a unei doze de

DL100, simptomatologia intoxicaţiei este prezentă la 100% din subiecţi. În funcţie de

rezistenţa fiecărui organism şi mai ales în funcţie de particularităţile metabolice ale fiecărui

subiect, aceştia au supravieţuit mai mult sau mai puţin. Insuficienţa cardio respiratorie, au

determinat decesul subiecţilor după 105-200 minute de la administrarea DL100.

12.4.2. Determinarea concentraţiilor de metanol prin GC-MS din organe şi ţesuturi la

iepuri din rasa „Olandez cenuşiu”

12.4.2.1. Protocol de lucru

După exitus toţi subiecţii testaţi prin administrare intraperitoneală a unei doze DL100

cu metanol, au fost autopsiaţi. Conform protocolului de prelevare de probe biologice s-au

prelevat de la fiecare subiect fragmente de organe în vederea examenului toxicologic. Astfel s-

au recoltat fragmente de creier, ochi, fragmente de cord, plămân, ficat şi rinichi. Probele s-au

condiţionat separate pentru fiecare tip de ţesut, în flacoane sterile, prevăzute cu capac etanş şi

etichetate . Fiecare etichetă a fost inscripţionată cu : numărul iepurelui, conţinut, data şi ora

prelevării. Pentru examenul toxicologic al ţesuturilor în vederea determinării concentraţiei de

metanol s-au prelevat câte 5 g ţesut din fiecare organ. Pentru acurateţea rezultatelor, probele

au fost cântărite cu o balanţă analitică ANH.

28


Tabelul 12.13. Valorile medii ale metanolului (în mg/g probă) în diferite ţesuturi în

cazul intoxicaţiei cu DL100 la iepure (4,8 mL metanol/kg corp)

Proba din organe g / mL

distilat

g/15 mL

distilat

g/5 g

probă g/ g probă mg/g probă

Proba 1 - creier 3679098 521,61 7824,13 7824,13 1564,83 1,56

Proba 2 - creier 3579940 507,53 7612,91 7612,91 1522,58 1,52

Proba 3 - creier 4426633 627,77 9416,53 9416,53 1883,31 1,88

Proba 4 - creier 3550442 503,34 7550,07 7550,07 1510,01 1,51

Proba 5 - creier 3805323 539,53 8093,02 8093,02 1618,60 1,62

Media creier 1,62

Proba 1 - Ochi 3093642 438,47 6576,99 6576,99 1315,40 1,32

Proba 2 - Ochi 3527116 500,03 7500,38 7500,38 1500,08 1,50

Proba 3 - Ochi 3997805 566,87 8503,04 8503,04 1700,61 1,70

Proba 4 - Ochi 2971125 421,07 6316,01 6316,01 1263,20 1,26

Proba 5 - Ochi 2848426 403,64 6054,64 6054,64 1210,93 1,21

Media ochi 1,40

Proba 1 - Cord 2717506 385,05 5775,75 5775,75 1155,15 1,16

Proba 2 - Cord 3620022 513,22 7698,29 7698,29 1539,66 1,54

Proba 3 - Cord 5310150 753,24 11298,60 11298,60 2259,72 2,26

Proba 4 - Cord 3615458 512,57 7688,57 7688,57 1537,71 1,54

Proba 5 - Cord 3871257 548,90 8233,47 8233,47 1646,69 1,65

Media cord 1,63

Proba 1 - Pulmon 3581997 507,82 7617,29 7617,29 1523,46 1,52

Proba 2 - Pulmon 4594036 651,54 9773,13 9773,13 1954,63 1,95

Proba 3 - Pulmon 4295518 609,15 9137,23 9137,23 1827,45 1,83

Proba 4 - Pulmon 4883413 692,64 10389,56 10389,56 2077,91 2,08

Proba 5 - Pulmon 3302258 468,09 7021,39 7021,39 1404,28 1,40

Media pulmon 1,76

Proba 1 - Ficat 504,51 7567,72 7567,72 1513,54 1,51

Proba 2 - Ficat 3872742 549,11 8236,63 8236,63 1647,33 1,65

Proba 3 - Ficat 8951123 1270,31 19054,59 19054,59 3810,92 3,81

Proba 4 - Ficat 3805323 539,53 8093,02 8093,02 1618,60 1,62

Proba 5 - Ficat 5235669 742,66 11139,94 11139,94 2227,99 2,23

Media ficat 2,16

29

Proba 1 - Rinichi 3101566 439,59 6593,88 6593,88 1318,78 1,32

Proba 2 - Rinichi 3417077 484,40 7265,98 7265,98 1453,20 1,45

Proba 3 - Rinichi 5220016 740,44 11106,59 11106,59 2221,32 2,22

Proba 4 - Rinichi 3396388 481,46 7221,90 7221,90 1444,38 1,44

Proba 5 - Rinichi 4436601 629,18 9437,76 9437,76 1887,55 1,89

Media rinichi 1,66

Media generală

organe 1,70

Minima 1,16

Maxima 3,81

Faţă de rezultatele obţinute cea mai mare concentraţie s-a obţinut în proba de ficat

recoltată de la subiectul nr. 3 cu o valoare de 3,81 mg/mL. Cea mai scăzută valoare s-a regăsit

în fragmentul de cord recoltat de la subiectul nr. 1, respectiv 1,16 mg/mL. Media valorilor

concentraţiilor metanolice pe tipurile de organe prelucrate a fost de 1,70 mg/mL, din care

media concentraţiilor metanolice obţinute din creier reprezintă 1,62 mg/mL, cord 1,63

mg/mL, plămân 1,76 mg/mL, rinichi 1,66 mg/mL şi cea mai mare valoare în ficat cu 2,16

mg/mL.

Fig. 12.13. Variaţia valorilor medii ale concentraţiei metanolului

determinat în organe faţă de valoarea medie generală în organe, determinată

în cazul intoxicaţiei provocate de DL100 la iepure. ( 4,8 mL /kg )

În figura 12.13. este prezentată fluctuaţia concentraţiei de metanol în organele

analizate. Astfel, sunt prezentate valorile medii ale concentraţiei metanolice obţinute din

analiza GC-MS a probelor prelevate de la cei cinci iepuri, probe din creier, ochi, cord,

plămân, ficat şi rinichi. Acestea sunt prezentate comparativ cu valoarea mediei generale. Din

sinteza datelor rezultă că valoarea medie cea mai mare s-a determinat în ficat, respectiv 2,16

mg / mL, iar valoarea cea mai scăzută s-a înregistrat în ochi, de 1,40 mg/mL. Concentraţia din

pămâni, de 1,76 mg/ mL este mai mare datorită afinităţii crescute a metanolului pentru celula

alveolară pulmonară cât şi funcţiei respiratorii care stimulează circulaţia la nivel pulmonar.

Concentraţia metanolică scăzută de la nivelul ochilor se explică prin faptul că globii oculari

prezintă o mare cantitate de lichid provenit din lichid lacrimal şi umoare apoasă. Valoarea

medie generală a concentraţiei metanolice s-a calculat la 1,70 mg/mL, valoare reprezentativă

faţa de valorile obţinute pe organele analizate.

Figura 12.19. exprimă reprezentarea grafică a mediilor concentraţiilor de metanol

30

determinate la cei cinci subiecţi prin GC-MS din sânge, creier, ochi, cord, plămân, ficat şi

rinichi, după administrarea de metanol în doză DL100 (4,8 mL/Kg) faţa de timpul de

supravieţuire. Din reprezentarea grafică reiese că subiectul nr. 3 a acumulat cea mai mare

cantitate de metanol respective 2,2 mg/mL, acesta de altfel a avut perioada cea mai scurtă de

supravieţuire (105 min). Următoarea valoare a concentraţiei metanolice este cea a subiectului

nr. 2 cu 1,63 mg/mL, acest a decedat ultimul la 200 de minute. Subiectul nr. 5 cu o

concentraţie metanolică de 1,60 mg/mL decedează la 180 de minute de la injectare la fel ca

subiectul nr. 4 cu 1,53 mg/mL. Subiectul cu valoarea concentraţiei metanolice cea mai scăzută

este iepurele nr. 1 cu 1,42 mg/mL, care a supravieţuit 155 de minute.

Conform timpului de supravieţuire faţă de valoarea mediei concentraţiei pentru fiecare

din cei cinci iepuri analizaţi, se constată că valoarea medie a concentraţiei metanolice nu este

relevant în procesul de supravieţuire, metabolismul individual având un rol hotărâtor, fapt

expus în figura 12.19.

Fig. 12.19. Valoarea medie a concentraţiei metanolice la cei cinci subiecţi testaţi cu

metanol DL100 (4,8 mL/Kg) faţă de timpul de supravieţuire din momentul injectării

Datele obţinute privind concentraţia metanolică ce se regăseşte în sângele şi

organele iepurilor testaţi la metanol în doză DL100 (4,8 mL/ Kg), corelate cu masa corporală

faţă de intervalul de supravieţuire evidenţiază faptul că în cazul în care expunerea la metanol

se face conform masei corporale, aceasta nu prezintă importanţă majoră în procesul de

supravieţuire.

12.5. Determinarea concentraţiei de metanol în cazul intoxicaţiilor

letale. Prezentare de caz

Marea majoritate a intoxicţiilor metanolice se produc pe fondul consumului de băuturi

alcoolice în exces şi care prezintă o concentraţie metanolică peste limita admisă. Acest gen de

intoxicaţii conduc de cele mai multe ori la un final nefast, deoarece intoxicaţia cu alcool etilic

maschează simptomatologia intoxicaţiei metanolice înârziind astfel aplicarea medicaţiei

antidot specifice. Tarele de sănătate, cât şi starea de confuzie, obnubilare sau chiar coma

pacienţilor sunt factori importanţi în diagnosticarea precoce a intoxicaţiilor metanolice. De o

importanţă majoră în aplicarea diagnosticului sunt examenele complementare şi in mod

31

special examenele biochimice şi nu în ultimul rând examenul toxicologic al sângelui. În cele

ce urmează se prezintă două cazuri de intoxicaţii metanolice care s-au prezentat la Spitalul

Judeţian Bacău şi au decedat la câteva ore de la internare.

12.5.1 Prezentarea cazului nr. 1

O pacientă de 32 de ani este internată în secţia Urgente a Spitalului Judeţean Bacău în

data de 21.02.2010 cu diagnosticul “Coma gradul III, şoc toxic în observaţie”. La examenul

clinic general, pacienta prezenta tegumente reci marmorate, secreţii albicioase abundente la

nivelul căilor respiratorii, TA nu se poate măsura, AV-68/minut, pupile midriatice bilateral,

ROT absente, raluri bronşice bilateral. Examenele complementare respectiv, examenul

biochimic al sângelui relevă: amilază -117 U/L, GGT–113 U/L, TGO–331 U/L şi TGP–147

U/L. Din datele de anchetă rezultă că femeia era o consumatoare cronică de băuturi alcoolice.

Starea gravă a pacientei cât şi a lipsei de informaţii privind toxicul care a fost ingerat

pe fondul consumului de băuturi alcoolice, a condus la o diagnosticare dificilă. Evoluţia a fost

gravă cu deprimare respiratorie, pacienta moare prin stop cardio-respirator după 9 ore de la

internare. În urma examenului toxicologic s-a constatat că in momentul decesului pacienta

prezenta o alcoolemie de 1,90g‰. Analiza concentraţiei metanolice din sange şi organe s-a

efectuat prin GC-MS, conform metodei, valorile fiind prezentate în tabelul 12.14.

Tabelul 12.14. Valorile concentraţiei metanolice din sânge

şi organe determinate prin GC/MS

Nr. Distilat

Concentraţia metanolului

µg/mL sânge,

sau g ţesut

mg/mL sânge,

sau g ţesut

g/1000 mL

sânge/g ţesut

1 Sânge 1720,342 1,720 1,72

2 Ficat 795,506 0,795 0,79

3 Bilă 2661,306 2,661 2,66

4 Stomac 2287,104 2,287 2,28

5 Intestin 1639,867 1,639 1,63

6 Rinichi 1590,389 1,590 1,59

Valoare medie 1,78

Datele obţinute pun în evidentă valorile crescute ale concentraţiilor metanolice atât în

sânge cât şi în organele cercetate. Astfel, în sânge concentraţia metanolului este de 1,720 g‰,

în ficat de 0,795 g ‰, în bilă de 2,661 g ‰, în stomac 2,287 g ‰, în intestin de 1,639 g ‰ iar

în rinichi de 1,590 g ‰.

Fig. 12.21. Variaţia concentraţiei de metanol în sânge şi organe

32

Datorită coeficientului bun de lipo–hidrosolubilitatate, metanolul se distribuie în

majoritatea organelor, cu precădere în organele cu concentraţii mari de apă. În cazul de faţă, în

bilă concentraţia metanolica este de trei ori mai mare faţă de concentraţia metanolică din ficat,

unde s-a înregistrat cea mai scăzută valoare. Variaţia mare a valorilor concentraţiilor

metanolice este explicată în primul rând de examenul anatomo-patologic. În cazul de faţă

steatoza hepatică cu degenerescenţă grasă, explică pe de o parte distribuţia neuniformă a

toxicului, cât şi accentuarea scăderii ratei metabolice a metanolului, cu potenţarea efectului de

acumulare. Valorile mari ale concentraţiei metanolice din stomac şi intestin pun în evidenţă

faptul că expunerea la metanol s-a făcut prin ingestie. Astfel, consumul excesiv de băuturi

alcoolice coroborat cu tarele de sănătate (leziuni bacilare vechi, steatoză hepatică, alcoolism

cronic) şi nu în ultimul rând concentrţia mult peste limită a metanolului din băuturile

alcoolice consumate au dus în cazul de faţă la deces. Valoarea concentraţiei metanolice

determinată în sânge şi organe fiind fatală chiar şi în cazul unui organism sănătos.

12.5.2. Prezentarea cazului nr. 2

În luna februarie 2011, un bărbat de 65 de ani este internat în secţia Urgenţe a S.J.U.

Bacău, la ora 14, 50 cu diagnosticul de : Comă profundă. Şoc toxic. În momentul internării,

tegumente reci, marmorate, hipotermie 34 ° C, pupile midriatice bilateral, areactive la lumină,

ROT absente, RCA abolite, TA – 80/50, AV – 60/ minut, GCS-6, examenul Compiuter

Tomograf nu s-a putut efectua.

Examenele complementare, respectiv analizele biochimice pun în evidenţă

următoarele valori : Creatinină - 1,35, TGP- 45, GOT- 65, GGT- 171, CO2 - 8, K- 6,39, Na -

156,4 , Gluc.- 143, pH – 6,8.

Cu toate eforturile de susţinere a vieţii, la ora 06,50 decedează în urma stopului

cardio-respirator.

Din analiza toxicologică reiese că acesta a consumat băuturi alcoolice cu o

concentraţie metanolică mult peste limită (1 g/100 mL etanol anhidru), constatându-se o

concentraţie etanolică de 0,90 g ‰ la 16 ore de la internare.

În urma analizei GC-MS a probelor biologice, s-au obţinut următoarele rezultate,

prezentate în tabelul 12.15.

Tabelul 12.15. Valorile concentraţiei metanolice din sânge

şi organe determinate prin GC-MS

Nr. Distilat

Concentraţia metanolului

µg/mL sânge, sau

g ţesut

mg/mL sânge, sau

g ţesut

g/1000 mL

sânge/g ţesut

1 sânge 526,6 0,526 0,52

2 creier 677,8 0,677 0,67

3 pulmon 946,1 0,946 0,94

4 cord 621,1 0,621 0,62

5 ficat 771,0 0,771 0,77

6 bila 1056,7 1,056 1,05

7 pancreas 924,2 0,924 0,92

8 stomac 1235,9 1,235 1,23

9 intestin 1345,2 1,345 1,34

10 rinichi 1483,5 1,483 1,48

Valoare medie 1,35

Datele prezentate în tabelul 12.15, pun în evidenţă valorile mari ale concentraţiei

metanolice obţinute stomac, intestin, rinichi, valori de 1,23 g‰ , 1,34 g‰, 1,48 g‰. Valori

33

apropiate s-au obţinut în pulmon cu 0,94 g‰ şi pancreas cu 0,92 g‰. În bilă s-a determinat

1,05 g‰. Valori mai mici s-au determinat în sânge şi anume 0,52 g‰, în creier 0,67 g‰ şi în

ficat 0,77 g‰ , date exprimate şi în figura 12.23 .

Fig. 12.23. Variaţia concentraţiei de metanol în sânge şi organe

Din analiza toxicologică prin GC-MS a sângelui şi a organelor în cazul de faţă se

constată o fluctuaţie a valorilor cu pondere mare pe rinichi, intestin şi stomac şi mai scăzută

pe creier, cord şi ficat. Valoarea concentraţiei metanolice din sânge a fost cea mai scăzută

valoare determinată la caz, ceea ce denotă că metabolismul metanolului era în dinamică.

12.5.3. Concluzii faţă de cazuistică

Cele două cazuri prezentate constituie practic două exemple de intoxicaţie

metanolică letală. În ambele cazuri pacienţii au fost internaţi în stare comatoasă, astfel încât

epicriza foilor de observaţie nu a putut fi completată cu date care ar fi putut avea o reală

importanţă în stabilirea diagnosticului. Ancheta cazurilor stabilea cu certitudine că ambii

pacienţi au consumat băuturi alcoolice în exces, prezentând în mod evident simptomatologia

intoxicaţiei etanolice.

Faţă de datele din literatură, valorile concentraţiei metanolice obţinute în urma

analizei probelor biologice prin GC-MS, se încadrează în intervalele valorice obţinute şi în

alte cazuri de intoxicaţii letale cu metanol, respectiv intervalul 0,52– 2,66 g‰ metanol

(Ashley L., 1992, Vaida H., 1997, Watson WA., 2003). Comparaţia valorile privind ponderea

concentraţiei de metanol obţinute la cazul nr.1 faţă de ponderea concentraţiei metanolice la

cazul nr. 2, pe aceleaşi organe conform valorilor expuse în tabelele nr. 12.14. şi 12.15. se

prezintă în figura nr. 12.25.

Fig. 12.25. Valori comparative între ponderea concentraţiei metanolice

obţinută din sânge şi organe la cazul nr. 1 şi cazul nr. 2

34

Având în vedere valorile expuse în figura 12.25, faţă de dinamica intoxicaţiei

metanolice, putem afirma că distribuţia şi absorbţia toxicului în organe la cele două cazuri

cercetate, este diferită. În baza acestor cercetări, se poate preciza că în momentul decesului la

cazul nr. 2, faţă de cazul nr. 1, metanolul era în faza de eliminare. Acest fapt este relevat în

primul rând de valoarea mare a concentraţiei metanolice din rinichi (1,48 g ‰) faţă de

valoarea obţinută în sânge (0,52 g‰), cât şi de valoarea mare din plămâni (1,05 g‰).

Analizând datele obţinute la cazul nr. 1, se observă o distribuţie diferită faţă de cazul nr. 2.

Deoarece concentraţia metanolică din sânge este mai mare faţă de concentraţia metanolică din

rinichi (tabelul 12.14.), se poate preciza că momentul decesului s-a produs în plin proces

metabolic, în faza de acumulare. Momentul decesului la scurt timp de la internare (9 ore), a

fost precipitat de mai mulţi factori şi anume în primul rând de tarele de sănătate a pacientei

(leziunile bacilare specifice infecţiei cu bacil Koch, ficat steatozic) şi nu în ultimul rând

concentraţia etanolică de 1,90 g‰.

În urma analizei celor două cazuri, s-a constatat că decesul a survenit ca urmare a

consumului excesiv de băuturi alcoolice contrafăcute, care în mod evident prezentau

concentraţii ale metanolului peste limita admisă.

13. INCIDENŢA INTOXICAŢIILOR LETALE CU ALCOOL METILIC ÎN UNELE

JUDEŢE DIN ROMÂNIA ÎN PERIOADA 2005 – 2010

13.1. STUDIUL STATISTIC AL INTOXICAŢIILOR LETALE

PENTRU TOATE JUDEŢELE

Studiul statistic privind intoxicaţiile letale cu metanol s-a efectuat în urma consultării

datelor preluate de la Serviciile de Medicină Legală a cincisprezece judeţe din România.

Datele cuprind: numărul de cazuri de morţi violente în urma intoxicaţiei metanolice, vârsta,

sexul, provenienţa persoanei decedate cât şi prezenţa alcoolului etilic sau a altor toxici

determinaţi în sânge. În tabelul 13.1. sunt prezentate datele privind numărul de cazuri de

intoxicaţii metanolice pentru fiecare judeţ pe fiecare an, din 2005 până în 2010.

Tabelul 13.1. Numărul de cazuri de intoxicaţii metanolice

în 15 judeţe din România în perioada 2005 – 2010

Judeţ 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Total

Alba 0 0 2 0 0 1 3

Bacău 0 13 4 0 3 3 21

Braşov 0 3 6 0 0 3 12

Buzău 2 0 0 0 1 1 4

Gorj 0 4 0 1 0 1 6

Neamţ 1 0 1 1 0 1 4

Olt 0 1 1 0 0 0 2

Suceava 0 0 0 0 0 1 1

Vrancea 2 1 1 2 3 1 10

Brăila 0 0 0 1 2 0 3

Galaţi 0 0 0 0 0 0 0

Botoşani 0 0 0 0 0 0 0

Vaslui 0 0 0 0 0 0 0

Mehedinţi 0 0 0 0 0 0 0

Bistriţa

Năsăud 0 0 0 0 0 0 0

Situaţia numărului total de cazuri înregistrate pe acest interval din cele cinsprezece

judeţe este prezentată în figura 13.1., unde se observă că judeţul cu cele mai multe cazuri de

35

intoxicaţii letale este judeţul Bacău cu 25 de cazuri. Este urmat de judeţul Braşov cu 12 cazuri

şi judeţul Vrancea cu 10 cazuri.

Fig. 13.1. Totalul intoxicaţiilor metanolice

din cinsprezece judeţe pe intervalul 2005 – 2010

Sintetizând datele obţinute din cele zece judeţe în care în perioada 2005 – 2010 au

existat cazuri de intoxicaţii metanolice letale, s-au obţinut o serie de rezultate privind totalul

cazurilor de intoxicaţii letale în funcţie de sex şi în funcţie de provenienţă.

În funcţie de sex, s-au înregistrat un număr de 53 de cazuri de bărbaţi şi 13 cazuri de

femei. Faţa de provenienţa celor decedaţi în urma intoxicaţiei metanolice cele mai multe

cazuri au fost înregistrate din mediul rural, respectiv 48 de cazuri faţă de 18 cazuri din mediul

urban. Aceste aspecte au fost sintetizate în figurile 13.2. şi 13.3.

Fig. 13. 2. Situaţia statistică a numului de bărbaţi faţă de numărul de femei decedaţi în

urma intoxicaţiei metanolice pe fiecare judeţ.

36

Fig. 13.3. Situaţia statistică a cazurilor de intoxicaţii metanolice letale

în funcţie de provenienţă

Din ambele figuri se observă că judeţul Bacău prezintă cele mai multe cazuri de

decese atât la bărbaţi cât şi la femei, totodată, comparative cu datele sintetizate de la celelalte

judeţe, prezintă şi cele mai multe cazuri din mediul rural şi mediul urban. Din acest punct de

vedere, este urmat de judeţul Braşov cu 11 cazuri bărbaţi şi un caz de sex feminine, iar în

funcţie de origine 8 cazuri din mediul rural cu patru cazuri din mediul urban.

În funcţie de grupele de vârstă ale intoxicaţilor cu metanol s-a efectuat o statistică pe

şase grupe de vârstă, se observă că grupa de vârstă 41- 50 ani prezintă cele mai multe cazuri

de decedaţi în urma intoxicaţiei metanolice, respectiv 19 cazuri. Aceste aspect au fost

sintetizate şi prezentate în figura 13.4.

Fig. 13. 4. Numărul de cazuri de decese în urma intoxicaţiei metanolice

în funcţie de grupa de vârstă

Fig. 13.5. Numărul total de cazuri în funcţie de intervalul 2005 – 2010

37

Datele din figura 13.5. oferă o imagine de ansamblu a numărului de cazuri de morţi

violente prin intoxicaţie cu alcool metilic. Este evidentă diferenţa de la un an la altul, cea mai

evidentă fluctuaţie fiind între anul 2005 cu 5 cazuri şi 2006 cu 22 de cazuri. De asemeni în

anul 2007 se înregistrează 13 cazuri ca în 2008 numărul de cazuri să se reducă la 5, urmând o

evoluţie în creştere, astfel în 2009 se ajunge la 9 cazuri, iar în 2010 la 12 cazuri.

13.3. CONCLUZII

Analizând datele preluate de la Serviciile de Medicină Legală din 15 judeţe privind

cazurile de morţi violente care s-au produs în urma intoxicaţiilor metanolice, s-a constatat:

Judeţele Galaţi, Botoşani, Vaslui, Mehedinţi şi Bistriţa Năsăud, pe intervalul studiat

nu a prezentat nici un caz de intoxicaţie metanolică letală;

Din cele 10 judeţe în care s-au înregistrat cazuri de intoxicaţii letale, s-a înregistrat

un total de 66 de cazuri, Judeţul Bacău prezentând cele mai multe cazuri, respectiv 21 de

cazuri, cele mai puţine cazuri înregistrându-se în judeţul Suceava şi anume, un caz;

În funcţie de sex, cele mai multe cazuri s-au înregistrat la bărbaţi, respectiv 53 de

cazuri şi 13 femei;

În funcţie de origine, din mediul rural au provenit 48 de cazuri faţă de 18 din mediul

urban;

Faţă de grupele de vârstă în care s-au încadrat subiecţii, grupa 41–50 care prezintă

19 cazuri, urmată la un scurt interval de grupa 51–60 cu 16 cazuri, numărul cel mai scăzut

s-a înregistrat în grupa 61–70 cu 3 cazuri;

Numărul total de cazuri pentru fiecare an analizat, pune în evidenţă anul 2006 cu 22

de cazuri, evoluţia fiind fluctuantă.

14. CONCLUZII GENERALE

Metanolul este prezent în numeroase produse de larg consum, dar majoritatea

cazurilor de intoxicaţii metanolice se produc în urma consumului de băuturi alcoolice care

prezintă o concentraţie metanolică peste limita admisă de 1g / 100 mL etanol anhidru.

Metanolul din aceste produse de distilare rezultă din degradarea părţii lemnoase a seminţelor

fructelor cât şi din degradarea substanţelor pectice din dermul fructelor şi al seminţelor

acestora. De asemeni, prezenţa metanolului în produsul finit de distilare este strâns legată de

tehnica de prelucrare a fructelor şi mixurilor de fructe.

În contextual actual generat de importanţa elucidării mecanismului de acţiune a

metanolului asupra organismului uman, cât si de importanţa testelor toxicologice în cazul

intoxicaţiilor metanolice, prezenta teză de doctorat si-a propus următoarele obiective:



Determinarea concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice natural prin metoda

propusă. Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice

natural.



Aplicarea metodei de determinare a metanolului din probe biologice într-un studiu

pe animale de laborator.

Aplicarea metodei de determinare a concentraţiei de metanol din probe biologice

GC-MS, pe subiecţi umani (prezentări de caz).

Evaluarea statistică a numărului de cazuri de intoxicaţii letale din judeţe din

România.

În lucrarea de faţă, prin analiza gaz cromatografică a probelor alcoolice am urmărit

38

separarea a cât mai multor componente din matricea complexă în vederea identificării

acestora precum şi determinarea cantitativă a metanolului prezent în acestea. În acest sens am

pus la punct o metodă de analiză a metanolului prin cromatografie de gaze cuplată cu

spectrometrie de masă. Determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf

de gaze tip Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent

Technologies 5975C inert MSD ca sistem de detecţie. În urma consultării literaturii de

specialitate cât şi în urma testelor în vitro am stabilit următoarele condiţii de lucru:

separarea cromatografică se realizează pe o coloană Zebron – Phenomenex, tip ZB-

WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm),

fază mobilă este constituită din heliu cu un debit de 1 mL/min,

gradient de temperatură în compartimentul coloanei: 50C timp de 20 minute, apoi

temperatura creşte cu 10C/min până la 250C unde este menţinută constantă încă 5 minute;

volumul de soluţie injectată este de 0,1 L şi un raport de splitare de 1 / 50 în portul

de intrare al injectorului ce are temperatura de 250C;

detecţia se realizează prin spectrometrie de masă cu temperatura sursei MSD de

230C şi cea a cvadrupolului MSD de 150C;

identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală faţă de biblioteca

de spectre Wiley.

Pentru ca metoda sa fie validată am studiat liniaritatea funcţiei de răspuns. Funcţia de

răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9–19775 g/mL). Ecuaţia dreptei de regresie

obţinute s-a calculat prin metoda celor mai mici pătrate:

Arie = 4877,4 x Concentraţia (g/mL) + 1569486,174





Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 146,4 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5

g/mL, respectiv LD = 875,8 g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL) şi limita de

cuantificare (LQ = 443,5 g/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 g/mL, respectiv LQ = 2653,9

g/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 g/mL) folosind estimarea acestor limite pe baza

deviaţiei standard şi a pantei dreptei de regresie.

A fost stabilit intervalul de lucru: 3559,5 – 9887,5 g/mL;


repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determinări,

valoarea deviaţiei standard relative (RSD) fiind de 1,0621 %;

repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluţii independente la trei

nivele de concentraţie diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de

2,6601 % pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL;

precizia intermediară pentru trei soluţii independente la trei nivele de concentraţie

diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de 2,3336 % pe domeniul

2768,5 – 19775 g/mL.

Pentru estimarea exactităţii s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe

la trei nivele de concentraţie diferite obţinându-se o regăsire medie de 95,9% pe intervalul

92,4 – 97,9% pe domeniul 2768,5 – 19775 g/mL.

Metoda astfel validată am aplicat-o în vederea determinării concentraţiei de alcool

metilic şi a prezenţei compuşilor volatili în distilatele alcoolice natural. Astfel am analizat un

număr de 98 de probe de distilate alcoolice natural, provenite din zona Moldovei .

Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS conform metodei, două probe

au avut valori ale concentraţiei metanolului sub limita de detecţie şi una sub limita de

39

cuantificare.

Cele 95 de probe prezintă concentraţii ale metanolului (g/mL distilat ) cuprinse între

499,5g/mL - 8316,0 g/mL. Valoarea medie cea mai mare se regăseşte în distilatele din

prune, respectiv 3320,46 g/mL distilat. Media cea mai scăzută a concentraţiei metanolului

în g/mL distilat se observă în probele de distilat alcoolic prelucrate din tescovină.

Regulamentul CEE 1014/90 şi STP 57–92 prevede că valoarea concentraţiei de

metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru.

Pentru raportarea concentraţiei metanolului faţă de 100 mL etanol anhidru am determinat

conţinutul în etanol conform unei metode de determinare a concentraţiei etanolice din

distilatele alcoolice conformă cu legislaţia.


analizate, am constatat:

19 probe au avut valori ale concentraţiei metanolice peste limita admisă (peste 1,00

g/100 mL alcool etilic anhidru), din care :

valoarea maximă determinată este de 2,30 g/mL etanol anhidru

6 probe cu valori ale concentraţiei metanolice peste limită au ca materie primă

tescovina.

7 probe cu valori ale concentraţiei alcoolului metilic peste limita admisă, provenite

din amestec de fructe.

6 probe cu valori ale concentraţiei metanolului peste limitele admise provenite din

prune.

Din calculul statistic privind concentraţia medie a metanolului din probele de distilat

analizate care au concentraţia metanolică peste limita admisă în funcţie de materialul din care

au fost prelucrate se observă:

valoarea medie cea mai mare a concentraţiei metanolice se regăseşte în probele de

distilate provenite din macerarea şi distilarea prunelor, respectiv 1,67 g/100 mL etanol

anhidru;

valoarea medie cea mai scăzută o întâlnim la probele provenite din distilarea

amestecurilor de fructe de 1.38 g/100 mL etanol anhidru.

valoarea medie generală pe cele 19 probe de distilat cu concentraţii metanolice peste

limita admisă este de 1,51 g/100 mL etanol anhidru.

În concluzie, din cele 98 de probe de distilate alcoolice naturale 19 probe prezentau

valori ale concentraţiei alcoolului metilic peste limita admisă, reprezentând 19,38%.

În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele probelor de

distilate naturale am identificat o serie de compuşi volatili denumiţi congeneri. Aceştia au

fost identificaţi prin metoda SCAN comparându-se timpii de retenţie cu datele din bibliotecile

spectrale. Am calculate concentraţia acestora raportând aria picului ce corespunde fiecărui

compus detectat şi identificat, faţă de aria totală a picurilor detectate, respectiv ariile picurilor

compuşilor volatili ce au putut fi detectaţi prin această metodă.

Concentraţia în mL/total congeneri a compuşilor volatili detectaţi si identificaţi am

calculat-o raportând procentul de arie al fiecărui pic la concentraţia în volume a etanolului,

concentraţie ce a fost obţinută anterior .

Faţă de totalul compuşilor volatili detectaţi prin GC-MS, 96% reprezintă etanol, 3%

alţi compuşi volatili şi 1 % alcool metilic. Faţă de ponderea etanolului din distilatele analizate,

metanolul reprezintă 1,04% .

Intoxicaţiile metanolice de diferite etiologii, dar cu precădere cu etiologie alcoolică,

constituie cauza multor urgenţe medicale, dar şi a multor decese. Important este ca

diagnosticul cu privire la natura toxicului la care a fost expus pacientul să fie pus cât mai

rapid pentru administrarea unei scheme de tratament adecvate. În acest sens am încercat

elaborarea şi validarea unei metode de determinare a metanolului din produsele biologice într-

un timp scurt şi eficient. Prin această metodă am analizat metanolul din probe de sânge, cât şi

40

din organe, în cazul examenului toxicologic pe cadavru.

Pentru a realiza separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a metanolului din

probe biologice prin cromatografie de gaze, cuplată cu spectrometrie de masă, am efectuat

iniţial o serie de teste în vitro, obligatorii de altfel, pentru a stabili condiţiile experimentale

optime de analiză, având în vedere metoda GC-MS de determinare a metanolului din distilate

alcoolice.

În ceea ce priveşte modul de preparare a probelor pentru izolarea alcoolului metilic,

acestea au fost prelucrate prin distilare conform metodei Cordebard. S-au pregătit o serie de

standarde de lucru pentru validărea metodei. Pentru calculul concentraţiei în metanol se are în

vedere densitatea metanolului (d) în mg/mL (0,791), volumul de metanol şi volumul final al

probei.

Astfel, pentru prepararea standardelor de lucru am lucrat în modul următor: un volum

(v) de 0,5 mL metanol a fost amestecat cu un volum de 9,5 mL sânge obţinându-se un volum

total (V) de 10 mL soluţie stoc (ST 1) a cărei concentraţie se calculează folosind formula

următoare:

0,791 0,50,03955 g/mL=39550 g/mL

10

d v

V

Din soluţia astfel obţinută am preparat prin diluare cu sânge soluţii de diferite

concentraţii. Aceste soluţii au fost supuse distilării conform modului descris anterior.

Distilatele astfel prelucrate le-am analizat pe un cromatograf de gaze tip Agilent

Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert

MSD ca sistem de detecţie. Faza staţionară - coloană polară Zebron – Phenomenex, de tip

YB-WAXplus (60 m x 0,25 mm; 0,25 µm).

Portul de intrare al injectorului se află la o temperatură de 250C. Cantitatea de probă

injectată este de 1 L cu un raport de splitare de 1 / 50.

Faza mobilă este constituită din heliu (debit 1 mL / min).

Programul de temperatură porneşte de la 50C - temperatură menţinută constantă timp

de 16 minute şi creşte la 250C cu o viteză de 25C/ min.

În ceea ce priveşte sistemul de detecţie, parametrii de lucru sunt următorii:

temperatura sursei MS: 230C;

temperatura quadrupolului: 150C;

mod de achiziţie (SIM – Single Ion Monitoring)

mod de lucru: SIM, ionii înregistraţi fiind cei cu raportul M/Z = 15, 29, 31 şi 32;

detecţie oprită între minutul 12 şi 15 (interval de timp necesar pentru eliminarea apei

din probă).

Identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală faţă de biblioteca de

spectre Wiley.

S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns. Funcţia de răspuns este liniară pe

domeniul studiat (4,9–19775 g/mL sânge sau 1,65–6591,67 g/mL distilat).

Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 139,3 g/mL) şi limita de cuantificare

(LQ = 422,1 g/mL) folosind estimarea acestor limite pe baza deviaţiei standard şi a pantei

dreptei de regresie.

A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3 – 6591,67 g/mL distilat respectiv 417,9 –

19775,01 g/mL sânge;


repetabilitatea - RSD 0,8748 %;

repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD 4,6811 % pe domeniul 263,67 –

527,33 g/mL distilat;

precizia intermediară - RSD 4,1078 % pe domeniul 263,67 – 527,33 g/mL distilat;

Pentru estimarea exactităţii s-a determinat - regăsirea medie de 98,0% pe intervalul

41

93,2 – 102,8%.

Aplicabilitatea metodei de determinare a metanolului din probe biologice s-a testat

într-un studiul experimental ce se bazează pe testarea toxicităţii alcoolului metilic pe animale

de laborator. În cazul de faţa s-a folosit un lot format din cinci iepuri din rasa“ Iepurele

olandez cenuşiu”, experimentele desfăşurându-se în cadrul Laboratorului de Biologie Animală

a Universităţii “V Alecsandri” Bacău.

Studiul pe animale de experienţă a avut următoarele obiective:

1. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge în cazul injectării de

metanol cu doza de DL50 la iepuri din rasa “Olandez cenuşiu” şi observarea simptomatologiei

intoxicaţiei.

2. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge şi organe în cazul

injectării de metanol cu doza de DL100 la iepuri din rasa „Olandez cenuşiu” şi observarea


S-a urmărit evoluţia intoxicaţiei metanolice din punct de vedere simptomatic cât şi din

punct de vedere toxicologic prin analiza probelor de sânge recoltate la intervale determinate

respective la 75, 195 şi 375 de minute.

Determinarea metanolului prin GC-MS s-a efectuat prin analiza distilatelor obţinute

din probele de sânge şi organe, conform metodei prezentate, pe acelaşi aparat şi aceiaşi

parametri pe care i-am utilizat la validarea metodei. Din punct de vedere toxicologic în prima

fază a experimentului, am obţinut valori ale concentraţiei de metanol în sânge pe urmatoarele

intervale de recoltare:

75 minute : 0,68 mg/mL - 1,02 mg/mL

195 minute: 0,75 mg/mL - 1,02 mg/mL

375 minute: 0,68 mg/mL - 0,89 mg/mL.

Faţă de evoluţia simptomatologiei, la 75 de minute de la administrarea toxicului 60 %

dintre subiecţi prezentau modificări minore a simptomatologiei, ca la minutul 375, 100 % din

subiecţi prezentau o simptomatologie ce releva deteriorării majore a stării de sănătate.

Evoluţia valorilor pulsului a fost diferită de la individ la individ, în medie valoarea cea mai

crescută raportându-se la minutul 75 de la administrarea metanolului.

În cea de-a doua etapă a experimentului am testat variaţia concentraţiilor de metanol

în sânge în cazul injectării de metanol cu doza de DL100 (4,8 mL/Kg corp) la iepuri din rasa

“Olandez cenuşiu”. Am efectuat două recoltări, prima la un interval de 75 de minute, cea de-a

doua recoltare efectuându-se în momentul decesului subiecţilor.

La primul interval de recoltare am obţinut valori ale concentraţiei metanolice cuprinse

între 1,08 mg/mL şi 1,77 mg/mL. A doua recoltare a fost efectuata intervale diferite în funcţie

de momentul decesului fiecărui subiect. Am obţinut valori ale concentraţiei metanolice

cuprinse între 1,23 mg/mL, şi 1,82 mg/mL.

Faţă de valorile obţinute din analiza organelor recoltate în urma decesului subiecţilor

testaţi cu metanol DL100, am constatat că cea mai mare concentraţie metanolică medie s-a

determinat în urma analizării ficatului cu o valoare de 2,16 mg/mL, iar cea mai scăzută

valoare s-a determinat în ochi cu o valoare medie de 1,40 mg/mL. Din punct de vedere al

fiecărui subiect în parte, am obţinut valori fluctuante şi diferite pe organe la fiecare subiect

analizat. Valoarea medie cea mai mare s-a obţinut la subiectul nr. 3 de 2,20 mg/mL şi cea mai

mică valoare la subiectul nr. 1 cu o valoare medie de 1,42 mg/mL. Datele obţinute privind

concentraţia metanolică ce se regăseşte în sângele şi organele iepurilor testaţi la metanol în

doză DL100 (4,8 mL/ Kg), corelate cu masa corporală faţă de intervalul de supravieţuire,

evidenţiază faptul că în cazul în care expunerea la metanol se face conform masei corporale,

aceasta nu prezintă importanţă majoră în procesul de supravieţuire.

Marea majoritate a intoxicaţiilor metanolice se produc pe fondul consumului de

băuturi alcoolice în exces şi care prezintă o concentraţie metanolică peste limita admisă.

42

În perioada 2010 – 2011 la SJU Bacău s-au prezentat două astfel de cazuri, care

constituie practic două exemple de intoxicaţie metanolică letală. În ambele cazuri pacienţii au

fost internaţi în stare comatoasă şi soc toxic. Ancheta cazurilor stabilea cu certitudine că ambii

pacienţi au consumat băuturi alcoolice în exces, prezentând în mod evident şi

simptomatologia intoxicaţiei etanolice.

Comparând valorile privind ponderea concentraţiei de metanol obţinute la cazul nr. 1

faţă de ponderea concentraţiei metanolice la cazul nr. 2, pe aceleaşi organe se constată că în

cazul numărul 1 decesul a survenit în plin proces metabolic şi acumulare a metanolului. În

cazul numărul 2 decesul a survenit în faza de eliminare a metanolului.

În ambele cazuri se poate spune că a fost vorba de o dublă intoxicaţie atât metanolică cât şi

etanolică. Simptomatologia acută a intoxicaţiei etanolice cât şi lipsa datelor de anchetă au

mascat intoxicaţia metanolică, conducând spre exitus.

Analizând datele preluate de la Serviciile de Medicină Legală din 15 judeţe privind

cazurile de morţi violente care s-au produs în urma intoxicaţiilor metanolice, s-a constatat:

Judeţele Galaţi, Botoşani, Vaslui, Mehedinţi şi Bistriţa Năsăud, pe intervalul studiat

nu a prezentat nici un caz de intoxicaţie metanolică letală;

Din cele 10 judeţe în care s-au înregistrat cazuri de intoxicaţii letale, s-a înregistrat

un total de 66 de cazuri, Judeţul Bacău prezentând cele mai multe cazuri, respectiv 21 de

cazuri.

În funcţie de sex, cele mai multe cazuri s-au înregistrat la bărbaţi, respectiv 53 de

cazuri şi 13 la femei;

În funcţie de provenienta , din mediul rural au provenit 48 de cazuri faţă de 18 din

mediul urban;

Faţă de grupele de vârstă în care s-au încadrat subiecţii, cele mai multe cazuri

înregistrându-se pe grupa 41–50 care prezintă 19 cazuri.

Numărul total de cazuri pentru fiecare an analizat, pune în evidenţă anul 2006 cu 22

de cazuri, evoluţia fiind fluctuantă.

În urma acestui studiu, consider ca metanolul este un toxic activ plasat în numeroase

produse de largă circulaţie, la care are acces un segment important din populaţie. Deşi se

cunosc în mare parte efectele toxice ale acestuia, prezenţa sa în băuturile alcoolice prezintă cel

mai mare risc. Datorită faptului că în majoritatea cazurilor decesul subiecţilor a survenit ca

urmare a consumului de băuturi alcoolice contrafăcute care în mod evident prezentau

concentraţii ale metanolului peste limita admisă se impun măsuri de control asupra băuturilor

alcoolice preparate artizanal. Se impune de asemeni avertizarea a populaţiei privind

potenţialul toxic al alcoolului metilic, acordândui-se importanţa cuvenită în categoria

toxicelor.

CONTRIBUŢII ORIGINALE

1. Am elaborat şi validat o metodă modernă de determinare a metanolului prin

cromatografie de gaze cuplată cu spectrometria de masă, din distilate alcoolice.

2. Am evaluat concentraţia metanolului din distilatele alcoolice naturale produse

artizanal în funcţie de materialul din care au fost distilate şi în funcţie de localităţile din care

provin.

3. Am elaborat şi validat o metodă în vederea determinării a metanolului din probe

biologice, respectiv sânge şi ţesuturi, prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometria de

masă.

4. Am evaluat dinamica intoxicaţiei metanolice pe baza concentraţiilor metanolului

determinate în sânge la intervale prestabilite într-un studiu pe organism animal, respectiv pe

iepuri.

5. Am evaluat distribuţia metanolului în organe în cazul intoxicaţiei letale, într-un

studiu pe animale de laborator (iepuri), cât si pe subiecţi umani, decedaţi în urma consumului

43

de băuturi alcoolice care aveau concentraţii metanolice peste limita admisă.

6. Am efectuat o situaţie statistică a intoxicaţiilor metanolice letale din judeţele din

România.

PERSPECTIVE DE CERCETARE

Tema tezei de doctorat oferă premizele către noi direcţii de cercetare:

Analiza concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale în funcţie de

specia de fruct din care s-a prelucrat distilatul, respective specia de strugure din care provine

tescovina, sau specia de prune din care s-a prelucrat distilatul.


vechimea distilatului.

Analiza concentraţiei metanolului din distilatele alcoolice natural în funcţie de

perioada de fermentare şi păstrare a materialului fructifer în vederea distilării.


gradul de infestare a materialului fructifer cu diferite specii de fungi.

Analiza concentraţiei de metanol din sânge în urma consumului de sucuri naturale.

Analiza concentraţiei de metanol din sânge în urma consumului de băuturi

răcoritoare acidulate îndulcite cu aspartam.

Analiza concentraţiei metanolului metabolic în funcţie de diferite afecţiuni ale

organismului.

Analiza concentraţiei metanolului din apele reziduale din staţiile de epurare a

apelor.

Analiza concentraţiei de metanol din diferite produse de curăţare.

44

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

6. * * * „2008 World Methanol Analysis”. www.cmaiglobal.com.

https://www.cmaiglobal.com/Marketing/News/WMA2008.pdf. Accesat la 9 ianuarie 2010

9. Hayes AW, et al. FATS, Principles and Methods of Toxicology, Third edition Raven Press, N.Y. 1994; (4 ):

129-142; 364-377

10. Ioniţă P I. Curs de chimia compuşilor organici cu funcţiuni simple. Universitatea din Bucureşti, 2008

11. Sun Y, Ong K Y. Detection Technologies for Chemical Warfare Agents and Toxic Industrial Chemical. CRC

Press, United Kindom, 2004

12. Luminiţa Agoroaiei, Elena Butnaru. Toxici gazosi şi volatili, Editura „Gr. T. Popa”, U.M.F., Iaşi 2005; 103 –

109.

13. Klaassen C, ed Cassaret and Doull’s Toxicology: The basic science of poisons, 6th ed. New York, McGraw-

Hill, 2001

17. Dorneanu Maria, Ştefănescu Eugenia, Rogut Odette. Chimie organica. Sinteze şi reacţii de recunoaştere, Ed.

Gr.T.Popa UMF Iaşi, 2002

43. * * * EPA (U.S. Environmental Protection Agency). Acute Exposure Guideline Levels (AEGLs). Methanol

Results (Proposed). AEGL Program, Office of Pollution, Prevention and Toxics, U.S. Environmental Protection

Agency, 2004

58. Some distilled fruit spirits contain, normally, high quantities of .62. Hui YN, Wai – Kit Nip, Nollet LML.

Food Biochemistry and Food Procesing. Blackwell Publissing, United States, 2006

62. Levy P, Hexdall A, Gordon P, Boeriu C, Heller M, Nelson L. Methanol Contamination of Romanian Home –

Distilled Alcohol. Journal of Toxicoloy, Clinical Toxicology, 2003; 41(1): 23-28

66. Stanciulescu G, Rusnac D, Bortos G. Tehnologia distilatelor alcoolice din fructe si vin. Editura Ceres,

Bucuresti, 1975

69. * * * Standard Profesional : STP 57-92/1992 elaborat de Intreprinderea Viei şi Vinului cu acordul

Ministerului Agriculturii şi Alimentatiei, 1992

70. * * * Regulamentul Nr. 110/2008 al Parlamentului European şi al Comisiei din 2008 privind definirea,

desemnarea, etichetarea si protectia indicatiilor geografice ale bauturilor spirtoase, 2008

141. Beliş V. Tratat de Medicina Legală, Ed. Medicală, Bucuresti, 1995; 2 (7): 138-155

142. Dermengiu D, Gorun G. Toxicologie Medico-Legală, Ed. Viata Medicala Romaneasca, Bucuresti, 2006;

146. Leikin & Paloucek’s. Poisoning & Toxicology Handbook 3rd Edition. Lexi Comp INC Hudson, Ohio, 2002;

600-602; 810-812

150. Richard C.Dart, MD, Ph.D(ed) Medical Toxicology Third Edition Lippincott Williams & Wilking, 2004;

1216

158. Graw M, Haffner HT, Althaus L, et al. Invasion and distribution of methanol. Arch Toxicol 2000; 74(6):

313-321

195. Wexier P, Anderson B D, Ann de Peyster, Gad SC, Hakinnen P J, Kamrin M A, Betty J Locey, Mehendale H

M, Pope C N, Shugart LR. Enciclopedia of Toxicology, Second Edition, Hardcover, 2005; 3: 56

200. Stegink LD, Filer LJ, Bell EF, et al. Effect of Repeated Ingestion of Aspartame-Sweetened Beverage on

Plasma Amino Acid, Blood Methanol, and Blood Formate Concentrations in Normal Adults. Metabolism, 1989;

38: 357-363

216. Charles JC, Heilman RL. Metabolic acidosis, Hospital Physician march, 2005; 37-42

217. Casaletto JJ. Differential diagnosis of metabolic acidosis, Emerg. Med.Clin. N. Am, 2005; 23: 771-787

237. Leakso O, Haapala M, Jaakkolo P, et al., FT-IR Breath Test in the Diagnosis and Control of Methanol

Intoxications, J Anal Toxicol, 2001; 25(1): 26-30

238. Watson WA, Litovitz TL, Rodgers GC, Klein-Schwartz W, Youniss J, Rose SR, Borys D, May ME. 2002

Annual Report of the American Association of Poison Control Centers Toxic Exposure Surveillance

System. American Journal of Emergency Medicine 2003; 21(5): 353-421

45

241. Bologa Cristina. Aspecte practice în abordarea acidozei metabolice de cauză toxică, Revista Medicală

Română, 2010; Vol. LVII, Nr. 2: 83-87

248. Vieriu Socaciu R. Teorie şi practică medico-legală în contextul legislaţiei actuale, Ed. Medicală Universitară

Iuliu Haţeganu Cluj Napoca, 2002;

249. Vaida H, Rusu A I, Zaharia Daniela, Moşoigo P, Florian Ş. Intoxicaţie colectivă cu alcool metilic în

penitenciarul Gherla în perioada iunie – august 1997. Rom. J. Med. Leg. 1997; 5(3): 229-233

276. Roe O. Species Differences in Methanol Poisoing, CRC Critical Reviews in Toxicology, 1982; 10(40): 275-

286

278. Vincent J, Marcovilivk, MD, Focep Peter T. Pous, MD, Focep.Emergency Medicine.Secret Questions and

Answers. Reveal the Secrets to Safe and Effective Emergency Medicine 3rd Edition Philadelphia USA, 2003;

363-607

304. * * * G4350-90020 7820 Gas Chromatograph Advanced User Guide, Agilent Technologies, USA, 2009

318. * * * Regulamentul CEE Nr. 2870/2000 Al Comisiei Europene din 19.12.2000 de stabilire a metodelor

comunitare de referinţă pentru analiza băuturilor alcoolice

323. Dorneanu V, Maria Stan. Metode Chimice şi intstrumentale de analiză, Ed. Gr. T. Popa UMF Iaşi, 2003; 23-

33; 438-445

329. Lazăr Doina, Lazăr M.I., Gaby Nutturez, Metode cromatografice si spectrale aplicate în controlul

medicamentului, Ed. „Terra Nostra” Iaşi 2000

333. Jung Adriana, Jung H, Auwarter V, Pollak S, Farr A M, Hecser L, Şchiopu A. Volatile congeners in

alcoholic beverages : analysis and forensic significance. Romanian Journal of Legal Medicine, 2010; Vol. XVIII

(4): 265 – 271

337. Ashley L. et ed., Determining volatile organic compounds in human blood from a large sample population

by using purge and trop gas chromatography/mass spectrometry, Anal. Chem., 1992; 64: 1201-1209

338. Streete J, et al. Gas Chromatographic separation of volatile substances by head-space capillary gas

chromatography to aid the diagnosis of acute poisoning Analyst, 1992; 117: 1111-1127

346. Şorodoc L, Lionte C, Rusalim Petriş O, Victoriţa Şorodoc. Toxicologie clinică de urgenţă. Intoxicaţii acute

nemedicamentoase, Ed. Junimea, Iaşi, 2009; 1: 19 – 35

349. Silverman J. Animal breeding and research protocols- the missing link Lab.Anim.N.Y. 2002; 19: 31

350. Stemek N.H. Role of the institutional animal care and use committee in te morning research, Ethics Behav.,

1997; 173

356. Ciudin Elena. Biologia animalelor de laborator, Editura ALFA, Iaşi, 2004; 109 – 158

358. * * * OG. 37/2002 Protecţia animalelor folosite în scopuri ştiinţifice sau în scopuri experimentale aprobată

cu L 471/2002

368. Scott P.W.R. - Gas chromatography detectors, Library For Science, LLC, 2003

369. * * * Agilent 5973N MSD Hardware Manual, Agilent Technologies, USA, 1999

372. Yuwono, M.; Indryanto, G. – Validation of Chromatographic method of analysis, Profiles of Drug

Substances, Excipients, and Related Methodology, Edited by Harry G. Brittain, Academic Press, Elsevier, 2005;

32: 243 – 262

373. Mei-Ling Wang, Jih-Terng Wang, Youk-Meng Choong. Simultaneous quantification of methanol and

ethanol alcoholic beverage using a rapid gas cromatographie method coupling with dual internal standard. Food

Chemistry, Aug. 2004; 86: 609-615

376. * * * U.S. Pharmacopeia Forum – Cromatographic Columns – Edition 2009-2010

381. Robert L, Grob PhD, Eugen F, Barry PhD. Modern Practice of Gas Cromatography 4 th Edition ISBN 978-

0-471-22983-4 June 2004

382. Roman L, Bojiţă M, Săndulescu R. Validarea metodelor de analiză şi control, Ed. Medicală, 1998

391. * * * Regulamentul Nr. 110/2008 al Parlamentului European şi al Comisiei din 2008 privind definirea,

desemnarea, etichetarea şi protecţia indicaţiilor geografice ale băuturilor spirtoase

46

LISTA CU LUCRĂRI ŞTIINŢIFICE PUBLICATE

1. Doina Moaleş, Şpac A F, Dorneanu V,

Elena Butnaru. Validation of a gas

cromatographic method for metanol determination. Farmacia, 2011, 1(59):

70 – 77.

2. Doina Moaleş, Şpac A F, Maria Prisecaru,

Elena Butnaru. The process and

validation of methanol determination from biological samples by means of a gas-

chromatographic method together with mass spectrometry. SCIENCIFIC STUDIES AND

RESEARCHES. Biology. Animal series. Editure “ALMA MATER “ Bacău, 2011, 21: 17 –

22.


Elena Butnaru. Determining the

concentration of methanol from natural distillate. SCIENCIFIC STUDIES AND

RESEARCHES. Biology. Animal series. Editure “ALMA MATER “ Bacău, Nov. 2010, 19 :

51 – 61.


Elena Butnaru. Determining the

concentration of alcohol from the natural distillates. SCIENCIFIC STUDIES AND

RESEARCHES. Biology. Animal series. Editure “ALMA MATER “ Bacău, Nov. 2010, 19 :

63 - 72.

5. Doina Moaleş, Elena Butnaru, Maria Prisecaru, Bădără

M. Statistical considerations

on lethal intoxication with methyl alcool from Bacău District during the period 1994 – 2007.

SCIENCIFIC STUDIES AND RESEARCHES. Biology. Animal series. Editure “ALMA

MATER “ Bacău, Nov. 2007, 13 : 28- 32.

47

CURRICULUM VITAE

Doctorand Biolog Specialist în Toxicologie Medico-Legală

Doina (Bejan) Moaleş

STUDII

2011 Doctorat fără frecvenţă în specialitatea Toxicologie: „Contribuţii la

cercetarea chimico-toxicologică a alcoolului metilic”

2006-2008 Masterat cu durata de doi ani „Protecţia şi Valorificarea Resurselor

Biologice”, Universitatea din Bacău, Facultatea de Ştiinţe, Biologie.

2001-2005 Facultatea de Ştiinţe, Secţia Biologie, Universitatea din Bacău.

1982-1987 Liceul Sanitar Bacău, clasa de Farmacie.

SPECIALIZĂRI PROFESIONALE

2009 – Biolog specialist – Toxicologie Medico – Legală

PREGĂTIRE POSTUNIVERSITARĂ

8-10 / 25-26 .

02. 2010

Curs de serologie –stagiu pregătire în vederea determinării grupei

sanguine la persoana vie şi la cadavru. Institutul de Medicină Legală Iaşi

24.03.2009

„Proiectarea hărţilor de control Levey – Jennings”, Asociaţia de Calitate

în Laboratoare „Calilab” , OBBCSSR

16.03.2009 „Asigurarea şi controlul calităţii în laboratoarele medicale”, Asociaţia de

Calitate în Laboratoare „Calilab” , OBBCSSR

7 - 9. 03. 2008 „Elemente de toxicologie clinică”, Universitatea de Medicină şi Farmacie

Iaşi

1 – 10. 02. 2008 „Expertiza Medico-Legală în decesele cauzate de consumul de droguri” ,

Universitatea de Medicină şi Farmacie Iaşi

17. 10. 2007 „Incertitudinea de măsurare în laboratoarele medicale”, Asociaţia de

Calitate în Laboratoare „Calilab” , OBBCSSR

13 – 15. 09.

2007

„Indicatori biotoxicologici în intoxicaţii profesionale”, Universitatea de

Medicină şi Farmacie Iaşi

1 – 13. 10. 2006 “Examenul Serologic Criminalistic al Corpurilor Delicte”, Universitatea de

Medicină şi Farmacie „Carol Davila” Bucureşti

21. 11. – 9.12.

2005

Curs practic de iniţiere în toxicologia medico-legală, Institutul de

Medicină Legală Iaşi

EXPERIENŢĂ PROFESIONALĂ

Perioadă Funcţia Locul de

muncă

Sarcini şi responsabilităţi

5.05.2009-

prezent

Biolog

specialist

Serviciul de

Medicină

Legală

Bacău

Determinarea şi dozarea toxicelor din sânge şi urină

la persoana vie, determinarea şi dozarea toxicelor

din sânge, urină şi organe la cadavru, determinarea

şi dozarea toxicelor din corpuri delicte. Examenul

serologic al grupelor de sânge la persoana vie şi

cadavru. Pregătirea şi gestionarea reactivilor şi

instrumentelor de laborator.

1.11. 2005-

4.50.2009

Biolog Serviciul de

Medicină

Legală

Bacău

Determinarea şi dozarea toxicelor din sânge şi urină

la persoana vie, determinarea şi dozarea toxicelor

din sânge, urină şi organe la cadavru, determinarea

şi dozarea toxicelor din corpuri delicte. Responsabil

cu gestionarea deşeurilor chimice şi biologice

periculoase.

48

PARTICIPAREA LA MANIFESTĂRI ŞTIINŢIFICE

26 –

28. 05.

2011

Congresul Naţional de Medicină Legală. Studiu privind concentraţia alcoolului

metilic din distilatele alcoolice naturale. Sesiune postere.

13 –

15. 05.

2011

„15th PanhellenicPharmaceutical Congress” Atena Grecia. Variations of metanol

concentration in natural distilates, determined through GC-MS. Sesiune postere.

16. 03.

2011

Seminar “Drogurile. Tendinţe, impacturi şi soluţii”. Universitatea “George Bacovia”

Bacău

18 –

20. 11.

2011

ECOLOGY AND PROTECTION OF ECOSYSTEMS THE 9 EDITION.

BIOLOGY AND SUSTAINABLE DEVELOPMENT INTERNATIONAL

SYMPOSIUM, Bacău. The determination of alcoholic content of distillates by gas

chromatography-mass spectrometry method. Sesiune postere.

9 – 12.

09.

2009

Simpozionul de Micologie din România, Iaşi

8- 11.

09.

2008

Simpozionul de Micologie din Romănia, Bacău

15. 05.

2008

Simpozionul „Biodiversitate şi Tinereţe” , Universitatea din Bacău, Facultatea de

Ştiinţe, Catedra de Biologie. Studiu retrospectiv privind intoxicaţiile letale cu

metanol în Judeţul Bacău. Articol prezentat.

20- 22.

05.

2008

Congresul Naţional de Medicină Legală. The lethal intoxication with methyl alcool

from Bacău district during the period 1994-2007. Articol prezentat.

11. 04.

2008

Simpozionul internaţional “Educaţie ecologică- educarea conştiinţelor”,

Inspectoratul Scolar al Judeţului Bacău. La limita dintre otravă şi medicament:

HELLEBORUS sp. Articol prezentat.

APARTENENŢA LA SOCIETĂŢI ŞTIINŢIFICE ŞI PROFESIONALE

Profesionale OBBCSSR

Ştiinţifice Societatea Micologică din România

ALTE MENŢIUNI

Lucrări publicate – 5 lucrari

Premii

15.05.2008 – Menţiune – pentru realizarea şi prezentarea lucrării ştiinţifice:

Studiu retrospectiv privind intoxicaţiile letale cu metanol în Judeţul Bacău. Simpozionul

„Biodiversitate şi Tinereţe”, Universitatea din Bacău, Facultatea de Ştiinţe, Catedra de

Biologie.

Documents

contribuţii la cercetarea chimico-toxicologică a alcoolului metilic