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Considerazione strategiche
2. Scelta del sistema cellulare
3. Scelta della tecnica di transfezione
4. Metodo di selezione delle cellule transfettate
1. Scelta del vettore
2. Scelta del sistema cellulare
2. Efficienza di transfezione
3. Modificazioni post-traduzionali
4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica
5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)
1. Facilità di coltura e stabilità
Considerazione strategiche
2. Scelta del sistema cellulare
3. Scelta della tecnica di transfezione
4. Metodo di selezione delle cellule transfettate
1. Scelta del vettore
3. Scelta della tecnica di transfezione
Microiniezione
Adsorbimento mediante DEAE-Destrano
Coprecipitazione con calcio fosfato
Lipofezione
Elettroporazione
Infezione con vettori virali
Microiniezione
Elevata efficienza (iniezione diretta nel nucleo)
Impossibile applicazione su larga scala
Grande manualità dell’operatoreApplicazioni particolari (topi transgenici, espressione di mRNA in cellule di Xenopus laevis)
Microiniezione
Adsorbimento mediante DEAE-Destrano
Formazione di aggregati di DNA (-) e DEAE-destrano (+)
Deposizione sulla membrana cellulare
Internalizzazione per endocitosi
Scarsa efficienza
Elevata degradazione del DNA, scarsa penetrazione nel nucleoUtilizzato in cellule con elevata attività endocitotica
DNA-DEAE Destrano-TBS
Coprecipitazione con calcio fosfato
La coprecipitazione di aggregati calcio fosfato-
DNA sulla superficie cellulare favorisce
l’internalizzazione dell’acido nucleico
Buona efficienza (5-40%)
Semplice esecuzionePiuttosto riproducibile
Tossicità cellulare
DNA+CaCl2 HEPES
Coprecipitazione
Lipofezione
Trasferimento di DNA mediato da liposomi
In particolari condizioni è possibile ottenere liposomi contenenti DNA
La struttura del doppio strato fosfolipidico facilita la fusione con la membrana cellulare ed il rilascio del DNA nel citosol
Buona efficienza Scarsa citotossicità
Riproducibilità
DNADNA
Lipofezione con reagenti lipidici neutri
I liposomi sono delle sfere di membrane sintetiche che
possono essere riempite con DNA. Esse fondono
spontaneamente con le membrane cellulari rilasciando il loro contenuto nel citoplasma.
Sono disponibile commercialmente dei kit per la
semplice preparazione dei liposomi.
Lipofezione con reagenti lipidici cationici
Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli (100-400nm) liposomi unilamellari. La superficie
carica positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente “incapsulato” nel liposoma ma piuttosto
legato alle sue superfici.
Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi.
L’internalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi.LIPOFECTAMINETM
OLIGOFECTAMINETM
CELLFECTINTM
Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati
Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici, possiedono un’architettura sferica, che si ramifica
radialmente da un core centrale e termina con gruppi amminici ionizzati.
Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte ottimizzando l’internalizzazione del DNA nella cellula.
Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di segno positivo, che favorisce il legame a recettori con carica negativa (ex. Glicoproteine sialilate). Una volta all’interno della cellula, il reagente tampona il pH del
lisosoma riducendo la degradazione del vettore.
Elettroporazione
Un campo elettrico altera la permeabilità di membrana e permette l’ingresso al DNA.
Non c’è endocitosi
Minore esposizione alle
nucleasi
Buona efficienza
Elevata citotossicità
Adatto a cellule con membrane particolarmente resistentiAdatta a cellule in sospensione
Elettroporazione
Le cellule vengono concentrate, miscelate con il DNA da
transfettare e collocate in una cella collegata a degli elettrodi. Un breve impulso elettrico apre
in maniera reversibile dei “buchi” nelle membrane
cellulari. Il DNA entra nelle cellule che vengono piastrate in
terreno fresco.
Infezione con vettori virali
I virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA nelle cellule in maniera efficiente e specifica
Infezione Iniezione del DNA Replicazione
Sintesi del capsideAssemblaggio
Lisi
Il genoma virale deve essere modificato
Inserimento del gene di interesse
Eliminazione dei “late genes”, codificanti per il capside, in modo da evitare la lisi della cellula infettata
Per la produzione del vettore virale si rendono necessarie coinfezioni con i virus “helper” oppure “packaging cell lines”.
Packaging cell lines
Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del
capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.
La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del
costrutto nel virione.
Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.
Vettori virali
SV40. Il primo. Genoma piccolo ed instabile, solo per cellule di scimmia
Retrovirus. Genoma ad RNA. Integrazione del vettore. Alta efficienza e capacità.
Terapia genica
Baculovirus. Virus degli insetti. Porta all’espressione ed accumulo di grandi
quantità di proteine.
Mutanti virali. Ex. Virus vaccinico iperesprimente la RNA pol T7.
Considerazione strategiche
2. Scelta del sistema cellulare
3. Scelta della tecnica di transfezione
4. Metodo di selezione delle cellule transfettate
1. Scelta del vettore
Transfezioni stabili o transienti
Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si
integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi
Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza
di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura.
La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle
cellule transfettate
Transfezione stabile
Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle
cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le
cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo
perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di
selezione.
Marcatori di selezione per cellule di mammifero
Tk fosforila la timidina
Aminopterina (Inibisce sintesi
timidina-P)
Timidina chinasi (Tk)
XGPRT sintetizza GMPAcido micofenolico(Inibisce sintesi GMP)
Xantina-guanina fosforibosil
transferasi (XGPRT)
Inattiva Xyl-A9--D-furanosil (Xyl-A) (danneggia
DNA)
Adenosina deaminasi (ADA)
HPH inattiva igromicina
Igromicina B (Inibitore sintesi
proteica)
Igromicina fosfotransferasi (HPH)
Variante resistente DHFR
Metotrexate (Inibisce DHFR)
Diidrofolato reduttasi (DHFR)
APH inattiva G418G418 (Inibitore sintesi proteica)
Aminoglicoside fosfotransferasi (APH)
MECCANISMOFARMACOENZIMA
Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è
praticabile
Timidino chinasi
Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio”
L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio
5-fosforibosil-1-pirofosfato
Uridina monofostato
Inosina monofostat
o
Timidina monofostato
AMINOPTERINA
Guanina monofostato
Adenina monofostato
IpoxantinaTimidina
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
RICERCA DI BASE
APPLICAZIONI INDUSTRIALI
Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci
Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans
Analisi struttura funzione delle proteine eucariote
Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)
Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)
Structure of TFMPV-E2/ER ligand-binding domain. (A) The structure of one monomer of ER is shown as a ribbon diagram, with the bound GRIP1 coactivator peptide coloured red. The compound is shown in a stick representation, with carbon atoms coloured green, oxygen atoms coloured red and fluorine atoms coloured pink. (B) A stereo view of part of the ligand-binding pocket bound to oestradiol (top panels; Protein Data Bank code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels). The ligands are coloured green and are shown in a stick representation. (C) TFMPV-E2 is shown in a 2F o–F c electron density map, contoured to 1.5 . ER , oestrogen receptor ; GRIP, glutamate receptor interacting protein; TFMPV-E2, trifluoromethyl-substituted phenylvinyl oestradiol compound
Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
RICERCA DI BASE
APPLICAZIONI INDUSTRIALI
Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci
Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans
Analisi struttura funzione delle proteine eucariote
Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)
L’esempio della identificazione di Nip-2 e protimosina
01234567
c nip 0.5 nip 1.5 nip 2.5Ce
ll d
ea
th (
de
ad
ce
lls
/dis
h)x
1
0 2
16 h 24h 48h
0
5
10
15
20
0 1 4 16 24 48
nip
2 m
RN
A
Hours after Locke
bnip-2 expression associates to cell death
• Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2• mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domani fail to cause apoptosis
Meda et al. 2001
CTRL
BNIP2
BNIP2CTRL
100
75
50
25
BNIP2CTRL
200
150
100
50
CTRL
BNIP2
%su
rviv
al%
pro
lifer
atio
n
0
0
TRANSFECTION OF bnip2 cDNA IN MCF-7 CELLS
Meda et al. 2001
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
RICERCA DI BASE
APPLICAZIONI INDUSTRIALI
Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci
Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans
Analisi struttura funzione delle proteine eucariote
Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)
Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk del virus Herpes Simplex
+1
-20-40-60-80-100
GC CCAAT GC TATA
++
++----
Generazione di mutanti
Trascrizione in oociti di Xenopus laevis
+ + + +- - - -
Analisi di Northern
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
RICERCA DI BASE
APPLICAZIONI INDUSTRIALI
Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci
Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans
Analisi struttura funzione delle proteine eucariote
Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)
Lo studio della regolazione dell’espressione genica. I sistemi reporter
Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione.
Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con l’espressione del gene reporter.
Questo principio può essere esteso agli animali transgenici
X
Y
Gene reporterPromotore
Elementi di regolazione cis
Z
Elementi di regolazione trans
Proteina facilmente dosabile
I geni reporter
Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione
(non è una reazione enzimatica)
Monomerico, non richiede substrato, assente nei
mammiferi, varianti con diversa di fluorescenza.
Green fluorescent
protein (GFP, varianti RFP,
BFP)
Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari.
Proteina di secrezione, saggio colorimetrico
molto sensibile.
Fosfatasi alcalina (Umana)
Richiede l’aggiunta di cofattore, O2, ATP.
Alta attività specifica, mancanza di attività
endogena (basso background)
Luciferasi (Lucciola)
Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima
tetramerico (risposta non lineare)
Ben caratterizzata, stabile, rilevazione
automatizzabile
B-Galattosidasi (Batterica)
SVANTAGGIVANTAGGIGENE
Screening di molecole farmacologicamente attive.
ER cDNA
ERE LUC Potenziali ligandi
CTR CTRE2LU
C
Un
its
LUC
ERER
Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine
fluorescenti (GFP e BFP).
Citosol BFP
Golgi GFP
High-throughput Screening (1)
La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad “alto flusso”.
Library di molecole
Saggio biologico automatizzabile
Piattaforma Robotizzata
Elaborazione digitale dei
dati
High-throughput Screening (2)
1990. 20 ricercatori
1.5 milioni di molecole/anno
Oggi. 4 ricercatori
2.5 milioni di molecole/anno
I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della
SPECIFICITA’ della sostanza testata.
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
RICERCA DI BASE
APPLICAZIONI INDUSTRIALI
Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci
Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans
Analisi struttura funzione delle proteine eucariote
Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)
Produzione di biofarmaci
La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-
traduzionali
L’utilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici
strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi
più elevati.
Difficoltà nella produzione di biofarmaciIstituzione di Master cell banks caratterizzate in
dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene.
Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamente nell’impianto pilota
Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks.Controllo delle condizioni di produzione
Recupero e produzione
Caratterizzazione del prodottoCONTROLLO
QUALITA’
Controllo di qualità di proteine terapeutiche
Spettrometria di massa
Presenza di DNA cellulare
Presenza pirogeni
Presenza di proteine cellulari
Presenza di proteine seriche
HPLC
SDS PAGE/Western
Determinazione dello stato di purezza
Composizione in acido sialico
Composizione in carboidrati
Sequenziamento N-terminale
Mappa peptidica
HPLC
Isoelectrofocusing
SDS PAGE Western
Saggio immunologico
Saggio biologico
Caratterizzazione della proteina
TPA ricombinante
Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero
Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary)
Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini
Assenza di attività tossica per l’uomo
Stabile integrazione di geni eterologhi
Crescita in sospensione o monostrato
Modificazioni post-traduzionali corrette
Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio
BHK (Baby Hamster Kidney
cells)
Fattore VIICHOGlucocerebrosidasiCHOEritropoietinaCHOInterferone betaCHOFSHE.ColiG-CSFE.ColiIL-2E.ColihGHE.ColiInterferone alfaE.ColiInsulina
E.Coli, CHOTPA