Tutor:

Katia Grillone Duarte Mendes Oliveira

Studenti:

Alessandra Valentino Carmelo Tomas Elena Vatrano

Francesca Conte Francesco Chiaravalloti

Università Magna Graecia di Catanzaro Progetto I love Research

CONSUMO DI CARNE E TUMORI: ANALISI DI POLIMORFISMI

GENETICI POTENZIALMENTE PREDISPONENTI

ALL’ INSORGENZA DEL CANCRO COLON-RETTALE

NELLA POPOLAZIONE CALABRESE.

CHE IMPATTO HA LA GENETICA SUL RISCHIO

IN CALABRIA?

RIASSUNTO DEL PROGETTO

La letteratura scientifica riporta diversi studi in cui si è individuata

una correlazione diretta tra l’ insorgenza di cancro colon rettale

(CCR) l’ assunzione di carne e il patrimonio genetico di varie

popolazioni. Il nostro progetto si focalizza sulla ricerca di

polimorfismi caratteristici della popolazione Italiana, a partire da

quella Calabrese sfruttando tecniche di sequenziamento di ultima

generazione che permettano di identificare eventuali alterazioni a

carico di geni quali CYP2E1, CYP1B1, NAT2, GSTM1, GSTT1,

ADIPOQ, SULT1A1, ODC1 potenzialmente predisponenti allo

sviluppo di cancro del colon. Seguirà la validazione funzionale

delle alterazioni individuate, qualora non descritte in letteratura, e

uno studio di correlazione tra i polimorfismi identificati, il

consumo di diversi tipi di carne (rossa trattata e/o nostrana, o

bianca) e l’ insorgenza di CCR in Calabria per stabilire se la

popolazione calabrese è più o meno predisposta geneticamente a

sviluppare CCR e di conseguenza per porre le basi per un sistema

di prevenzione basato sullo screening genetico.

INTRODUZIONE

Fig. 2: fattori predisponenti allo sviluppo di tumore. (Immagine adattata da sito web:http://www.carcinomaepatico.it)

Fig 1. sequenza adenoma-carcinoma. (Immagine adattata da sito web: http://www.mednemo.it)

Il cancro del colon-retto (CCR) è il terzo tipo di tumore maligno per incidenza e mortalità sia per gli uomini che per le donne nei Paesi Occidentali. E' dovuto alla proliferazione incontrollata delle cellule della mucosa colica che, a seguito dell' accumulo di mutazioni genetiche a danno del DNA, porta alla formazione di polipi che continuano a proliferare in senso maligno (Figura 1). Diversi fattori, quali etnia, stato di salute, nutrizione, età e costituzione genetica possono predisporre allo sviluppo del tumore (Fig. 2).

Tra i vari fattori di rischio la nutrizione rappresenta quello più studiato nel caso del tumore del colon. Benché la ricerca abbia fornito in merito risultati in parte contrastanti, si può affermare che una dieta ad alto contenuto di grassi animali e proteine (che provoca a sua volta il rilascio nell'intestino di grandi quantità di acidi biliari) è in grado di favorire la trasformazione maligna di eventuali polipi preesistenti. Inoltre molteplici studi hanno dimostrato che particolari polimorfismi, ovvero variazioni genetiche che presentano una prevalenza maggiore dell 1% in una popolazione, favoriscono l' insorgenza del CCR a parità di abitudini alimentari. (1)

È stato dimostrato che alterazioni a carico di enzimi coinvolti nel metabolismo di sostanze pre-cancerogene come gli idrocarburi aromatici policiclici (PHA) e le ammine eterocicliche (HCA), presenti nella carne eccessivamente cotta, sono associate ad un maggior rischio di sviluppare cancro colon-rettale (1-2). Tra questi enzimi sono da annoverare quelli di fase I appartenenti della famiglia del citocromo P450 (CYP), o quelli di fase II come la glutatione S-trasferasi (GST) e la UDP-glucuronosyltrasferasi (UGT) (3-5) (Fig.3). Tra i polimorfismi studiati si è concluso che alterazioni a carico di CYP2E1, CYP1B1, GSTM1

Fig. 3: alterazioni e cancro. (Immagine adattata dall’ articolo: Molecular

epidemiology, biomarkers and cancer prevention)

e UGT1A7, SULT1A1 (sulfotransferase), ODC1 (ornithine Decarboxylase1) influiscono significativamente sul rischio di contrarre tumore del colon consumando carne rossa, mentre per geni come la N-acetyltransferase 2 (NAT2) si sono pubblicati risultati contrastanti a seconda delle popolazioni oggetto di studio (6-11) Più di recente è stato inoltre dimostrato che sussiste una correlazione negativa tra il rischio di sviluppare CCR e la concentrazione serica di adiponectina, ovvero un ormone proteico secreto dal tessuto adiposo che modula alcuni processi metabolici come la regolazione del glucosio e il catabolismo degli acidi grassi (12-13). Polimorfismi come rs2241766 and rs1501299 del gene ADIPOQ (codificante l’ adiponectina) cambiano la concentrazione sierica di tale proteina e correlano con l’ insorgenza di CCR e il consumo di carne (14-17). L’interesse per la componente genetica della suscettibilità a malattie complesse sta dunque assumendo sempre più importanza nella medicina moderna, in quanto si sta mettendo in evidenza il ruolo di alcuni polimorfismi genetici relativamente comuni, ma che se associati tra loro e combinati con specifiche componenti ambientali, quali il consumo di carne, possono elevare notevolmente il rischio di sviluppare patologie diffuse nella società industriale inclusi i tumori.

OBIETTIVO DEL PROGETTO La letteratura scientifica offre diversi esempi in cui si è individuata una correlazione diretta tra l’ insorgenza di CCR, l’ assunzione di carne e il patrimonio genetico di popolazioni come quella Pakistana, Australiana, Afroamericana, Giapponese, Cinese (18-23); il nostro progetto si focalizza sulla ricerca di polimorfismi caratteristici della popolazione Italiana, a partire da quella Calabrese.

Il progetto si pone l’ obiettivo di:

individuare la presenza di eventuali polimorfismi genetici diffusi nella popolazione

calabrese a carico di geni noti per essere in qualche modo correlati all’ insorgenza del cancro colon-rettale. Le tecnologie di sequenziamento di ultima generazione (NGS), di cui dispone l’ ateneo, permetteranno di sequenziare in tempi e costi accessibili tutti gli esoni dei geni target selezionati per lo studio (CYP2E1, NAT2, GSTM1, GSTT1, ADIPOQ, CYP1B1, SULT1A1, ODC1) in modo da individuare non solo la presenza dei polimorfismi già noti, ma anche nuove alterazioni non ancora descritte in letteratura. La realizzazione del progetto, che prevede anche la validazione funzionale delle eventuali nuove mutazioni identificate, ha lo scopo di individuare i geni più frequentemente alterati nella popolazione calabrese e più fortemente correlati ad un maggior rischio di insorgenza del tumore del colon così da porre le basi per l’ introduzione di uno screening di tali geni in soggetti a rischio di sviluppare CCR (esempio a causa di familiarità, obesità, sedentarietà, o semplicemente età avanzata), proponendo delle metodiche di NGS che possano essere adattate alla pratica clinica. Uno screening di fattori genetici predisponenti al CCR permetterebbe di adottare misure di prevenzione quali per esempio la modulazione della dieta.

Effettuare uno studio di correlazione tra l’ insorgenza di CCR, la predisposizione

genetica e l’ assunzione di carne rossa (trattata e nostrana) o bianca con l’ obiettivo di valutare l’ impatto della genetica sul rischio confrontando 2 gruppi di individui (sani o affetti da CCR) che a parità di alimentazione sviluppano o meno tumore. Sarà rilevante acquisire questa informazioni soprattutto a seguito della decisione dell’ OMS di inserire la carne rossa tra i composti cancerogeni limitando però lo studio alla sola carne rossa e alla sola carne prodotta in USA. Uno dei nostri obbiettivi è quelli di capire se un maggior consumo di carne nostrana, quale quella calabrese, possa ridurre il rischio di sviluppare CCR rispetto a quello predetto dall’ OMS a seguito dell’ analisi condotta sulla carna trattata prodotta in USA che non tiene in considerazione vari fattori quali l’ ambiente degli allevamenti, la modalità di produzione della carne e la genetica delle popolazioni.

Validazione funzionale dei polimorfismi identificati

Studio di correlazione

ARTICOLAZIONE DEL PROGRAMMA DI RICERCA

Estrazione DNA da sangue periferico

Sequenziamento di geni target

Arruolamento dei pazienti da includere nello studio

Utilizzo di tecniche di sequenziamento di

ultima generazione per il rilevamento di

polimorfismi genetici potenzialmente

predisponenti all’ insorgenza di cancro colon-rettale nella popolazione Calabrese

Il progetto prevede di utilizzare tecniche di sequenziamento di ultima generazione per identificare eventuali polimorfismi genetici a carico di geni quali CYP2E1, NAT2, GSTM1, GSTT1, ADIPOQ, CYP1B1, SULT1A1, ODC1 potenzialmente predisponenti allo sviluppo di carcinoma colon-rettale. Le alterazioni individuate, qualora non descritte in letteratura, saranno validate funzionalmente mediante l’ utilizzo di modelli di studio in vivo. Sarà quindi effettuato uno studio di correlazione tra la predisposizione genetica, il consumo di diversi tipi di carne e l’ insorgenza del tumore colon-rettale. Lo studio si focalizzerà sulla popolazione calabrese, dove è alto il consumo di carne, soprattutto nostrana.

Arruolamento dei pazienti da includere nello studio

È previsto l’ arruolamento di 1000

soggetti suddivisi in 2 gruppi: 500 Individui Normali (non affetti da patologie tumorali)

500 Pazienti affetti da tumore colon-rettale

I 2 gruppi saranno normalizzati per età, sesso, BMI, stile di vita, status di fumatore. Per ciascuno dei 2 gruppi sarà operata una ulteriore suddivisione a seconda delle abitudini alimentari di ciascun individuo:

Scarso consumo

di carne

(<25gr/gg)

(200 soggetti per gruppo)

Medio-Alto

consumo di

carne

(50-100gr/gg)

(300 soggetti per gruppo)

Prevalentemente carne

rossa nostrana (100 soggetti per gruppo)

Prevalentemente carne

rossa trattata (100 soggetti per gruppo)

Prevalentemente carne

bianca (100 soggetti per gruppo)

Estrazione del DNA e Sequenziamento dei geni Target

È prevista: l’ estrazione del DNA dal sangue periferico degli

individui oggetto di studio e il successivo controllo di qualità dell’ integrità e la quantizzazione degli acidi nucleici estratti (Fig. 4.1-2)

La preparazione delle librerie dei geni da sequenziare seguita dal controllo di qualità.

(Fig. 4.3-4)

La preparazione dei campioni e il loro caricamento sul chip da sequenziare e il successivo sequenziamento.(Fig. 4.5-6)

L’ analisi bioinformatica dei risultati ottenuti. (Fig. 4.7)

Validazione funzionale dei polimorfismi rilevati e studio di correlazione

Sarà effettuato uno studio di correlazione tra lo sviluppo di tumore e il consumo di carne rossa (trattata e nostrana) o bianca e il background genetico degli individui oggetto di studio.

Saranno quindi selezionati per la

validazione funzionale eventuali polimorfismi non ancora descritti in letteratura e strettamente correlati allo sviluppo di CCR.

Gli studi in vivo saranno condotti su dei modelli murini APC [-/-] , in quanto costituiscono un modello ottimale per valutare l’ interazione geni-ambiente nell’ insorgenza di un CCR il cui evento mutazionale iniziante riproduce ciò che effettivamente si verifica nelle cellule staminali della mucosa colica nell’ uomo. Una volta generati i topi APC [-/-] esprimenti la mutazione da validare, essi saranno sottoposti a diverse diete, o trattati con composti carcinogeni specifici del CCR come le N-nitrosammine e le ammine eterocicliche. Sarà quindi valutata la formazione di masse tumorali o l’ alterazioni a carico delle cripte del colon a seconda dell’ espressione o del knockout dei polimorfismi oggetto di studio.

MATERIALI E METODI

ARRUOLAMENTO DEI SOGGETTI DELLO STUDIO

I soggetti dello studio saranno selezionati tra individui di diverse città della Calabria, che firmino il proprio consenso alla donazione di un campione di sangue venoso periferico a scopo di ricerca. Saranno arruolati 500 individui sani, possibilmente selezionati tra i donatori di sangue, e 500 pazienti affetti da carcinoma colon-rettale.

Ciascun individuo dovrà compilare un questionario che permetta di ricavare informazioni circa le abitudini alimentari, il BMI, lo stile di vita e lo status di fumatore così da poter normalizzare i 2 gruppi da sottoporre allo screening genetico.

A ciascun individuo oggetto di studio sarà richiesto di effettuare un prelievo di 2 ml di sangue venoso da cui estrarre il DNA da sequenziare. Il sangue sarà estratto dai linfociti mediante un kit Invitrogen che prevede l’ utilizzo di coloninne in grado di isolare selettivamente il DNA.

Sarà utilizzato lo strumento Agilent

Tape Sation per quantizzare in modo molto preciso il DNA e fornire indicazioni circa il livello di degradazione del materiale genetico estratto.

ESTRAZIONE DEL DNA E CONTROLLO DI QUALITA’

Il sequenziamento verrà realizzato mediante il sistema ion Torrent

PGM, di cui dispone l’ ateneo Università Magna Graecia di Catanzaro.

Le librerie genetiche saranno generate utilizzando il kit Ion

Ampliseq a partire da 10 ng di DNA genomico. Il protocollo prevede di amplificare le regioni dei geni target con un sistema di PCR multiple; la parziale digestione dei primer; il legame a dei barcode univoci delle regioni amplificate e infine il legame a degli adattatori che consentiranno di ancorare i frammenti del DNA da sequenziare ad un supporto solido (chip).

SEQUENZIAMENTO MEDIANTE TECNOLOGIE DI NUOVA GENERAZIONE

La piattaforma di sequenziamento di ultima generazione Ion Torrent che sarà utilizzata per la realizzazione del progetto offre la possibilità di disegnare il proprio pannello di studio in modo che vengano sintetizzati dei primer che amplifichino l’ intera porzione codificante dei geni target selezionati: CYP2E1, NAT2, GSTM1, GSTT1, ADIPOQ, CYP1B1, SULT1A1, ODC1.

MODELLI ANIMALI ADOTTATI PER LA VALIDAZIONE FUNZIONALE

Per la validazione funzionale dei polimorfismi identificati saranno generati dei topi knock-in, ovvero saranno isolate le cellule staminali embrionali murine e vi sarà inserito il DNA contenente il gene di interesse precedentemente modificato in modo da presentare l’ alterazione nucleotidica specifica identificata nei pazienti.

I topi saranno quindi sottoposti a diverse diete o trattati con componenti specifici della carne rossa-bianca o trattata, come per esempio con N-nitrosammine o le ammine eterocicliche. Lo studio sarà effettuato su modelli murini APC [-/-]. 2 mesi dopo i trattamenti sarà valutata l’ eventuale insorgenza di tumore o l’ alterazione della mucosa colica a seguito dei diversi stress ambientali in modo diverso a seconda della genetica dei modelli murini ingegnerizzati.

Si introdurranno le cellule staminali così modificate nell'embrione di topo, che verrà impiantato in una femmina. Tre settimane più tardi nasceranno i topolini chimerici, che saranno incrociati per ottenere un modello murino esprimente le varianti oggetto di studio.

Costrutto veicolante il DNA mutato di interesse

ANALISI STATISTICA

Sarà utilizzato il software EpiData 3.1 per inserire i dati raccolti, e il software SPSS 18.0 per effettuare l’ analisi. La differenze nella frequenza di distribuzione delle caratteristiche demografiche generali, il genotipo e gli alleli tra gli pazienti oggetto di studio rispetto ai controlli, così come il test di equilibrio di Hardy-Weinberg, saranno calcolare mediante il test del X2.

Per definire il rapporto causa-effetto tra l’ assunzione di carne rossa trattata o non trattata e carne bianca e l’ insorgenza di CCR a seconda del genotipo degli individui oggetto di studio sarà calcolato l’ ODDS RATIO. Mentre sarà applicato un modello di regressione logistica multivariata per ottenere diversi OR per tenere in considerazione le variabili dello studio quali BMI, stile di vita, status di fumatore.

OUTPUT DEL PROGRAMMA

L’ incrementato consumo di carne, tipico dei paesi occidentali, è stato significativamente associato all’ aumentato rischio di cancro colon-rettale. L’ identificazione di polimorfismi in geni chiave può aumentare notevolmente questo rischio. Ci aspettiamo di individuare polimorfismi caratteristici della popolazione calabrese per determinare se in questa regione, i fattori genetici possono interagire con le cause ambientali (quali per esempio allevamento degli animali in zone più o meno controllate e con diete degli animali più o meno controllate, prevalente consumo di carne nostrana piuttosto che trattata o di esportazione.) aumentando il rischio di CCR. A seguito dello studio di correlazione, ci aspettiamo di validare funzionalmente nuovi polimorfismi in modelli murini che meglio rappresentano la complessità di un sistema biologico e riproducono caratteristiche simili a quelle riscontrate nell’ uomo. L’ identificazione di nuove alterazioni validate, e la conferma di quelle già descritte in letteratura come associate al CCR in altre etnie, può porre le basi per futuri screening utili per la prevenzione, ma anche per la diagnosi e il follow up della popolazione. Qualora il nostro progetto fornisse risultati chiari circa l’ impatto della genetica sul rischio, si potrebbe pensare di estendere lo studio, per la prima volta, al resto dell’ Italia.

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