COMPARACION DE TRES TECNICAS DE PRESERVACION POR

COMPARACION DE TRES TECNICAS DE PRESERVACION POR

CONGELACIÓN A –20ºC PARA EL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS

GRAMPOSITIVAS Y GRAMNEGATIVAS

GILMA JANNETH CANARIA PULIDO DIANA ROCIO MARTINEZ CIFUENTES

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

para optar al título de

BACTERIOLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGIA Bogotá D.C

7 de noviembre del 2000

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución Nº13 de julio de 1946: “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus tesis de grado”.





__________________________ _________________________ MARCELA GOMEZ HUGO DIEZ DIRECTORA CODIRECTOR

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGIA Bogotá D.C

7 de noviembre del 2000


CONGELACION A –20ºC PARA EL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS



_____________________________ CARLOS CORREDOR PhD Decano académico facultad de ciencias

______________________________ AURA ROSA MANASCERO Directora de las carrera de bacteriología

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BACTERIOLOGIA

Bogotá D.C 7 de noviembre del 2000

DEDICATORIA

A DIOS POR PERMITIRNOS LOGRAR CADA META PROPUESTA

Y COLABORARNOS EN TODOS LOS ASPECTOS DE NUESTRAS

VIDAS.

A NUESTROS PADRES POR APOYARNOS EN TODOS LOS

MOMENTOS.

A LOS AMIGOS QUE CON GRAN ALEGRIA NOS HAN

ALENTADO A LO LARGO DE LA CARRERA.

A MARCELA GOMEZ Y HUGO DIEZ POR SU FORMACION Y

AYUDA EN EL CICLO PROFESIONAL Y DURANTE ESTE

TRABAJO DE GRADO.

A NOSOTRAS MISMAS POR HACERNOS VER QUE NO EXISTEN

METAS INALCANZABLES CUANDO SE CUENTA CON

VERDADEROS AMIGOS Y LA AYUDA DE DIOS.

TABLA DE CONTENIDO

OBJETIVOS ¡Error! Marcador no definido.

INTRODUCCION 2

JUSTIFICACION 3

1. MARCO TEORICO 4

1.1 Preservación 4

1.1.1 Métodos de preservación a largo plazo 8

1.1.1.1 Liofilización 8

1.1.1.2 Ultracongelación 12

1.1.1.3 Mantenimiento sobre perlas de vidrio 12

1.1.2 Métodos de preservación a corto plazo 13

1.1.2.1 Subcultivo 13

1.1.2.2 Inmersión en aceite mineral 14

1.1.2.3 Desecación 15

1.1.2.3.1 Desecación en tiras o discos de papel 15

1.1.2.3.2 Desecación en discos de gelatina 15

1.1.2.3.3 Desecación con silica gel 16

1.1.2.3.4 Desecación en vidrio poroso y perlas de porcelana 16

1.1.2.4 Congelación 17

1.1.2.4.1 Congelación ordinaria 18

1.1.2.4.2 Congelación profunda 18

1.2 Generalidades de las cepas bacterianas en estudio 19

1.2.1 Bacterias grampositivas 19

1.2.2 Bacterias gramnegativas 20

1.2.3 Bacilos esporulados 21

2. MATERIALES Y METODOS 24

2.1 Tipo de estudio 24

2.2 Variables 24

2.3 Bacterias evaluadas 24

2.4 Hipótesis 25

2.5 Congelación a -20ºC en leche descremada al 10% 25

2.6 Congelación a -20ºC en caldo triptona soya con adición de glicerol al 3% 26

2.7 Congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica gel en dicos de gelatina 26

2.8 Recuperación de la cepa 27

2.9 Pureza 28

2.10 Análisis de resultados 28

3. Resultados 29

3.1 Identificación de cepas 29

3.2 Viabilidad bacteriana posterior a cada técnica de mantenimiento 32

3.2.1 Conservación en leche descremada al 10% 32

3.2.2 Conservación en caldo triptona soya con adición de glicerol al 3% 34

3.2.3 Corservación por congelación posterior a la desecación con silica gel sobre discos de gelatina 35

3.3 Evaluación de cada técnica de mantenimiento en los gruposde bacterias evaluadas 37

3.4 Porcentajes de mortalidad obtenidos en cada método de preservación por cepa estudiada 38

3.5 Análisis estadístico 39

4. DISCUSIÓN 40

5. CONCLUSIONES 44

6. RECOMENDACIONES 45

BIBLIOGRAFIA 46

ANEXOS

INDICE DE TABLAS

pág

TABLA 1 EXPECTATIVA DE VIDA DE 33 GENEROS BACTERIANOS PRESERVADOS POR DIFERENTES METODOS DE CONSERVACIÓN 9 TABLA 2 METODOS DE PRESERVACION PARA DIFERENTES GENEROS BACTERIANOS 11 TABLA 3 RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS 29 TABLA 4 RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS 30 TABLA 5 RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS 31 TABLA 6 VALORES SIGNIFICATIVOS OBTENIDOS EN EL ANALISIS ESTADISTICO POR EL TEST DE ESFERICIDAD DE BARTLETT’S 39

INDICE DE FIGURAS

pág FIGURA 1 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE

BACILOS GRAMNEGATIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN

LA TÉCNICA DE CONGELACIÓN A –20ºC EN LECHE DESCREMADA AL 10% (P/V).

32

FIGURA 2 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE

COCOS GRAMPOSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA

TÉCNICA DE CONGELACIÓN A –20ºC EN LECHE DESCREMADA AL 10% (P/V).

33


BACILOS GRAMPOSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA

TÉCNICA DE CONGELACIÓN A –20ºC EN LECHE DESCREMADA AL 10% (P/V).

33



LA TÉCNICA DE CONGELACIÓN A –20ºC EN CALDO TRIPTONA SOYA CON

ADICIÓN DE GLICEROL AL 3%. 34


COCOS GRAM POSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA

TÉCNICA DE CONGELACIÓN A-20ºC EN CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN

DE GLICEROL AL 3%. 34



TÉCNICA DE CONGELACIÓN A -20ºC EN CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN

DE GLICEROL AL 3%. 35



LA TÉCNICA DE CONGELACIÓN A -20ºC POSTERIOR A LA DESECACIÓN CON

SILICA GEL EN DISCOS DE GELATINA. 35


COCOS GRAMPOSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA

TÉCNICA DE CONGELACIÓN A -20ºC POSTERIOR A LA DESECACIÓN CON SILICA

GEL EN DISCOS DE GELATINA. 36



TÉCNICA DE CONGELACIÓN A -20ºC POSTERIOR A LA DESECACIÓN CON SILICA

GEL EN DISCOS DE GELATINA. 36

FIGURA 10 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS EN LOS GRUPOS

DE ESTUDIO MEDIANTE CONGELACIÓN A –20ºC CON LECHE DESCREMADA AL

10% (P/V). 37


DE ESTUDIO, MEDIANTE CONGELACIÓN A –20ºC EN CALDO TRIPTONA SOYA

CON ADICIÓN DE GLICEROL AL 3%. 37


DE ESTUDIO MEDIANTE CONGELACIÓN A –20ºC POSTERIOR A LA DESECACIÓN

CON SILICA GEL EN DISCOS DE GELATINA. 38

FIGURA 13 PORCENTAJES DE MORTALIDAD FINALES EN CADA

MICROORGANISMO, DEACUERDO AL SISTEMA DE CONSERVACIÓN

EMPLEADO. 38




OBJETIVO GENERAL

Comparar las técnicas de preservación, para así determinar el método de

mantenimiento más adecuado en las especies Staphylococcus aureus, St epidermidis,

St. saprophyticus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Enterococcus

faecium y Listeria monocitogenes, Salmonella spp, Shigella spp, Escherichia coli,

Bacillus subtilis y Bacillus cereus.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Aplicar tres métodos de conservación: : Desecación de discos de gelatina

sobre silica gel, congelación en leche descremada y congelación en medio

triptona soya con adición del crioprotector glicerol en las cepas bacterianas.

• Evaluar la viabilidad bacteriana antes y después del empleo de cada técnica.

• Establecer la técnica de preservación más apropiada para cada cepa bacteriana

estudiada.

• Confrontar las tres técnicas de mantenimiento y determinar el mejor sistema

en los grupos bacterianos

RESUMEN

Los microorganismos cuentan con amplia variedad de aplicaciones, entre ellas la

investigación, la educación y control de calidad en industrias y laboratorios; por tal

motivo, es necesaria la implementación de técnicas adecuadas para la preservación de

estos; para lo cual cada laboratorio debe estandarizar sus técnicas de preservación de

acuerdo a sus necesidades y recursos.

En el presente estudio se evaluaron y compararon las siguientes técnicas de

preservación por congelación a –20ºC: en leche descremada al 10%, en medio

triptona soya con adición de glicerol al 3% y posterior a la desecación con silica gel

en discos de gelatina; aplicadas a bacterias representativas de los grupos

grampositivos y gramnegativos, evaluando viabilidad y pureza posteriores a la

congelación, a intervalos de 3 días, 1,2,3 y 4 semanas.

Los microorganismos grampositivos y gramnegativos se recuperaron viables y puros,

a todos los períodos evaluados en cada técnica de conservación; aunque la

concentración de bacterias recuperadas decreció en todas las cepas de ensayo a

medida que aumentaba el tiempo de preservación; se observo la mayor recuperación

en el grupo de cocos grampositivos por los tres métodos de preservación; finalmente

se obtuvieron grandes porcentajes de mortalidad en B. subtillis (67%) por silica gel y

en Salmonella spp un 48.5% independientemente del sistema usado.

Al comparar los tres sistemas de mantenimiento se estableció que los

microorganismos mejor preservados de acuerdo a cada técnica son: Shigella spp, St.

aureus y B. subtillis por el método de congelación a –20ºC en leche descremada al

10%; E. coli, St. saprophyticus, E. faecalis, Listeria monocytogenes y Bacillus cereus

en la técnica de congelación a –20ºC en caldo triptona soya con adición de glicerol al

3%; por último Salmonella spp, St. epidermidis, St mutans, y E. faecium en la técnica

de congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica gel en discos de gelatina.

INTRODUCCION

Algunos avances de la industria y la investigación en microbiología dependen del

mantenimiento de microorganismos para proveer cultivos bacterianos puros, viables y

estables haciendo necesaria la preservación de cepas bacterianas como una gran

prioridad (Kirsop and Snell, 1984). El objetivo primario de la preservación de los

cultivos es mantener el microorganismo vivo, libre de contaminación y sin variación

o mutación en su ADN (Gerhardt, 1994); ya que los cultivos microbianos son

extremadamente vulnerables a la contaminación, cambios ocasionados por su hábitat

o muerte por lo cual es de gran importancia la adopción de técnicas apropiadas para

mantener los microorganismos de acuerdo al período de tiempo requerido, costos, y

recursos de cada laboratorio. Se han empleado diferentes métodos para preservación

de bacterias, como congelación a -20°C, -70°C y –80°C, subcultivo, liofilización,

inmersión en aceite mineral y desecación (Gerhardt, 1994); produciendo resultados

variados dependiendo de las especies bacterianas, por lo cual es aconsejable que cada

laboratorio evalúe la mayor cantidad de técnicas de preservación para así al momento

de escoger una de ellas, sea la que más se ajuste a sus necesidades teniendo en cuenta

el balance de ventajas y desventajas de la misma. Además la preservación de un

cultivo también depende de variables propias de cada cepa del laboratorio como el

tiempo transcurrido desde la adquisición del cultivo, las especies y las condiciones de

almacenamiento (Tsvetkowt et al, 1983).

El mantenimiento de las cepas bacterianas en el laboratorio de Microbiología

Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana se lleva a cabo con fines

pedagógicos y científicos, por lo cual en este trabajo se evaluaron tres técnicas de

congelación a –20ºC en la preservación de cultivos a corto plazo; en leche

descremada al 10%, en medio triptona soya con adición de glicerol al 3% y por

último posterior a la desecación con silica gel en discos de gelatina, para así

determinar el método de preservación más adecuado en las especies más

representativas de los grupos evaluados.

JUSTIFICACION

Muchos laboratorios bacteriológicos mantienen cultivos de stock o colecciones

bacterianas de referencia con múltiples propósitos; entre ellos investigación,

bioensayos, industria y educación (Gibson, et al 1986); los métodos para el

mantenimiento de dichos cultivos, se dividen básicamente en dos categorías: Métodos

a corto plazo, como subcultivo, inmersión en aceite mineral, congelación y

desecación; y métodos a largo plazo, entre los que se encuentran, la liofilización,

ultracongelación, criofijación y deshidratación (Gherna, 1994). El propósito de la

preservación de cultivos es mantener microorganismos, viables, libres de

contaminación y sin mutaciones ni variación de sus características, por lo cuál es

importante la estandarización y evaluación de cada método por el laboratorio,

deacuerdo a los equipos, cepas y reactivos con que se cuente, para así lograr

seleccionar la técnica mas apropiada que mantenga el mayor número de especies de

varios de microorganismos incluyendo los de más relevancia en cada área de trabajo.

Debido al déficit de estudios sobre preservación bacteriana en Colombia y

observando que en el Laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia

Universidad Javeriana, solo se ha implementado el mantenimiento de cepas por el

método de subcultivos, el cual posee varias desventajas como el alto riesgo de

contaminación, pérdida de la cepa original y mutaciones; debido a la propensión de

estos cultivos a perder la estabilidad de sus caracteres creando un mutante que puede

seguir siendo seleccionado para subcultivos posteriores; se propuso evaluar en este

laboratorio tres técnicas de preservación por congelacion a –20ºC a corto plazo para

la preservación: la primera en leche descremada al 10%, la segunda en medio triptona

soya con adición del glicerol al 3% y por último, posterior a la desecación con silica

gel en discos de gelatina; para así determinar el método de preservación más

adecuado en las especies más representativas en los grupos de bacterias grampositivas

y gramnegativas estudiados. Estas técnicas al ser empleadas han arrojado excelentes

resultados en estudios anteriores en otros países (CECIL, P et al, 1955), (GRIVELL,

Et al, 1969).

1. MARCO TEORICO

Muchos laboratorios de bacteriología mantienen un stock de cultivo bacterianos, para

educación, investigaciones, bioensayos, o industria, por medio de diferentes sistemas

de preservación; con diversos resultados entre géneros y entre las mismas especies

bacterianas. La preservación de cultivos es extremadamente importante y debe

dársele la misma atención que a la estandarización de equipos y la selección de

compuestos químicos, ya que numerosos estudios en biología molecular, bioquímica

y genética, han sido estropeados por la pérdida o variación del stock de cultivos como

resultado de una preservación inadecuada (Gerhardt, 1994). Distintos autores han

empleado métodos de preservación en bacterias grampositivas y gramnegativas como

congelación -20ºC, -70ºC y –80ºC, subcultivos en medios apropiados dependiendo

del microorganismo, desecación y liofilización (Juven, 1979; Kirsop and Snell, 1984;

Demain and Solomon, 1986; Gibson and Khoury, 1986; Mills and Gherna, 1988;

Myonsun et al, 1991; Gerhardt, 1994; Lou and Youses, 1999).

1.1 PRESERVACION

El objetivo de la preservación de cultivos es mantener al organismo viable no

contaminado, sin variación o mutación en su ADN, conservando características

biológicas y sus propiedades morfológicas y bioquímicas; esto significa poseer las

condiciones adecuadas para que el microorganismo aislado sea igual al original. Se

han empleado muchos métodos de preservación pero no todas las especies responden

de manera similar, de hecho algunas cepas de la misma especie, responden diferente

frente al mismo procedimiento; es así como la preservación de un cultivo depende del

medio que se emplea, la técnica, la antigüedad de la cepa, la concentración del

inoculo y el tiempo de preservación (Villalobos, 1995; Gibson and Khoury, 1986;

Tsvetkov and Brankova, 1982). Por tal motivo todos los microorganismos utilizados

rutinariamente en el laboratorio deben ser conservados por la mejor técnica posible.

La información de métodos de preservación es limitada en la literatura y a menudo no

esta disponib le, ya que no existe un protocolo universal para todas las bacterias, sin

embargo algunos procedimientos usados en otros sistemas biológicos como células

eucariotas resultan aplicables. Todas las técnicas tienen ventajas y desventajas y la

elegida para un uso particular debe ser determinada por la relación de características

de cada método de acuerdo a las necesidades de su uso en el laboratorio (Kirsop et al,

1984).

Las características a ser consideradas cuando se elige una técnica de preservación

son:

♦ Mantenimiento de la viabilidad

La muerte celular puede ocurrir durante el proceso de preservación y puede aumentar

durante el almacenamiento, por causas como la contaminación, inestabilidad de los

caracteres bacterianos por mutaciones, o daño celular por la formación de cristales en

la preservación por congelación; resultando eventualmente en un bajo nivel de

viabilidad inaceptable. Para mantener la viabilidad de los cultivos, el método a

escoger debe minimizar la perdida de esta durante el procesamiento y

almacenamiento ya que una vez preservado el cultivo debe sobrevivir por largos

periodos (Kirsop et al, 1984).

♦ Cambio de población a través de selección

Una proporción de células en una población puede morir durante el proceso inicial de

preservación y este puede parecer poco significativo al usar altas concentraciones

celulares iniciales. Sin embargo la reducción en el número de células viables puede

resultar en selección de poblaciones resistentes de células sobrevivientes (mutantes) e

introducir la posibilidad de un cambio en las características del cultivo preservado.

Los sistemas de preservación deben tratar de recuperar el mayor numero de células

vivas para que las poblaciones sobrevivientes sean lo mas parecidas a la original

(Ellis, 1975).

♦ Cambio genético

Algunos microorganismos son usualmente preservados porque ciertos caracteres de

las cepas son de significancia científica o industrial. Por esto es importante que las

cepas preservadas no pierdan las características importantes o ganen otras. Los

cambios pueden ocurrir durante la preservación mediante mutaciones o perdida de

plásmidos, así que la técnica de preservación debe minimizar la ocurrencia de estos

eventos. Generalmente se recomiendan soluciones con bajas concentraciones de

agentes selectivos (mutagénicos) para mantener la presión selectiva uniforme en

estado preservado (Demain et al, 1986 and Snyder et al, 1997).

♦ Pureza

Los cultivos preservados deben permanecer puros y el procedimiento de preservación

debe minimizar la oportunidad de contaminación (Kirsop et al, 1984). Para esto es

necesario que las instalaciones, el material, y la manipulación durante el proceso

cumplan con todas las normas de esterilidad en el laboratorio, especialmente cuando

se trabaja con un amplio stock de microorganismos (bacterias, hongos, protozoos,

virus y células eucarióticas).

♦ Gastos

Los costos de mantenimiento de cultivos incluyen el gasto en personal, equipos,

materiales y facilidades generales tales como espacio para el almacenamiento y

capacidad de copias. El alto costo de capital en equipos para algunos métodos como

el liofilizador puede estar compensado con los costos de personal reducidos, dado que

la estabilidad por largo tiempo de los cultivos reduce la necesidad de intervención

manual frecuente (Kir sop et al, 1984).

♦ Tamaño del stock de cultivos preservados

El principal factor a ser considerado en relación con el número de cultivos para

escoger el método es el tiempo requerido por el operador en la preservación inicial y

la subsecuente manipulación, si se requieren una o más copias. Encontrar un método

apropiado para la preservación de pequeñas colecciones puede ser una labor extensiva

cuando el número de cepas aumenta. Escoger un método para un gran stock de

cultivos puede estar afectado por la cantidad de espacio de almacenamiento

disponible (Gerhardt, 1994).

♦ Importancia de los cultivos

Las consecuencias de la perdida de cultivos deben ser consideradas en la elección del

sistema de conservación. Los cultivos de mayor importancia económica, de difícil

aislamiento o consecución, y de uso en la investigación, deben ser preservados por

técnicas que minimicen el riesgo de pérdida y para mayor seguridad utilizar más de

un método de preservación, además, de poseer numerosas copias. (Ellis, 1975).

♦ Suministro y transporte de cultivos

Para la distribución de los cultivos son necesarias replicas de estos. Estas pueden ser

preparadas según sea requerido o prepararse en un volumen stock para la posterior

distribución. La ventaja de mantener la igualdad entre las copias de una misma

especie, depende del método de preservación usado y el número de cultivos a ser

distribuidos. Si los cultivos son distribuidos por correo deben estar empacados en

forma apropiada y sobrevivir al retraso y condiciones adversas encontradas; debe

tenerse estricto seguimiento de las regulaciones nacionales e internacionales del

correo, los duplicados de estas regulaciones se obtienen con las autoridades

nacionales postales (Kirsop et al, 1984).

♦ Frecuencia del uso de los cultivos

Algunos cultivos tales como cepas de ensayo, cepas de producción industrial o

aquellas empleadas para control de calidad son usadas frecuentemente en un

laboratorio. En estos casos, la facilidad de resucitación y el riesgo de contaminación

de los cultivos stock deben ser considerados al elegir la técnica de mantenimiento; en

cultivos usados irregularmente otros factores pueden ser de mayor importancia

(Demain et al, 1986).

Ningún método de preservación cumple todos estos criterios y su selección es un

proceso dispendioso. Esto es importante para reconocer que los microorganismos

difieren en su tolerancia a varios métodos de preservación y, a menos que una

colección sea muy especializada, es improbable que un solo método pueda proveer

óptimas condiciones para todas las cepas; en general la vida media de las cepas

bacterianas conservadas por distintos métodos se resume en la tabla 1.

En conclusión, la escogencia de un método depende del balance de ventajas y

desventajas de este. Los métodos de preservación se clasifican dependiendo del

tiempo en el cual se pueda tener una buena recuperación celular en métodos a corto

plazo que incluyen subcultivo, inmersión en aceite mineral, congelación y

desecación; y métodos a largo plazo como liofilización, ultracongelación y

mantenimiento sobre perlas de vidrio; los cuales se muestran en la tabla 2.

1.1.1 METODOS DE PRESERVACION A LARGO PLAZO

1.1.1.1 LIOFILIZACION

La liofilización implica la remoción de agua de suspensiones de células

congeladas por sublimación bajo presión reducida. Este es un buen método

de preservación a largo plazo para muchos microorganismos, aunque

algunos reportes demuestran que el proceso de liofilización puede inducir a

mutaciones en la bacteria (Ashwood et al, 1976). Para un óptimo resultado en

la preservación por liofilización se requiere el uso de agentes crioprotectores

como leche descremada al 10% (p/v), sucrosa al 12% (p/v), dimetil sulfoxido

(DMSO), o glicerol; estos compuestos químicos son adicionados a la

suspensión bacteriana para ayudar a reducir el daño causado durante la

congelación por la formación de cristales (Tsvetkov and Brankova, 1982;

Demain et al, 1986; Gerard et al, 1993).

TABLA 1. Expectativa de vida de 33 géneros bacterianos preservados por diferentes

métodos de conservación. GENERO SUBCULTIVO

(meses)

INMERSIÓN

EN ACEITE

MINERAL

(años)

CONGELACIÓN

PROFUNDA

(años)

LIOFILIZACION

(años) ULTRA

CONGELACION

EN NITRÓGENO

LIQUIDO

(años)

Acetobacter 1-2 1 1-3 >40 >40

Achromobacter 1 1-2 1-3 >40 >40

Acinetobacter 1 sem >40 >40

Actinobacillus 1 sem 2-3 >40 >40

Actinomyes 1 2-3 >40 >40

Agrobacterium 1-2 1-2 >40 >40

Arthobacter 1-2 1-2 >40 >40

Bacillus 2-12 2-3 >40 >40

Bacteroides 1 sem 1 >40 >40

Bifidobacterium 1 sem >40 >40

Chromatium 1 >5 >40

Clostridium 6-12 1-2 2-3 >40 >40

Corinebacterium 1-2 1 1-2 >40 >40

Enterobacter 1-4 1-2 >40 >40

Erwinia 1-4 1-2 >40 >40

Escherichia 1-4 1-2 >40 >40

Flavobacterium 1 2 >40 >40

Gluconobacter 1 >40 >40

Haemofilus 1 sem 1 mes

(37°C)

>40 >40

Klebsiella 1-4 1 1-2 >40 >40

Lactobacillus 1 sem >40 >40

Methanobacterium 1 >5 >40

Methanomonas 1 >5 >40

Micromonospora 1 1 1 >30 >40

Neisseria 1 >30 >40

Nocardia 1-4 1 1-2 >30 >40

Proteus 1-2 1 1-2 >40 >40

Pseudomonas 1-3 >40 >40

Spirillum 1 sem >40

Staphylococcus 1-2 1 >40 >40

Streptococcus 1-2 1 >40 >40

Streptomyces 1-8 1-2 1-3 >40 >40

Xantomonas 1-2 >40 >40

Tomado de Gerhardt, P et al, 1994 in methods for general and molecular bacteriology.

TABLA 2. Métodos de preservación para diferentes géneros bacterianos

METODOS A CORTO PLAZO METODOS A LARGO PLAZO

♦ Subcultivo

♦ Desecación

♦ Congelación

♦ Inmersión en aceite mineral

♦ Liofilización

♦ Ultracongelación

♦ Mantenimiento de bacterias sobre perlas de vidrio

Muchas cepas pueden preservarse liofilizadas por periodos de diez años o

más. La liofilización es particularmente útil cuando los cultivos preservados

son transportados constantemente, ya que los cultivos liofilizados no

requieren descongelamiento, así como para su transporte y almacenamiento

no es necesario refrigerar (Gerhardt, 1994).

1.1.1.2 ULTRACONGELACION

La preservación por largo tiempo de especies bacterianas no sensibles a la

liofilización ha sido alcanzada a través del almacenamiento en estado de congelación

a la temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC) o encima (fase de vapor, -150 ºC,

aislado debidamente en tanques) este sistema requiere la adición de crioprotectores

como el glicerol y DMSO en la preparación de los cultivos. La colección Americana

de cultivos tipo o de fuentes comerciales (ATCC) ha aislado satisfactoriamente

muchas bacterias exigentes en nitrógeno líquido por cerca de 30 años sin pérdida de

las propiedades fenotípicas (Gibson and Koury, 1986).

La preservación por largo tiempo de cultivos bacterianos puede ser también alcanzada

usando temperaturas ultra-bajas en congeladores mecánicos (Revco, Inc.) Con una

temperatura de –70ºC, con adición de criopreservantes; aunque se deben tomar

precauciones para los inconvenientes de fluido eléctrico como alarmas o generadores

eléctricos para prevenir la pérdida de una colección de valor, usando esta técnica

(Gerhardt, 1994; Gerard et al, 1993).

1.1.1.3 MANTENIMIENTO DE BACTERIAS SOBRE PERLAS DE VIDRIO

El mantenimiento de cultivos en el rango de –60ºC a –80ºC es posible en algunos

laboratorios por la disponibilidad de congeladores comerciales con este rango de

temperatura, la desventaja del almacenamiento de la bacteria de este modo, es el daño

causado por la congelación y descongelación repetida cuando se requieren

subcultivos. Para superar este problema un método basado en el uso de suspensiones

bacterianas con adición de glicerol unido a perlas de vidrio fue desarrollado (Feltham

et al, 1978). La técnica permite remover perlas individuales sin descongelar la

muestra entera, y ha probado ser confiable por periodos hasta de 7 años, en el

almacenamiento de un amplio rango de microorganismos usando suspensiones

bacterianas mayores de 1 x 108 organismos por ml, y almacenadas en un rango de

–60ºC a –80ºC; lo cual es una gran desventaja, ya que la disponibilidad de estos

congeladores en los laboratorios es limitada dado su elevado costo (Kirsop et al,

1984).

1.1.2 METODOS DE PRESERVACION A CORTO PLAZO

1.1.2.1 SUBCULTIVO

El método tradicional de preservación bacteriana es por transferencias periódicas

seriadas a medio fresco; el intervalo entre cada transferencia varia de acuerdo al

microorganismo, el medio usado y las condiciones externas como temperatura,

humedad y riesgo de contaminación (Gibson and Khoury, 1986), así algunas bacterias

deben ser transferidas siempre a los pocos días como Neisseria spp y Listeria spp, en

cambio otras hasta semanas o meses después, tal es el caso de los Staphylococus y

coliformes. Las mayores desventajas de la técnica de transferencias seriadas son: el

riesgo de contaminación, la errada designación de cepas, la selección de varios

mutantes y la posible pérdida del cultivo, también el espacio de almacenamiento

requerido por lo cual el subcultivo no es recomendable como sistema de preservación

en laboratorios donde se manejen grandes volúmenes, ni como técnica de

preservación a largo plazo. Tres condiciones deben ser determinadas cuando se usa

este método de preservación de cultivos: medio apropiado de mantenimiento,

temperatura ideal de almacenamiento y frecuencia entre transferencias.

Los medios mínimos son preferidos para el subcultivo ya que bajan la taza metabólica

del organismo y prolongan el período entre transferencias. Sin embargo algunas

bacterias requieren medios complejos para el crecimiento, o para la conservación de

sus propiedades fisiológicas especificas y necesitan la presencia de compuestos

complejos en el medio. Cuando un medio complejo se usa, son necesarios más

repiques como resultado del crecimiento acelerado o la acumulación de metabolitos

(Gerhardt, 1994).

El almacenamiento en un contenedor cerrado en refrigerador de 5ºC a 8ºC es el

preferido para subcultivos, ya que reduce la tasa metabólica del organismo y la

desecación; muchas bacterias pueden ser conservadas por periodos de 3 a 5 meses

tomando las precauciones necesarias, los cultivos deben examinarse para pureza

después de cada subcultivo y realizar una caracterización periódica para monitorear

algún cambio en las características fenotípicas; además siempre se debe mantener un

duplicado en tubos como una precaución contra la perdida. Nunca se debe seleccionar

una sola colonia en la transferencia de cultivos, ya que las posibilidades de la

selección de un mutante aumentan cuando esta técnica es usada (Demain and

Solomon, 1986).

1.1.2.2 INMERSION EN ACEITE MINERAL

Un procedimiento simple para preservar una cepa bacteriana, sin necesidad de

refrigeración, es la inmersión en aceite mineral del cultivo en la fase logarítmica de

crecimiento o ocurrida la esporulación sobre agar inclinado o caldo de cultivo,

colocado en una posición vertical a 25ºC, para prevenir la deshidratación y reducir la

actividad metabólica y de crecimiento del cultivo. El aceite debe ser esterilizado en

un horno a 170ºC por una o dos horas y seguidamente realizársele una prueba de

esterilidad sobre un medio apropiado como agar nutritivo o agar triptona soya, se

recomienda no exceder la temperatura de esterilización puesto que el aceite podría

ahumarse y encenderse. La siembra sumergida dentro del aceite puede ser fácilmente

subcultivada en medio fresco, con un inoculo por picadura. Este procedimiento

tampoco es recomendado para el almacenamiento por largo tiempo de

microorganismos ya que posee las mismas desventajas del subcultivo y la adición del

aceite aumenta aun más la probabilidad de contaminación (Hartsell, 1956).

1.1.2.3 DESECACION

La desecación es el método de preservación más extensivamente usado. Existe una

gran variedad de métodos pero todos consisten esencialmente en remover el agua y

prevenir la rehidratación. Es tos métodos han sido ampliamente aplicados a hongos,

los cuales presentan mayor resistencia a la desecación que otros grupos de

microorganismos. Algunas levaduras y bacterias selectas como Campilobacter spp,

Neisseria gonorrhoeae y Vibrio cholerae han sido exitosamente preservadas por

desecación (Kirsop et al, 1984); pero en cambio cepas de Staphylococcus, Listeria

monocytogenes y Salmonella tiphymurium han presentado muerte (Walsh et al, 1974;

Juven et al, 1984; Beard et al, 1988; Palumbo and Williams, 1990; Janning et al,

1994).

1.1.2.3.1 Desecación en tiras o discos de papel

Es un método simple y económico de preservación para bacterias suspendidas en

caldo nutritivo apropiado (1x108 bacterias por ml), las cuales son posteriormente

impregnadas en tiras o discos de papel filtro estéril (Whatman No. 4) sin añadir

ningún agente crioprotector, colocadas en un desecador y almacenadas a temperatura

ambiente o en refrigeración. Muchos discos que contienen la misma bacteria pueden

ser colocados en un mismo tubo de ensayo o vial de tapa rosca refrigerados para

aumentar la vida media del cultivo desecado. Un único disco puede ser removido

asépticamente con pinzas estériles y ser inoculado en el caldo apropiado para la

recuperación (Demain and Solomon, 1986). Es idealmente usada en el mantenimiento

de cultivos de control de calidad y para envíos postales de un gran número de cepas

1.1.2.3.2 Desecación en discos de gelatina

Muchas bacterias heterotrópicas pueden ser preservadas por varios años en discos

desecados (Heckly, 1978). En este método, originalmente descrito por Stamp (1947),

los organismos son suspendidos en un medio nutritivo de gelatina, solidificados en

cajas de petri, y con la ayuda de una espátula pequeña se obtienen discos de

aproximadamente 1cm de diámetro; Los cua les son desecados posteriormente sobre

pentóxido de fósforo o silica gel, previamente activados y esterilizados en tubos tapa

rosca, para finalmente ser almacenados en refrigerador (Kirsop and Snell, 1984;

Gerhardt, 1994).

1.1.2.3.3 Desecación con silica gel

Hunt, Gourevitch and Lein (1958) y Perkins (1962) describieron los métodos para

preservación de cepas microbianas por deshidratación con silica gel y desde allí una

gran variedad de bacterias ha sido exitosamente preservada por desecamiento en

gránulos de silica gel estéril; el procedimiento es simple, rápido y económico. Tubos

de vidrio con silica gel son esterilizados a 180ºC, allí es también activada la silica, se

agrega la suspensión bacteriana en leche descremada al 10% (v/v) o los discos de

gelatina con una concentración bacteriana conocida se cubren y llevan a

refrigeración. Esta técnica es efectiva hasta por años (Grivell and Jackson, 1969;

Janning et al, 1994). La silica gel es un absorbente granular compuesto de cuarzo,

tridimita, cristobalita y otros minerales (cuya base estructural es la molécula de

SiO2), que le confieren la capacidad de resistir altas o bajas temperaturas y controlar

la humedad sin alterar su estructura (Grivell and Jackson; 1969; Kirsop and Snell,

1984)

1.1.2.3.4 Desecación en vidrio poroso y perlas de porcelana

Una amplia gama de bacterias han sido preservadas eficazmente por desecación bajo

el vacío sobre esferas perforadas de vidrio (Miller y Simmons, 1962), o esferas de

porcelana porosa (Hunt, 1958). Se usa 1ml de suspención de aproximadamente 1x108

células por ml en leche descremada al 10% (v/v) a las cuales se transfieren

asépticamente 20 a 40 esferas de vidrio, previamente tratadas para que cumplan las

condiciones necesarias de esterilidad y pH, se mezcla bien y remueve el exceso. Las

esferas son transferidas a un tubo de ensayo estéril con silica gel y algodón, tapados,

almacenados a temperatura ambiente por una semana y posteriormente en

refrigerador a 4ºC (Hunt et al, 1969; Gerhardt, 1994).

1.1.2.4 CONGELACION

La congelación es el método más simple y cómodo usado para la preservación de

microorganismos, no requiere un equipo especial; sin embargo para obtener

resultados satisfactorios, deben ser agregados agentes preservativos como el glicerol,

DMSO, leche descremada o sucrosa al medio cultivo (Laskin and Lechevalier, 1977;

Demain and Solomon, 1986; Gerhardt, 1994); las temperaturas de almacenamiento

deben ser constantes e inferiores de –20ºC (Kirsop and Snell al, 1984).

En la preservación por congelación el agua no es disponible para los

microorganismos y las células deshidratadas son almacenadas a bajas temperaturas.

Cuando la temperatura de la suspensión celular baja a 0°C el liquido extracelular

comienza a congelarse y forma cristales externos; La temperatura a la cual ocurre este

suceso depende de las propiedades de congelamiento de la suspensión y puede ser

evitado con la adición de agentes crioprotectores (Demain and Solomon, 1986),

adicionalmente, la concentración de solutos aumenta y el agua celular interna

comienza a migrar fuera de la célula por diferencia en la presión osmótica, la

remoción de esta también puede resultar en daño celular; eventualmente todos los

cristales de agua congelados se convierten en hielo puro dejando únicamente los

solutos concentrados y el agua de hidratación, los cuales se congelan y a esto se le

denomina temperatura eutéctica. Una congelación muy rápida puede contribuir a los

daños celulares por la formación de cristales internos, además, se puede causar daño

celular en las étapas subsecuentes de congelación y descongelación; por factores

como la concentración de electrolitos por remoción del agua en forma de hielo o por

la formación de cristales los cuales dañan la integridad celular (Reusser, 1963;

Manzur, 1970; Kirsop and Snell, 1984; Gerhardt, 1994). Un balance entre el daño

causado por la concentración de solutos y la formación interna de cristales puede ser

alcanzado con el control de la tasa de congelación. Una taza de 1-10°C por minuto es

satisfactoria para todas las bacterias. Anexo a esto, la concentración de solutos

durante la congelación puede alterar los componentes del medio por la formación de

complejos o bajas de pH en medios bufferados pobremente (Reusser, 1963; Gerhardt,

1994).

El uso de agentes crioprotectores ha sido ampliamente estudiado, comenzando por el

efecto protector del glicerol el cual fue descubierto por Pollee, Smith, and Parkes en

1949, y demostró ser el aditivo más efectivo hasta el descubrimiento de las virtudes

del DMSO en 1959 por Lovelock and Bishop. El glicerol es otro compuesto químico

crioprotector, de bajo peso molecular, no tóxico, capaz de penetrar la membrana

celular fácilmente, y hábil para unirse a cualquiera de los electrolitos que aumentan

su concentración durante la congelación, o a las moléculas de agua que demoran la

misma (Gerhardt, 1994).La protección por glicerol es explicable sobre las bases de

molaridad y solubilidad; actuando por reducción de la concentración de electrólitos

en los residuos no congelados de la solución y alrededor de la célula a una

temperatura dada (Manzur, 1970).

1.1.2.4.1 Congelación ordinaria

Cultivos en caldo o células cultivadas en medio inclinado son dispensados en tubos o

viales y almacenados en el compartimento de congelación en una nevera ordinaria

con temperaturas en el rango de -5ºC a –20ºC. La viabilidad de muchos

microorganismos depende de la especie, pero en general es de seis meses a dos años.

Sin embargo este método no es recomendable para un almacenamiento a largo plazo

ya que produce los daños mencionados anteriormente (Tsvetkov and Brancova, 1983;

Delgado et al, 1994).

1.1.2.4.2 Congelación profunda

La preservación de bacterias por este sistema a –70ºC en un congelador mecánico es

superior a la anterior a –20ºC. El procedimiento envuelve el congelamiento de viales

con la suspensión bacteriana en el medio adecuado y adición obligatoria de un

crioprotector para prevenir el daño celular durante el proceso de congelación, lo cual

significa una ventaja frente al sistema de congelación ordinaria; posteriormente las

células son recuperadas en el medio apropiado para cada especie, por descongelación

rápida de la suspensión celular en un baño de agua a 37ºC (Gerhardt, 1994).

1.2 GENERALIDADES DE LAS CEPAS BACTERIANAS EN ESTUDIO

Las bacterias se usan con múltiples propósitos, como pedagogía, investigación,

industria y control de calidad en los hospitales. Por las inconsistencias en diferentes

reportes en su conservación debido a: su metabolismo, ciclo de vida, propiedades

morfológicas y bioquímicas; es importante evaluar el mayor numero posib le de

cepas representativas por genero teniendo en cuenta sus características. En el presente

trabajo se evaluaron las especies más representativas de tres grupos de bacterias, los

cuales son:

1.1.2 BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Las bacterias grampositivas poseen varias características que ayudan a diferenciarlas

de los microorganismos gramnegativos, estas son en el elevado contenido de

glucopeptidos y bajo contenido lipídico de sus paredes celulares, lo cual les permita

que retengan el colorante de cristal violeta de la tinción de Gram (desarrollada por él

medico danés Hans Christian Gram; de aquí su nombre), debido a que los alcoholes y

otros solventes orgánicos no penetran en las paredes celulares deficientes en lípidos.

Son en general más resistentes a los efectos de la desecación, el calor y la luz solar,

así como a la acción de sustancias químicas (Mattar y Melo, 1998).

Las paredes celulares son las capas más externas de estos microorganismos

(excluyendo las cápsulas), esencialmente gruesas (20-80nm) y consisten en un 50 a

60% de péptidoglucano, extensivamente entrecruzado en tres dimensiones para

formar una red polimérica gruesa; el restante esta compuesto de ácidos teicoicos,

ácidos teicuronicos y lipopolisacáridos (LPS) en bajas proporciones. Todas las células

grampositivas poseen un polímero lineal de ácido N-acetilmurámico y

N-acetilglucosamina, pero existe una variación en longitud y composición del

puente peptídico y el tetrapéptido de un ácido N-acetilmurámico que cruza hacia el

polímero adyacente. Los ácidos teicoicos, están unidos al ácido murámico de la capa

de peptidoglucano y se presentan en dos formas principales, ácido ribitol teicoico y

ácido glicerol teicoico. En general hay polímeros largos ya sea de ribitol (un alcohol

azúcar de cinco carbonos) o un glicerol (alcohol azúcar de tres carbonos) unidos entre

sí a través de puentes fosfodiéster. Sin embargo, todos los grupos hidroxil de ribitol o

subunidades de glicerol están unidos a diferentes azucares o aminoácidos. Debido a

que estos ácidos teicoicos son altamente antigénicos (inducen en un huésped la

producción de anticuerpos específicos que reaccionan contra estos) parece que se

extienden a través de la capa de péptidoglucano, y por lo tanto, brindan determinantes

antigénicos utilizados en la identificación serológica de muchos grupos y especies de

bacterias grampositivas (Howard, 1983; Wesley, 1993). Para la mayor parte las

proteínas no se encuentran como constituyentes de la pared celular de este grupo. Una

excepción es la proteína M del grupo A de Streptococcus.

1.2.2 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

La pared celular de las bacterias gramnegativas es más compleja desde el punto de

vista químico, estructuralmente poseen una membrana citoplasmática fosfolipídica,

rodeada por una capa de peptidoglicanos que delimitan el espacio periplasmático, así

como una pared externa que contiene elementos intercalados como lipopolisacaridos

(LPS), moléculas construidas sobre la región core y una cadena lateral. El LPS es un

complejo lipídico en el que intervienen, un lípido A (disacárido de glucosamina) y un

polisacárido, de extrema importancia por su toxicidad para los animales, recibiendo el

nombre de endotoxina ; aunque esta se encuentra asociada principalmente con el

lípido A, mientras que el polisacárido constituye el antígeno O somático. Otros

elementos de la membrana son lipoproteínas, porinas y otras proteínas, las cuales son

bastante complejas, e irradian los flagelos, las fimbrias o pilis. Al microscopio con la

tinción de Gram estos microorganismos se observan rosados por tomar el colorante

fucsina de la técnica. En estos más que en los grampositivos, hay un espacio entre la

membrana citoplasmática y la membrana externa, denominado espacio

periplasmático; el cual ha demostrado contener proteínas, enzimas hidrolíticas como

fosfatasa, DNAsa I, RNAsa I y penicilasas controladas por plásmidos (Brock, 1991;

Krieg, 1994; Mattar y Melo1998).

Es interesante observar que todos los LPS de la pared celular existen de

manera aislada en la capa exterior de la membrana externa, haciendo que esta

sea considerablemente más rígida que las membranas de las células normales.

Además, la membrana externa de los gramnegativos no esta del todo

penetrada por componentes hidrofóbicos (insolubles en agua) y es, por tanto,

resistente a la disolución por detergentes, otorgando a las bacterias la

posibilidad de crecer en presencia de detergentes que son letales para las

células grampositivas (Wesley, 1993).

1.2.3 BACILOS ESPORULADOS

Muchos miembros bacterianos de los géneros Bacillus y Clostridium entre otros

tienen la propiedad de formar un cuerpo refringente intracelular llamado

endoesporas, cuya función primaria es la sobrevivencia y diseminación de las

especies. Estas poseen una mayor resistencia que las células vegetativas a las

condiciones ambientales adversas, impenetrabilidad a las sustancias químicas,

resistencia al calor y a otros factores ambientales, además, pueden sobrevivir a los

procesos empleados en la preservación de comidas o a la esterilización de materiales

para uso en procedimientos médicos a menos que las condiciones de desinfección o

esterilización estén perfectamente mantenidas, ya que solo muy pocas especies

manifiestan una resistencia extrema (Moat and Foster, 1988; Divo, 1990)

La diseminación de esporas en la fase vegetativa puede resultar en contaminación de

las comidas y la producción de toxinas que pueden ocasionar riesgos serios de

enfermedad o muerte. Por estas razones los aspectos fisiológicos de la esporulación y

la resistencia de esporas a las condiciones ambientales han sido estudiados

extensivamente (Moat and Foster, 1988; Wesley, 1993).

Cuando una célula vegetativa forma una endospora fabrica una pared celular

totalmente diferente, cambia de forma y produce enzima nuevas, las cuales no se han

podido asociar específicamente, ya que las esporas y células tienen mucho en común

con respecto a las especies de proteínas. Por ejemplo cerca del 97% del mRNA

sintetizado durante la esporulación, es mRNA celular. Algunas actividades

enzimáticas encontradas en el desarrollo de las esporas no están presentes en el

citoplasma de la célula madre (aspartato-amino-transferasa y alanino-amino-

transferasa), y La L-alanino- deshidrogenasa es encontrada solamente en el

citoplasma de la célula madre (Howard, 1983; Wesley, 1993; Krieg, 1994).

La formación de endosporas es iniciada generalmente por la depleción de las fuentes

de carbono y nitrógeno en el medio de crecimiento y comprende los siguientes pasos:

Etapa del filamento axial, formación del septum y engolfamiento de la espora,

formación de cortex, formación de cubierta y por último la maduración (Krieg,

1994). Pueden permanecer viables por muchos años, tal vez siglos, en condiciones

normales en el suelo. Además mientras que la mayor parte de las células vegetativas

mueren a temperaturas de 60ºC a 70ºC, las endosporas pueden sobrevivir en agua en

ebullición por una hora o más. No hay una explicación simple para esta resistencia

pero el hecho de que las endosporas posean muy poca agua libre indudablemente es

una razón importante para su estabilidad térmica; por otra parte, las endosporas

contienen grandes cantidades de dipicolinato cálcico, una sustancia que no se

encuentra en las células vegetativas, y se ha postulado que este compuesto podría

desempeñar un papel importante en la resistencia al calor de la endospora, pero

cualquier mecanismo por el cual podría ocurrir es aún desconocido. Se ha mostrado

que las endosporas contienen aproximadamente cinco veces mas aminoácido cisteína

por miligramo del nitrógeno total, que su correspondiente célula vegetativa, y se ha

postulado que como resultado, el alto contenido de grupos de disulfuro podría

tomarse en cuenta para la marcada resistencia de la endospora a la radiación

ultravioleta, además, su resistencia ante las sustancias químicas que destruyen a las

células vegetativas podría explicarse por su impermeabilidad al grueso abrigo de la

espora.

La formación de esporas envuelve muchos loci genéticos por ejemplo en B. subtillis

50 o más de estos se encuentran implicados. Existen muchos genes implicados en la

formación de esporas, los genes ger y out están implicados en la maduración de las

esporas y la diseminación en B. subtillis, otros genes designados cot, codifican para

los polipéptidos de la cubierta de la espora y por ultimo los genes spo que

intervienen en todas las etapas de la esporulación (Howard, 1983; Moat and Foster,

1988 Krieg, 1994).

En miembros del género Bacillus una pequeña familia de proteínas esporas ácido-

solubles (SASPs), son sintetizadas solo durante la esporulación bajo control

transcripcional. Estas SASPs son los productos de una familia de multigenes a las

cuales se les han dado las siguientes designaciones, sspA, sspB, sspC y sspD. Durante

la germinación de las esporas las SASPs son degradadas rápidamente en

aminoácidos libres, los cuales proveen la síntesis de proteínas durante las etapas

tempranas de la germinación, además, las proteínas SASPs comprenden del 25 al

50% del núcleo proteico o protoplasto de la espora. Se han encontrado evidencias de

la implicación de este tipo de proteínas en la resistencia de las esporas inactivas a la

luz ultravioleta (Moat and Foster, 1988).

2. MATERIALES Y METODOS

2.1 TIPO DE ESTUDIO: Se realizo un trabajo experimental descriptivo estadístico,

en el que se determinan concentraciones de cada bacteria para evaluar cada una

de las técnicas de preservación tanto para bacterias grampositivas como

gramnegativas en el Laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia

Universidad Javeriana.

2.2 VARIABLES: se evaluaron tres técnicas de preservación a corto plazo

(congelación a –20°C en leche descremada al 10%, congelación a –20°C en

caldo triptona soya con adición de glicerol y desecación con silica gel en discos

de gelatina), considerando las siguientes variables:

o Concentración de bacterias recuperadas.

o Técnica empleada.

o Intervalo de tiempo de preservación; los cuales fueron: 3 días; 1, 2, 3 y 4

semanas.

o Especie bacteriana preservada.

2.3 BACTERIAS EVALUADAS: se tomaron las especies más representativas de

los grupos de bacterias grampositivas, gramnegativas y esporulados; las cuales

se listan a continuación:

v Bacterias grampositivas:

o Cocos: Staphylococcus aureus, St. epidermidis y St. saprophyticus;

Streptococcus mutans y Enterococcus faecalis y E. faecium.

o Bacilos: Listeria monocytogenes.

v Bacterias gramnegativas:

o Bacilos: Escherichia coli, Salmonella spp y Shigella spp.

v Esporulados:

o Bacilos: Bacillus cereus y B. subtillis.

Las cepas de ensayo fueron obtenidas de la colección de cepas del laboratorio de

Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana que se mantienen

actualmente por subcultivos en refrigeración.

2.4 HIPOTESIS:

♦ Hipótesis nula (Hn): No hay relación entre las variables concentración de bacteria

recuperada, el tipo de sistema de preservación empleado y el tiempo dependiendo

de la cepa bacteriana, es decir, el resultado se debe al azar.

♦ Hipótesis alterna (Ha): Plantea que hay una relación entre las tres variables

anteriormente citadas, dependiendo de la cepa bacteriana y por consiguiente la

concentración de bacterias recuperadas esta relacionada con la técnica usada, el

tiempo de preservación y la especie bacteriana.

2.5 CONGELACIÓN A –20°C EN LECHE DESCREMADA AL 10% (SKIM

MILK):

El polvo de leche desnatada se utiliza como aditivo, ya que mejora las condiciones

de crecimiento de los microorganismos presentes; y el uso de este ofrece un soporte

sólido para la congelación (Gibson and Khoury, 1986), por la presencia de sustancias

conocidas como osmoprotectores, osmolitos, o solutos compatibles. Los osmolitos

son acumulados usualmente en las células durante periodos de estrés osmótico y

pueden estabilizar funciones fisiológicas inestables de proteínas citoplasmáticas u

otras estructuras bajo estas condiciones (Ryser and Marth, 1999). El medio fue

basado en la fórmula descrita por Gibson and Khoury (1986) y Gherna (1994) con

las siguientes modificaciones:

♦ El ensayo se monto por triplicado en cada cepa, dispensando 9ml de leche

descremada al 10% (p/v) (Anexo No.1) en tubos tapa rosca de 16x150mm.

♦ Seguidamente los tubos a temperatura ambiente se inoculan con un mililitro de

caldo Eugon (anexo No.2) con la suspensión bacteriana correspondiente, a una

concentración de 1,5x108 UFC/ml, correspondiente al patrón 0.5 de Mc Farland

(anexo No.3).

♦ La suspensión bacteriana es alicuotada en viales estériles de a 1ml y

posteriormente almacenados a -20°C.

2.6 CONGELACIÓN A –20°C EN CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN

DE GLICEROL AL 3%:

El método fue basado en la fórmula descrita por Gherna (1994) con varias

modificaciones, descritas a continuación:

♦ El glicerol (15ml) es adicionado a un medio soporte que contiene caldo triptona

soya (50ml) con suero fetal bovino al 2%, extracto de levadura (100mg), y un

porcentaje final del 30% de glicerol al 3% (anexo No.4).

♦ El ensayo se monta por triplicado en cada cepa, tomando un tubo tapa rosca de

16x150mm con 9ml del medio soporte con glicerol, y seguidamente los tubos a

temperatura ambiente se inoculan con un mililitro de caldo Eugon con la

suspensión bacteriana, correspondiente al patrón 0.5 de Mc Farland.

♦ La suspensión resultante es alicuotada en viales estériles de a 1ml y

posteriormente almacenados a -20°C.

2.7 DESECACIÓN CON SILICA GEL EN DISCOS DE GELATINA:

Se utilizo la técnica descrita por Kirsop and Snell (1984), Demain et al. (1986), y

Janning et al. (1994); con los cambios descritos a continuación:

♦ Se dispensan 0.5g de silica gel en tubos Khan, cubiertos con una capa delgada de

algodón, se lleva a 180°C en horno por 2 horas cubiertos con papel aluminio para

esterilizar y activar la silica; posteriormente todo el conjunto se cubre con vinilpel

y es almacenado a 4°C hasta su uso.

♦ Por otra parte, medio gelatina nutritivo (anexo No.5), dispensado de a 9ml en

tubos de 16x150mm; se esteriliza a 121ºC por 15 minutos.

♦ Seguidamente los tubos a 37ºC se inoculan con un mililitro de caldo Eugon con la

suspensión bacteriana correspondiente, a una concentración de 1,5x108UFC/ml,

correspondiente al patrón 0.5 de Mc Farland; para obtener una concentración final

de 1.5x107UFC/ml en la mezcla.

♦ La mezcla de la bacteria con la gelatina, es servida en cajas de petri pequeñas y

llevada a refrigerar (4ºC) para su solidificación.

♦ Posteriormente, se extraen discos de 1cm de diámetro, con una concentración de

bacterias de 7.1x105UFC/cm3, para ser colocados sobre el algodón en los tubos

con silica y sellados con parafilm.

♦ Por último todo el conjunto es llevado a congelar a –20°C.

2.8 RECUPERACIÓN DE LA CEPA:

♦ Después de ser sometidas a cada una de las técnicas de preservación, las cepas

dispuestas en los viales a –20°C, fueron resuspendidas en 9ml de caldo nutritivo

Eugon, pasados los siguientes intervalos de tiempo de evaluación: 3 días,

1, 2, 3 y 4 semanas.

♦ Los caldos con las cepas son preincubadas a 37°C por 25 minutos, pasado este

tiempo se realiza la primera lectura de las absorbancias “tiempo 0”, tomando

2.5ml de la suspensión en una celda especto fotométrica, para ser leída en un

espectrofotómetro a 540nm; nuevamente a las 24 horas de incubación se realiza

la segunda lectura de misma manera descrita anteriormente, para poder establecer

la viabilidad posterior a la aplicación de cada técnica.

Nota: Las lecturas se realizan contra blancos preparados paralelamente a cada técnica

pero sin adición de bacterias, que son resuspendidos en 9ml de caldo Eugon.

2.9 PUREZA:

♦ Previamente a la ejecución de cada una de las técnicas de preservación se realizo

la identificación de cada una de las cepas con las siguientes reacciones para cada

grupo:

o Bacterias grampositivas: Catalasa (Anexo No.6), Producción de

Coagulasa (Anexo No.7), Resistencia a la Novobiocina (Anexo No.8),

DNAsa (Anexo No.9), Hemólisis en Agar Sangre de Cordero (Anexo

No.10), Resistencia a la Optoquina (Anexo No.11), Bilis Esculina

(Anexo No.12), y Crecimiento en NaCl (Anexo No.13).

o Bacterias gramnegativas: Triple Azúcar Hierro (TSI) (Anexo No.14),

Lisina Hierro Agar (LIA) (Anexo No.15), Citrato (Anexo No.16),

Sulfuros-Indol-Motilidad (Agar SIM) (Anexo No.17), Urea (Anexo

No.18), Rojo de metilo-Voges Proskawer (Anexo No. 19).

♦ Pasadas las 24 horas de incubación de cada recuperación, se sembró cada especie

bacteriana recuperada de las tres técnicas, por el método de única estría; los

microorganismos gramnegativos en el agar eosina azul de metileno modificado

(EMB) (anexo No.20), y los grampositivos se siembran en Agar Columbia

(anexo No.21), se llevaron a encubar a 37°C por un día.

♦ Seguidamente se observaron las colonias características y la morfología de cada

cultivo se verifico por tinción de Gram (Anexo No.22).

2.10 ANÁLISIS DE RESULTADOS:

Los datos obtenidos se procesaron en el programa estadístico Start view 4.0, para

obtener las diferencias significativas entre los sistemas usados, tiempo de

almacenamiento, concentración de bacterias recuperadas y especie bacteriana;

graficados posteriormente en el programa Microsoft Excel.

3. RESULTADOS

3.1 IDENTIFICACION DE CEPAS: se siguieron los protocolos de identificación de

Koneman (1999); los resultados obtenidos (tabla 3, 4, 5), fueron constantes a lo

largo del estudio, demostrando así la pureza de cada una de las especies en los

diferentes procesos de conservación aplicados.

TABLA 3. Resultados en las pruebas de identificación de bacilos gramnegativos

E. coli Salmonella spp Shigella spp

Colonias

características en

medio EMB

Colonias circulares,

convexas, de borde

continuo o

ligeramente

ondulado, con brillo

verde metálico.

Colonias mucosas

circulares, planas,

convexas de borde

continuo, color

púrpura claro o

semitranslúcidas.

Colonias redondas

brillantes de borde

continuo, mucosas de

color púrpura claro o

semitranslúcidas

Morfología en tinción

de Gram

Bacilo gramnegativo Bacilo gramnegativo Bacilo gramnegativo

TSI A(K)/A K/A K/A

H2S/GAS Negativo/positivo Positivo/positivo Negativo/negativo

LIA K/K K/K K/A

CITRATO Negativo Positivo Negativo

UREA Negativo Negativo Negativo

INDOL Positivo Negativo Negativo

MOTILIDAD Positivo/negativo Positivo Negativo

RM Positivo Positivo Positivo

VP Negativo Negativo Negativo

LACTOSA Positivo Negativo Negativo

TABLA 4. Resultados en las pruebas de identificación de cocos grampositivos

St. aureus St.

saprophyticus

St.

epidermidis

St. mutans E. faecalis E. faecium

Colonias

características

en Agar

Triptona soya

Colonias

elevadas,

redondas con

borde

continuo,

lisas

brillantes con

pigmento

beis.

Colonias

elevadas,

levemente

convexas de

borde

continuo lisas

y opacas.

Colonias

redondas de

borde

continuo,

lisas,

mucoides,

brillantes.

Colonias

redondas de

borde

continuo,

lisas,

mucoides

con

superficie

granulosa.

Colonias

redondas,

lisas,

cremosas y

de color

blanco en su

totalidad.

Colonias

redondas,

lisas,

cremosas

Y de color

blanco.

Morfología

en tinción de

Gram

Coco

gampositivo

Coco

grampositivo

Coco

grampositivo

Coco

grampositivo

Coco

grampositivo

Coco

grampositivo

Coagulasa Positiva Negativa Negativa

Catalasa Positiva Positiva Positiva Negativa Negativa Negativa

Sensibilidad

a la

Novobiocina

Resistente

Sensible

Dnasa Positiva Negativa Negativa

Hemolísis en

Agar Sangre

de Cordero

Gamma

δ

Gamma

δ

Gamma

δ

Alfa/Gamma

α/δ

Gamma

δ

Gamma

δ

Sensibilidad

a la

optoquina

Resistente

Solubilidad

en bilis

Negativa

Bilis

esculina

Positiva Positiva

Crecimiento

en NaCl al

Positivo

Positivo

Positivo

6.5%

TABLA 5. Resultados en las pruebas de identificación de bacilos grampositivos

Listeria

monocytogenes

B. subtillis B. cereus

Colonias

características en

Agar Triptona soya

Colonias pequeñas

redondas, elevadas,

levemente convexas.

Colonias altamente

irregulares, cremosas,

brillantes.

Colonias irregulares,

cremosas opacas.

Morfología en tinción

de Gram

Bacilo corto delgado

grampositivo.

Bacilo grampositivo

esporulado.

Bacilo grampositivo

esporulado.

Catalasa positiva positiva Positiva

Hemolísis en Agar

Sangre de Cordero

Beta

β

Gamma

δ

Gamma

δ

Crecimiento en NaCl

al 6.5%

Negativo Positivo Débilmente positivo

3.2 VIABILIDAD BACTERIANA POSTERIOR A CADA TECNICA DE

MANTENIMIENTO: se evaluó la recuperación de las bacterias en intervalos de

3 días, 1-2-3 y 4 semanas después de aplicados los métodos de preservación por

congelación a –20ºC, en los bacilos gramnegativos E. coli, Salmonella spp,

Shigella spp; los cocos grampositivos St. aureus, St. epidermidis, St

saprophyticus, St. mutans, E. faecium, E. faecalis; y los bacilos grampositivos

listeria monocytogenes, B. cereus y B. subtillis. Los resultados obtenidos en cada

sistema se presentan a continuación:

3.2.1 CONSERVACION EN LECHE DESCREMADA AL 10%(p/v) (fig. 1, 2 y3)

FIGURA 1. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de bacilos gramnegativos, a los

diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a –20ºC en leche descremada al 10% (p/v).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas

TIEMPO DE PRESERVACIÓN

CON

CEN

TRA

CIÓ

N D

E B

ACT

ERIA

S R

ECU

PERA

DA

S

(1

x10^

8 U

FC/cc

)

E. coli Salmonella Shigella

FIGURA 2. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de cocos gramposit ivos, a los diferentes

intervalos de tiempo en la técnica de congelación a –20ºC en leche descremada al 10% (p/v).

FIGURA 3. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de bacilos grampositivos, a los

diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a –20ºC en leche descremada al 10% (p/v).

0

0,51

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5



CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PER

AD

AS

(1x1

0^8

UFC

/cc)

St. aureus St. epidermidis St. saprophyticus

St. mutans E. faecium E. faecalis

0

0,51

1,5

2

2,53

3,54

4,5

3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanasTIEMPO DE PRESERVACIÓN

CO

NC

EN

TR

AC

ION

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PER

AD

AS

(1x1

0^8

UFC

/cc)

Listeria monocytogenes B. cereus B. subtillis

3.2.2 CONSERVACIÓN EN CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN DE

GLICEROL AL 3% (fig. 4, 5, y 6).


diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a –20ºC en caldo Triptona soya con

adición de glicerol al 3%.

FIGURA 5. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de cocos gram positivos, a los

diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a-20ºC en caldo triptona soya con adición

de glicerol al 3%.

0

0,5

1

1,5

2

2,5



CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PER

AD

AS

(1x1

0^8

UFC

/cc)


0

0,5

1

1,5

2

2,5



CON

CEN

TRA

CIÓ

N D

E BA

CTER

IAS

REC

UPE

RA

DA

S (1

x10̂

8 U

FC/cc

)

St. aureus

St. epidermidis

St. saprophyticus

St. mutans

E. faecium

E. faecalis


diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a -20ºC en caldo triptona soya con adición

de glicerol al 3%.

3.2.3 CONSERVACIÓN POR CONGELACIÓN POSTERIOR A LA

DESECACION CON SILICA GEL SOBRE DISCOS DE GELATINA (fig.

7, 8 y 9)


diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica

gel en discos de gelatina.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2


T I E M P O D E P R E S E R V A C I Ó N

CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PER

AD

AS

(1x1

0^8

UFC

/cc)

Lister ia monocytogenes B. cereus B. subtillis

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3



CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PER

AD

AS

(1x1

0^8

UFC

/cc)


FIGURA 8. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de cocos grampositivos, a los diferentes

intervalos de tiempo en la técnica de congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica gel en

discos de gelatina.


diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica

gel en discos de gelatina.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3



CON

CEN

TRA

CIÓ

N D

E BA

CTER

IAS

REC

UPE

RA

DA

S (1

x10̂

8)

St. aureus

St. epidermidis

St. saprophyticus

St. mutans

E. faecium

E. faecalis

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4



CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PER

AD

AS

(1x1

0^8

UFC

/cc)

Listeria monocytogenes B. cereus B. subtillis

3.3 EVALUACIÓN DE CADA TECNICA DE MANTENIMIENTO EN LOS

GRUPOS DE BACTERIAS EVALUADOS: se realizo comparación en los

grupos de bacilos gramnegativos, cocos grampositivos y bacilos grampositivos

para cada una de las técnicas utilizadas (fig. 10, 11, 12).

Figura 10. Concentración de bacterias recuperadas en los grupos de estudio mediante congelación a –

20ºC con leche descremada al 10% (p/v).

Figura 11. Concentración de bacterias recuperadas en los grupos de estudio, mediante congelación a

–20ºC en caldo triptona soya con adición de glicerol al 3%.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5


CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PER

AD

AS

(1x1

0^8

UFC

/cc)

BACILOS GRAM NEGATIVOS BACILOS GRAM POSITIVOS COCOS GRAM POSITIVOS

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8



CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PE

RA

DA

S (

1x10

^8)


Figura 12. Concentración de bacterias recuperadas en los grupos de estudio mediante congelación a

–20ºC posterior a la desecación con silica gel en discos de gelatina.

3.4 PERDIDAS DE VIABILIDAD OBTENIDAS EN CADA MÉTODO DE

PRESERVACIÓN: se evaluaron las perdidas de viabilidad en porcentaje (%), a

medida que transcurrían los intervalos de tiempo, para obtener la mortalidad

final a las cuatro semanas, por cepa de estudio, en cada técnica de preservación;

estableciendo una comparación, los datos se muestran en la figura 12.

Figura 13. Porcentajes de mortalidad finales en cada microorganismo, deacuerdo al sistema de

conservación empleado.

0

0,5

1

1,5

2

2,5


CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

DE

BA

CT

ER

IAS

RE

CU

PE

RA

DA

S (

1x10

^8 U

FC

/cc)


0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

100

PO

RC

EN

TA

JE D

E M

OR

TA

LID

AD

(%

)

E. coli

Salmon

ella

Shige

llaSt.

aureu

s

St. ep

iderm

idis

St. sa

prop

hytic

usSt.

mutan

sE. f

aeciu

mE. f

aeca

lis

Listeri

a mon

ocyto

gene

s

B. cere

usB. s

ubtil

lis

T I E M P O D E P R E S E R V A C I Ó NL e c h e S i l i c a G l i c e r o l

3.5 ANALISIS ESTADISTICO: los datos obtenidos se analizaron por el test de

esfericidad de Bartlett’s en el programa Start View 4.0 para establecer la

correlación de los diferentes sistemas de mantenimiento aplicados; los valores

significativos obtenidos se muestran en la tabla 6.

LECHE GLICEROL SILICA

DF 14 14 14

DETERMINANTE 0.00 0.01 0.01

Chi Square 67.34 61.08 61.77

VALOR-P <.0001 <.0001 <.0001

4. DISCUSION

La preservación de cultivos bacterianos se realiza con diversos propósitos entre ellos,

la educación, investigación y control de calidad en la industria, por lo cual es

importante evaluar técnicas de preservación a corto y largo plazo para poder

determinar el método más adecuado de acuerdo a la especie bacteriana, los recursos y

necesidades de cada laboratorio. Esta área de estudio ha sido pobremente explorada

en los últimos años, especialmente en países en vía de desarrollo como Colombia; por

lo cual es posible plantear varias hipótesis sobre las causas de pérdida de los cultivos

bacterianos preservados; difiriendo del objetivo inicial de la conservación que es

mantener microorganismos vivos, viables, libres de contaminación y sin variación o

mutación de sus características.

La conservación de microorganismos por congelación a –20ºC, es un sistema que ha

tenido óptimos resultados en bacterias grampositivas y gramnegativas; aunque se

pueden producir algunos daños en las células durante el proceso de remoción del agua

en forma de hielo, por la formación de cristales que afectan la pared bacteriana;

adicionalmente el aumento en la concentración de electrólitos puede resultar tóxico

para la célula y la etapa de subsecuente descongelación aumenta los daños por

cambios bruscos en la temperatura. Para evitar la perdida de viabilidad ocasionada

por la congelación se adiciona a la suspensión bacteriana sustancias crioprotectoras

complementarias que evitan la formación de los cristales, como el glicerol y la leche

descremada al 10%, según Tsvetkov and Brankova (1983).

Uno de los posibles riesgos al llevar a cabo cualquiera de los procesos de

preservación es la contaminación de las cepas bacterianas; lo cual puede terminar en

perdida de la cepa original por selección de colonias contaminantes; en nuestro

estudio la pureza de los microorganismos recuperados por cada técnica, se verifico

mediante los protocolos de identificación de Koneman, los resultados obtenidos

fueron satisfactorios y se muestran en las tablas No. 3, 4 y 5.

La viabilidad obtenida en las distintas especies bacterianas por la técnica de

congelación a –20ºC en leche descremada al 10% se muestra para cada grupo en las

figuras 1, 2 y 3. Del grupo de bacilos gramnegativos, la especie que presentó la mejor

recuperación al término de los intervalos de preservación evaluados en esta técnica

fue la E. coli; mientras que la Salmonella spp mostró la más alta recuperación en los

primeros intervalos de tiempo (3.79x108 UFC/cc, 3 días; 3.58x108 UFC/cc, 1 semana;

3.58x108 UFC/cc, 2 semanas), pero esta decrece casi a la mitad a las cuatro semanas

(1.95x108 UFC/cc). En el grupo de cocos grampositivos se obtuvo la mejor

recuperación por este método en la especie de E. faecalis (4.63x108 UFC/cc, 3 días;

3.76x108 UFC/cc, 1 semana; 3.37x108 UFC/cc, 2 semanas; 3.17x108 UFC/cc, 3

semanas; 3.14x108 UFC/cc, 4 semanas); y la menor recuperación se observo en St.

epidermidis a todos los intervalos evaluados. Por último en el grupo de los bacilos

grampositivos se alcanzó un comportamiento similar en las concentraciones de

bacterias recuperadas para las especies: Listeria monocytoges, B. subtillis y B. cereus.

En la técnica de congelación a -20ºC en caldo triptona con adición de glicerol al 3%,

se valoró igualmente la recuperación de las bacterias en los tres grupos anteriormente

mencionados, y los períodos establecidos; los resultados se exponen en las figuras 4,

5 y 6. Para los bacilos gramnegativos se consiguió la más alta recuperación en

Salmonella spp, contrario a lo observado en la técnica de leche descremada; la

especie de cocos grampositivos con la máxima recuperación fue St. saprophyticus y

la menor St. epidermidis al igual que en la técnica anterior; finalmente en el grupo de

bacilos grampositivos se obtuvo la viabilidad más alta en B subtillis, aunque a la

cuarta semana de mantenimiento las concentraciones de las bacterias recuperadas son

parecidas en las tres especies.

Los valores obtenidos en la recuperación de cada bacteria subsiguiente a la

preservación en congelación a –20ºC posterior a la desecación con silica gel en discos

de gelatina se presentan en las figuras 7, 8 y 9. En el grupo de bacilos gramnegativos,

al período de tres días se alcanzó la mayor concentración de microorganismos

recuperados en la cepa de Salmonella spp; mientras a las cuatro semanas de

mantenimiento fue para E. coli. En los cocos grampositivos se consiguió una

viabilidad óptima para St. aureus en los primeros intervalos de tiempo, sin embargo

en la última recuperación la concentración decreció por debajo de la recuperación de

las otras especies; finalmente en el grupo de bacilos grampositivos B. subtillis tiene la

recuperación más alta hasta las tres semanas; ya que en el último período su

recuperación es inferior a la obtenida en B. cereus.

Al comparar los tres grupos bacterianos en cada una de las técnicas (fig. 10, 11 y 12)

se observa una recuperación mayor en el grupo de cocos grampositivos por los tres

sistemas de conservación, probablemente por la resistencia que les otorga su pared

gruesa compuesta por peptidoglicano (60%), ácidos teicoicos, teicurónicos y

lipopolisacárido, frente a los cristales formados durante el proceso de congelación

que pueden afectar la integridad celular.

Enfrentando los porcentajes de mortalidad obtenidos a las cuatro semanas de

preservación (fig. No 12), entre los datos más relevantes se observa un alto porcentaje

de mortalidad (67%) por la técnica de silica gel en B. subtillis, y pérdidas

significativas en Salmonella spp de 49%, 47% y 49% en las técnicas de congelación a

–20ºC en leche descremada al 10%, posterior a la desecación con silica gel en discos

de gelatina y en caldo triptona soya con adición de glicerol al 3% respectivamente;

por lo cual se proponen evaluar otros métodos de conservación para esta especie.

Se puede establecer una relación entre las variables planteadas en este trabajo dados

los valores p<.0001 obtenidos en el análisis estadístico por el test de esfericidad de

Bartlett’s (tabla No. 6), permitiendo aceptar la hipótesis alterna, es decir, existe un

vínculo entre el tiempo de preservación, técnica usada y concentración de bacterias

recuperadas en cada especie.

Al reunir los diferentes valores obtenidos (fig. No 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) se

puede establecer que los microorganismos mejor preservados por el método de

congelación a –20ºC en leche descremada al 10% son: Shigella spp, St. aureus y B.

subtillis; en la técnica de congelación a –20ºC en caldo triptona soya con adición de

glicerol al 3% se obtuvieron los menores porcentajes de mortalidad para un buen

número de cepas, comprobándose así el papel crioprotector del glicerol de acuerdo a

otros estudios realizados por Calcott and Macleod (1974), las cepas mejor

preservadas por este sistema fueron: E. coli, St. saprophyticus, E. faecalis, Listeria

monocytogenes y Bacillus cereus; por último en la técnica de congelación a –20ºC

posterior a la desecación con silica gel en discos de gelatina las cepas mayor

preservadas son Salmonella spp, St. epidermidis, St mutans,E. faecium.

El efecto crioprotector del glicerol comprobado en el presente estudio, fue

descubierto por Pollee, Smith y Parkes en 1949; este compuesto químico de bajo peso

molecular, no tóxico, es capaz de penetrar la membrana celular fácilmente y unirse a

cualquiera de los electrólitos que aumentan su concentración durante la congelación,

y a las moléculas de agua que demoran esta misma; atribuyéndosele de esta manera

algunos de los porcentajes más bajos en la mortalidad de varias cepas estudiadas (fig.

No. 12).

Contrario a lo esperado en los bacilos grampositivos esporulados, en donde se

pensaba conseguir un mayor crecimiento o no tener pérdidas de viabilidad en el

proceso debido a la formación de endoesporas que surgen en condiciones ambientales

adversas, como la congelación, los resultados obtenidos pueden ser explicados por la

fase exponencial de crecimiento en la que se encontraban los microorganismos al

momento de ser preservados y el poco tiempo que existe entre esta y la congelación

de la suspención, ya que no se alcanzan a formar las esporas.

5. CONCLUSIONES

§ La pureza de cada bacteria en los diferente métodos de conservación se alcanzo

cumpliendo con uno de los objetivos de la preservación de cepas.

§ La viabilidad bacteriana decrece a medida que transcurre el tiempo de

preservación por lo cual es importante trabajar altas concentraciones iniciales de

las cepas.

§ El daño celular causado por la formación de cristales y el aumento en la

concentración de electrólitos, durante la congelación puede ser evitado mediante

la adición de sustancias criprotectoras como el glicerol y la leche descremada,

pero sus efectos están sujetos a otras variables como las características de los

grupos de microorganismos, la temperatura de almacenamiento y el tiempo de

preservación.

§ Los cocos grampositivos presentan las mayores concentraciones de recuperación

en los tres sistemas evaluados; probablemente por la composición de su pared

bacteriana.

§ No se puede establecer un protocolo universal de conservación para todas las

bacterias, debido a las diferencias entre sus características estructurales y

bioquímicas por lo cual, es necesario evaluar cada especie bacteriana en

diferentes sistemas de preservación.

§ Todos los microorganismos se mantuvieron viables en las tres técnicas de

preservación hasta el final de los intervalos evaluados

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• TORTORA, G. FUNKE, B. AND CASE, CH. Introducción a la microbiología. Zaragoza-España. Editorial Acribia S.A. 1993.

• TSVETKOW , TS. AND BRANKOVA, R.. Viability of Micrococci and

Lactobacilli upon freezing and freeze-Drying in the presence of different cryoprotectants. Criobiology. 1983. 20 (3): 318 – 323.

• VILLALOBOS, M.. Valoración y comparación de tres métodos para la

preservación y conservación del género Micobacterium. Santa fé de Bogota. Tesis pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias Básicas. Depto de Microbiología. Bacteriología. 1995.

• WELLS, J. AND RUSELL, J. Why do many ruminal bacteria die and lise

so quickly. Journal Dairy Science. 1996. 79(8): 1487-1495.

• WESLEY, A. Microbilogía básica. 7ma Edición. Mexico. Editorial Harla S.A.

1996. p.35-87 • YOU, M. NARITA, I. HONDA, T. MIWATANI, T. AND NISHIBUCHI,

M. Comparison of preservation methods for enterotoxigenic Escherichia coli producing heat- labile enterotoxin. Journal of clinical microbiology. 1991. 29(10): 2326-2328.

ANEXO No1.

MEDIO LECHE EN POLVO DESNATADA 10% p/v

(SKIM MILK POWDER OXOID)

El polvo de leche desnatada se utiliza como aditivo porque me jora las condiciones de

crecimiento de los microorganismos presentes. Este producto se puede utilizar solo o

como constituyente de medios de cultivo complejos (Oxoid, 1995).

Composición:

Humedad 5.0%

Cenizas 8.0%

Nitrógeno total 5.3%

Azucares reductores (lactosa monohidrato) 48.0%

Extracto soluble en éter 0.25%

Ingredientes Por litro

Medio leche desnatada al 10% 100g

Agua destilada 1000ml

Preparación

En un erlemeyer de 1000ml, mezclar el polvo de leche desnatada y el agua destilada.

Calentar hasta punto de ebullición para que se disuelva completamente, servir de a

9ml en tubos tapa rosca (16x150mm). Esterilizar en autoclave durante 5 minutos a

121ºC. Hay que tener cuidado de no sobrecalentar en la esterilización para evitar la

caramelización (Oxoid, 1995), guardar en nevera hasta su uso.

ANEXO No.2

CALDO EUGON (EUGONBROTH BBL)

El propósito general del caldo es el cultivo de especies microbianas exigentes. El

caldo Eugon fue designado por Vera para obtener cultivos de bacterias exigentes

incluyendo muchos microorganismos difíciles de cultivar como: Haemophilus,

Neisseria, Brucella y Lactobacillus. El caldo Eugon contiene peptonas, L-cisteina,

dextrosa y sales, todas estos componentes contribuyen al crecimiento bacteriano

(BBL, 1992).

Composición de la formula clásica por litro de agua destilada:

Caseína pancreática asimilada 15.0g

Papaina digerida 5.0g

Cloruro de sodio 4.0g

L- cisteina 0.3g

Sulfito de sodio 0.2g

Dextrosa 5.5g

Ingredientes Por litro

Polvo Eugonbroth 30g

Agua Destilada 1000ml

Preparación

En un erlemeyer de 1000ml mezclar el polvo Eugonbroth con el agua destilada.

Calentar mezclando frecuentemente por un minuto para disolver completamente el

polvo y después hasta punto de ebullición, servir de a 9ml en tubos tapa rosca de

16x150mm. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos (BBL, 1992), guardar en

nevera hasta su uso.

ANEXO No.3

ESCALA Mc FARLAND (Patrón 0.5)

Estos son patrones de turbidez requeridos para curvas de crecimiento y pruebas de

susceptibilidad antimicrobiana.

Ingredientes Por 10ml (Patrón 0.5)

Solución de Cloruro de Bario al 1% (BaCl2) 0.05ml

Solución de ácido sulfúrico al 1% (H2SO4) 9.95ml

Procedimiento

Se miden y sirven los volúmenes anteriormente mencionados en tubos tapa rosca de

16x150m, se almacenan a temperatura ambiente hasta su uso; teniendo la precaución

de cerrar bien el tubo para evitar contaminación.

La concentración bacteriana equivalente al tubo patrón 0.5 de Mc farland es de

1.5x106 bacterias por ml (Mattar y Melo, 1998)

ANEXO No.4

CALDO TRIPTONA SOYA-GLICEROL (10% v/v)

El caldo triptona soya es un medio versátil altamente nutritivo que se recomienda

para uso general del laboratorio en el desarrollo de bacterias y hongos. Debido a la

inclusión tanto de la triptona como de la peptona de soya, el medio favorece un

crecimiento exuberante sin la adición de suero, etc. (Oxoid, 1995). La adición de

agente crioprotector glicerol evita la formación de cristales durante el proceso de

congelación que pueden afectar la integridad celular (Kirsop and Snell, 1984)

Ingredientes Por 50ml

Polvo caldo triptona soya (OXOID) 2.9g

Suero fetal bovino (SFB) (BBL) 1ml

Extracto de levadura (MERCK) 100mg

Glicerol 3% (MERCK) 15ml

Agua destilada 50ml

Preparación

Los ingredientes son mezclados en un erlenmeyer de 100ml sin adición del SFB, se

llevan a punto de ebullición y a esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Por otra parte el

SFB es inactivado a 56ºC por media hora previamente; cuando la mezcla se encuentre

a 37ºC después de esterilizar se añade el SFB pasándolo por un filtro de 0.5um para

evitar la contaminación del medio. Posteriormente es dispensado de a 9ml en tubos

tapa rosca de 16x150mm y almacenado a 4ºC hasta su uso.

ANEXO No. 5

MEDIO GELATINA NUTRITIVO

La gelatina es una proteína del colágeno utilizada para solidificar medios de cultivo,

que se obtiene por hidrólisis ácida a partir de materias primas de origen animal

(Merck, 1994; Oxoid 1995).

Ingredientes Por 100ml

Polvo gelatina (BBL) 10g

Caldo nutritivo No2 (OXOID) 2.5g

Glucosa (MERCK) 5g

Agua destilada 100ml

Preparación

Se mezclan los sólidos en un recipiente, se disuelven suavemente calentando hasta

punto de ebullición, después se dispensan de a 9ml en tubos tapa rosca 16x150mm y

se esterilizan en autoclave por 15 minutos a 121ºC.

ANEXO No. 6

CATALASA (MERCK)

Fundamento

La catalasa es una enzima que se encuentra en todas las células con metabolismo

aerobico. Contiene hemina como grupo activo. La catalasa transforma el peróxido de

hidrógeno tóxico, formado durante el proceso metabólico en agua y oxígeno. La

presencia o ausencia de actividad de la catalasa es una característica taxonómica de

los microorganismos y se utiliza en este sentido para su diferenciación o

identificación.

Composición:

Solución acuosa al 3% de peróxido de hidrógeno.

Empleo e interpretación:

Utilizando un asa de platino se toma una porción de la colonia a investigar y se

coloca sobre un portaobjetos seco. Sobre la masa de bacterias se deposita una gota de

reactivo de catalasa.

Reacción positiva: Desprendimiento inmediato de gas oxígeno sobre la masa de

bacterias.

Reacción negativa: No hay desprendimiento de gas.

Reacción Microorganismos

Catalasa-negativa Anaerobios, Anaerobios aerotolerantes,

lactobacteriáceas, estreptococos y otros.

Catalasa-positiva Aerobios, Propionibacterias, estafilococos

enterobacteriaceas y otros.

ANEXO No. 7

PRODUCCION DE COAGULASA

Esta prueba es usada universalmente desde hace muchísimos años y es aceptada

como el mejor criterio para la identificación de Staphylococcus patógenos más

comunes como el St. aureus en humanos(Sánchez, 1994)

Procedimiento:

Esta prueba debe realizarse en tubo utilizando plasma humano o de conejo estériles,

se prepara una suspensión de varias colonias de un cultivo que tenga 18 a 24 horas de

incubación, en 0.5ml de caldo nutritivo (OXOID), agregar 1ml de plasma fresco e

encubar a 37 grados centígrados.

Interpretación:

Observar a partir de las cuatro horas siguientes para ver la formación de coágulos.

Generalmente el St. aureus puede coagular el plasma en este periodo de tiempo; en

ocasiones puede demorar de 8 a 16 horas. Si el tiempo de incubación se prolonga de

un día para otro debe tenerse en cuenta que la producción de estafiloquinasa por

algunas cepas de St. aureus puede lisar el coágulo formado dando resultados falsos

negativos (Sánchez,1994).

ANEXO No. 8

RESISTENCIA A LA NOVOBIOCINA

Dentro de las especies clínicamente importantes de Staphylococcus: aureus,

epydermidis y saprophyticus, la prueba de resistencia a la novobiocina a una

concentración mayor de 1.6µg/ml, resulta util para identificar al St. saprophyticus,

pues es el único que presenta resistencia (Brock, 1991).

Procedimiento:

Se utilizan discos de sensibilidad antibiótica de 5µg/ml. Se prepara una suspensión de

la colonia que tenga turbidez 0.5 en la escala de Mac-Farland, esta suspensión se

siembra con un hisopo de algodón sobre una caja de agar Mueller Hinton y se coloca

un disco de novobiocina sobre la superficie de la caja ya sembrada. Se encuba por 18

a 24 horas a 37°C y se lee la zona de inhibición (Sánchez, 1994).

Interpretación:

Si la zona de inhibición tiene un halo de inhibición menor o igual a 16mm se

considera resistencia positiva a la novobiocina (Sánchez, 1994).

ANEXO No. 9

PRUEBA DE LA DNasa (MERCK)

Según el método de Jeffries et al.(1957), este medio se usa en la identificación de

microorganismos sobre todo de Staphylococcus DNasa positivo.

Fundamento:

Las colonias formadoras de DNasa hidrolizan a su alrededor, el ácido (DNA)

contenido en el medio de cultivo. Posteriormente se acidifica el conjunto con HCl 1N

con lo cual precipita el DNA (turbidez), en tanto que las colonias DNasa positiva

presentan a su alrededor los correspondientes halos de aclaración.

Composición (g/litro):

Triptosa 20,0

Cloruro sódico 5.0

Acido desoxirribonicleico 2.0

Agar-agar 15.0

Preparación:

Disolver 42g en un litro se agua destilada, esterilizar en autoclave (15 minutos a

121°C) y verter en placas. Almacenar en refrigeración hasta su uso.


Sembrar en superficie, por estría, el agar de ensayo con un cultivo puro de material

sometido a investigación. Sobre la misma placa se siembran varias cepas en forma de

bandas paralelas., posteriormente se encuban de 18 a 24 horas a 37°C en el caso de

los Staphylococcus.

Microorganismos Dnasa-positivos: Halos de aclaración perfectamente delimitados,

constrando con el medio de cultivo.

Microorganismos Dnasa-negativos: Sin formación de halo.

ANEXO No. 10

HEMOLISIS EN AGAR SANGRE DE CORDERO

Fundamento:

El agar sangre es un medio con propiedades nutritivas que permite el crecimiento de

la mayoría de microorganismos; es adecuado para el crecimiento de microorganismos

patógenos muy exigentes y especialmente diseñado para mejorar las reacciones

hemolíticas de estos (Mattar y Melo, 1998).


Triptona 14

Peptona 4.5

Extracto de levadura 4.5

Cloruro de sodio 5.0

Agar- agar 12.5

Preparación:

Suspender 40g en un litro de agua destilada y llevar a ebullición hasta su completa

disolución. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos, enfriar a 50°C y

agregar asépticamente 7% (v/v) de sangre de cordero estéril. Servir encajas de petri y

almacenar en refrigeración hasta su uso.


La colonia a investigar se sembró por el método de aislamiento sobre una caja de agar

sangre de cordero y se lleva a incubar a 37°C por 24 horas.

La hemólisis producida en glóbulos rojos de cordero puede ser:

Alfa: cuando se presenta una destrucción parcial de eritrocitos alrededor de la

colonia, produciendo coloración a verde-marrón del medio de agar sangre

(St.pneumoniae, o St. viridans).

Beta hemólisis: una zona clara decolorada alrededor de la colonia, por destrucción

total de los eritrocitos puede observarse perfectamente (St pyogenes grupo B o St.

agalactiae).

Gamma hemólisis: no hay actividad hemolítica aparente (St. viridans o

Enterococcus).

ANEXO No. 11

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A OPTOQUINA (OXOID)

Bowers y Jeffries demostraron que existe una correlación completa entre la

solubilidad en bilis y la sensibilidad total a la “Optoquina” para la diferenciación de

St. pneumoniae de St. viridans. Los discos de optoquina oxoid están impregnados con

clorhidrato de etilhidrocupreína proporcionando un sistema sustitutivo cómodo y

fiable a la prueba de solubilidad en bilis (Oxoid, 1995).


Se sembró en estría masiva un cultivo puro del organismo a probar a través de la

mitad de una placa de agar sangre y se aplica un disco de optoquina, inmediatamente

antes de la incubación. Al mismo tiempo, se aplico un segundo disco de optoquina a

la otra mitad de la placa con un neumococo conocido, para proporcionar un control

positivo; y se llevo a incubación por 24 horas a 37ªC., transcurrido este tiempo se

observo deacuerdo a los siguientes parámetros:

◊ Sensible: zona de inhibición de al menos 5mm a partir del borde del disco

(neumococos).

◊ Resistente: sin halo de inhibición o con una pequeña zona que no se extiende mas

allá de 5mm a partir del borde del disco (St. Viridans).

ANEXO No. 12

PRUEBA DE BILIS ESCULINA EN AGAR (OXOID)

Fundamento:

Esta medio evalúa la capacidad de las bacterias para hidrolizar esculina a esculetina y

formar glucosa en presencia de bilis, este producto final de mezcla con iones hierro

III, dando un color verde oliva a negro (Oxoid, 1995). Se utiliza corrientemente para

diferenciar especies de Enterococcus (reacción positiva), Enterobacteriaceae, Listeria

monocytogenes y organismos anaerobios(Oxoid, 1995).

Composición (g/L)

Extracto de carne 3

Peptona de carne 5

Bilis de buey 5

Esculina 40

Citrato férrico 0.5

Agar 14.5

pH 6.6+- 0.1

Preparación:

Se suspenden 64gr en un litro de agua destilada; se lleva a esterilizar en autoclave a

121ºC por 15 minutos; y es servido en cajas de petri almacenadas en refrigeración a

5ºC hasta su uso.


Se siembra la caja por el método de aislamiento, tomando de 1-2 colonias del

microorganismo en estudio y se lleva a incubación a 37ºC durante 24 horas;

Considerando como reacción positiva un cambio de color del medio a verde

oliva/negro; o como reacción negativa si no hay cambios en el color original del

medio (Oxoid, 1995).

ANEXO No. 13

CRECIMIENTO EN NaCl

Fundamento:

La prueba de tolerancia a la sal (NaCl 6.5%) puede diferenciar fácilmente entre los

grupos D enterococo y grupo D no enterococo. El grupo D enterococo (E. faecalis, E.

faecium y E durans) resisten una concentración de 6.5% de NaCl adicionado a un

caldo nutritivo desarrollándose allí, enturbiamiento del caldo de cultivo (Sánchez,

1998).

Preparación:

A 100ml de caldo nutritivo (Oxoid) se añaden 6.5g de NaCl (Merck), se mezcla y es

llevado a punto de ebullición para posteriormente ser dispensado de a 2.5ml en tubos

de ensayo y llevados a esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos; Los cuales

son almacenados a 5ºC hasta su uso.

Empleo e Interpretación:

Se toma una colonia del microorganismo a estudiar en cultivo puro, con un asa

estéril para ser mezclada en el tubo de caldo con NaCl al 6.5%; el conjunto es

llevado a incubación por 24-48 horas considerándose como positivo un

enturbiamiento del caldo (Sánchez,1998).

ANEXO No.14

TRIPLE AZUCAR HIERRO (TSI)(OXOID)

Fundamento:

El medio tiene como objetivo identificar si los microorganismos realizan o no 4

procesos bioquímicos a saber:

o Fermentación de azucares (lactosa, sacarosa, Glucosa) – Cuando se fermenta un

azúcar este da productos de carácter ácido lo cual hace que de acuerdo al

indicador el medio vire a ácido (Amarillo).

o Formación de H2S - Algunos microorganismos transforman el tiosulfato de sodio

en sulfuro de hidrógeno (H2S) el cual reacciona con las sales de hierro que tiene el

medio y forma un precipitado negro insoluble (sulfuro ferroso). Para que un

microorganismo produzca H2S necesariamente necesita un medio ácido, ya que en

este medio se proporcionan los hidrogeniones (H2) que forman el H2S, razón por

la cual esta formación solo se da cuando el medio esta amarillo (ácido por la

fermentación).

o Producción de CO2 (gas) – Algunos microorganismos no solo tienen la capacidad

de fermentar los azucares sino también de decarboxilarlos hasta CO2, fenómeno

que se observa por desplazamiento del medio o formación de burbujas.

o Degradación aeróbica de aminoácidos – En la parte superior o pico del medio hay

microorganismos que en presencia de oxigeno son capaces de desdoblar péptidos

en aminoácidos, los cuales ricos en sus grupos amina (grupo básico) viran el color

del medio a púrpura o rojizo.

Composición (g/l):

Lab-lemco en polvo 3.0


Peptona 20.0


Lactosa 10.0

Sacarosa 10.0

Dextrosa 1.0

Citrato férrico 0.3

Tiosulfato de sodio 0.3

Agar 12.0

Preparación:

Se suspenden 65g en 1 litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por

completo. Se mezcla bien y es distribuido en tubos de ensayo. Se esteriliza en el

autoclave a 121°C durante 15 minutos, para seguidamente solidificar el medio en

posición inclinada para formar un fondo de aproximadamente una longitud de 2.5cm.


Con una colonia aislada en un medio selectivo por picadura, se inocula el tubo de TSI

y lisina hierro Agar (LIA) y es llevado a incubación por 24 horas para la posterior

lectura de los siguientes parámetros:

Fermentación de azúcares: Positivo = ácido (color amarillo), Negativo = alcalino o no

cambio (color púrpura para alcalino o naranja para no cambio).

Formación de H2S: Positivo = color negro, negativo = no color.

Producción de CO2: Positivo = gas, Negativo = no gas.

Degradación de aminoácidos: Positivo = púrpura, Negativo = cualquier otro color.

ANEXO No.15

AGAR LISINA HIERRO (LIA) (BBL)

Fundamento:

Este medio es muy útil para la demostración simultanea de lisina decarboxilasa (LD)

y formación de ácido sulfihídrico para la identificación de la familia

Enterobacteriaceae. La lisina al ser decarboxilada por microorganismos LD-positivo,

se transforma en cadaverina, amina que en medio ácido provoca el viraje del

indicador púrpura de bromocresol, en el cual la lectura es K/K. Los microorganismos

LD-negativo fermentadores de glucosa producirán un viraje a amarillo de la totalidad

del medio, la lectura es A/A. Los géneros Proteus, Providencia y Morganella

desaminan la lisina generando ácido α-acetocarbónico, que forma compuestos rojizos

al mezclarse con sales de hierro en presencia de oxígeno; la lectura es R/A.

Composición (g/l):

Gelatina pancreática digerida 5.0


Dextrosa 1.0

L- lisina 10.0

Citrato amonio férrico 0.5

Tiosulfato sódico 0.04

Púrpura de bromocresol 0.02

Agar 13.5

Preparación:

Se reconstituyen 33g de medio en un litro de agua destilada mezclando; seguidamente

se calienta bajo constante agitación hasta que se disuelva por completo y es

distribuido en tubos de ensayo, para ser esterilizados en autoclave a 121ºC durante 15

minutos y dejar enfriar en posición inclinada.

Empleo e Interpretación:

Este medio se inocula paralelamente al de TSI y es llevado a incubar por 24 horas

a37ºC. La lectura se realiza con estos parámetros: La decarboxilación de la lisina es

detectada en el medio por una reacción alcalina púrpura en el fondo. La deaminación

de la lisina es detectada por el color rojo en el medio en la parte superior. Producción

de sulfuro de hidrógeno es evidenciada por la presencia de un precipitado negro. Una

reacción negativa (púrpura en la superficie y amarilla en el fondo) indica la

fermentación de la lactosa solamente. (BBL, 1992)

ANEXO No. 16

AGAR CITRATO SIMONS (BBL)

Este agar es usado para la diferenciación de bacterias gram negativas sobre la base la

utilización del citrato. Koser en 1923, desarrollo un medio liquido consistente de

sales inorgánicas en las cuales la sal de amonio fue la única fuente de nitrógeno y el

citrato la única fuente de carbono para diferenciar especialmente las cepas de E. coli y

Enterobacter aerogenes como parte de las reacciones IMViC (Indol-Rojo de metilo-

Voges Proskauer-Citrato). Simmons en 1926 modifico la formulación de Koser con la

adición de 1.5%de agar y azul de bromotimol (BBL, 1992).

Fundamento:

Los organismos hábiles para utilizar el amonio dihidrógeno fosfato y el citrato de

sodio como las únicas fuentes de nitrógeno y carbono respectivamente pueden crecer

sobre este medio y producir una reacción alkalina evidenciada por una cambio de

color del indicador azul de bromotimol de verde (neutro) a azul (alkalino) (BBL,

1992)

Composición (g/l):

Amonio dihidrógeno fosfato 1.0

Fosfato dipotásico 1.0

Citrato de sodio 2.0


Sulfato de magnesio 0.2

Agar 15.0

Azul de bromotimol 0.08

Preparación:

Se suspenden 24.2g del medio en 1 litro de agua destilada y se mezcla, a continuación

es disuelto totalmente bajo constante agitación por calor, dispensado en tubos de

ensayo esterilizado a 121°C por 15 minutos, que posteriormente se dejan solidificar

inclinados y se almacenan en refrigeración hasta su uso.


El agar es inoculado con una colonia de cultivo bacteriano pura de la bacteria a

investigar, y el conjunto llevado a incubación por 24-48 horas a 37ºC.

Si hay solo crecimiento, la prueba debe interpretarse como positiva porque indica que

la bacteria utilizó como única fuente para su subsistencia el carbono contenido en el

citrato sódico. Si el crecimiento esta acompañado por un color azul indicará la

presencia de productos alcalinos, originados por la acción de la bacteria sobre el

fosfato de amonio extrayendo su nitrógeno y convirtiéndolo en un producto

fuertemente básico que es el amoniaco, producto que vira el pH del medio

manifestado por el cambio de color del indicador de pH a este color azul.

Se informa como positivo ya sea por el crecimiento o cambio de color a azul y como

negativo el no crecimiento y permanencia del color verde original.

ANEXO No.17

AGAR SULFURO INDOL MOTILIDAD (SIM) (BBL)

Es un medio para la diferenciación de Enterobacteriaceae sobre la base de producción

de ácido sulfhídrico evidenciable por coloración negra debido a la unión de sales

ferrosas; por la producción de indol a partir de triptófano visualizable al adicionar el

reactivo de Kovacs y por la motilidad de las bacterias gracias a la baja concentración

de agar que se emplea (BBL,1992).

Fundamento:

Los ingredientes del medio SIM permiten la determinación de tres actividades por las

cuales las bacterias entéricas pueden ser diferenciadas. El tiosulfato de sodio y el

sulfato de amonio ferroso son indicadores de la producción de sulfuro de hidrogeno.

El sulfato de amonio ferroso reacciona con el gas H2S par producir sulfuro ferroso,

un precipitado negro. La peptona de caseina es rica en triptofano, la cual es atacada

por ciertos microorganismos resultando la producción de indol; el cual es detectado

por la adición de reactivos químicos después del periodo de incubación . La detección

de motilidad es posible debido al naturaleza semisólida del medio, un crecimiento

irradiado hacia fuera de la línea central de inoculación indica que el organismo es

motil (BBL, 1992).

Composición (g/l):

Digerido pancreático de caseina 20

Digerido péptico de tejido animal 6.1

Sulfato amonio ferroso 0.2

Tiosulfato sódico 0.2

Agar 3.5

Preparación:

Suspender 30g en un litro de agua destilada, llevar a ebullición hasta su completa

disolución y distribuir en tubos. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos y

dejar enfriar el tubo en posición vertical.


Se emplea una pequeña colonia de la cepa pura en estudio, la cual es inoculada por

picadura con aguja a dos tercios de distancia del botom en el centro del tubo, y

posteriormente se llevan a incubar por 18-24 horas a 37ºC. Pasado este tiempo se

puede verificar la motilidad por el crecimiento difuso sobre la línea recta sembrada

por profundidad en el medio; sobre la misma zona se detecta la producción de H2S

por la presencia de color negro y por último la reacción indol positiva se evidencia

por la presencia de color rojo sobre la superficie del agar después de agregar 3 a 4

gotas de reactivo de Kovacs (BBL, 1992).

ANEXO No.18

AGAR UREA (OXOID)

Fundamento:

Es un medio útil para la diferenciación de Entero-bacteriaceae productoras de ureasa.

La urea al ser hidrolizada produce amonio que reacciona en solución formándose

carbonato de amonio, compuesto que vira el indicador rojo de fenol (Oxoid, 1995).


Peptona 1

Dextrosa 1

Cloruro de sodio 5

Fosfato disódico 1.2

Fosfato de potasio 0.8

Mezcla de sales biliares 1.5

Rojo de fenol 0.012

Agar 15

PH 6.8 +-0.1

Preparación:

Se pesan 50g de agar base urea para ser mezclados con un litro de agua destilada y

llevados a ebullición hasta su completa disolución: esterilizado por 20 minutos en

autoclave a 121ºC. Se enfría hasta 50ºC y se la adiciona 5ml de solución urea estéril

al 40% en condiciones asépticas. Servir en tubos y dejar enfriar en posición inclinada,

almacenar en refrigeración hasta su uso.


Se siembra inóculo abundante sobre la superficie del Agar Urea inclinado con un

cultivo puro del microorganismo a ensayar. Una reacción positiva se observa en los

organismos que hidrolizan la urea para formar amoniaco cambiando el medio por el

viraje del indicador a un color rojo púrpura, una reacción negativa se evidencia por el

no cambio del medio (Oxoid, 1995).

ANEXO No. 19

ROJO DE METILO – VOGES PROSKAWER (DIFCO)

fundamento:

Este medio de cultivo sirve primordialmente para la diferenciación bioquímica del

grupo Coli-Enterobacter. El principio de la prueba es determinar el tipo de

fermentación (Acido mixta o Butielenglicolica) que siguen los microorganismos a

partir de la glucosa.

Composición Caldo RM-VP (g/litro)

Peptona de carne 7.0

Glucosa 5.0

Tampón de fosfato 5.0

Preparación:

Se disuelven 18g en un litro de agua destilada, se distribuye de 5ml en cada tubo de

ensayo y se lleva a esterilizar a 121ºC por 15 minutos.


Los microorganismos inicialmente se siembran en un medio que contenga una fuente

primaria (glucosa) (Caldo RM-VP de Merck) y son incubados de 24 a 48 horas a

37ºC, posteriormente se dividen en dos tubos: Uno marcado como RM y otro como

VP. Al tubo marcado como RM se le adiciona de 1 a 2 gotas de rojo de metilo y al

marcado como VP se le agrega primero una gota de KOH y luego una de α-naftol-

creatina.

Interpretación (Rojo de metilo): Los microorganismos son capaces de desdoblar la

glucosa hasta ácido pirúvico (glucólisis) y a partir del ácido pirúvico pueden tomar

varias vías: unas originan ácidos fuertes como el ácido acético, ácido butírico, ácido

fórmico, ácido succínico, ácido propiónico, otras originan otros compuestos

orgánicos como alcoholes (Etilico y butírico), productos que en conjunto se llaman

ácidos mixtos (ácidos + alcoholes) y que tienen la particularidad de acidificar el

medio, razón por la cual cuando se agrega el rojo de metilo este vira hacia el lado

ácido dando un color rojizo al medio. Cuando la prueba da positiva se concluye que

el microorganismo tiene fermentación ácido mixta (colores rojos). El color rojo

indica positividad de la prueba y el no cambio de color indica que esta es negativa.

Interpretación Voges Proskawer: Algunos microorganismos no toman la vía

anteriormente descrita sino que el ácido pirúvico lo desdoblan en acetoína y butilén

glicol (colores azules). Al alcalinizar el medio con KOH y O2 atmosférico convierten

la acetoína (acetil metil-carbinol) en diacetilo y este diacetilo queda libre para que al

agregar el α-naftol-creatina esta lo convierte en un producto coloreado rojizo.

Aquellos microorganismos que son capaces de seguir esta vía y reaccionan con estos

reactivos se les ubica dentro de una fermentación Bultilen glicolítica ya que este es el

producto final de esta vía. El colo r rojo indica positividad de la prueba y el no cambio

de color indica que esta es negativa.

ANEXO No. 20

AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (MODIFICADO) (EMB)(OXOID)

Fundamento:

Es un medio para el aislamiento y diferenciación de organismos del tipo coliforme

como: E. coli y Enterobacter, según Levine (1818-1820). Los colorantes contenidos

en su fórmula inhiben a muchos gérmenes Gram positivos de acompañamiento.

Gracias a los dos indicadores que contiene el medio, eosina y azul de metileno se

evidencia la fermentación de la lactosa (Oxoid 1995).

Composición (g/l):

Peptona 10.0

Lactosa 10.0

Fosfato dipotásico 2.0

Eosina amarillenta 0.4

Azul de metileno 0.065

Agar 15.0

Preparación

Se disuelven 37.4g/L, y son llevados a ebullición hasta su completa disolución y

esterilizados en autoclave a 121ºC durante 15 minutos posteriormente se vierte en

cajas de petri, y son almacenadas en refrigeración a 4ºC hasta su uso. Las placas con

medio de cultivo son claras y de color rojo pardusco.

Empleo e interpretación

Este medio de cultivo se sembró finamente, por el método de estría única con las

cepas E, coli, Salmonella spp y Shigella spp, se incuba 24 horas a 37ºC para obtener

las siguientes colonias características

♦ E.coli: Colonias de 2 a 3mm de diámetro, con brillo metálico verdoso a la luz

reflejada, con centro oscuro hasta negro en luz transmitida (Oxoid, 1995).

♦ Salmonella-Shigella: Colonias transparentes, de color ámbar (Oxoid, 1995).

ANEXO No. 21

AGAR BASE COLUMBIA (MERCK)

Fundamento:

Este medio completo de gran calidad, es utilizable, tanto para el cultivo de

microorganismos, incluso exigentes, como también como base para la preparación de

diversos medios de cultivos especiales (Ellner et al, 1966).

Composición (g/l):

Sustrato nutritivo especial 23.0

Almidón 1.0

Cloruro sódico 5.0

Agar-agar 13.0

Preparación

Los ingredientes se mezclan en un erlemeyer de 1000ml, se calienta hasta punto de

ebullición, y se esteriliza en autoclave por 15 minutos a 121ºC, luego se vierte en las

cajas de petri y se almacena en refrigeración a 4ºC hasta su uso. Las placas con el

medio base son claras e incoloras (Merck, 1994).


Este medio de cultivo se sembró finamente, por el método de estría única con las

cepas de grampositivas y esporulados del trabajo para ser llevados a incubar por 24

horas a 37ºC y después observar sus la morfología de sus colonias características y

pureza.

ANEXO No. 22

TINCION DE GRAM (MERCK)

La coloración de Gram fue desarrollada por Christian Gram en 1823. En el proceso

de tinción los colorantes anilinicos se fijan, bajo la acción posterior al yodo, en la

pared celular de las bacterias, formando un complejo de yodo. Con este

procedimiento de tinción, las bacterias pueden clasificarse en gram-negativas y gram-

positivas. En las bacterias gram positivas el complejo de colorante-yodo no se puede

eliminar de las células utilizando decolorantes como alcohol o acetona. Las células

permanecen teñidas de color azul-violeta. En las bacterias gram-negativas, el

complejo colorante-yodo puede eliminarse y las células se tiñen de color rosa a rojo

con una contratinción con Fucsina o de color anaranjado con Safranina (Merck,

1994).

Reactivos y preparación:

CRISTAL VIOLETA

◊ Solución A: se prepara triturando 2 g de cristal violeta en mortero, agregando

poco a poco 20ml de etanol al 95%, y se lleva a frasco ámbar.

◊ Solución B: disolver 0.8g de oxalato de amonio en 80ml de agua destilada.

◊ Solución de trabajo: en frasco ámbar, diluir la solución A en proporción 1:3 y

adicionar 4 partes de solución B. conservar durante 24 horas antes de su uso y

seguidamente filtrar para su empleo.

LUGOL DE GRAM

Se colocan en un mortero 1g de yodo y 2g de yoduro de potasio y se agregan 300ml

de agua destilada poco a poco y almacenar en frasco ámbar.

DECOLORANTE

Alcohol etílico de 95º.

SAFRANINA

◊ Solución madre: se trituran 2.5g de Safranina en mortero, agregando poco a poco

100ml de etanol de 95º y se llevan a frasco ámbar.

◊ Solución de trabajo: en otro frasco ámbar se agrega 10ml de solución madre

filtrada, con 90ml de agua destilada.

Técnica:

Se toma una lamina porta-objetos limpia en la cual se realiza una emulsión de la

bacteria pura con una pequeña gota de agua, posteriormente la lamina se deja secar y

es fijada al calor en un mechero de gas. Se inicia el proceso de tinción de acuerdo a

los tiempos establecidos en cada laboratorio para este caso son los siguientes:

◊ Se cubre la lamina con cristal violeta por 1 minuto.

◊ Lavar con abundante agua destilada y escurrir.

◊ Aplicar el lugol de gram por 1 minuto.


◊ Agregar solución decolorante por 15 segundos.


◊ Cubrir con Safranina por 4 segundos.


◊ Dejar secar al aire libre y observar al microscopio en lente de 100x con aceite de

inmersión.

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COMPARACION DE TRES TECNICAS DE PRESERVACION POR