ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté

UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS

DE TOURS

ÉÉCCOOLLEE DDOOCCTTOORRAALLEE «« SSaannttéé,, SScciieenncceess,, TTeecchhnnoollooggiieess »»

Service de Parasitologie - Mycologie - Médecine Tro picale, Faculté de Médecine

THÈSE présentée par :

Kamla MUSTFA

Soutenue le : 16 Décembre 2011

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais

Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie / Parasitologie

EFFETS DES ANTIPALUDIQUES SUR LES STADES HÉPATIQUES ET LES STADES SEXUÉS (TRANSMISSION)

D’UNE PLASMODIE MURINE PLASMODIUM YOELII

THÈSE dirigée par : M. RICHARD-LENOBLE Dominique Professeur, Université de Tours

RAPPORTEURS :

M. CHABASSE Dominique Professeur, Université d’Angers M. DANIS Martin Professeur émérite, Université de Paris VI

JURY : M. CHABASSE Dominique Professeur, Université d’Angers M. CHANDENIER Jacques Professeur, Université de Tours M. DANIS Martin Professeur émérite, Université de Paris VI MME. LANDAU Irène Professeur émérite, Muséum National d'Histoire

Naturelle de Paris M. RICHARD-LENOBLE Dominique Professeur, Université de Tours

MEMBRE INVITE : M. DUONG Thanh Haï Docteur, Université de Tours

Je dédie ce travail à ma famille et à mes proches.

Je n’ai pas besoin de vous dire combien je vous aime et que c’est votre

confiance en moi et vos encouragements qui m’ont aidé à supporter les

difficultés de l’éloignement.

C’est à vous ainsi qu’à vos familles que je dois toute ma reconnaissance :

à ma mère Salma,

mes sœurs Hawa, Radia, Ssaliha, Magbola, Aziza et ma petite sœur

Naïma,

mes frères Faraj et Ahmad.

A la mémoire de mon père Abdelrahim Al HUSSEIN MUSTFA

2

Remerciements

Tout d’abord, toute ma reconnaissance va aux membres des équipes qui m’ont accueillie et

permis de réaliser cette thèse. Ainsi, je remercie :

À Tours

Le laboratoire de Parasitologie - Mycologie - Médecine tropicale

- Mon directeur de thèse, le professeur Dominique RICHARD-LENOBLE pour m’avoir

consacré du temps, pour ses précieux conseils et pour ses passionnantes anecdotes.

- Je remercie le docteur Thanh Haï DUONG ainsi que le professeur Jacques

CHANDENIER pour leurs conseils, leur soutien, leurs encouragements, leurs

corrections.

- Je remercie le docteur Nathalie VAN LANGENDONCK, pour la patience et la

disponibilité dont elle a su faire preuve pour m’initier à la PCR quantitative en temps

réel, ainsi que toute l’équipe du service de Parasitologie-Mycologie Médecine tropicale

du CHU de Bretonneau à Tours.

- Je tiens également à remercier, plus particulièrement, certaines personnes pour leurs

conseils et leurs qualités humaines, mesdames Jeannine BRISACIER et Dominique

VINCENT.

- Un grand merci à Monsieur Alain FERRER pour ses encouragements et ses conseils

scientifiques avisés.

L’équipe de l’animalerie. Merci à tous, notamment à Jérôme MONTHARU et Georges

ROSEAU.

Le service de Microscopie électronique du CHU Bretonneau. Je remercie le professeur Brigitte

ARBEILLE, Rustem UZBEKOV ainsi que tous les membres du service pour leur collaboration

et l’apprentissage de leur technique.

À Paris

Le Muséum National d’Histoire Naturelle

Je remercie en particulier Madame le professeur Irène LANDAU qui m’a co-dirigée sur une

grande partie de ce travail. Sa disponibilité, ses conseils, son encadrement, sa patience ont toute

ma reconnaissance. Jean-Marc CHAVETTE et Madame Françoise GONNET pour m’avoir aidé

3

à la préparation de la collection de moustiques nécessaires à mes expériences. Enfin, Monsieur le

professeur Alain CHABAUD pour ses conseils.

Je souhaite ici remercier toutes les personnes qui m’ont aidé à réaliser des manips, à

résoudre des difficultés techniques, à me fournir des échantillons ou même pour les simples

discussions enrichissantes, aussi bien dans notre service à Tours qu’au muséum d’Histoire

Naturelle de Paris.

Merci également aux membres de jury et qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde

gratitude d’avoir accepté de juger mon travail.

De grands remerciements pour ma deuxième famille en France (créée au labo !) : Krystina

MENGUE ME NGOU (mon âme sœur), Christophe RANDIER, (mon grand frère) et Martine

BERTON (ma grande sœur) pour leur présence, leur soutien et leurs encouragements : ils étaient

autour de moi dans les moments difficiles ou heureux ; je n'oublierai pas les moments de joie que

nous avons partagé ensemble. Je n’oublie pas non plus Charles DOUCHET pour son soutien

moral et sa bonne humeur. De même, Madame Michèle BOIRON qui m’a aussi soutenue tout au

long de ses années.

Je remercie également mes amies SHATHA, SAHAR et MANEL et leurs maris

MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à

remercier toute la communauté libyenne de Tours à travers LAÏLA, NADIA, ZAHRA, HANAN,

AMEL, HADEL, Hassan ALSGIR, Hassan ALDROE et Saleh ALSALEH.

4

Résumé

La chimie trouve encore sa place dans la prise en charge du paludisme entre la vaccination

très attendue et la moustiquaire imprégnée d’insecticides de plus en plus utilisée. Au cours de

son cycle, l’hématozoaire évolue en trois grandes périodes : l’impaludation correspondant au

développement intrahépatique des formes infectantes venues du moustique vecteur, la période de

la multiplication intra-érythrocytaire, la plus bruyante où l’action thérapeutique est primordiale,

enfin, la phase sexuée du parasite où les gamétocytes assurant la pérennité de l’espèce chez le

moustique vecteur. Le but de notre travail est d’étudier l’action de médicaments classiquement

efficaces sur les formes sanguines au niveau des formes intrahépatiques, assurant le

développement des formes asexuées et sexuées (gamétocytes). Ces dernières, en rapport avec la

transmission du paludisme. Il s’agit d’une étude expérimentale sur un modèle animal :

Plasmodium yoelii entretenu sur souris Swiss avec le vecteur Anopheles stephensi dont le cycle

parasitaire et le mode de transmission du parasite sont proches de ceux du paludisme humain.

Ont été testées : la Malarone®, la primaquine, la ferroquine et l’artésunate (dérivé de

l’artémisinine). L’activité sur le stade intrahépatique du parasite murin est étudiée par PCR

quantitative en temps réel. L’efficacité de la Malarone® sur le stade intra-hépatique est totale,

contrairement aux autres antipaludiques ayant une activité partielle. L’étude sur la

gamétocytogénèse et la transmission par la ferroquine et l’artésunate, prescrites à doses

infracuratives sur les formes asexuées, est mesurée quantitativement par la mesure de la

gamétocytémie et qualitativement en comptant la quantité d’oocystes (développés sur l’estomac

du moustique) témoins de l’activité des gamétocytes. Des lots de 30 moustiques se sont gorgés

avant traitement et 1h30 et 5 heures à la suite de la prise de thérapeutique. Quantitativement, on

note une augmentation des gamétocytes circulants quel que soit le médicament ou la dose (5 ou

10 mg/kg). Pour l’artésunate à 5 mg/kg, on a pu noter que la gamétocytémie était pratiquement

double de celle des témoins. Par contre, qualitativement, les premiers résultats (en microscopie

optique et électronique) montrent des altérations morphologiques des gamétocytes circulants

(amas de pigments, latéralisation des gamétocytes dans l’hématie) et une moindre infectivité des

gamétocytes pour les moustiques gorgés 1 et 5 heures après la prise de thérapeutique. Nous

avons statistiquement pu démontrer que l’infectivité des gamétocytes mesurée par la quantité

d’oocystes comptés sur l’estomac du moustique, était respectivement diminuée de 70 % pour la

ferroquine et de 85 % pour les souris traitées par l’artésunate. Des études complémentaires

chercheront à préciser les populations (âge) de gamétocytes atteintes par les thérapeutiques et

l’importance et la nature des altérations morphologiques des gamétocytes traités.

5

Résumé en anglais

Chemistry still has a role in the management of malaria, alongside the mosquito netting

soaked in insecticide that is used increasingly, as we continue to await the long anticipated

vaccine. During its cycle, the hematozoon parasite develops through three major periods.

The first, malarial infection corresponds to the intrahepatic development of infective forms

from the mosquito vector; this period is not sensitive to treatment and is often asymptomatic.

The period of erythrocytic schizogony is the most urgent, and treatment activity is primordial.

Finally, the phase of sexual reproduction, when gametocytes develop within the erythrocytes

ensures the perpetuation of the species when these reach the blood-feeding vector mosquitoes.

The aim of our work was to study the effect on the forms intrahepatic and the forms sexual

gametocytes of drugs known to be effective on the asexual blood forms of the protozoan and

thus the potential repercussions on malaria transmission. This experimental study was conducted

with an animal model Plasmodium yoelii, maintained on Swiss mice, with the Anopheles

stephensi vector whose parasite cycle and modes of transmission are close to those of human

malaria. We tested: Malarone®, primaquine, ferroquine and artesunate (a derivative of

artemisinin). The activity on the stage of the parasite intrahepatic mouse was studied by

quantitative real-time PCR. The efficacy of Malarone ® on the intrahepatic stage was total,

contrary to the others antimalarials, who have a partial activity. The efficacy of ferroquine and

artesunate, prescribed at doses subcurative for the asexual forms, were tested against gametocyte

production, quantitatively by counting them in the blood and qualitatively by counting the

quantity of oocysts developed on the mosquito’s midgut, which are indicators of gametocyte

activity. Lots of 30 mosquitoes fed on each mouse before treatment and 5 hours after treatment.

Quantitatively, it had noted an increase circulating gametocytes, regardless of drug or dose (5 or

10 mg/kg). For artesunate at 5 mg/kg, we noted that the blood gametocyte level was almost

double that of the controls. On the other hand, qualitatively, the first results obtained with optical

and electronic microscopy showed morphologic alterations of the circulating gametocytes

(pigment clumping and lateralisation within red blood cells) and reduced infectivity of the

gametocytes for the mosquitoes that fed at 1 and 5 hours after treatment. We were able to

demonstrate statistically that the infectivity of gametocytes, measured by the quantity of oocysts

counted in the mosquito midgut, was reduced by 70% for those treated with ferroquine and by

85% for those from mice treated by artesunate.

Complementary studies will seek to specify the populations (age) of gametocytes damaged

by treatment and the importance and nature of their morphologic alterations.

6

Table des matières Remerciements ............................................................................................................................................ 2

Résumé......................................................................................................................................................... 4

Résumé en anglais........................................................................................................................................ 5

Table des matières ....................................................................................................................................... 6

Liste des tableaux......................................................................................................................................... 8

Liste des figures............................................................................................................................................ 9

Liste des annexes........................................................................................................................................ 12

Liste des annexes........................................................................................................................................ 12

Liste des abréviations................................................................................................................................. 13

Introduction................................................................................................................................................ 14

Première partie : Généralités sur le paludisme......................................................................................... 16

I. Généralités .........................................................................................................................17

I. 1. Histoire du paludisme et de son traitement................................................................17

I. 2. Le parasite : historique et actualité ............................................................................18

I. 3. Évolution de la répartition du paludisme humain ......................................................20

I. 4. Les anophèles vecteurs du paludisme humain ...........................................................21

I. 5. Cycle évolutif du parasite et cibles thérapeutiques....................................................24

I. 5. 1. Cycle évolutif du parasite ..................................................................................24

I. 5. 2. Les cibles biologiques des antipaludiques .........................................................29

I. 6. Les gamétocytes.........................................................................................................31

I. 6. 1. Origine des gamétocytes ....................................................................................32

I. 6. 2. La morphologie des gamétocytes.......................................................................32

I. 6. 3. La gamétocytogénèse.........................................................................................34

I. 6. 4. La gamétogénèse................................................................................................38

I. 6. 5. L’infectivité des gamétocytes pour le moustique ..............................................39

II. La lutte contre le paludisme..............................................................................................43

II. 1. La lutte anti-vectorielle.............................................................................................43

II. 1. 1. Méthodes de lutte mécanique ...........................................................................44

II. 1. 2. Méthodes de lutte chimique..............................................................................44

II. 1. 3. Méthodes de lutte biologique ...........................................................................45

II. 2. Les antipaludiques ....................................................................................................45

II. 2. 1. Notion d’antipaludique.....................................................................................45

II. 2. 2. Histoire et actualité des antipaludiques ............................................................45

II. 2. 3. Classification des antipaludiques......................................................................46

7

II. 2. 4. Structure chimique générale des antipaludiques ..............................................47

II. 2. 5. Le mode d’action des antipaludiques ...............................................................56

II. 2. 6. Chimiorésistance ..............................................................................................59

III. Présentation du travail de thèse.......................................................................................64

Deuxième partie : Matériel et Méthode ................................................................................................... 66

I. Matériel biologique............................................................................................................67

I. 1. Le parasite..................................................................................................................67

I. 2. L’hôte vertébré (intermédiaire)..................................................................................67

I. 3. L’hôte invertébré (le vecteur) ....................................................................................68

II. Thérapeutiques testées......................................................................................................68

III. Méthodes .........................................................................................................................69

III. 1. Méthodes portant sur le stade hépatique .................................................................69

III. 1. 1. Infestation et traitement des souris..................................................................72

III. 1. 2. PCR quantitative en temps réel .......................................................................75

III. 1. 3. Protocoles ........................................................................................................80

III. 2. Méthodes portant sur la gamétocytogénèse, les gamétocytes circulants et la

transmission du paludisme ................................................................................................83

III. 2. 1. Constitution des stocks de sang parasité et conservation................................83

III. 2. 2. Infestation des souris.......................................................................................83

III. 2. 3. Suivi des infections chez la souris...................................................................83

III. 2. 4. Etude quantitative des effets des traitements sur la gamétocytogénèse ..........84

III. 2. 5. Etude qualitative des effets des traitements sur : ............................................85

Troisième partie : Résultats....................................................................................................................... 90

Chapitre 1 - Le stade hépatique ................................................................................................................. 92

Chapitre 2 - Le stade sexué : la gamétocytogénèse et la transmission du paludisme............................ 100

AA// Etude quantitative des effets des traitements sur la gametocytogenese .............................100

BB// Etude qualitative des effets des traitements sur les gamétocytes .......................................115

I. La morphologie des gamétocytes circulants ....................................................................115

II. Le pourcentage des gamétocytes altérés.........................................................................117

III. Infectivité des gamétocytes chez le moustique .............................................................121

Discussion................................................................................................................................................. 128

Conclusions et perspectives ..................................................................................................................... 139

Bibliographie ............................................................................................................................................ 142

Annexes .................................................................................................................................................... 155

Résumé..................................................................................................................................................... 158

Résumé en anglais.................................................................................................................................... 158

8

Liste des tableaux TABLEAU 1. CLASSIFICATION DE PLASMODIUM. ....................................................................................... 19

TABLEAU 2. CARACTERISTIQUES GENERALES DES 5 ESPECES DE PLASMODIUM PARASITES CHEZ

L’HOMME........................................................................................................................................... 19

TABLEAU 3. CLASSIFICATION DES DIFFERENTS TYPES DE RESISTANCE PARASITAIRE ET DES REPONSES

THERAPEUTIQUES EN ZONE DE FAIBLE TRANSMISSION ................................................................... 61

TABLEAU 4. DATES DE PREMIERE UTILISATION DES ANTIMALARIQUES ET D’APPARITION DE LA

RESISTANCE. ...................................................................................................................................... 63

TABLEAU 5. LES CARACTERISTIQUES BIOLOGIQUES CHEZ LA SOURIS INFESTEE AVEC P. YOELII EN

CONDITIONS DE LABORATOIRE (ADAPTE DE LANDAU ET GAUTRET, 1998)...................................... 70

TABLEAU 6. LES PROTOCOLES DU STADE HEPATIQUE EN DETAIL. ........................................................... 82

TABLEAU 7. ÉTUDE DE L’EFFET DE LA DOSE UNIQUE ET DE 2 DOSES SUBCURATIVES SUCCESSIVES DE

FERROQUINE SUR LA GAMETOCYTOGENESE .................................................................................. 103

TABLEAU 8. ÉTUDE DE L’EFFET DE DOSES SUBCURATIVES DE FERROQUINE ET D’ARTESUNATE SUR LA

GAMETOCYTOGENESE..................................................................................................................... 106

TABLEAU 9. EFFET DE L’ASSOCIATION FERROQUINE–ARTESUNATE SUR LA GAMETOCYTOGENESE...... 108

TABLEAU 10. EFFET DE 3 DOSAGES (5, 10, 50 MG/KG) D’ARTESUNATE SUR LA GAMETOCYTOGENESE 111

TABLEAU 11. ÉTUDE DE L’EFFET DE 2 DOSAGES DIFFERENTES D’ARTESUNATE ET DE FERROQUINE (5,

10MG/KG) SUR LA GAMETOCYTOGENESE ...................................................................................... 114

9

Liste des figures FIGURE 1. REPARTITION MONDIALE DU PALUDISME (OMS).................................................................... 21

FIGURE 2. FEMELLE DU GENRE ANOPHELE SE GORGEANT........................................................................ 22

FIGURE 3. LE CYCLE DEVELOPPEMENT DU MOUSTIQUE. .......................................................................... 23

FIGURE 4. LE CYCLE PARASITAIRE DES PLASMODIES CHEZ L’HOTE (EXEMPLE DE L’HOMME). ................. 25

FIGURE 5. METABOLISME DU PARASITE DANS LE GLOBULE ROUGE PARASITE, « EX : P. FALCIPARUM ». 30

FIGURE 6. LES DIFFERENTS STADES DES GAMETOCYTES DE P. YOELII, QUANTITE ET QUALITE. .............. 33

FIGURE 7. FORMES CHIMIQUES DEVELOPPEES DES ANTIPALUDIQUES. ................................................... 54

FIGURE 8. MODE D’ACTION DES ANTIFOLIQUES ET ANTIFOLINIQUES (D’APRES CHARMOT, 1993) ........ 59

FIGURE 9. CINETIQUE DE LA PCR, COURBE EXPRIMANT L’INTENSITE DE LA FLUORESCENCE EMISE EN

FONCTION DU NOMBRE DE CYCLES DE PCR EFFECTUES PAR LE THERMOCYCLEUR......................... 72

FIGURE 10. ETAPES DE LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL UTILISANT LE SYBR® GREEN. ................. 73

FIGURE 11. ANATOMIE SCHEMATIQUE D’UN MOUSTIQUE FEMELLE. ...................................................... 74

FIGURE 12. COURBE DE FUSION REPRESENTANT LA SPECIFICITE DU PRODUIT PCR AMPLIFIE ET DETECTE

PAR LE SYBR® GREEN I. ..................................................................................................................... 79

FIGURE 13. COURBE REPRESENTANT L’INTENSITE DE FLUORESCENCE DU SYBR ® GREEN I EN FONCTION

DU NOMBRE DE CYCLES DE PCR........................................................................................................ 79

FIGURE 14. DROITE DE REGRESSION (LINEAIRE) DE LA GAMME ETALON OBTENUE A PARTIR DES

RESULTATS APPORTES PAR LA FIGURE COURBE D’AMPLIFICATION D’UNE REACTION PCR (VALEUR

LOGARITHMIQUE).............................................................................................................................. 81

FIGURE 15. SCHEMA DE L’EXTRACTION DU TUBE DIGESTIF DU MOUSTIQUE........................................... 89

FIGURE 16. INTENSITE DE FLUORESCENCE DU SYBR® GREEN EN FONCTION DU NOMBRE DE CYCLES .... 93

FIGURE 17. STADES HEPATIQUES DETECTES PAR PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL APRES

TRAITEMENT AVEC DIFFERENTS ANTIPALUDIQUES. ......................................................................... 93




FIGURE 20. INTENSITE DE FLUORESCENCE DU SYBR® GREEN EN FONCTION DU NOMBRE DE CYCLES. ... 97

10






FIGURE 24. EVOLUTION DE LA PARASITEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS................ 101

FIGURE 25. EVOLUTION DE LA GAMETOCYTEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS ........ 102

FIGURE 26. ÉVOLUTION DE LA PARASITEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS................ 105





FIGURE 31. EVOLUTION DE LA GAMETOCYTEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS. ....... 110

FIGURE 32. ÉVOLUTION DE LA PARASITEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS................ 112

FIGURE 33. ÉVOLUTION DE LA GAMETOCYTEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS. ....... 112

FIGURE 34. GAMETOCYTES ALTERES : FEMELLES (A), MALES (B) ............................................................ 116

FIGURE 35. GAMETOCYTES DE PLASMODIUM YOELII YOELII ALTERES DANS L'HEMATIE, 1H30 APRES

TRAITEMENT A LA FERROQUINE 5MG/KG ...................................................................................... 116

FIGURE 36. ÉVOLUTION DU NOMBRE DE GAMETOCYTES APRES TRAITEMENT A 3 DOSAGES

D'ARTESUNATE EN FONCTION DU TEMPS....................................................................................... 118

FIGURE 37. ÉVOLUTION DU NOMBRE DE GAMETOCYTES APRES TRAITEMENT A 3 DOSAGES DE

FERROQUINE EN FONCTION DU TEMPS.......................................................................................... 118

FIGURE 38. ÉVOLUTION DU NOMBRE DE GAMETOCYTES APRES TRAITEMENT A 2 DOSAGES DIFFERENTS

DE FERROQUINE ET D’ARTESUNATE EN FONCTION DU TEMPS...................................................... 120

FIGURE 39. ÉVOLUTION DU NOMBRE DE GAMETOCYTES APRES TRAITEMENT A 3 DOSAGES DIFFERENTS

DE FERROQUINE ET D’ARTESUNATE EN FONCTION DU TEMPS...................................................... 120

FIGURE 40. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A LA FERROQUINE

(5MG/KG)......................................................................................................................................... 122

FIGURE 41. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A LA FERROQUINE 123

11

FIGURE 42. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A L’ARTESUNATE

(5MG/KG)......................................................................................................................................... 124

FIGURE 43. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A LA FERROQUINE

(10MG/KG)....................................................................................................................................... 125

FIGURE 44. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A L’ARTESUNATE

(10MG/KG)....................................................................................................................................... 125

FIGURE 45. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A L’ARTESUNATE, LA

FERROQUINE L’ASSOCIATION AXFQ 1 DOSE ET AXFQ 3 DOSES (5MG/KG POUR CHAQUE DOSE).. 127

12

Liste des annexes ANNEXE 1 TECHNIQUE DE COLORATION DES LAMES.............................................................................. 156

13

Liste des abréviations

Quantités :

mg : milligrammes

mL : millilitres

mm : millimolaires

µg : microgrammes

µl : microlitres

µM : micromolaires

nm : nanomètres

U : unités

Médicaments

AQ : amodiaquine

ATVQ : atovaquone

AX : artésunate

FQ : ferroquine

MAL : Malarone ®

PG : proguanil

PQ : primaquine

Autres

ADN : acid désoxyribonucléique

(abbreviation Anglophone: DNA)

ARN : acid ribonucléique

(abbreviation Anglophone: RNA)

CI : chlore

Ct : threshold cycle (“cycle seuil”)

dNTP : désosoxynucléotide tri-phosphate

G6PD : glucose-6-phosphate

déshydrogénase

IV : intra-veineuse (voie

d’administration)

K : potassium

Mg : magnésium

min : minutes

OMS : Organisation Mondiale de la

Santé

PCR : polymerase chain reaction

PPI : pour préparation injectable

qsq : quantité suffisante pour

QT-NASBA : real-time quantitative

nucleic acid sequence-based

amplification

Rnase : ribonucléase

rpm : rotation par minute

trs/min : tours par minute

UV : ultra-violets

VO : voie orale

VS. : versus

° C : degré Celsius

Introduction

15

Le paludisme grande endémie mondiale touche de 216 millions d'êtres humains dont 81% dans

la région Afrique de l’OMS, soit 174 millions de cas. Le nombre des décès dus au paludisme est

estimé à 655 000 pour l’année 2010, dont 91 % en Afrique. À l’échelle mondiale, 86 % des

décès imputables au paludisme ont frappé des enfants de moins de 5 ans. Le paludisme a été

classé dans les 3 maladies infectieuses causant mondialement le plus de morts avec le sida et la

tuberculose (WHO, 2011).

Cette parasitose est due à un hématozoaire du genre Plasmodium, transmis à l’homme par

la piqûre du moustique femelle du genre Anophèles. Cette érythrocytopathie est endémique dans

les régions chaudes et humides intertropicales.

Il existe 4 espèces de Plasmodium parasitant spécifiquement l’homme (P. falciparum, P.

vivax, P. malariae, P. ovale) et une nouvelle espèce P. knowlesi, peut naturellement passer du

singe à l’homme, le passage naturel de l’homme à l’homme n’est pas encore prouvé. Ce passage

du pathogène du singe à l’homme se fait par l’intermédiaire, soit d’Anopheles lateens qu’on

trouve dans les forêts et les exploitations fermières de Malaisie orientale et à Bornéo, soit

d’Anopheles cracens qui prédomine dans les forêts et vergers de Malaisie péninsulaire, de

Thaïlande et des Philippines.

On a découvert les plasmodies de rongeurs après la découverte de Plasmodium humain par

Laveran (1880). Les facilités d’élevages et manipulations des rongeurs, face aux difficultés liées

à l’essai chez l’homme, favorisent le développement des recherches expérimentales chez les

rongeurs. Les espèces plasmodiales les plus utilisées chez les rongeurs sont P. yoelii, P. berghei,

P. chabaudi et P. vinckei.

L’apparition de polychimiorésistances des souches éventuellement mortelles de

P. falciparum, entraîne une recherche permanente de nouvelles molécules, isolées ou mieux,

associées intervenant sur des cibles métaboliques différentes.

Les thérapeutiques actuellement disponibles sont destinées en priorité aux formes

sanguines pathogènes ; afin d’inhiber de façon complète la croissance parasitaire, d’autres

formes de parasites peuvent être ciblées, en particulier les formes hépatiques secondaires à

l’impaludation et les formes sexuées qui assure la transmission et la pérennité de l’espèce

plasmodiale.

Notre objectif a été d’étudier sur un modèle expérimental animal ayant un développement

cyclique proche du cycle chez l’homme, l’efficacité d’antipaludiques sur les formes asexuées

hépatiques et celles à potentiel sexué (gamétocytes) assurant la transmission.

Première partie :

Généralités sur le paludisme

17

II.. GGéénnéérraalliittééss

II.. 11.. HHiissttooiirree dduu ppaalluuddiissmmee eett ddee ssoonn ttrraaiitteemmeenntt

Le paludisme (de palus : marais) ou malaria (« mauvais air »), est défini d’abord

épidémiologiquement : les scientifiques comprennent qu’il se transmet dans les régions humides

et qu’il y a un rapport entre les marais et les syndromes fébriles (il était aussi connu sous le nom

de ( fièvre romaine des marais pontins » ou en France, « fièvre des marais poitevins »). Sur le

plan physiopathologique et épidémiologique, il s’agit d’une érythrocytopathie endémique due à

un hématozoaire du genre Plasmodium qui est transmise par la piqûre d’un moustique

hématophage femelle infesté appartenant au genre Anopheles et chez lequel le parasite assure sa

pérennité par un cycle ovogénique, cycle sexué faisant de l’anophèle l’hôte définitif du parasite.

Les premières traces d’atteinte palustre ont été relevées sur des momies égyptiennes datant

de plus de 5200 ans. Sur certaines d’entre elles, la présence d’ADN de Plasmodium a en effet été

détectée. Le premier qui a reconnu et décrit le parasite est un médecin français, Alphonse

Laveran, à Constantine en Algérie en 1880 ; il a reçu le Prix Nobel en 1907. Golgi en 1886 puis

Marchiafava et Celli en 1889, ont distingué 3 espèces parasites de l’homme : P. vivax, P.

falciparum et P. malariae et la 4e espèce, P. ovale, a été découverte par Stephens en 1922.

Une cinquième espèce paraît concerner l’homme, il s’agit de Plasmodium knowlesi, connu

chez les macaques à longue queue. En 1931, P. knowlesi a été reconnu comme agent d’une

infection mortelle chez ces macaques (Singh et al., 2004) en Malaisie et 34 ans plus tard, en

1965, on signale pour la première fois sa transmission naturelle chez l'homme en Malaisie (Chin

et al.,1965). Il est actuellement sensible à la chloroquine.

En 1897, la découverte du rôle d’un moustique de genre Anopheles comme agent de

transmission du paludisme est faite par Ronald Ross, médecin anglais vivant en Inde. Cette

découverte est confirmée par Battista Grassi en 1898.

La même année, trois médecins italiens : Amico Bignami, Giuseppe Bastianelli et Battista

Grassi décrivent le cycle complet du paludisme.

18

II.. 22.. LLee ppaarraassiittee :: hhiissttoorriiqquuee eett aaccttuuaalliittéé

Classification du parasite (Tableau 1) :

Le genre Plasmodium est constitué de 9 sous-genres dont 3 sont capables de se développer

chez les mammifères, 4 chez les oiseaux et 2 chez les lézards. Ces 9 sous-genres comprennent

près de 200 espèces.

Les deux sous-genres qui se développent chez les primates dont l’homme sont :

� Le sous-genre Laverania qui comprend P. falciparum, Welch, 1897, qui n’a qu’une

génération de schizontes exo-érythrocytaires et dont les gamétocytes sont en forme de faux

(falciforme).

� Le sous-genre Plasmodium qui comprend :

o P. vivax, Grassi & Feletti, 1890 : responsable de la fièvre tierce souvent bénigne et

apparaissant très « vivace » dans l’hématie parasitée

o P. ovale, Stephens, 1922 : très proche du précédent et prenant sa place en Afrique

subsaharienne dans les groupes sanguins « Duffy négatif »

o P. malariae, Laveran, 1881: peu présent dans le monde, il est l’agent de la fièvre quarte

persistant longtemps dans le foie de l’homme parasité et parfois responsable d’atteintes

rénales sévères (néphrite quartane).

o P. knowlesi, Franchiti, 1927 : responsable du paludisme du singe macaque, il a été signalé

pour la première fois chez l’homme en 1932, et décrit comme une fièvre intermittente à

Bornéo. Il est proche génétiquement de Plasmodium vivax et microscopiquement de

Plasmodium falciparum puis malariae. Trois espèces sont exclusivement humaines : P.

falciparum, P. vivax et P. ovale. Les espèces P. malariae et P. knowlesi sont à la fois

humaines et simiennes (Tableau 2).

Ces plasmodies humaines sensibles depuis toujours aux dérivés de l'écorce de quinquina et

du Qinghaosu (Artemisia annua) sont apparues résistantes à ces molécules de synthèse très

utilisées dans le monde, en curatif comme en prophylactique. Ceci a nécessité la recherche et le

développement de nouvelles molécules ou d’associations de molécules actives, en particulier sur

l’espèce éventuellement mortelle : P. falciparum. Ces recherches ont porté sur les différentes

phases du métabolisme du cycle du paludisme.

19

Règne Protiste

Sous –règne Protozoaire

Phylum sporozoaire ou Apicomplexa

Classe Sporozoea

Sous-classe Coccidies

Sous-ordre Haemospiridiidae

Ordre Coccidiida

Famille Plasmodiidae

Genre Plasmodium

Tableau 1. Classification de Plasmodium.

P. ovale P. vivax P. malariae P. falciparum P. knowlesi

Longévité 2 à 3 ans,

parfois 5 ans 2 à 3 ans

Peut

atteindre

20 ans

Généralement < 2

mois,

exceptionnellement

1 an

-

érythrocytes

infectés

Jeunes

hématies

Jeunes

hématies

Vieilles

hématies

Toutes

les hématies

Toutes les

hématies

Durée du

cycle 48 h 48 h 72 h 48 h 24

Tableau 2. Caractéristiques générales des 5 espèces de Plasmodium parasites chez l’homme.

20

II.. 33.. ÉÉvvoolluuttiioonn ddee llaa rrééppaarrttiittiioonn dduu ppaalluuddiissmmee hhuummaaiinn

Cette endémie est largement distribuée à travers le monde (Figure 1). Elle est présente dans

les régions tropicales et sub-tropicales. La maladie est surtout présente dans les zones tropicales

chaudes et humides d’Afrique sub-saharienne, d’Asie, d’Amérique centrale et d’Amérique du

Sud. Dans les pays les plus pauvres, essentiellement en Afrique, elle est une cause importante de

mortalité infantile (Snow et al., 2001). Sur 300 à 500 millions d’accès cliniques par an, elle est

responsable de 1 à 3 millions de décès chaque année, dont près d’un million en Afrique

subsaharienne. Les enfants de moins de cinq ans et les femmes enceintes sont les cibles les plus

touchées.

La distribution mondiale est différente selon l’espèce plasmodiale en cause. P.

falciparum, le plus dangereux, est le plus présent. Cette espèce provoque à elle seule 120

millions de nouveaux cas. Les trois autres espèces de Plasmodium humains ont une distribution

plus restreinte.

P. ovale, espèce plus rare et qui ne tue pas, peut entraîner des rechutes 4 à 5 ans plus tard.

Il est présent en Afrique subsaharienne.

P. vivax, moins dépendant des écarts de température a une répartition plus étendue. On le

trouve dans le bassin méditerranéen, en Afrique du Nord, au Moyen Orient, en Turquie, à

Madagascar, sur l’île Maurice et aux Comores, dans toute la région tropicale d’Asie et dans les

régions de basse altitude de l’Amérique centrale et de l’Amérique du Sud ; il est absent en

Afrique de l’Ouest.

P. malariae n’est pas meurtrier mais peut entraîner des rechutes jusqu’à 20 ans après la

primo infection.

P. falciparum, le plus pathogène est le responsable majeur des cas mortels. Il est présent

dans les régions tropicales d’Afrique subsaharienne (où le taux de mortalité est le plus élevé et

où il représente plus de 90% des espèces identifiées chez les malades), d’Amérique Latine et

d’Asie.

Plasmodium knowlesi parasite étroitement lié à la répartition des singes macaques, est un

parasite décrit en Asie du Sud-Est, en particulier en Malaisie. Actuellement, plusieurs centaines

de cas ont été rapportés chez l'homme. Au microscope, P. knowlesi ressemble à P. malariae, ou à

P. falciparum en début de parasitémie. Comme P. malariae, il est sensible à la chloroquine.

21

Figure 1. Répartition mondiale du paludisme (OMS)

II.. 44.. LLeess aannoopphhèèlleess vveecctteeuurrss dduu ppaalluuddiissmmee hhuummaaiinn

Il y a environ 430 espèces de moustiques Anopheles (Harbach, 2004) dont 70 sont capables

de transmettre le paludisme, et parmi celles-ci, seulement 40 sont des vecteurs d’importance

majeure (Service et Townson, 2002). Certains anophèles préfèrent piquer l’animal et ne

transmettent normalement pas de parasites à l’homme, ou alors très rarement. Les Anopheles font

partie de la sous-famille Anophelinae, de la famille Culicidae, du sous-ordre des Nématocères et

de l’ordre des diptères (Figure 2).

La transmission du paludisme humain en Afrique est effectuée essentiellement par A.

gambiae et A. funestus. Deux espèces, A. arabiensis et A. nili ont un rôle vecteur secondaire.

D'autres espèces d'anophèles ont été trouvées infectées, mais jouent un rôle négligeable par

rapport aux espèces précédentes. A. gambiae et A. arabiensis appartiennent au complexe A.

gambiae qui regroupe 7 espèces cryptiques reproductivement isolées. A. funestus est la seule

espèce du complexe A. funestus impliquée dans la transmission palustre humaine (Fontenille et

Lochouarn, 1999).

22

Figure 2. Femelle du genre Anophèle se gorgeant.

(http://umvf.omsk-osma.ru/campus-parasitologie-mycologie/cycle2/poly/3003ico.html)

Chin et al., (1965) ont montré que P. knowlesi peut également être transmis du singe à l'homme.

Le moustique vecteur en cause est A. balabacencis (qui appartient au groupe A. leucosphyrus).

Dans le cycle biologique des moustiques (Figure 3), il y a quatre stades : l’œuf, la larve, la

pupe (nymphe) et l’adulte ; les trois premiers stades sont aquatiques et durent environ une

semaine ; les adultes mènent une vie aérienne ; ils se fécondent dans les deux jours suivant

l’émergence. Seules les femelles se nourrissent d'un repas sanguin dans lequel elles prélèvent les

protéines nécessaires au développement de leurs œufs ; les femelles seules sont responsables de

la transmission ; elles pondent les premiers œufs après un ou deux repas selon l’espèce, tandis

qu’elles pondent le lot suivant après un seul repas. La plupart des espèces d’anophèles piquent la

nuit. Certaines piquent juste après le coucher du soleil, d’autres piquent plus tard, aux environs

de minuit ou même aux petites heures matinales. Le mâle a des antennes garnies de longs poils

qui lui donnent une apparence touffue comme une moustache. Sur les antennes de la femelle, les

poils sont peu nombreux et courts (WHO, 2003).

23

Figure 3. Le cycle développement du moustique.

(http://www.ars.corse.sante.fr/Dengue-et-Chikungunya.120081.0.html)

La capacité vectorielle est l’aptitude d’une espèce de moustique à transmettre l’infection et

à assurer le cycle de l’agent pathogène et est fonction de la longévité (MacDonald, 1957), de

l'anthropophilie et de la compétence vectorielle. Elle varie largement d’une espèce à l’autre et

dépend de plusieurs phénomènes successifs :

�� L’aptitude du vecteur à infecter

�� L’aptitude à assurer le développement parasitaire

�� L’aptitude à transmettre

Cette capacité vectorielle dépend également de facteurs (intrinsèques et extrinsèques)

susceptibles de conditionner chacun de ces trois phénomènes.

Les facteurs environnementaux favorisants

1. Le climat a des influences sur : la répartition et l’abondance des anophèles vecteurs, la

possibilité et le succès du développement sporogonique du parasite à l’intérieur du

vecteur, la modulation du contact homme-vecteur.

2. La température minimale pour le cycle sporogonique est 15°C pour P. vivax et P.

malariae, 20 à 25°C pour P. falciparum ; la température optimale est voisine de 27°C.

3. L’humidité, elle, favorise la longévité du vecteur. La diminution de l’humidité entraîne

une baisse de la longévité du vecteur, réduisant la transmission. Les pluies assurent une

24

multiplication des vecteurs, en alimentant les gîtes larvaires, (l'humidité relative

conseillée est de 70 à 80% en insectarium).

4. L’altitude joue un rôle important dans l’extension du paludisme, en provoquant une

distribution locale du vecteur. Les Anophèles se trouvent rarement à des altitudes

supérieures à 2500 mètres (Service & Townson 2002) ; dès que l’altitude augmente, les

périodes de transmission deviennent plus courtes.

La résistance aux insecticides a été définie comme la présence, dans une population

d’insectes, de spécimens qui survivent à des doses qui, habituellement, tuent l’ensemble de cette

population (Mouchet et al, 2004).

La résistance des anophèles aux insecticides n’est pas un fait nouveau, la résistance aux

pyréthrinoïdes se développe parmi les vecteurs majeurs du paludisme, notamment par

l’intermédiaire de la mutation Kdr qui confère une résistance croisée à tous les pyréthrinoïdes, et

risque de compromettre l’efficacité des moustiquaires imprégnées.

Différents mécanismes de résistance sont possibles :

� une modification du comportement de l’insecte qui évite ainsi le contact avec l’insecticide,

� une modification de l’absorption ou de l’excrétion de l’insecticide,

� une modification des voies métaboliques permettant sa dégradation ou enfin une

modification de sa cible.

II.. 55.. CCyyccllee éévvoolluuttiiff dduu ppaarraassiittee eett cciibblleess tthhéérraappeeuuttiiqquueess

II.. 55.. 11.. CCyyccllee éévvoolluuttiiff dduu ppaarraassiittee

La morphologie du parasite change sans cesse dans son aspect, sa taille et son rapport extra ou

intracellulaire, au cours du cycle biologique (Figure 4). Néanmoins, les cycles biologiques des

différentes espèces sont proches, autorisant des études expérimentales cohérentes comparables

avec le développement parasitaire chez l’homme.

Les plasmodies sont des parasites principalement intracellulaires dont la multiplication

nécessite un hôte intermédiaire vertébré (homme) (impaludation et phase clinique) où se déroule

le cycle asexué ou schizogonie, et un hôte définitif invertébré (anophèle) chez qui se déroule la

multiplication sexuée ou sporogonie (la transmission).

25

Figure 4. Le cycle parasitaire des plasmodies chez l’hôte (exemple de l’homme).

(http://dpd.cdc.gov/dpdx/html/Malaria.html : Malaria_LifeCycle(French_version))

II.. 55.. 11.. 11.. CCyyccllee hhuummaaiinn oouu sscchhiizzooggoonniiqquuee

Ce cycle se divise en cycle pré-érythrocytaire (hépatique ou asymptomatique) et cycle

érythrocytaire, ce dernier conduisant à la fièvre suite à l'éclatement des globules rouges et aux

toxines palustres.

II.. 55.. 11.. 11.. aa)) PPhhaassee dd’’iimmppaalluuddaattiioonn ((CCyyccllee eexxoo--éérryytthhrrooccyyttaaiirree oouu

PPhhaassee hhééppaattiiqquuee))

L’anophèle femelle infectée par des sporozoïtes dans ses glandes salivaires, en prenant le

sang nécessaire à sa ponte, bave chez l'hôte plusieurs centaines de sporozoïtes (forme parasitaire

libre extracellulaire possédant un complexe apical de pénétration), qui sont présents dans les

26

glandes salivaires du moustique; ils pénètrent dans les capillaires sanguins, parfois dans les

tissus, circulent dans le sang pendant une trentaine de minutes, avant de pénétrer un hépatocyte.

Un grand nombre d’entre eux sont détruits par les phagocytes (macrophages) et par les

anticorps spécifiques chez les sujets immuns (Sidjanski et Vanderberg, 1997), essentiellement

dans la rate ; mais quelques-uns de ces sporozoïtes gagnent le foie en empruntant les sinusoïdes

et en traversant la barrière constituée par les cellules de Küpffer et les cellules endothéliales. Le

passage est assuré en moins de trente minutes. Grâce à une interaction de type ligand-récepteur,

ils pénètrent les hépatocytes. Le parasite peut, soit s’y cacher sous forme quiescente (cryptozoïte

ou hypnozoïte (Krotoski, 1989) responsable de rechutes tardives du paludisme, soit s’y

multiplier sous forme de mérozoïtes, entraînant un « corps bleu », image de l’hépatocyte

déformé par le parasite multiplié et qui en éclatant va libérer les éléments simples ou mérozoïtes.

Cette phase de multiplication intra-hépatique dure en moyenne entre 5 et 15 jours selon les

espèces.

L’éclatement de l’hépatocyte (corps bleus mûrs, cellules plasmodiales volumineuses (40-100

µm), contenant quelques milliers de noyaux (environ 30 000)), provoque la libération des

mérozoïtes qui ont alors trois destinées possibles :

o la mort in situ, prise en charge par le système réticulohistiocytaire hépatique,

o la pénétration d’un nouvel hépatocyte, débutant ainsi un cycle intra-hépatocytaire

secondaire, immédiat ou différé,

o la migration et la pénétration dans les hématies entraînant le paludisme maladie.

Cette phase hépatique du cycle plasmodial, asymptomatique, a été peu étudiée en termes

de thérapeutiques et demeure moins directement concernée par un traitement en urgence d’un

accès grave. Seules des molécules comme la primaquine, du groupe des amino-8-quinoléine,

sont connues pour avoir effet sur les formes intrahépatiques.

II.. 55.. 11.. 11.. bb)) PPhhaassee cclliinniiqquuee ((ccyyccllee éérryytthhrrooccyyttaaiirree))

Durant le stade intra-érythrocytaire apparaissent les signes cliniques. Après la pénétration

des mérozoïtes dans les hématies par endocytose (la membrane de l’hématie s’invagine), ceux-ci

se déplacent par mouvements amiboïdes vers le centre du globule rouge et forment une vacuole

nutritive remplie d’hémoglobine ; ils prennent alors une forme en anneau et se transforment en

trophozoïtes (2 à 3 µm) situé dans une vacuole parasitophore faite du matériel de la cellule hôte,

qui repoussent le cytoplasme érythrocytaire en périphérie (en entourant la vacuole nutritive).

27

Ces trophozoïtes sont le siège d’une activité métabolique intense qui comprend la digestion de

l’hémoglobine et la polymérisation de l’hème en hémozoïne (ou pigment malarique), autant de

points métaboliques cibles des thérapeutiques.

Le trophozoïte grossit et son noyau se divise (3 à 5 fois) pour donner un schizonte, qui, une

fois mûr éclate à son tour en libérant, selon l’espèce, un nombre variable de mérozoïtes qui

envahissent de nouvelles hématies vierges colonisées à leur tour, tandis que de nouvelles

schizogonies endo-érythrocytaires se produisent (en 48 ou 72 heures selon les espèces décrites

chez l’homme).

L'éclatement des globules hébergeant des schizontes mûrs s'accompagne de la libération de

toxines (d'hémozoïne et de débris membranaires érythrocytaires) dans le sang, entraînant les

accès fébriles.

Le cycle, continu pendant la durée de l’infection, aboutit à l’augmentation progressive de

la densité parasitaire, jusqu’à ce que l’hôte développe une réponse immunitaire (générale ou plus

spécifiquement splénique) efficace ou que la thérapeutique agisse sur la multiplication du

parasite.

L’importance de la parasitémie est en rapport avec les signes cliniques dont le principal est

l’accès fébrile, pouvant s’accompagner d’une anémie, d’une hépatomégalie, d’une

splénomégalie ou de troubles neurologiques graves dans le cas de P. falciparum.

Après plusieurs cycles schizogoniques sanguins asexués, certains mérozoïtes et

trophozoïtes acquièrent un potentiel sexuel ; ne se divisant pas, ils se différencient en cellules à

potentiel sexué : les gamétocytes, mâles ou femelles, uninucléées, assureront la pérennité de

l’espèce par la poursuite du cycle chez le moustique.

Cette phase d’urgence clinique est la cible prioritaire des thérapeutiques curatives et

prophylactiques évaluées jusqu’à présent.

II.. 55.. 11.. 22.. CCyyccllee sseexxuuéé oouu ssppoorrooggoonniiqquuee cchheezz ll’’AAnnoopphhèèllee :: pphhaassee ddee

ttrraannssmmiissssiioonn

On peut schématiser la transmission en deux étapes :

II.. 55.. 11.. 22.. aa)) TTrraannssmmiissssiioonn dduu mmoouussttiiqquuee àà ll’’hhôôttee

Les gamétocytes ne vont continuer leur développement que s’ils sont absorbés par

l’anophèle femelle lors de son repas sanguin sur son hôte impaludé ; c’est donc en changeant

28

d’hôte à partir de ce stade bloqué que le Plasmodium peut continuer son cycle. Il faut que le

nombre de gamétocytes ingéré soit suffisant pour que la fécondation chez le moustique puisse

avoir lieu. On admet qu’une densité gamétocytaire d’au moins vingt gamétocytes par millimètre

cube soit nécessaire pour que le vecteur puisse s’infecter (Coz et Picq, 1972). Seuls les

gamétocytes poursuivent leur développement alors que les autres stades du parasite, ingérés de la

même façon, sont digérés par le moustique.

II.. 55.. 11.. 22.. bb)) TTrraannssmmiissssiioonn ddee ll’’hhôôttee aauu mmoouussttiiqquuee

Les gamétocytes à potentiel mâle pompés par le moustique, s’exflagellent, donnant dans

l’estomac du vecteur de nombreux gamètes ou microgamètes (8 gamètes mâles haploïdes

flagellés de « 20 µm »). Les gamétocytes à potentiel femelle donnent un gamète femelle unique

(macrogamète), après expulsion des corpuscules chromatiniens.

Les microgamètes filamenteux peuvent fusionner avec un gamète femelle haploïde.

La fécondation (gamogonie) aboutit à la formation d’un zygote diploïde qui subit deux

méioses, en moyenne 5 heures après sa formation. Il se transforme alors en oocinète diploïde non

mobile (zygote et oocinète sont les deux seules formes diploïdes du parasite).

Après quelques heures de repas sanguin par méiose réductionnelle rapide, l’oocinète se

transforme en ookinète, œuf mobile qui possède un complexe apical de pénétration lui

permettant de traverser activement la paroi de l’appareil digestif pour se fixer au niveau du

feuillet externe où il s’enkyste sur sa partie externe en formant un oocyste d’où sortiront des

centaines de sporozoïtes infectants (les cellules parasitaires vont se multiplier par divisions

cellulaires pour libérer, en quelques jours et après éclatement de l’oocyste, un millier de

sporozoïtes ou cellules filles, mobiles).

Enfin, les sporozoïtes gagnent, en quelques jours, les glandes salivaires du moustique hôte

définitif pour s’y accumuler.

Au cours d’un repas sanguin ultérieur, quelques dizaines de sporozoïtes sont bavés et

pénètrent un nouvel individu. Une femelle anophèle possédant des sporozoïtes dans ses glandes

salivaires reste infestante toute sa vie.

Cette phase assure la pérennité du parasite ; peu de thérapeutiques curatives cliniquement

sont actives.

Dans cette étude, nous avons essayé d’évaluer l’action de thérapeutiques, isolées ou

associées, sur la gamétocytogénèse et sur l’infectivité des parasites pour les moustiques, et

d’aborder le rôle éventuel des chimiothérapies sur la transmission du paludisme.

29

II.. 55.. 22.. LLeess cciibblleess bbiioollooggiiqquueess ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess

Dans cette partie, nous allons nous concentrer plus spécifiquement sur les cibles des

antipaludiques relatifs au stade érythorocytaire du parasite. Face à la résistance qui apparaît de

plus en plus rapidement lors de la commercialisation de nouveaux antipaludiques, il est

nécessaire, de comprendre le mode d'action cellulaire des antipaludiques. Le Plasmodium

dispose pour son développement intra-érythrocytaire d’un métabolisme et de moyens de défenses

spécifiques qui constituent autant de cibles plasmodiales (Figure 5).

II.. 55.. 22.. 11.. MMééttaabboolliissmmee vvaaccuuoollaaiirree

La vacuole nutritive du plasmodium dispose d’un pH acide et d’enzymes telles que des

hydrolases, des protéinases et des phosphatases acides. Elle est le siège de la digestion de

l’hémoglobine en vue d’obtenir les acides aminés indispensables à sa survie. Cette étape libère la

globine (partie protéique qui est hydrolysée en acides aminés) et l’hème toxique (union d’un

atome ferreux et d’un noyau tétrapyrrolique, la protoporphyrine). La cristallisation de l’hème est

un mécanisme pour détoxifier l’hème. Un complexe, l’hémozoïne ou pigment malarique

insoluble, est formé pour détourner le stress oxydatif. Nombre d’antipaludiques actuellement sur

le marché utilisent la vacuole nutritive comme cible privilégiée, en empêchant l’hydrolyse de la

globine ou la formation de l’hémozoïne (les quinolines, dont les « 4-aminoquinolines »), ou

encore en favorisant la production de radicaux libres dans la vacuole, comme l’artémisinine et

ses composés dérivés.

II.. 55.. 22.. 22.. MMééttaabboolliissmmee ccyyttooppllaassmmiiqquuee

Le cytoplasme comporte le cytosol et deux organites essentiels, les mitochondries et

l’apicoplaste. Ils sont nécessaires à la biosynthèse des acides nucléiques.

II.. 55.. 22.. 22.. aa)) LL’’aappiiccooppllaassttee :: llee mmééttaabboolliissmmee ddeess aacciiddeess nnuuccllééiiqquueess

La synthèse d’ADN se produit tout au long du cycle, dans l’hôte et le parasite. Mais les

deux sont incapables de synthétiser le noyau purique. Le parasite récupère les purines de l’hôte

pour la synthèse de ses acides nucléiques. La synthèse d’ADN et d’ARN est régie par plusieurs

enzymes, comme l’ADN polymérase, le Ribonucléotide réductase (RNRase), les

Topoisomérases I & II et l’ARN polymérase.

30

Figure 5. Métabolisme du parasite dans le globule rouge parasité, « ex : P. falciparum ».

Facteurs intervenant dans le métabolisme du parasite dans le globule rouge, adapté de Biagini et al., Trends Parasitol 2003, 19: 479-487.

La majorité de ces enzymes sont des cibles antipaludiques, les fluoroquinolones, antibiotiques

qui peuvent inhiber les Topoisomérases (Touze et al., 2002).

II.. 55.. 22.. 22.. bb)) LLee ccyyttoossooll :: llee mmééttaabboolliissmmee ddeess ffoollaatteess

La métabolisation des folates est à la base de la synthèse des nucléotides, la biosynthèse

des pyrimidines et des acides aminés. Plusieurs enzymes de cette voie métabolique sont des

cibles antipaludiques. Ils se répartissent en deux groupes :

31

� les antifoliques inhibent la dihydroptéroate synthase (DHPS) qui produit l’acide folique,

comme les sulfamides dont le sulfone.

� les antifoliniques inhibent la dihydrofolate réductase (DHFR) qui produit l’acide

folinique comme la pyriméthamine et le proguanil (Winkler, et al., 1994).

II.. 55.. 22.. 22.. cc)) LLaa mmiittoocchhoonnddrriiee

Le parasite réalise le métabolisme mitochondrial pour avoir de l’énergie, grâce aux deux

enzymes : le cytochrome c réductase et la déhydroorotate déshydrogénase. Cette dernière, est

l’enzyme clé dans la biosynthèse des nucléotides. De telles modifications sont obtenues en

traitant par les amino-8-quinoléines (Primaquine) et les naphtoquinones (Rosenthal, 2003 et

Touze et al., 2002).

II.. 55.. 22.. 33.. MMééttaabboolliissmmee mmeemmbbrraannaaiirree

La membrane plasmique constitue de phospholipides, de canaux calciques et

parasitophores. Elle est le siège du trafic nutritionnel. Ce mécanisme d’efflux actif des

médicaments et de régulation du pH vacuolaire au cours du cycle érythrocytaire peut être ciblé

en bloquant les canaux calciques par des inhibiteurs spécifiques (Vérapamil) ou en modulant

l’efflux vacuolaire par les antidépresseurs tricycliques (desipramine, amitriptyline), les

phénothiazines (chlorpromazine) et des antihistaminiques de classe I (Touze et al., 2002). Cette

nouvelle voie métabolique fonctionne d’autant plus que les parasites sont fortement diffusés à

l'intérieur des cellules sanguines humaines. Les scientifiques doivent encore étudier si le parasite

utilise cette même voie au cours des autres étapes de son cycle de vie.

II.. 66.. LLeess ggaammééttooccyytteess

Les gamétocytes sont des cellules spécialisées assurant la transition entre l’hôte et le

moustique. Ils remplissent deux fonctions cellulaires très différentes, qui sont toutes deux

essentielles à la survie du parasite : ces fonctions fournissent un mécanisme efficace de

transmission de l'hôte vertébré au moustique vecteur et d’autre part, ils sont responsables des

événements du cycle de vie sexuelle qui ne sera achevé que dans le repas sanguin du moustique

(Sinden et al., 1996) C’est l’élément charnière permettant la poursuite du cycle chez le vecteur.

32

II.. 66.. 11.. OOrriiggiinnee ddeess ggaammééttooccyytteess

Lors d’infections naturelles, la majorité des gamétocytes proviennent de mérozoïtes

d’origine sanguine apparus au cours de la multiplication des stades asexués (schizogonie

érythrocytaire). On n’observe pas, chez les plasmodies humaines, de production de gamétocytes

directement à partir des mérozoites hépatiques (Sinden, 1998), contrairement à d’autres espèces

(P. yoelii) où les gamétocytes proviennent de mérozoïtes hépatiques (Garnham, 1966). Lors de

l’infection par P. falciparum, l’observation de gamétocytes circulant ne se ferait que 7 à 15 jours

après l’identification de stades asexués intracellulaires (Eichner et al., 2001).

II.. 66.. 22.. LLaa mmoorrpphhoollooggiiee ddeess ggaammééttooccyytteess

Les gamétocytes de P. falciparum (falciformes) sont allongés, avec des extrémités

arrondies, légèrement incurvés, avec une face concave et une face convexe (formes en banane,

en croissant), contrairement aux gamétocytes des autres espèces humaines (P. malariae, P. ovale

et P. vivax), qui ont une forme arrondie.

En 1956, Field et Shute sont les premiers à décrire les stades de maturation des

gamétocytes chez P. falciparum. Les gamétocytes ne se développent que dans les organes profonds

(rate et moelle osseuse) : ils n’apparaissent dans le sang périphérique que sous leur forme

mature. Le stade mature V de P. falciparum est le seul à être présent dans le sang périphérique ;

donc le seul infectant pour le moustique (Trager et al., 1999). Pour les autres espèces humaines,

la gamétocytogénèse s’effectue également dans le sang périphérique où on peut donc rencontrer

des gamétocytes jeunes.

Aspects particuliers à Plasmodium yoelii

L’analyse morphologique des gamétocytes mâles de P. yoelii a permis de différencier

quatre types morphologiques : O, I, II et III, qui se succèdent chronologiquement (Figure 6) (les

transformations des gamétocytes femelles sont parallèles) (Landau et al., 1979).

Les jeunes gamétocytes immatures ne remplissent pas les hématies hôtes, leur

cytoplasme est bleu pâle, le pigment est fin. Leur noyau est rose clair et est formé de granules

chromatiniens. Ils sont surtout présents dans les hématies mûres.

33

Figure 6. Les différents stades des gamétocytes de P. yoelii, quantité et qualité.

(d’après Landau et al., 1979)

Planche I : Microgamétocytes de P. yoelii classés par ordre chronologique.

1-2 : Jeunes gamétocytes immatures ; 3-4 : Gamétocytes O sains ; 5 : Gamétocyte O altéré ;

6-7-8 : Gamétocytes I ; 9-10 : Gamétocytes II (10 est légèrement altéré) ; 11-12-13-14-15 :

Gamétocytes III (14 et 15 ont un noyau fragmenté) ; 16 : Gamétocyte III altéré.

34

Les gamétocytes de type O remplissent les globules rouges qui sont hypertrophiés. Le

noyau est d’un rose plus clair, presque incolore, il contient parfois quelques masses

chromatiniennes très denses. Le cytoplasme est lui d’un rose plus soutenu et comporte un

pigment fin.

Les gamétocytes de type I ont un noyau granuleux, il est de taille assez importante

(environ trois quarts du volume du parasite) ; rose, sa couleur est assez proche de celle du

cytoplasme. Ce dernier forme une bande périphérique plus ou moins régulière avec des pigments

chevauchant parfois le noyau.

Les gamétocytes de type II sont plus petits que les autres. Le noyau occupe environ la

moitié du volume du parasite, il est homogène, plus dense et plus coloré que le cytoplasme. Le

cytoplasme est gris clair, bleuté ou rose. Le pigment est abondant et se limite au cytoplasme.

Les gamétocytes de type III sont petits, plus denses et plus chromophiles. Leur noyau est

plus condensé, leur teinte plus foncée. Ils n’occupent plus que le tiers du parasite, ont souvent

une forme triangulaire et peuvent être morcelés en deux ou trois masses irrégulières.

Certains gamétocytes peuvent être dégénérés, ils apparaissent lors d’infections à taux

élevé, remplaçant ainsi les gamétocytes sains. Ils présentent un certain nombre d’altérations

morphologiques, dont le pigment en mottes. (Landau et al., 1979).

Gautret et al., 1996 ont observé que le microgamétocyte, stade 0 de la maturation des P.

vinckei petteri et P. yoelii yoelii, apparaît 27 heures après l’invasion des mérozoïtes.

Il faut 3 heures pour qu’un gamétocyte de type O passe au stade I pour P. vinckei petteri et

6 heures pour celui de P. yoelii yoelii ; 6 heures pour passer du type I au stade II pour P. vinckei

petteri et 3 heures pour P. yoelii yoelii ; 3 heures pour le type II pour devenir de type III chez les

deux espèces.

II.. 66.. 33.. LLaa ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee

Les gamétocytes sont des cellules à potentiel sexué spécialisées, assurant la pérennité de

l’espèce plasmodiale et la transition entre l’hôte et le moustique.

Ils remplissent deux fonctions cellulaires très différentes, qui sont toutes deux essentielles à la

survie du parasite :

• un mécanisme efficace de transmission de l'hôte vertébré au moustique vecteur d’une

part,

35

• d’autre, ils sont responsables des événements du cycle de vie sexuelle, cycle qui ne sera

achevé que dans le repas sanguin du moustique (Sinden et al., 1996). C’est l’élément

charnière permettant la poursuite du cycle chez le vecteur.

Les facteurs qui provoquent la gamétocytogénèse :

II.. 66.. 33.. 11.. LLeess ffaacctteeuurrss ddee ll’’hhôôttee

II.. 66.. 33.. 11.. aa)) LL’’aannéémmiiee

L’anémie faite de stress s’accompagne souvent de poussées gamétocytaires. Schneweis et

al., en 1991, ont émis l’hypothèse qu’un produit de l’hémolyse soit responsable de la production

de gamétocytes infectants. Ils ont montré que la dilution avec érythrocytes lysés provoquait la

gamétocytogénèse (Schneweis et al., 1991 ; Nacher et al., 2002).

II.. 66.. 33.. 11.. bb)) LL’’iimmmmuunniittéé ddee ll’’hhôôttee vveerrttéébbrréé

Le stress immunitaire agit sur la gamétocytogénèse par son effet sur les lymphocytes (Smalley et

Brown, 1981). Les études sur l’immunité de l’hôte vertébré ont trouvé deux directions

inverses par rapport au nombre de gamétocytes produits :

A) in vivo:

� Production moindre de gamétocytes, chez les individus possédant une immunité

élevée dirigée contre le stade asexué, que chez ceux non immuns (Molineaux et

Gramiccia, 1980 ; Piper et al., 1999)

� Augmentation du taux de conversion de stade asexué en gamétocytes de P.

falciparum chez l’homme (Brockelman, 1982 ; Ono et al., 1986 ) : ainsi, la

diminution de la charge parasitaire par l’effet de l’immunité (environnement

défavorable), a favorisé la production de gamétocytes. Même phénomène chez les

rongeurs avec P.yoelii (Motard et al., 1995) et P.chabudi (Bucling et Read, 2001),

dans des souris immunisées.

B) in vitro : une stimulation de la gamétocytogénèse a également été trouvée en utilisant des

lymphocytes et du sérum de P. falciparum d’enfants infectés. (Smalley et Brown, 1981).

36

II.. 66.. 33.. 11.. cc)) LLeess hhoorrmmoonneess ddee ll’’hhôôttee

L’insuline, la progestérone, le 17 β-œstradiol, la testostérone (Lingnau et al., 1993) et les

corticostéroïdes (Maswoswe et al., 1985) augmentent la production des gamétocytes de P.

falciparum.

II.. 66.. 33.. 11.. dd)) LL’’ââggee eett ll’’eennvviirroonnnneemmeenntt iinnttrraacceelllluullaaiirree ddeess

éérryytthhrrooccyytteess

L’âge des érythrocytes et l’état de leur environnement intracellulaire sont des paramètres

qui pourraient avoir un rôle dans la gamétocytogénèse (Trager et Gill, 1992). Les érythrocytes

jeunes (réticulocytes) sont les cibles préférées d’invasion par le gamétocyte : le nombre de

gamétocytes dans un sang riche en réticulocytes, est dix fois plus important que celui contenu

dans un sang ordinaire. (Trager et Gill 1992 ; Trager et al., 1999 ; Trager, 2005). Les

érythrocytes jeunes contiennent une teneur élevée en ARN et elles sont encore capables de

synthétiser l'hémoglobine (Bosch et al., 1993). Smally et Brown (1981) ont montré que le sérum

et les lymphocytes prélevés chez des enfants gambiens provoquaient in vitro une

gamétocytogenèse plus importante que les mêmes éléments provenant de sujets européens

immunologiquement neufs. Une chute rapide du taux de gamétocytes a été constatée à la suite de

la dilution des cultures de P. falciparum par l‘adjonction d'érythrocytes frais en vue d'abaisser la

parasitémie (Carter et Miller 1979).

D’autre part, Gautret et al., (1997) ont indiqué que le rôle de l’âge de la cellule hôte sur le

développement des Plasmodium de rongeurs apparaissait complexe. Ils ont trouvé que

l’augmentation des réticulocytes provoquée par l’injection de phénylhydrazine entraînait une

augmentation de la production des gamétocytes chez P. chabaudi et P. berghei, mais que la

gamétocytogénèse chez P. yoelii yoelii et P. vinckei petteri n’était pas modifiée, sachant que les

deux espèces, P. yoelii et P. berghei, ont une préférence pour les réticulocytes, et que P.

chabaudi et P. vinckei ont une affinité identique pour les hématies (jeunes et mûres).

II.. 66.. 33.. 22.. LLeess ffaacctteeuurrss ppaarraassiittaaiirreess

II.. 66.. 33.. 22.. aa)) LLaa ffoorrttee cchhaarrggee ppaarraassiittaaiirree aasseexxuuééee

La charge parasitaire augmente logarithmiquement dix fois plus à chaque cycle (Simpson

et al., 2002). On suppose que la gamétocytogénèse serait liée à une certaine souffrance du

parasite soumis à des conditions défavorables (Carter et Miller, 1979) ; l’augmentation de la

37

parasitémie engendre une production élevée de gamétocytes (Alano et Carter, 1990). Dyer et

Day (2000) ont supposé qu'il y avait une relation inverse établie entre le nombre de parasites

asexués et la quantité de conversions en gamétocytes.

II.. 66.. 33.. 22.. bb)) LLeess ssoouucchheess

Certaines souches sont plus gamétocytogènes que d’autres (Graves et al., 1984). Certaines

études ont trouvé que la gamétocytogénèse des souches chloroquino-résistantes est augmentée

par rapport aux souches sensibles, que ce soit avec des Plasmodium de rongeurs ((Ramkaran et

Peters, 1965 ; lchimori et al., 1990) ou avec P. falciparum (Robert et al, 1996). Par contre, Hogh

et al., 1995 n’ont trouvé aucune différence d’augmentation entre les deux souches résistantes ou

sensibles.

La souche P. berghei (NK 65) ne produit plus de gamétocytes après plusieurs passages

chez un même hôte, mais elle pourrait redevenir gamétocytogène en changeant d'hôte (Birago et

al., 1982).

Il existe une variation entre les différents clones de la même souche de parasite ; Bhasin et

Trager (1984) ont isolé trois clones de la souche du Honduras (I/CDC) de P. falciparum, dont

deux (HB-1 et HB-3) étaient gamétocytogène, tandis que la troisième (HB-2) n’a pas produit de

gamétocytes.

II.. 66.. 33.. 22.. cc)) CCoo--iinnffeeccttiioonnss eett ccoonnttrrôôllee ddee llaa ccrrooiissssaannccee ddee

ll’’aauuttooccrriinnee

Les interactions, entre plusieurs génotypes qui existent chez le même hôte, sont moins

connues mais elles ont des conséquences importantes pour l’épidémiologie et l’évolution du

parasite. Taylor et al. (1997) ont trouvé que les interactions entre génotypes mixtes de P.

chabaudi, entraînaient une stimulation pour produire des gamétocytes. Il existe des dynamiques

interactives entre deux populations du parasite, qui peuvent être soit directes, par interaction

parasite-parasite autocrine, soit indirectes, par la compétition immunitaire (Dyer et Day, 2000).

II.. 66.. 33.. 33.. EEffffeett dduu ttrraaiitteemmeenntt cchhiimmiiqquuee ccllaassssiiqquuee ssuurr llaa

ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee eett//oouu lleess ggaammééttooccyytteess

� A la dose subcurative, les parasites souffrent sans être tués et ont tendance à favoriser la

gamétocytogénèse c’est le cas de la chloroquine avec P. chabaudi (Buckling et al., 1999).

38

Buckling et al. (1997) ont montré que la gamétocytogénèse de P. chabaudi était deux fois

et demi celle de témoins, après traitement à la chloroquine. Par contre, Gautret et al.,

(2000) ont observé une diminution de gamétocytes de P. v. petteri trois jours après avoir

traité avec une dose subcurative de chloroquine ; les mêmes résultats ont été observés sur

le nombre de gamétocytes de P. falciparum en traitant à l’artésunate (Pukrittayakamee et

al., 2004).

� Certains antipaludiques à action lente (qui agissent avec retard) peuvent augmenter la

souffrance des parasites (sans les tuer) qui orientent alors leur développement vers la

gamétocytogénèse. Citons notamment le proguanil, la pyriméthamine et l’association

sulfadoxine+pyriméthamine (Sokhna et al., 2001).

� Certains antipaludiques ont des effets directs sur la gamétocytogénèse. Ils peuvent donc

influer indirectement sur la transmission par le biais d'une forte réduction ou d’une forte

de la densité gamétocytaire, comme les amino-4-quinoléine (la chloroquine est létale

pour les stades jeunes des gamétocytes), les dérivés de l’artémisinine, la quinine et

l’association sulfadoxine+pyriméthamine sont fortement gamétocytocides (Barber et al.,

1929 ; Buckling et al., 1999 ; Targett et al., 2001).

� Le retard au traitement est une cause d’augmentation du temps de souffrance du parasite

asexué (Sokhna et al., 2001).

II.. 66.. 44.. LLaa ggaammééttooggéénnèèssee

La gamétogenèse du Plasmodium se réalise dans l’estomac du moustique qui est donc l’hôte

définitif du Plasmodium. C’est la formation des gamètes quelques minutes après l’ingestion des

gamétocytes par le moustique, en conséquence d’une activation que les gamétocytes mâles et

femelles réalisent. Ils s’échappent de la membrane plasmique et de l’hématie hôte pour être

libres dans le bol alimentaire du moustique. Ces transformations sont différentes dans les

gamétocytes mâles et femelles. L’exflagellation chez les gamétocytes mâles se fait par

multiplication cellulaire et aboutit à la formation de 8 microgamètes flagellés, alors que les

gamétocytes femelles réalisent une activation sans multiplication cellulaire et produisent à la fin

un macrogamète. (Sinden, 1998).

39

Les facteurs impliqués dans l’induction de la gamétogénèse :

1) Le changement de température : la chute de température entre l’homme (37°C) et le

moustique (inférieure de 5°C à celle de l'hôte vertébré) (Arnot et Gull ; 1998).

2) L’exposition à des molécules du moustique tel le GAF (gamétocyte activating factor) ou

l’acide xanthurénique (Billker et al., 1997).

3) La variation de pH : l’élévation de pH de l’estomac de moustique entre 8 et 8.3 a lieu suite à

une élévation de la pression en CO2 et du niveau de bicarbonates (Billker et al., 1998 ;

Bhattacharyya et al., 2001).

II.. 66.. 55.. LL’’iinnffeeccttiivviittéé ddeess ggaammééttooccyytteess ppoouurr llee mmoouussttiiqquuee

L’infectivité peut être définie comme la capacité pour les gamétocytes mâles et femelles de

générer un œuf mobile, l’ookinète, puis un œuf fixe d’où naîtront les sporozoïtes, formes

infectantes pour l’homme, se trouvent dans les glandes salivaires du moustique. Elle dépend de

nombreux facteurs inhérents soit au parasite, soit à l’hôte, et qui interagissent entre eux (Lensen,

1996).

II.. 66.. 55.. 11.. FFaacctteeuurrss iinnfflluuaanntt ssuurr ll’’iinnffeeccttiivviittéé ddeess mmoouussttiiqquueess lliiééss aauu

ppaarraassiittee

Un certain nombre de facteurs « parasite » ont été identifiés pour expliquer l’infectivité:

L’âge des gamétocytes : il influence le succès de l’infectivité pour le moustique, les jeunes

gamétocytes de stade V étant peu ou pas infectants chez P. falciparum ; Landau et al. en 1979

ont fait l’analyse morphologique des gamétocytes de P.yoelii yoelii et ont permis de différencier

quatre types morphologiques (O, I, II III) qui se succèdent chronologiquement. A l’intérieur de

chaque type, il y a des gamétocytes sains et d’autres altérés. Seules les formes jeunes (O et I)

sont infectantes pour le moustique, ceci est confirmé par le fait qu’aucune infection n’est obtenue

chez l’anophèle lorsque ces formes sont absentes du sang ingéré. L’apparition des formes

altérées coïncide avec la diminution de l’infectivité des gamétocytes. L’immaturité des

gamétocytes prélevés par le moustique peut être une des causes de leur « non infectivité » ; une

période de maturation des gamétocytes d’environ 1 ou 2 jours dans le sang périphérique, serait

nécessaire avant que ceux-ci ne deviennent infectants pour le moustique (Jeffery et Eyles, 1955).

Hawking et al., 1968 ont montré que les gamétocytes de P. knowlesi, P. cathemerium et P.

cynomologi, espèces à multiplication synchrone, n’étaient matures et infectants que la nuit

40

pendant quelques heures (5 à 12 heures), heures qui coïncidaient avec la période où le vecteur

piquait le plus.

La densité gamétocytaire : elle a également une influence sur l’infectivité des gamétocytes pour

le moustique. Lumsden et Bertram (1940) ont noté que le maximum d’infectivité des

gamétocytes de P. gallinaceum chez le moustique Aêdes aegypti ne coïncide pas toujours avec le

maximum de production des gamétocytes : cette observation a été confirmée par Cantrell et

Jordan (1946). Cependant, il n’existe qu’une faible corrélation linéaire positive entre densité et

infectivité. Il existe une valeur minimum de la gamétocytémie pour laquelle il n’y a pas

d’infestation du moustique (Dearsly et al., 1990). Mais la gamétocytémie ne peut pas, à elle

seule, présager de la mesure de l’infectivité pour le moustique (Carter et Graves, 1988).

La disponibilité des gamétocytes : Landau et al., 1979 suggèrent que les gamétocytes infectants

de P. yoelii sont situés préférentiellement dans les capillaires. L’agrégation des gamétocytes

pourrait favoriser l’infection chez le moustique, même si le repas sanguin a été réduit (Pichon et

al ; 2000).

La forte parasitémie asexuée : elle réduit parfois l’infectivité des gamétocytes. Le mécanisme est

inconnu. L’existence d’une corrélation positive entre une forte densité de formes asexuées et un

faible pouvoir infectant est généralement admise (Rutledge et al., 1969). Les résultats de Landau

et al 1979 suggèrent fortement que la période de haute parasitémie asexuée est associée à une

période d’infectivité réduite des gamétocytes pour les moustiques. Il pourrait s’agir du rôle

inhibiteur sur l’infectivité de certaines cytokines, comme le tumor necrosis factor (TNF)

abondamment secrété lors des poussées parasitaires asexuées (Lensen et al., 1997 ; Naotunne et

al., 1993) et l’apoptose de la cellules d’ ookinète est responsable de la réduction de plus de 50%

de stades intra-stomacaux de P. berghei avant l’invasion de l’estomac de A. stephensi .( Al-

olayan et al., 2002).

Le sex- ratio des gamétocytes : certaines études indiquent qu’il n’aurait pas d’influence sur

l’infectivité des gamétocytes pour le moustique (Boudin et al., 1989 ; Noden et al., 1994 ; Read

et al., 1992) ; à l’opposé, d’autres études confirment le rôle du sex-ratio sur l’infectivité : il faut

en général de 3 à 6 fois plus de femelles que de mâles. (Paul et al., 2002 ; Robert et al., 1996).

Le sexe-ratio habituel présente une prédominance de femelles, un fait qui compense

biologiquement la production de 8 microgamètes à partir d'un gamétocyte mâle. Une condition

optimale d'infectivité serait celle d'un gamétocyte mâle pour deux à huit femelles. Les études ont

identifié deux facteurs influençant le sexe-ratio :

41

� L’hormone de l’érythropoïétine synthétisée en réponse à une anémie, qui entraîne une

augmentation du nombre d’érythrocytes dans le sang, et une augmentation de la proportion

de gamétocytes mâles.

� Le pic gamétocytaire : une forte proportion de gamétocytes femelles apparaît, au moment du

pic gamétocytaire et deux semaines après ce pic (Robert et Boudin, 2003).

Les co- infections : Taylor et al 1997, indiquent que les taux de transmission des infections de

clones mixtes ont été 7 fois supérieurs à ceux de l’infection d’un seul clone.

II.. 66.. 55.. 22.. FFaacctteeuurrss iinnfflluuaanntt ssuurr ll’’iinnffeeccttiivviittéé ddeess mmoouussttiiqquueess ll iiééss àà ll’’hhôôttee

ddééffiinniittiiff

II.. 66.. 55.. 22.. aa)) LL’’iimmmmuunniittéé bbllooqquuaanntt llaa ttrraannssmmiissssiioonn ((TTBBII)) nnaattuurreellllee

L’état immunitaire modifie l’infectivité des gamétocytes pour le moustique (McCarthy et

al., 1978). Le moustique absorbe, avec les gamétocytes, des facteurs sériques ou des cellules

sanguines qui ont un rôle sur l’infectivité des gamétocytes pour le moustique :

Facteur globulaire : il existe un facteur d’origine érythrocytaire indispensable pour transformer

l’ookinète de P. gallinaceum en oocyste dans l’estomac de l’anophèle ; le nombre d’oocystes

varie proportionnellement avec l’augmentation des hématocrites (jusqu’à 50% d’hématocrites)

du sang ingéré par le moustique (Rosenberg et al., 1984).

Facteurs sériques :

� Immunité non médiée par les anticorps

L’infectivité des gamétocytes est élevée au début de l’infection, mais elle diminue

rapidement lorsque le nombre d’hématies infectées augmente dans le sang (Cantrell et Jordan,

1946 ; Rutledege et al., 1969), surtout au moment de la crise (Landau et al., 1979 ; Naotunne et

al., 1991) ; cependant, les gamétocytes sont produits normalement. Les gamétocytes non

infectants redeviennent infectants lorsqu’ils sont transférés dans un sérum sain ou dans le sang

neuf d’une souris (P. cynomolgi ; P. yoelii nigeriensis) en moins de deux heures (Landau et al.,

1979, Naotunne et al., 1990). Des études ont observé que le sérum récolté après la crise,

diminuait l’infectivité des gamétocytes in vivo (Petit et al., 1982) et in vitro (Bastien et al.,

1987). Dearsly et al., 1990 ont montré que l’injection des souris fortement parasitées avec P.

berghei « clone 233L » (clone donnant uniquement des stades asexués), avait diminué

l’infectivité des gamétocytes. Cela signifie que l’immunité anti-stade sexué n’est pas le seul

42

mécanisme qui bloque la transmission naturelle et que la présence de facteurs sériques bloque

l’infectivité in vivo liée aux stades asexués.

Les facteurs inflammatoires (comme l’oxyde nitrique) et des cytokines qui pourraient

jouer un rôle sur l'infectivité des gamétocytes (en ayant une action toxique sur les stades sexués

du parasite) ont été dépendants de la présence des globules blancs (Naotunne, et al., 1993) ;

l’action toxique du Tumor Necrosis Factor (TNFα) et de l’interféron gamma (INFγ) provoque

une baisse de l’infectivité des gamétocytes chez le singe infecté par P. cynomolgi ; après addition

d’anticorps anti-TNF et anti-INFγ au sérum de crise, les gamétocytes ont rétabli leur infectivité.

� Immunité médiée par les anticorps anti-gamètes

Les antigènes induisent la formation d’anticorps bloquant la transmission. Cela a été

démontré in vivo par vaccination des gamètes de P. berghei et P.yoelii nigeriensis chez le

rongeur, P.knowlesi chez le singe et P. gallinaceum chez le poulet (Gwadz et Green, 1978 ;

Carter et al., 1979 ; Mendis et Targett, 1979) ; in vitro, par l’utilisation d’anticorps monoclonaux

anti-gamètes de P.falciparum , P. vivax et P. gallinaceum (Kaushal et al., 1983 ; Rener et al.,

1980 ; Mendis et al., 1987). Voller et Bray en 1962 furent les premiers à démontrer l’existence

d’anti-gamétocytes contre P. falciparum. On peut classer les antigènes en deux groupes :

� Antigènes qui sont exprimés à la surface des gamètes mais aussi du gamétocyte

intracellulaire (ceux du gamétocyte sont internes au parasite entourant par la

membrane d’hématies, ils apparaissent en surface du gamète après la gamétogenèse)

et antigènes induisant la formation d’anticorps bloquant la fécondation.

� Antigènes qui sont synthétisés et exprimés après l’ingestion des gamétocytes par le

moustique : les anticorps dirigés contre ces antigènes, interrompent le développement

du parasite chez le moustique après la fécondation (Carter et al., 1979 ; Kaushal et al.,

1983 ; Grotendorst et al., 1984 ; Robert et Boudin, 2003).

Plusieurs anticorps dirigés contre des antigènes des gamétocytes de P. falciparum ont été

identifiés comme étant la cible d’anticorps bloquant la transmission :

� une protéine de 230 kDa (Pfs 230).

� une protéine de 25 kDa (Pfs 25) : exprimée à la surface du zygote, elle ne semble pas

exister chez le gamétocyte.

� deux protéines de 48 kDa et 45kDa sont exprimées à la surface des gamètes, composant

le complexe Pfs48/45 (Quakyi et al., 1987 ; Rener et al., 1980 ; Vermeulen et al., 1985).

� une protéine de plus de 2 megaDaltons (Feng et al., 1993).

43

Les autres espèces de Plasmodium (P. gallinaceum, P. yoelii et P. berghei) présentent des

antigènes de surface analogue (Carter et al., 1988 ; Harte et al., 1985 ; Winger et al., 1988).

Une bonne corrélation entre les taux d’anticorps anti-Pfs230 et la diminution de

l’infectivité des gamétocytes avait été mise en évidence, mais aucune corrélation n’avait été

indiquée avec les anticorps anti-Pfs48/45(Graves et al., 1988). Plus tard, Graves et al., (1992)

ont démontré une relation entre la présence d’anticorps du Pfs48/45 et l’absence d’infectivité des

gamétocytes.

II.. 66.. 55.. 22.. bb)) LLeess lleeuuccooccyytteess eett llaa pphhaaggooccyyttoossee

La phagocytose est responsable de 84% des pertes parasitaires in vitro, alors qu’elle

n’atteint que 7% in vivo (Sinden et Smalley, 1976, Lensen, et al., 1998) ; en interprétant la courte

de demi -vie des gamètes dans l’estomac du moustique (quelques minutes), ce stade parasitaire

ne peut probablement pas être la cible d'une phagocytose dans l'estomac du moustique.

II.. 66.. 55.. 22.. cc)) LLaa cceelllluullee TT

Le transfert passif immunitaire de cellules T d’une souris immunisée à une souris non

immune, réduit la transmission (95%) ; l'effet est dû à une réduction significative du nombre de

gamétocytes de rongeur P. yoelii nigeriensis circulants lors de l'infection (Haret et al., 1985).

IIII.. LLaa lluuttttee ccoonnttrree llee ppaalluuddiissmmee

IIII.. 11.. LLaa lluuttttee aannttii--vveeccttoorriieellllee

Les recherches sur la mise au point d’un vaccin débuteront en 1969 à partir de sporozoïtes

irradiés de P. berghei (Nussenzweig et al., 1969). Un vaccin paraît être de plus en plus

souhaitable devant l’accroissement de la chloroquinorésistance et la mauvaise réponse des

insecticides. Les sujets vaccinés seraient partiellement protégés et empêcheraient la transmission.

La recherche concernant les vaccins vise la mise au point de 3 types de vaccins :

� Les vaccins anti-sporozoïtaire ou pré-érythrocytaire ;

� Les vaccins dirigés contre les stades érythrocytaires asexués ;

44

� Les vaccins bloquant la transmission. Mais jusqu’à présent aucun vaccin efficace n’a

encore été trouvé.

Les moyens existants contre la morbidité et, la mortalité, restent du domaine des

médicaments naturel ou de synthèse unique ou associés et l’arrêt de la transmission peut-être

enrayé par la lutte anti-vectorielle, et la transmission. Cette première ligne de défense contre le

paludisme, revêt un caractère essentiellement préventif en limitant le contact entre l’homme et le

moustique par des méthodes mécaniques, chimiques, biologiques et génétiques, mais peut aussi

comprendre la lutte contre le vecteur lui-même.

IIII.. 11.. 11.. MMéétthhooddeess ddee lluuttttee mmééccaanniiqquuee

Elles consistent en l'aménagement du territoire afin d'éliminer les gîtes larvaires,

l’assèchement et le remblaiement des marais, le drainage des eaux utilisé en irrigation,

l’aménage de barrages et leurs fonctionnement et la suppression des plantes aquatiques ;

entraînant ainsi une baisse des sources de vecteurs. L'amélioration de l'habitat peut entraîner les

moustiques endophiles à devenir plus exophiles, ce qui peut diminuer leur espérance de vie.

Les moustiquaires imprégnées d'insecticides s'utilisaient comme lutte anti-vectorielle

contre le paludisme. En effet, les forces armées soviétiques, allemandes et américaines, au cours

de la deuxième guerre mondiale, ont utilisé des moustiquaires et vêtements imprégnés

d'insecticide dans le dessein de se protéger contre le paludisme. Au début des années 80, l'OMS a

commencé par s'intéresser aux moustiquaires.

IIII.. 11.. 22.. MMéétthhooddeess ddee lluuttttee cchhiimmiiqquuee

Elles utilisent des produits insecticides ou répulsifs (insectifuges, ce sont des substances

appliquées sur la peau exposée ou sur les vêtements pour repousser le vecteur). Les répulsif

actifs, employés couramment, sont le DEET, l’éthylhexanediol, le méthyl- phtalate et le

diméthyl-phtalate. Il existe cinq familles d'insecticides ayant chacune un mode d'action

particulier. Ce sont les organochlorés (D.D.T), les organophosphorés (Malathion, Témophos), les

carbanates (Propoxur), les pyréthrinoïdes « Perméthrine » (on place ces pyréthrinoïdes à

l’intérieur des habitations, à la surface des eaux stagnantes, afin de supprimer les gîtes larvaires,

toxine du Bacillus thuringiensiset BT14 ; et surtout l’emploi de moustiquaires) et les inhibiteurs

de croissance des insectes (Encore à l'état expérimental). On observe des phénomènes de

résistances croisées qui s'expriment au niveau enzymatique (D.D.T) ou physiologique

45

(pyréthrinoïdes). La résistance des moustiques aux insecticides se développe ce qui oblige à

trouver d’autres approches, notamment la lutte biologique.

IIII.. 11.. 33.. MMéétthhooddeess ddee lluuttttee bbiioollooggiiqquuee

Elle repose sur l’utilisation de parasites comme les Mermithidae (des nématodes) et les

Coelomonryces (champignons de l’ordre des Blastocladiales), de bactéries entomopathogènes,

dont Bacillus thuringiensiset et B. shareicus, de prédateurs des anophèles (les larves des

Culicidae, mollusques, poissons larvivores), destinés à attaquer les différents stades du

moustique: malheureusement, ce moyen de lutte est une bonne solution pour la sauvegarde de

l'environnement mais il présente une rémanence faible pour un coût élevé (Mouchet et al., 2004).

La solution restante est la chimie. Cette dernière permet de lutter contre le parasite à

différents niveaux, chez l’homme et chez le moustique. On utilise des thérapeutiques

prophylactiques ou curatives, aussi bien au plan individuel que collectif.

IIII.. 22.. LLeess aannttiippaalluuddiiqquueess

IIII.. 22.. 11.. NNoottiioonn dd’’aannttiippaalluuddiiqquuee

C’est l’ensemble des produits chimiques (naturels ou synthétiques) administrés à l’homme

pour lutter contre le plasmodium, soit pour le tuer (plasmocides) soit pour inhiber son

développement plasmostatique.

IIII.. 22.. 22.. HHiissttooiirree eett aaccttuuaalliittéé ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess

L’histoire des antipaludiques a commencé depuis le 16e siècle, en 1630 avec la découverte des

écorces de quinquina qui ont été apportées du Pérou en Europe par Don Francisco Lopez. En

France, Pelletier et Caventou ont isolé l’élément actif (alcaloïde) dans les racines de quinquina :

c’était le début de la première chimiothérapie. Neuf ans avant la deuxième guerre mondiale, en

1930, fut découvert le premier antipaludique de synthèse. En 1971, des chimistes chinois ont

isolé des feuilles de la plante Qinghao (Artémisia annua), l’artémisinine qui est un sesquiterpène

lactone contenant un groupe endopéroxide, qui semble être responsable de l’activité

46

antipaludique de la plante. Cette plante est utilisée depuis des millénaires dans la médecine

chinoise pour traiter les fièvres (Klayman, 1985).

Les antipaludiques sont des médicaments qui ont un champ d’action bien défini contre

différentes espèces de parasites de l’homme et de l’animal, et un degré variable d’activité contre

les différentes formes que prennent les hématozoaires au cours de leur cycle évolutif. Chez l’hôte

vertébré et chez le vecteur invertébré, les seuls antipaludiques naturels sont la quinine et

l’artémisinine. On peut classer les antipaludiques selon deux modalités : la classification

chimique et la classification selon le site d’action.

IIII.. 22.. 33.. CCllaassssiiffiiccaattiioonn ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess

IIII.. 22.. 33.. 11.. CCllaassssiiffiiccaattiioonn cchhiimmiiqquuee

Cette classification tient compte de la structure chimique de la molécule, ce qui donne 11

groupes :

1- Alcaloïdes du quinquina (Quinine)

2- Amino-4-quinoléines (Chloroquine, Amodiaquine)

3- Amino-8-quinoléines (Primaquine)

4- Amino-9 acridines (Mépacrine)

5- Amino-alcools (Méfloquine, Halofantrine et Luméfantrine)

6- Dérivés de l’artémisinine (Artéméther, Artésunate, Artééther et Dihydroartémisinine)

7- Antifoliniques (Proguanil, Pyriméthamine et Triméthoprime)

8- Antifoliques (Sulfaoxine, Sulfaténe et Dapsone)

9- Hydroxynaphtoquinone (Atovaquone)

10- Antibiotiques

11- Les associations

IIII.. 22.. 33.. 22.. CCllaassssiiffiiccaattiioonn sseelloonn llee ssiittee dd’’aaccttiioonn

On peut classer les antipaludiques selon leur site d’action sur le parasite en 3 classes :

I. Schizonticides, actifs sur le cycle endo-érythrocytaire asexué. La plupart des

antipaludiques sont des schizontocides ; ils sont eux-mêmes classés dans deux groupes

selon leur mode d’action :

47

1) Schizonticides tissulaires : qui ont une action lente et agissent sur les formes exo-

érythrocytaires (les schizontes exo-érythrocytaires) dans les hépatocytes chez

l’homme ; le proguanil, la primaquine, en sont des exemples.

2) Schizonticides sanguins : qui agissent sur les schizontes érythrocytaires. Ce sont

la chloroquine, la quinine, l’artésunate, la méfloquine, la sulfadoxine-

pyriméthamine, l’halofantrine et les antibiotiques.

II. Gamétocytocides : qui agissent en inhibant la transformation des gamétocytes « mâles et

femelles » du sang humain en gamètes chez le moustique ; ils entravent ainsi le cycle

sporogonique et interrompent la transmission de l’espèce plasmodiale. Les gamétotocides

sont tous des amino-8-quinoléines, qui sont tous toxiques.

III. Sporontocides : inhibent le développement des oocystes et des sporozoïtes chez les

anophèles (WHO, 1984).

IIII.. 22.. 44.. SSttrruuccttuurree cchhiimmiiqquuee ggéénnéérraallee ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess

En général, le noyau benzénique se retrouve dans la structure moléculaire de tous les

antipaludiques classiques (Figure 7).

IIII.. 22.. 44.. 11.. AAllccaallooïïddeess dduu qquuiinnqquuiinnaa ((llaa qquuiinniinnee eett sseess ddéérriivvééss))

La quinine

La quinine est en le principal composé et elle est le plus ancien des ces amino-alcools. Elle

contient un noyau quinoléine lié par un alcool secondaire à un noyau quinuclidine avec un

groupe méthoxyle en position 6 et un groupe vinyle lié au cycle quinuclidine.

Formule brute : C20H24N2O2

Nom chimique : Vinyl-1 quinuclidyl-2méthoxy-6quinoly-4carbinol

Chaque substitution sur la structure chimique de la quinine modifie les actions pharmacologiques

du composé (WHO, 1984). Woodward et Doering réalisèrent la synthèse totale de la quinine en

1945 (Hostettmann, 1997).

48

IIII.. 22.. 44.. 22.. AAmmiinnoo--44--qquuiinnoollééiinneess

Ce sont les premiers antipaludiques de synthèse isolés entre 1938 et 1941. En général, ils

ont un noyau quinoléique, une chaîne latérale aminée en position 4 et un radical chloré en

position 7.

La chloroquine (Nivaquine®)

Formule brute : C18H26ClN3

Nom chimique : chloro-7 (diethylamino-4 ‘méthul-1’butylamino)-4 quinoléine.

L’amodiaquine (Flavoquine®)

Formule brute : C20H22ClN3O

Nom chimique : chloro-7 (diethylamino-3 hydroxy-4anilino)-4 quinoléine.

La Ferroquine

Les phénomènes de résistance chez le parasite se développant de plus en plus rapidement.

Il devient donc urgent de développer de nouvelles molécules antipaludiques pour lesquelles les

probabilités d’appariation de résistance sont minimes. La ferroquine est née de l’incorporation

d’un groupement ferrocénique au sein de la molécule de chloroquine (Biot, et al., 1997).

Formule brute : C23H24ClFeN3

IIII.. 22.. 44.. 33.. AAmmiinnoo--88--qquuiinnoollééiinneess

Synthétisés par Schulemann et ses collaborateurs vers les années 1920 en Allemagne ; la

primaquine est le chef de ce groupe qui contient aussi la pamaquine (première 8 aminoquinoléine

synthétisée en Allemagne), la rhodoquine, la pentaquine, l’isopentaquine et la quinocide.

La primaquine :

Formule brute : C15H21N3 .O2

Nom chimique : (amino-4 méthyl-1 butylamino)-8 méthoxy-6 quinoléine

La pamaquine :

Formule brute : C19H29N3O

Nom chimique : 1-N, 1-N-diéthyl-4-N-(6-méthoxyquinolin-8-yl) pentane-1,4-diamine

49

IIII.. 22.. 44.. 44.. AAmmiinnoo--99 aaccrriiddiinneess

En 1932, Kikuth et ses collaborateurs ont introduit une chaîne basique

dialcoylaminoalcoyle dans le noyau acridine. Ceci a conduit à la découverte de la mépacrine (ils

ont remplacé le noyau quinoléine de la pamaquine par l’acridine).

La mépacrine

Formule brute : C19H29N3O

Nom chimique : (diéthylamino-4méthyl-1 butylamino)-8 méthoxy-6 quinoléine

La pyronaridine (aussi appelé : Malaridine®)

Formule brute : C29H32ClN5O2

Nom chimique : 4-[(7-Chloro-2-methoxybenzo[b]-1,5-naphthyridin-10-yl) amino]-2,6-bis (1-

pyrrolidinylmethyl) phenol

IIII.. 22.. 44.. 55.. AAmmiinnoo--aallccoooollss

La méfloquine (Lariam®) et l'halofantrine (Halfan®) sont des amino-alcools de synthèse

apparentés à la quinine, introduits récemment en thérapeutique (méfloquine et halofantrine) et en

chimioprophylaxie (méfloquine) par voie orale du paludisme (Le Bras et al., 1991).

La méfloquine (Lariam®)

Formule brute C17H16F6N2O

Nom chimique: (R*, S*)-2, 8-bis (trifluoromethyl) quinolin-4-yl]-(2-piperidyl) methanol

L’halofantrine (Halfan®)

Formule brute : C26H30Cl2F3NO

Nom chimique : 3-dibutylamino-1-[1,3-dichloro-6-(trifluoromethyl) phenanthren-9-yl]-propan-

1-ol

La luméfantrine (Benflumétol : est en association de la Cortem ®et Riamet®)

Formule brute : C30H32Cl3NO

Nom chimique : (Z) - 2,7-Dichloro-9- [méthylène (4-chlorophenyl)] - alpha [(dibutylamino)

méthyle] - 9H-fluorene-4-methanol

50

IIII.. 22.. 44.. 66.. DDéérriivvééss ddee ll’’aarrttéémmiissiinniinnee

L’artémisinine est un sesquiterpène lactone dérivé de la plante Qinghao. Comme ses

dérivés, elle est hydrolysée en dihydroartémisinine. La structure de l’artémisinine est une lactone

sesquiterpènique avec deux atomes d'oxygène liés par un pont péroxyde au-dessus d'un cycle à

sept atomes de carbone.

Formule brute : C15H22O5

L’artéméther : (Paluther®) est un dérivé semi-synthétique de l'artémisinine


Nom chimique : 3 6 9-triméhyl, 10-méthoxy, 3 12-époxydécahydro, 12-pyrano 1 2-benzodioxépine

L’artééther Formule brute : C17H28O5

Nom chimique : (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-éthoxydécahydro- 3,6,9-triméthyl-3,12-

époxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxépine

L’artésunate (Arsumax®) : C’est un dérivé hémisuccinate hydrosoluble de l’artémisinine.


Nom chimique : dihydro artémisinine 10ά hémisuccinate

La dihydroartémisinine (Artenimol)


Nom chimique : 3, 12-epoxy-12H-pyrano (4, 3-J)-1, 2-benzodioxepin-10-ol, décahydro-3, 6, 9-triméthyl-(3R- (3-α, 5a-β, 6-β, 8a-β, 9-α, 10-α, 12-β, 12aR*))

IIII.. 22.. 44.. 77.. AAnnttiiffoolliinniiqquueess

Ce sont des inhibiteurs de la réductase de l’acide dihydrofolate. Les antifoliniques et (les

antifoliques) sont connus depuis les années 1950.

Le Proguanil (Paludrine®) : il a un noyau benzénique et une chaîne est fixée à l’une de ses

extrémités à un noyau chlorophényl et à l’autre à un simple groupe alcoyle (isopropyle).


Nom chimique : (p-chlorophényl)-1- isopropyl-5-biguanide

51

La pyriméthamine (Malocide®) : c’est le plus efficace des inhibiteurs de la dihydrofolate

réductase synthétisée en 1951.


Nom chimique : 5-(4-chlorophényl)-6–éthyl–2,4–pyrimidinediamine

IIII.. 22.. 44.. 88.. AAnnttiiffoolliiqquueess :: lleess ssuullffaammiiddeess ((ssuullffaaddooxxiinnee eett ssuullffaammeetthhooxxaazzoollee))

eett lleess ssuullffoonneess ((DDaappssoonnee))

Ils ne sont pas indiqués en monothérapie à cause de leur action lente et de la

chimiorésistance face à certaines souches de P. falciparum, mais en association avec la

pyriméthamine.

La sulfadoxine

Formule brute : C12H14N4O4S

Nom chimique : (amino-4 benzène sulfonyl)-6 diméthoxy-4,5 pyrimidine

La dapsone

Formule brute : C12H12N2O2S

Nom chimique : diamino-4,4’ diphènylsulfone

IIII.. 22.. 44.. 99.. HHyyddrrooxxyynnaapphhttooqquuiinnoonnee

L’atovaquone : hydroxynaphtoquinone inhibitrice des fonctions mitochondriales de

Plasmodium utilisée en association avec la Proguanil (Malarone®).

Formule brute : C22H19ClO3

Nom chimique : 2-[trans-4-(4-chlorophényl) cyclohéxyl]-3-hydroxynaphtalène-1,4-dione

IIII.. 22.. 44.. 1100.. AAnnttiibbiioottiiqquueess

Il existe plusieurs antibiotiques qui montrent une activité antipaludique. L’usage des

antibiotiques a pour intérêt d’éviter les rechutes en achevant l’élimination des parasites.

1-Les cyclines

o Les tétracyclines : sont utilisées en traitement curatif, en association, par exemple

avec la quinine (Karbwang et al., 1994) ; la tétracycline est un antibiotique produit

par une bactérie du genre Streptomyces.

52

Formule brute C22H24N2O8

Nom chimique : 4-diméthylamino-1,4,4a,5,5a ,6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-

pentatydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphthacenecarboxamide.

o La doxycycline (Vibramycine®) inhibe la synthèse protéique mitochondriale

(Wiesner et al., 2003)

Formule brute : C22H24N2O8

Nom chimique : 4-dimethalamino-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,5,10,12,12a-

pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphthecenecarbonxamide

2-Les macrolides

Ils sont utilisés en association avec d’autres antibiotiques (érythromycine, spiramycine) ou

isolément (clindamycine) en cas de chimiorésistance:

o La clindamycine : C'est un dérivé semi-synthétique de la lincomycine, proche des

macrolides.

Formule brute: C18H33ClN2O5S

Nom chimique : méthyle7-chloro-6, 7,8-tridésoxy-6-(1methyl-trans-4-propyl-L-2

pyrrolidinecarboxamido)-1-thio-L-thréo-α-D-galacto-

octopyranosidemonohydrochloride.

o L’azithromycine est dérivée de l'érythromycine par addition d'un atome d'azote dans

le cycle lactone de l'érythromycine A

Formule brute: C38H72N2O12

Nom chimique : 9-désoxy-9a-aza-9a-méthyl-9a-homoérythromycine A.

53

Chloroquine Amodiaquine Ferroquine

Amino-4-quinoléines

Pipéraquine

Primaquine Pamaquine

Amino-8-quinoléines

Mépacrine Pyronaridine

Amino-9-acridines

Quinine Méfloquine Luméfantrine Halofantrine

Amino-alcools

Arthéméther Arthééther Artésunate Dihydroartémisinine

Dérivés de l’artémisinine

54

Figure 7. Formes chimiques développées des antipaludiques.

(http://en.wikipedia.org)

Proguanil

Pyriméthamine

Antifoliniques

Sulfadoxine

Dapsone

Antifoliques

Hydroxynaphtoquinon

Atovaquone

Doxycycline Tétracycline Clindamycine

Azithromycine

Antibiotiques

55

IIII.. 22.. 44.. 1111.. LLeess aassssoocciiaattiioonnss dd’’aannttiippaalluuddiiqquueess

L’apparition de polychimiorésistances de certaines souches des plasmodies chez l’espèce

la plus dangereuse (P. falciparum) suscite la recherche permanente de nouvelles molécules,

isolées ou associées si possible entre différents produits actifs sur des cibles métaboliques

différentes. Le concept de combinaison thérapeutique est basé sur l’action potentielle synergique

ou additive de deux médicaments ou plus, dans le but d’améliorer l’efficacité et de retarder

l’apparition de la résistance aux composants individuels de l’association.

Les nouveaux antipaludiques qui ont fait l’objet de développement récent sont tous

associés, au moins en bithérapie, et se démarquent de la plus ancienne des associations, la

sulfadoxine-pyriméthamine capable de sélectionner rapidement des mutants résistants. Certaines

associations sont fixes : l’atovaquone-proguanil, l’artéméther-luméfantrine et la chlorproguanil-

dapsone (« Lapdap® » est abandonnée depuis plusieurs années). D’autres associations sont libres,

associant toujours un dérivé de l’artémisinine: artésunate-méfloquine, artésunate-amodiaquine,

artéméther-proguanil et artésunate-sulfadoxine-pyriméthamine (WHO, 2000).

En prophylaxie, les associations chloroquine-proguanil (Savarine®) et atovaquone-

proguanil (Malarone®) sont recommandées selon les zones de chloroquino-résistance.

D’après le programme « Roll Back Malaria », un traitement combiné consiste

«l’association additive de deux thérapeutiques, afin d’améliorer leur efficacité thérapeutique et

de retarder l’apparition de résistance à chacun des constituants de cette association ». Il y a deux

types d’associations de médicaments antipaludiques :

� Associations sans artémisinine (non CTA) :

Ce sont des associations dans lesquelles il n’y a pas de dérivés d’artémisinine. Elles sont

constituées de schizonticides sanguins agissant sur différentes cibles biochimiques du parasite.

Elles sont présentées sous forme des antipaludiques individuels pour administration conjointe ou

sous forme d’associations fixes. Les associations ont présenté des taux de guérison plus élevés

que les médicaments individuels, ces associations sont comme Sulfadoxine-Pyriméthamine

(Fansidar®), Sulfaméthoxazole-Triméthoprime (Bactrim®), Sulfadoxine-Pyriméthamine

Méfloquine (Fansimef®), Dapsone-Pyriméthamine (Maloprime®), Quinine-Tétracycline,

Quinine-Doxycycline, Quinine-Clindamycine et proguanil-Atovaquone (Malarone®).

56

� Associations artémisinine (Combinaisons Thérapeutiques à base d’Artémisinine

(CTA) :

Plusieurs dérivés d’artémisinine ont été utilisés dans différentes formulations contre le paludisme

depuis le début des années 1980. Les CTA sont assez neufs et possèdent de nombreux avantages

par rapport aux originaux. L’Artémisinine (quinghaosu), l’artésunate, l’artéméther et la

dihydroartémisinine ont tous été utilisés en combinaison avec d’autres antipaludiques pour le

traitement du paludisme. Les CTA sont comme Artésunate-Chloroquine, Artésunate-

Amodiaquine, Artésunate-Sulfadoxine-pyriméthamine, Artésunate-méfloquine, Artéméther-

Luméfantrine (Riamet®, Coartem®) dihydroartémisinine-piperaquine (Eurartesim®) et

artésunate - pyronaridine (Pyramax®).

Les avantages de l’introduction des combinaisons à base d’artémisinine selon l’OMS sont :

1-absence de résistance

2-bonne tolérance

3- négativité rapide de la parasitémie

4-activité contre les souches multirésistantes de P. falciparum

5- éliminer rapide de symptômes

6-réduction rapide de la biomasse plasmodiale

7- Possibilité de réduire la transmission, en raison de l’activité des dérivés de l’artémisinine sur

le taux de portage gamétocytaire.

IIII.. 22.. 55.. LLee mmooddee dd’’aaccttiioonn ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess

IIII.. 22.. 55.. 11.. LLeess iinnhhiibbiitteeuurrss ddee ddééttooxxiiffiiccaattiioonn ddee ll''hhèèmmee

IIII.. 22.. 55.. 11.. aa)) LLyyssoossoommoottrrooppeess

Lysosomotrope qualifie une drogue produisant un disfonctionnement des lysosomes. Les

lysosomes sont des vésicules issues d’un appareil de Golgi atypique ; ils transfèrent les enzymes

nécessaires à la dégradation de l’hémoglobine.

57

La caractéristique principale des lysosomotopes est de se concentrer à des degrés divers

dans la vacuole digestive, d’où leur toxicité sélective pour le parasite : ils bloquent la

dégradation enzymatique de l’hémoglobine dans la vacuole nutritive du plasmodium, source

principale des acides aminés du parasite intra-érythrocytaire.

�� En se liant avec l’hème libre, il y a formation des complexes toxiques : (hème-CQ, hème-

quinine) puis blocage de la formation de l’hémozaïne.

�� L’accumulation des lysosomotropes augmente le pH dans la vacuole digestive qui inhibe

l’hémopolymérase (pas de détoxification de l’hème en hèmozoïne (Surolia et Padmanban,

1991 ; Slater, 1993 ; Steele et al., 2000)

Les lysosomotropes comprennent deux groupes : les amino-4-quinoléines (chloroquines,

amodiaquine, pipéraquine) et les amino-alcools (quinine, méfloquine, halofantrine,

luméfantrine).

IIII.. 22.. 55.. 11.. bb)) LLeess aallkkyyllaannttss

Alkylation des métabolites de l’hémoglobine:

�� Endopéroxydes : la réaction de péroxyde d’artémisinine avec le fer héminique

parasitaire produit par protéolyse de l’hémoglobine de l’hôte libère des radicaux

actifs de l’oxygène.

�� Alkylation : formation d’actions covalentes avec l’hème, hème-polymérase.

�� La libération d’oxygène et de radicaux libres qui provoque un blocage de la

réplication de l’ADN et de la synthèse protéique, ainsi qu’une perturbation des

membranes par alkylation des protéines. (WHO, 2000; Robert, 2003; Wiesner,

2003).

IIII.. 22.. 55.. 22.. LLeess iinnhhiibbiitteeuurrss dduu mmééttaabboolliissmmee ddeess aacciiddeess

nnuuccllééiiqquueess ((aannttiimmééttaabboolliitteess))

Ils inhibent la division du noyau de parasite. Ce groupe est réparti en trois groupes,

antifolates, naphtoquinones et antibiotiques.

58

IIII.. 22.. 55.. 22.. aa)) LLeess aannttiiffoollaatteess

Les antifolates bloquent la division du noyau du Plasmodium aux stades schizontes (phases

érythrocytaire et hépatocytaire). Les antifolates comprennent deux familles, les antifoliques et les

antifoliniques. Ils inhibent les enzymes dans la voie de synthèse de l’acide folique nécessaire aux

plasmodies (Figure 8).

Les antifoliques : inhibition de la DHPS (sulfadoxine, dapsone)

Ils agissent comme inhibiteurs compétitifs de la dihydroptéroate synthétase (DHPS) au

niveau de son site actif. La DHPS catalyse la transformation de l’hydroxyméthyldihydroptérine

en dihydroptéroate au cours du métabolisme des folates.(Winkler, et al., 1994)

Les antifoliniques : inhibition de la DHFR (pyriméthamine, cycloguanil)

Ils inhibent la dihydrofolate réductase (DHFR), qui intervient dans la réduction du

dihydrofolate en tétrahydrofolate. Ce dernier est un cofacteur nécessaire dans la biosynthèse de

la thymidylate, des nucléotides puriques et de certains acides aminés. (Olliaro, et Trigg, 1995).

IIII.. 22.. 55.. 22.. bb)) LLeess nnaapphhttooqquuiinnoonneess :: ccyyttoocchhrroommee bbcc AATTPP

((aattoovvaaqquuoonnee))

L’atovaquone, en bloquant la chaîne de transfert d’électrons au niveau de son enzyme-

clé, la dihydroorotate deshydrogénase (DHOdase) : est un inhibiteur puissant des fonctions

mitochondriales (Touze, et al., 2002 ; Pradines et al., 2003).

IIII.. 22.. 55.. 22.. cc)) LLeess aannttiibbiioottiiqquueess ::

Ils peuvent inhiber la synthèse protéique par inhibition de certaines fonctions de l’apicoplaste, un

reliquat d’un ancien chloroplaste identifié chez P. falciparum. Par exemple :

- Inhibiteurs de l'ARN polymérase : ansamycines.

- Inhibiteurs de l'ADN-gyrase et de la topoisomérases IV : quinolones et

fluoroquinolones.

- Inhibiteurs de la synthèse de l'acide folique : sulfamides et diaminopyridines. (Touze, et

al., 2002 ; Pradines et al., 2003).

-

59

Figure 8. Mode d’action des antifoliques et antifoliniques (d’après Charmot, 1993)

IIII.. 22.. 66.. CChhiimmiioorrééssiissttaannccee

La chimiorésistance concerne exclusivement P. falciparum et les schizontocides sanguins.

L’OMS, en 1973, définit la pharmaco-résistance ou la résistance comme étant l'aptitude d'une

souche parasitaire à survivre ou à se reproduire malgré l'administration et l'absorption d'un

60

médicament aux doses égales ou supérieures à celles recommandées mais comprises dans les

limites de tolérance du sujet. (Basco et Ringwald, 2000). Une résistance a déjà mis en évidence

pour toutes les classes des médicaments antipaludiques. Elle augmente le niveau de transmission

çdu paludisme et, par conséquent, le nombre d’accès augmente.

Cette résistance a d’abord été définie :

in vivo

1- - Test de chimiorésistance parasitologique, OMS, 1965 :

On mesure le temps de diminution et de disparition de la parasitémie par des contrôles

quotidiens pendant 7 jours et on recherche son éventuelle réapparition par des contrôles

hebdomadaires pendant 28 jours, après avoir administré une dose thérapeutique standard. On

peut distinguer, en fonction de leur sensibilité, 3 types de résistance (Tableau 3) :

� Sensibilité : disparition des stades sanguins asexués avant le septième jour de traitement.

� une résistance de type RI marquée par une disparition des stades asexués en moins de 7

jours, suivie d'une recrudescence avant 4 semaines.

� une résistance de type RII marquée par une baisse de la parasitémie inférieure à 25% de

la parasitémie initiale pendant la première semaine, sans disparition totale, suivie d’une

ré-augmentation de la parasitémie.

� une résistance de type RIII caractérisée par une persistance de la parasitémie à plus de

25% de la parasitémie initiale.

2- - Test d’efficacité thérapeutique (clinique et parasitologique) OMS 1996, modifié 2001 :

La résistance aux antipaludiques est exprimé en réponse clinique adéquate (adequate

clinical response « ACR ») ou en échec thérapeutique précoce (early treatment failure « ETF »)

ou tardif (late treatment failure « LTF ») en fonction de la disparition, de l’aggravation, de la

persistance ou de la réapparition des signes cliniques, en particulier la fièvre, et en fonction de

l’évolution de la parasitémie.

in vitro, on évalue quantitativement la réponse aux traitements des souches plasmodiales ; on fait

dans le même temps un dosage de la chloroquinémie, pour caractériser une souche résistante.

� Test de Rieckmann de maturation des trophozoïtes de P. falciparum dans un milieu de

culture.

61

Réponse Symbole

recommandé Signes observés

Sensibilités S

Disparition des formes érythrocytaires asexuées dans les

7 jours suivants de début du traitement, sans

recrudescence ultérieure.

Résistance R I Disparition des formes érythrocytaires asexuées comme

en S, mais suivie de recrudescence

R II Diminution marquée du nombre des formes

érythrocytaires asexuées, mais non disparition complète.

R III Pas de diminution marquée des formes érythrocytaires

asexuées

Tableau 3. Classification des différents types de résistance parasitaire et des réponses thérapeutiques en zone de faible transmission

� Test phénotypique : culture de souches plasmodiales dans un milieu spécial, en présence

de concentrations variables d’antipaludiques pendant un période de 24 à 48 heures

(WHO, 1984).

IIII.. 22.. 66.. 11.. MMééccaanniissmmeess ddee rrééssiissttaannccee aauuxx aannttiippaalluuddiiqquueess

Les mécanismes de la résistance sont dépendants des mécanismes d’action des

antipaludiques.

L’efficacité des lysosomotropes est due à leur concentration sélective dans les hématies

infectées, alors que chez les hématies saines la résistance aux lysosomotropes est liée à leur

moindre accumulation dans la vacuole digestive du parasite (Le bras et al., 1993), le déficit de

concentration dans cette vacuole est en rapport avec une sortie rapide de la chloroquine hors de

la vacuole.

Cet efflux est celui d’une liaison de la chloroquine avec une protéine située dans la membrane de

la vacuole digestive (Krogstad et al., 1987 ). Cette molécule est le gène pfcrt « Plasmodium

falciparum chloroquine résistance transporter » et la mutation K76T du gène pfcrt confère une

résistance à la chloroquine (Fidock et al., 2000).

La résistance à la pyriméthamine et au proguanil est due à des mutations ponctuelles dans

le gène codant la DHFR (di-hydrofolate-réductase). La résistance aux antifoliques est également

62

due à des mutations portant sur les gènes codant la DHPS (di-hydro-ptérote-synthétase) (Le Bras

et al., 1993). Lors que les antifolates sont utilisées en monothérapie les résistances se

développent très rapidement, par mutation de l’enzyme-cible. Des combinaisons ont donc été

mises au point, c’est le cas par exemple du Fansidar® (pyriméthamine-sulfadoxine) et du

Lapdap® (chlorproguanil-dapsone) (Warhurst, 1999).

IIII.. 22.. 66.. 22.. ÉÉvvoolluuttiioonn ddee llaa rrééssiissttaannccee aauuxx aannttiippaalluuddiiqquueess ddaannss llee mmoonnddee

La résistance est un phénomène qui augmente en quantité et qualité. En cas Afrique,

depuis 1980, on peut noter plusieurs niveaux :

o extension géographique, à partir de l’Amérique du Sud et du Sud-est Asiatique,

o augmentation continue des pourcentages de souches résistantes,

o augmentation du niveau de résistance des souches, par exemple la

chloroquinerésistance s’est propagée plus rapidement en Afrique et atteint de

résistance RII ou RIII plus vite que prévu (Tableau 4),

o poly-chimiorésistance. (Basco et Le Bras; 1994),

o l’apparition de la résistance àl’ artémisinine en 2009 (Dondorp et al., 2009).

On peut distinguer trois causes de résistance :

� Les mutations génétiques

� L’expulsion du médicament hors de l’hématie (révèle un phénotype d’efflux rapide du

médicament, comme dans la résistance à la chloroquine) (Le Bras et al., 1993)

� L’usage abusif du médicament (pression médicamenteuse).

IIII.. 22.. 66.. 33.. RRôôllee ddeess vveecctteeuurrss ddaannss lleess rrééssiissttaanncceess aauuxx aannttiippaalluuddiiqquueess dduu

PPllaassmmooddiiuumm

La rapidité avec laquelle les souches résistantes se disséminent dans la population humaine laisse

entrevoir une responsabilité partielle du vecteur dans l'avantage apparent qu'ont les souches

résistantes par rapport aux souches sensibles. Au Burkina Faso, Coz et al., (1970) ont montré que

les isolats pyriméthaminorésistants sont expérimentalement transmis par A. gambiae mais avec

un cycle extrinsèque légèrement allongé par rapport aux souches sensibles.

63

Antimalariques Première utilisation

(commercialisées)

Date et lieu d’émergence des premières

résistances

Quinine

Chloroquine

Pyriméthamine

Proguanil

Méfloquine

Halofantrine

Artémisinine

1830

1947

1948

1950

1980

1983

1979

1910 : Amazonie

1958-1960 : Péninsule indochinoise, Colombie

1950 : Afrique, Asie du Sud-Est

1950 : Afrique, Asie du Sud-Est

1990 : Thaïlande

1991 : Afrique de l’Ouest, Thaïlande

2009

Tableau 4. Dates de première utilisation des antimalariques et d’apparition de la résistance.

(adapté Le Bras et al., 1993)

64

IIIIII.. PPrréésseennttaattiioonn dduu ttrraavvaaiill ddee tthhèèssee

Les thérapeutiques actives sur les formes hépatiques de réserve et les formes sexuées

assurant la transmission, sont peu étudiés.

Or, la phase d’impaludation apparaît comme une prophylaxie de choix puisque la

suppression du stade exo-érythrocytaire empêcherait le développement du parasite dans la

circulation sanguine, ceci amenant à supprimer l’état pathologique et de surcroît la transmission

du parasite. De plus, la mise en évidence d’une action totale sur les formes intrahépatiques

limiterait à quelques jours la poursuite d’une prophylaxie contre l’accès grave à P. falciparum

chez les voyageurs.

Dans cette thèse, nous avons travaillé sur deux stades parasitaires différents :

� Premier stade : il concerne la première partie du cycle parasitaire, correspondant à

l’impaludation c’est la phase hépatique exo-érythrocytaire

� Le deuxième stade concerne la transmission par l’intermédiaire des formes

érythrocytaires sexuées (gamétocytes).

Notre travail a pour but d’évaluer les effets des antipaludiques seuls ou en association qui

sont sur le marché actuellement en phase de développement ou déjà sur le marché et qui sont

amenés a être testés, sur les formes extra-érythrocytaires hépatiques et les formes sexuées, les

gamétocytes et leur développement chez le moustique :

�� Le stade hépatique : l’objectif principal de cette partie, est de mesurer l’efficacité des

antipaludiques seuls ou association sur la forme exo-érythrocytaire du P. yoelii yoelii, en

testant différents paramètres de mesure :

o L’évolution de la parasitémie préjugeant de l'efficacité des thérapeutiques sur les

formes hépatiques mais d'interprétation difficile du fait de la pharmacocinétique des

produits testés dont l'efficacité conjointe éventuelle sur les formes hépatiques et

sanguines ne permet pas d'en différencier les niveaux d'action.

o Le comptage des corps bleus par observation de coupes de foie colorées en

microscopie optique, dont l’inconvénient majeurs est d’être peu sensible et

difficilement quantifiable.

L’objectif secondaire de cette partie, est la mise au point et l’utilisation d’une technique

quantitative de mesure de l’efficacité sur les formes hépatiques par la biologie moléculaire PCR

65

quantitative en temps réel, technique palliant les inconvénients des précédentes. Elle permet la

détection d’éventuels développements parasitaires dans le foie après l’administration des

antipaludiques en étude.

�� Le stade sexué : l’objectif principal est de mesurer les effets des doses infracuratives de

deux antipaludiques sur la gamétocytogénèse et la transmission du paludisme au moyen

d’un modèle expérimental murin.

Cette partie de notre thèse, a deux objectifs secondaires :

o objectif quantitatif : étude des effets des thérapeutiques sur la gamétocytogénèse

(gamétocytes circulants dans le sang)

o objectif qualitatif : étude d’un point de vue morphologique, la qualité des gamétocytes

qui arrivent à se développer jusqu’au stade d’oocystes chez le moustique :

� En évaluant l’action qualitative thérapeutique sur les gamétocytes à la suite

d’observations morphologiques des gamétocytes en microscope optique et

électronique.

� En testant l’infectivité des gamétocytes chez le moustique par :

a. le comptage des oocystes sur le feuillet externe de l’estomac

b. le pourcentage des moustiques infects

Deuxième partie :

Matériel et Méthode

67

II.. MMaattéérriieell bbiioollooggiiqquuee

La spécificité hôte-parasite du plasmodium humain représente une contrainte majeure dans

l’étude du paludisme chez l’homme, car l’agent responsable ne peut être maintenu

expérimentalement chez un animal de laboratoire pratique et de petite taille. Le besoin d’un

modèle animal, dans les années cinquante, a conduit à l’utilisation de parasites aviaires ou

simiens. En 1948, Vincke et Lips ont découvert et ont isolé un parasite capable d’infecter les

rongeurs de laboratoire (Peters, 1965). L’intérêt de l’infestation d’un modèle expérimental

rongeur est que son cycle parasitaire et sa sensibilité aux thérapeutiques sont proches de ceux

observés chez l’homme. Ce modèle bien connu, peu coûteux, reste incontournable dans les

évaluations thérapeutiques à leur début.

Le modèle expérimental choisi pour cette étude est le modèle :

«Souris Swiss - P. yoelii yoelii- Anophèles stephensi»

II.. 11.. LLee ppaarraassiittee

La souche 17X du parasite de rongeur utilisé est P. yoelii yoelii (Landau et Killick-

Kendrick, 1966), qui provient d’un muridé africain (Thamnomys rutilans) et a été clonée (clone

1.1) en 1969. P. yoelii yoelii envahit préférentiellement les réticulocytes, même s’il est

également capable d’envahir les hématies matures. Cette espèce peut provoquer des infections

virulentes souvent mortelles, ou au contraire avirulentes et suivies d’une totale guérison. De plus,

comparativement aux autres espèces plasmodiales murins, P. yoelii yoelii produit un grand

nombre de gamétocytes ce qui facilite notre étude quantitative et qualitative des différents stades

gamétocytaires. De plus, le développement du cycle est totalement asynchrone : toutes les

formes parasitaires sanguines sont présentes en permanence.

II.. 22.. LL’’hhôôttee vveerrttéébbrréé ((iinntteerrmmééddiiaaiirree))

Les souris utilisées sont des souris Swiss femelles dont le poids varie de 20 à 30 grammes.

Elles proviennent de l’élevage Janvier (Le Genest Saint Isle, France) et sont ensuite entretenues

en animalerie.

68

II.. 33.. LL’’hhôôttee iinnvveerrttéébbrréé ((llee vveecctteeuurr))

L’hôte définitif est l’espèce Anopheles stephensi Liston (1901), c’est l’espèce naturelle la

plus utilisée en laboratoire. La souche originaire d’Inde est maintenue à l’insectarium du

Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris. Elle provient d’un élevage initialement stabilisé

par Shute et Maryon en 1966 à Londres. Le cycle complet du moustique y est entretenu à 23°C et

avec un taux d’humidité relative de 70% à 80%. Les imagos sont maintenus dans des cages

autoclavables de 50x50x50 cm et de l’eau glucosée (5%) est disponible en permanence. Une fois

par semaine, les imagos femelles prennent un repas sanguin sur un lapin anesthésie avec un

mélange de Vetranquil® à 1% et d’Imagène® 500 à 0.25% (1 ml/kg par voie intramusculaire).

Les pontes sont récoltées le 3e jour suivant le repas sanguin et les œufs sont transférés dans une

cuvette d’eau. Les larves sont nourries quotidiennement avec des biscuits canins réduits en

poudre (sans poisson dans leur composition) supplémentés en Superlevure-Gayelord Hauser®

(8%) jusqu’à l’apparition des nymphes. Une fois la mue effectuée, les imagos sont collectés soit

dans des cages de « pondeurs », soit dans des cages d’expérience.

IIII.. TThhéérraappeeuuttiiqquueess tteessttééeess

Les thérapeutiques utilisées feront l’objet de deux études d’efficacité :

� sur les stades intra-hépatiques par la technique de PCR quantitative pour la

primaquine, l’amodiaquine (FLAVOQUINE®), le proguanil, l’atovaquone, la

ferroquine, l’artésunate (ARSUMAX®), l’association atovaquone + proguanil

(MALARONE®), l’association artésunate + amodiaquine (ARSUCAM®) et

l’association artésunate + ferroquine.

� sur les stades sexués chez l’hôte (gamétocytes) et leur développement chez le

moustique (oocystes) : pour la ferroquine et l’artésunate.

69

IIIIII.. MMéétthhooddeess

IIIIII.. 11.. MMéétthhooddeess ppoorrttaanntt ssuurr llee ssttaaddee hhééppaattiiqquuee

Méthodes de mesure de l’efficacité des thérapeutiques sur les stades intra-hépatiques

Le stade hépatique du cycle plasmodial a déjà fait l’objet d’études au sein même du

laboratoire de Parasitologie de la faculté de Médecine de Tours. Ces études consistent à tester

une technique permettant l’analyse fine du développement, l’efficacité des antipaludiques sur les

formes intracellulaire (hépatocytes et hématies). Les méthodes testées pour mesurer l’efficacité

des thérapeutiques sur les stades intra-hépatiques ont été multipliées avant de s’arrêter à la

technique de PCR quantitative.

1. Le suivi de la parasitémie

Une étude en 1994 (Lanotte et Sidiboumedine, 1995) avait pour objectif d’étudier

l’évolution temporelle de la parasitémie, reflétant indirectement l’activité intra-hépatique

supposée des molécules. Le suivi de la parasitémie est rendu possible par la réalisation régulière

de frottis sanguins colorés au May Grünwald par la technique rapide, sur toute la durée de

l’étude. L’observation au microscope optique (x100, à l’immersion) permet le comptage des

parasites présents au niveau sanguin. Cette technique présente l’avantage d’être peu coûteuse et

facile à mettre en œuvre. Elle permet d’étudier l’efficacité des thérapeutiques sur le stade intra-

hépatique grâce à l’analyse de plusieurs paramètres : le retard à l’apparition des parasites, leur

densité dans le sang et leur qualité en terme de schizogonie. Cependant, il n’est pas possible de

conclure quant à la spécificité d’action sur la cible hépatique des molécules testées en raison de

la superposition de deux cinétiques : l’une parasitaire et l’autre pharmacocinétique, des

molécules employées. En effet, certaines molécules possèdent une demi-vie telle qu’elles

persistent dans la circulation sanguine à des taux suffisants pour être actives. De ce fait, la baisse

de la parasitémie, si elle est détectable, ne peut être attribuée de façon certaine à l’activité intra-

hépatique seule de ces molécules, mais essentiellement à leur efficacité connue sur les formes

parasitaires schizogoniques intra-érythrocytaires. Les caractéristiques biologiques de cette espèce

sont détaillées dans le tableau 5.

70

Sporogonie Schizogonie

hépatique

Schizogonie érythrocytaire

(durée du cycle érythrocytaire) Gamétocytes

9 à 15 jours

à 23° C ≥ 45 heures 18 heures / asynchrone

Production constante

au cours de l’infection

Tableau 5. Les caractéristiques biologiques chez la souris infestée avec P. yoelii en conditions de laboratoire (adapté de Landau et Gautret, 1998)

2. L’observation de marqueurs anatomo-pathologiques

En 1998, une nouvelle approche plus spécifique du stade intra-hépatique est abordée

(Baruteau et Girard, 1999) : il s’agit d’évaluer l’efficacité sur les stades intra-hépatiques des

molécules administrées par observation directe en microscopique classique et en microscopie

électronique, de préparations anatomo-pathologiques de parenchyme hépatique de souris

infectées et traitées. Cette technique permet à la fois une approche quantitative reposant sur

l’analyse de plusieurs critères (densité et taille des corps bleus, densité et taille des granulomes

inflammatoires) et une approche qualitative se basant sur l’étude morphologique des corps bleus

et de l’environnement hépatocytaire par les deux techniques de microscopie. Elle permet aussi

d’analyser de façon spécifique l’activité hépatocytaire des molécules étudiées et de s’affranchir

du conflit entre la cinétique parasitaire et la pharmacocinétique, principal obstacle de la

technique précédente. De plus, cette méthode, fondée sur la numération des corps bleus et leurs

diamètres, permet une approche quantitative de l’activité médicamenteuse. Mais, cette technique

impose un sacrifice systématique des souris afin de réaliser les coupes histologiques de foie, ce

qui induit une augmentation du coût de l’étude et empêche surtout un suivi a posteriori de la

parasitémie. Deuxièmement, la réalisation des coupes permet l’étude d’une partie seulement du

foie de chaque souris sacrifiée, rendant difficile l’interprétation d’un résultat négatif. Enfin, cette

technique repose sur la qualité de la lecture, délicate, des coupes histologiques. Par ailleurs, la

faible quantité de corps bleus attendus à la suite de l’infestation rend difficile toute interprétation

statistique comparative.

3. Les techniques de sub-inoculation

Dans la continuité des travaux précédents, et dans le souci de perfectionner l’analyse de

l’efficacité intra-hépatique des antipaludiques, une technique reposant sur l’inoculation de

broyats de foie de souris « donneuses », infestées et traitées, à des souris « receveuses » a été

développés (Savoie, 2004). L’objectif est d’étudier la vitalité d’éventuels corps bleus, même non

71

détectés par la méthode d’observation de marqueurs anatomo-pathologiques, tout en évitant un

effet résiduel de la thérapeutique chez les souris receveuses, puisque celles-ci ne reçoivent pas de

traitement.

Cette dernière particularité est un avantage majeur de la technique de sub-inoculations.

Cependant, au cours de cette expérience, l’infestation des souris a été faite par voie intra-

abdominale ce qui n’est pas la voie naturelle d’infestation. Ceci peut être à l’origine d’un biais

dans les résultats puisque le péritoine peut jouer ici un rôle de barrière limitant plus ou moins le

passage du parasite dans le sang de la souris receveuse. De plus, cette technique ne permet

qu’une approche qualitative, les résultats correspondant au développement ou non d’une

parasitémie chez la souris receveuse.

4. La technique de PCR quantitative en temps réel

Les techniques précédentes de détection des stades hépatiques, comme la technique

microscopique (Levine et al., 1989) etc., les techniques moléculaires (Barker et al., 1994), la

détection antigénique (Pieroni et al., 1998), manquent toutes de sensibilité en cas de faible

parasitémie, d’où la nécessité d’une nouvelle technique plus adaptée ayant une limite de

sensibilité de 10 parasites/mL : la PCR quantitative en temps réel. La PCR (Polymerase Chain

Reaction) est un outil de biologie moléculaire essentiel, découvert par Karry Mulis en 1983, et

contrairement au clonage moléculaire, qui consiste à faire produire l'ADN cloné par des

bactéries, la PCR est l'amplification d'ADN in vitro. Cette technique qualitative est basée sur

l’utilisation d’ADN polymérase résistante à de hautes températures, isolé d’organismes

hyperthermophiles comme Thermus aquaticus. L’amplification est sensible et spécifique du

fragment d’ADN cible (un site sur chaque brin). Elle comprend deux phases : une phase

exponentielle correspondant à une amplification exponentielle pendant les 20 à 25 premiers

cycles, puis une phase plateau correspondant à un ralentissement de l’amplification dû à

l’inactivation thermique partielle de l’ADN polymérase ainsi qu’à l’épuisement des différents

réactifs de la PCR (Figure 9) ; (Tse et Capeau, 2003). La PCR quantitative en temps réel

constitue une avancée technologique importante de la PCR classique, car elle s’effectue en

milieu fermé, contrairement à la PCR classique, ce qui réduit considérablement les risques de

contamination extérieure de l’échantillon. A travers l’utilisation de stratégies de détection par

fluorescence, la quantité initiale d’acide nucléique présente dans le mélange réactionnel peut être

déterminée. La quantification est réalisée par mesure de l’augmentation de la fluorescence durant

la phase exponentielle de la PCR. En effet, au début de la réaction (au cours des premiers

cycles), l’intensité de fluorescence émise est très faible et définit le bruit de fond.

72

Figure 9. Cinétique de la PCR, courbe exprimant l’intensité de la fluorescence émise en fonction du nombre de cycles de PCR effectués par le thermocycleur.

(d’après Tse et Capeau, 2003)

Après un certain nombre de cycles, le signal dépasse significativement le bruit de fond et le

nombre de cycles correspondant à ce point est appelé cycle seuil ou Ct (Threshold Cycle).

Le système de détection des molécules d’amplicons utilisé ici est un agent intercalant, le SYBR®

Green I. (Higuchi et al., 1992) ; il est capable de se fixer préférentiellement sur l’ADN double

brin néo-synthétisé. En s’intercalant entre les bases nucléotidiques, le SYBR® Green I émet un

signal fluorescent après excitation par les UV, 250 fois plus élevé lorsqu’il est fixé sur l’ADN

double brin (Figure 10).

Malgré sa sensibilité et sa simplicité, le système manque de spécificité puisque cet agent

marque toutes les molécules d’ADN double brin, qu’elles soient spécifiques ou non de la

séquence à amplifier. Pour pallier ce problème, l’automate réalise une courbe de fusion qui va

caractériser chaque produit PCR par une température de fusion. Le produit détecté est spécifique

lorsque sa température de fusion est identique à celle des échantillons de la gamme étalon.

IIIIII.. 11.. 11.. IInnffeessttaattiioonn eett ttrraaiitteemmeenntt ddeess ssoouurriiss

On dissèque les anophèles femelles infectants au Muséum d’ Histoire Naturelle de Paris,

au moment où les sporozoïtes sont déjà dans les glandes salivaires. La dissection se fait à l’œil

nue, à l’aide d’une aiguille ; la tête et l’abdomen sont retirés et le thorax est mis de côté.

73

Figure 10. Etapes de la PCR quantitative en temps réel utilisant le SYBR® Green.

(Source : http://www.gfrup.com/gfrup_journee_urgence05/diagnostic_infection_virale.pdf)

Les thorax disséqués sont placés dans un sérum physiologique maintenu dans de la glace

et y sont broyés à l’aide d’un potter (Figure 11) ; la solution est centrifugée à 500 rpm (rotations

par minute) pendant une minute afin de séparer les sporozoïtes des différents débris constitués

notamment par les ailes et l’enveloppe extérieure du thorax

Si le surnageant, dans le quel sont contenus les sporozoïtes, n’est pas assez clair, la

centrifugation peut être réitérée dans les mêmes conditions. Afin de déterminer la quantité de

sporozoïtes inoculés aux souris dans les différents protocoles, la densité de sporozoïtes est

évaluée sur cellule de Mallassez.

Etant donné la courte durée de vie des sporozoïtes hors des glandes salivaires, les souris

sont infestées dans l’heure qui suit la dissection des moustiques.

3- Pendant l'étape d'élongation, le nombre de molécules de fluorophorelié à l'ADN synthétisé augmente ce qui se traduit par une augmentation de la fluorescence. La fluorescence est mesurée à la fin de l'étape d'élongation de chaque cycle

2- Après le couplage des amorces, le fluorophorescence lie au double brin. La liaison à l’ADN se traduit par une augmentation de la fluorescence

1- Au début de l'amplification, le mélange réactionnel contient de l'ADN dénaturé, les amorces et le fluorophorenon lié

74

Figure 11. Anatomie schématique d’un moustique femelle.

L’infestation se fait par voie intraveineuse au niveau de la veine de la queue de la souris.

Le moment de l’infestation correspond, dans chaque protocole, au temps J0.

Les souris sont réparties de façon aléatoire dans les cages à raison de 5 souris minimum par

cage, la thérapeutique est administrée par voie orale juste après l’infestation, à l’aide d’une

seringue munie d’une canule. Les thérapeutiques sont administrées en dose unique (sauf

75

protocole IV) par voie orale. Quarante trois heures après l’infestation, les souris sont sacrifiées et

leur foie est prélevé et découpé en plusieurs morceaux :

- deux morceaux d’environ 5 x 3 mm sont placés chacun dans un tube Eppendorf et

conservés à -80 °C en vue de servir à la PCR quantitative en temps réel.

- un morceau est placé dans une solution de formol acétique en vue d’une étude anatomo-

pathologique.

- le reste est conservé dans un tube Eppendorf à -80°C et constitue ainsi une réserve

utilisable si nécessaire.

dans chaque cage, et une souris est laissée vivante et suivi quotidiennement par frottis

sanguin (pendant quatre jours après le traitement), afin de vérifier qu’il y a bien eu infestation.

IIIIII.. 11.. 22.. PPCCRR qquuaannttiittaattiivvee eenn tteemmppss rrééeell

IIIIII.. 11.. 22.. 11.. MMéétthhooddeess dd’’eexxttrraaccttiioonn ddee ll’’AADDNN ddeess ffoorrmmeess ppaarraassiittaaiirreess

iinnttrraa--hhééppaattiiqquueess

Après ajout de 180 µL de tampon de lyse ATL, les morceaux de foie sont broyés à l’aide

d’un piston. Ensuite, 20µL de protéinase K sont ajouté afin d’éliminer ceux qui pourraient

interférer dans la réaction de PCR. Cette étape a lieu pendant la nuit, au bain-marie à 55°C. Pour

digérer l’ARN, on a ajouté 4µL de RNase A à 100mg/mL. Après incubation de 2 minutes à

température ambiante, 200 µL de tampon de lyse AL sont ajoutés et les échantillons sont laissés

à incuber pendant 10 minutes, l’incubation s’effectuant à 70°C. Puis 200 µL d’éthanol sont

ajoutés et le contenu de chaque tube est transféré sur une colonne d’extraction elle-même placée

dans un tube collecteur. Après une centrifugation de 2 minutes à 8000 rpm, l’ADN des

échantillons fixés sur les colonnes est lavé par le tampon de lavage AW1 et centrifugé pendant 1

minute à 8000 rpm. Un deuxième lavage est effectué à l’aide du tampon AW2 suivi d’une

minute à 14000 rpm. Finalement, 150 µL de tampon d’élution AE sont ajoutés. Après 5 minutes,

d’incubation à température, les échantillons sont centrifugés 2 minutes à 8000 rpm, et l’ADN

purifié est ainsi récupéré dans des tubes Eppendorf. Les extraits peuvent être conservés à +4°C

ou à -20°C.

La quantité d’ADN contenue dans les extraits est déterminée par spectrophotométrie. En

effet, une quantité définie de chaque échantillon extrait est diluée au 1/5e dans de l’eau pour

préparation injectable (eau PPI dépourvue d’ADN). La densité optique de ces préparations est

76

mesurée à 260 nm, ce qui permet de déterminer la quantité d’ADN dans chaque extrait selon la

formule suivante :

CADN (µg/mL) =Absorbance x Facteur de dilution x 50

Cette étape permet alors la détermination du volume d’extrait pour réaliser le dénombrement des

formes parasitaires par PCR quantitative, laquelle nécessite environ 1 µg d’ADN par échantillon.

IIIIII.. 11.. 22.. 22.. PPCCRR qquuaannttiittaattiivvee eenn tteemmppss rrééeell

Milieu réactionnel :

Chaque réaction se fait dans un volume de 25 µL. Les conditions du milieu réactionnel

sont conformes à celles décrites par Bruna-Romero et al., 2001.

Un mix provenant d’INVITROGEN® (Platinium ® SYBR® Green qPCR Super Mix UDG) est

utilisé dilué au ½. Ainsi, le milieu réactionnel comprend :

o SYBR® Green I,

o Platinium ® Taq DNA polymerase, 30 U/mL

o Tri-HCI (pH 8.4), 20 mM

o KCI, 50mM

o MgCl2, 3 mM

o dNTP, 200 µM chacun

o Uracil-DNA Glycosylase (UDG), 20 U/mL

o Amorces NyU3 et NyU5, 500 mM chacune

o ADN, environ 1 µg par réaction

o Eau PPI (qsq 25 µL)

Amorces :

Deux amorces spécifiques ont été utilisées pour amplifier une région du génome du

parasite codant pour le gène de l’ARN ribosomal 18S de P. yoelii (Bruna-Romer et al., 2001).

Les séquences de ces amorces sont :

-pour l’opéron NyU3 (forward primer) :

5’-GGGGATTGGTTTTGACGTTTTTGCG -3

77

-pour l’opéront NyU5 (reverse primer) :

5’- AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAT-3’.

Gamme étalon :

Une gamme d’échantillons de charge parasitaire connue sert de référence pour chaque

PCR. Cette gamme est préparée à partir d’ADN génomique. La parasitémie d’une souris infestée

par P. yoelii yoelii est régulièrement surveillée par frottis sanguins. Lorsqu’elle atteint 10 à 15%,

la souris est sacrifiée et son sang est prélevé. Un frottis sanguin est alors réalisé, sur lequel est

déterminé le nombre de noyaux parasitaires rapporté au volume de sang prélevé. L’ADN de 105

parasites/µL est ensuite extrait selon le même procédé que décrit précédemment et une gamme

étalon allant de 105 à 10 parasites/µL est obtenue après dilutions successives.

Programme :

La PCR quantitative en temps réel est réalisée sur l’iCycler de BIORAD®. Cet appareil a la

particularité d’analyser les échantillons sur plaque de 96 puits.

La programmation du thermocycleur est effectuée en trois étapes :

o La première, consiste à activer l’enzyme (de type « hot start ») du milieu réactionnel par

un cycle de 10 minutes à 95°C.

o La seconde étape est la PCR en temps réel proprement dite. Elle comporte 50 cycles de

trois phases chacun :

1. la phase de dénaturation à 95°C,

2. la phase d’hybridation à 60°C

3. la phase d’élongation à 72 °C. Chaque phase dure 10 secondes.

o La dernière étape débute à 72°C et permet la réalisation de la courbe de fusion qui

nécessite 45 cycles de 10 secondes, au cours desquels la température augmente de 0.5°C

par cycle.

Echantillons analysés

Pour les trois premiers protocoles, les échantillons analysés correspondent, pour chaque

souris, aux extraits de deux morceaux différents du même foie. Pour ces protocoles, chaque lot

(un lot correspondant à une thérapeutique) est donc composé de 10 échantillons (2 extraits

équivalents par souris, à raison de 5 souris par lot destinées à être disséquées, les autres souris

étant maintenues en vie afin de suivre l’évolution de l’infestation jusqu’à J8).

78

Le dernier protocole présente la particularité d’analyser tous les extraits en duplicate (soit

cette fois des lots constitués de 20 échantillons chacun).

Cependant, en raison de la limite du nombre d’échantillons analysables en une fois (taille

des plaques) , et en vue de travailler sur l’analyse rigoureuse et cohérente des résultats

comparatifs, le lot de souris traitées par la MALARONE®, pour ce dernier protocole, ne contient

que 5 échantillons ; cette pratique étant autorisée du fait de la grande homogénéité des résultats

obtenus avec cette spécialité pharmaceutique dans les trois premiers protocoles.

IIIIII.. 11.. 22.. 33.. MMéétthhooddee dd’’aannaallyyssee ddeess rrééssuullttaattss

1) Aspect des résultats fournir

Le thermocycleur, au terme du programme, condense les résultats numériques

correspondant aux échantillons étudiés sous forme graphique (Figure 12). Chaque courbe

correspondant à l’analyse d’un puits de la plaque PCR.

2) Courbe de fusion

Cette courbe permet de vérifier la spécificité du produit PCR amplifié et détecté par le

SYBR® Green I. Ce produit est spécifique lorsque sa température de fusion est égale à celle des

échantillons de la gamme étalon. La PCR quantitative réalisée sur les échantillons de la gamme

étalon résulte en un seul et unique pic sur la courbe de fusion (Figure 13).

La température à laquelle ce pic apparaît correspond à la température de fusion Tm du

produit spécifique, soit 80,5°C. Le nombre de cycles d’amplification de PCR quantitative en

temps réel et le manque de spécificité de détection du SYBR ® Green font que des produits de

PCR non spécifiques sont détectés dans certains protocoles, en plus de l’absence du génome de

P. yoelii, de par la richesse des échantillons en ADN murins.

Seuls les produits amplifiés ayant une température de fusion de 80,5°C et qui

correspondent à la séquence du génome de P. yoelii signent leur présence dans l’échantillon et

rendent le dénombrement du parasite possible.

79

Figure 12. Courbe de fusion représentant la spécificité du produit PCR amplifié et détecté par le SYBR® Green I.

Figure 13. Courbe représentant l’intensité de fluorescence du SYBR ® Green I en fonction du nombre de cycles de PCR.

80

3) Courbe standard

Pour chaque protocole, les charges parasitaires caractérisant les échantillons de foies traités

ou non, sont déterminées à partir de la courbe standard réalisée grâce aux échantillons de la

gamme étalon. La droite obtenue possède un coefficient de corrélation (Figure 14) proche de 1,

soit 0.995.

La limite inférieure de détection correspond au nombre de cycles seuil caractérisant la

détection de la dernière dilution de la gamme, soit 10 parasites/mL ; en dessous de ce chiffre,

l’échantillon est considéré comme non détectable. Ainsi, bien que l’i Cycler® puisse encore

détecter des produit amplifiés au-delà de ce nombre de cycles seuil, seront considérés, dans les

analyses, comme indétectables.

4) analyse graphique et statistique

L’analyse des résultats fournis par la PCR quantitative est exprimée en logarithme des

charges parasitaires afin de diminuer la déviation standard.

Les histogrammes sont réalisés à partir des moyennes des valeurs logarithmiques des

nombres de parasites des stades hépatiques mesurées pour chaque échantillon issu de souris

ayant reçu une même thérapeutique. Pour chaque protocole, l’étude s’effectue sur des

échantillons de petite taille, inférieure à 30.

IIIIII.. 11.. 33.. PPrroottooccoolleess

Quatre protocoles différents (tableau 6) visant à tester l’efficacité des antipaludiques seuls et des

associations sur le stade intra-hépatique du parasite ont été mis au point :

�� Protocole 1 : analyse de deux spécialités (et de leurs principes actifs dans le cas de la

MALARONE® qui est une association) dont l’activité en thérapeutique humaine sur les

stades intra-hépatiques par inhibition de la synthèse des pyrimidines du parasite a été

largement démontrée. Cette analyse permettra ainsi la détermination d’une référence en

termes d’activité thérapeutique pour les autres protocoles.

Cinq lots de cinq souris sont infestés (10 000 sporozoïtes injectés/souris) : lot 1 traité à la

Malarone® (2 cp/60kg ; 0.1 mL/souris), lot 2 à la primaquine (20mg/kg ; 0.1 mL/souris),

lot 3 à l’atovaquone (500mg/kg, 0.1mL/souris), lot 4 au proguanil (20mg/kg,

81

Droite de régression: Gamme étalon

y = -3,75x + 39,29

R2 = 0,995

0

10

20

30

40

1 2 3 4 5

Logarithme de la charge parasitaire

Nom

bre de cycles seuil

Figure 14. Droite de régression (linéaire) de la gamme étalon obtenue à partir des résultats apportés par la figure Courbe d’amplification d’une réaction PCR (Valeur logarithmique)

0.1mL/souris) et lot 5 témoin (souris infestées non traitées). Le lot de souris traitées par la

Malarone® et pris comme témoin est traité à la même dose pour les quatre protocoles.

� Protocole 2 : il correspond à l’étude de plusieurs principes actifs : artésunate (AX

10mg/kg, 0.1mL/souris), ferroquine (FQ 10mg/kg, 0.1mL/souris) et amodiaquine (AQ 30

mg/kg, 0.1mL/souris) et la primaquine (20mg/kg ; 0.1 mL/souris) ; les associations

artésunate- ferroquine et artésunate- amodiaquine. Cinq lots de 6 souris sont infestés (45

000 sporozoïtes/souris).

� Protocole 3 : étude des associations médicamenteuses en développement : artésunate +

amodiaquine (AX 10 mg /kg + AQ 10mg/kg, 0.15mL/souris) et ferroquine + artésunate

(FQ 10mg/kg + AX 10mg/kg, 0.15mL/souris) les souris sont infestés avec 20 000

sporozoïtes injectés/souris ensuite sont réparties en quatre lots de 6 souris.

� Protocole 4 : étude de ces associations dans des conditions d’administration modifiées :

en effet, l’artésunate ayant une demi-vie très courte (20 à 25 minutes, et 45 minutes pour

son métabolite), il a été étudié dans ce protocole l’effet d’une seconde administration de

thérapeutique (7 heures) pour les traitements contenant ce principe actif : (AX 10 mg /kg

+ AQ 10mg/kg, 0.15mL/souris) et (FQ 10mg/kg + AX 10mg/kg, 0.15mL/souris) et (AX

10 mg/kg , 0.1mL), les souris infestés avec 80 000 sporozoïtes/souris, sont reparties en

cinq lots de 6 souris.

82

Protocoles Protocole I :

choix d’un

antipaludique référent

Protocole II :

étude de principes

actifs pris isolément

Protocole III :

étude d’associations

thérapeutiques

Protocole IV :

étude d’associations

thérapeutiques avec

une dose d’artésunate

supplémentaire

Nombre de

sporozoïtes

injectés par

souris

10 000 45 000 20 000 80 000

Constitution

des lots :

Traitements

administrés

(voie orale

doses)

Malarone® (2cp/60kg)

PQ = 20mg/kg

ATVQ = 500mg/60kg

PG = 200mg/60kg


PQ = 20mg/kg

FQ = 10mg/kg

AX = 10mg/kg

AQ = 30mg/kg


(AX 10 mg/kg + AQ

30mg/kg)

(AX 10mg + FQ

10mg/kg)


AX = 10mg/kg

(AX10mg/kg + AQ 30

mg/kg)

(AX 10mg/kg + FQ 10

mg/kg)

(AX 10mg/kg 7 h plus

tard pour les

associations)

Nombre de

souris par lot 5 6 6 6

Tableau 6. Les protocoles du stade hépatique en détail.

(1 lot T+ / protocole, ; 1 souris de chaque lot maintenue en vie (protocoles II, III, IV) = suivi de la parasitémie). En rouge : lot traité par la Malarone® ; en bleu : lot traité par un seul médicament ; en vert : lot traité par association thérapeutique, en violet = deuxième dose d’artésunate.

83

IIIIII.. 22.. MMéétthhooddeess ppoorrttaanntt ssuurr llaa ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee,, lleess ggaammééttooccyytteess

cciirrccuullaannttss eett llaa ttrraannssmmiissssiioonn dduu ppaalluuddiissmmee

IIIIII.. 22.. 11.. CCoonnssttiittuuttiioonn ddeess ssttoocckkss ddee ssaanngg ppaarraassiittéé eett ccoonnsseerrvvaattiioonn

Un stock de sang congelé répertorié au Muséum d’Histoire Naturelle de Paris conservé au

congélateur à -70°C, a été constitué.

Ce procédé permet d’effectuer plusieurs expériences à partir du même stock de sang

congelé. La mise en congélation est effectuée sans palier de température. De la même façon, le

sang sera décongelé brutalement (placé directement à température ambiante). Le taux de

mérozoïtes infectants est estimé à 5 % .

IIIIII.. 22.. 22.. IInnffeessttaattiioonn ddeess ssoouurriiss

Les souris sont infestées par voie intrapéritonéale à partir d’un même sang congelé

contenant 106 hématies parasitées par millilitre. L’observation des parasites se fait sur frottis

sanguin en prélevant une goutte de sang à la queue des souris (la parasitémie est évaluée sur

2000 hématies).

IIIIII.. 22.. 33.. SSuuiivvii ddeess iinnffeeccttiioonnss cchheezz llaa ssoouurriiss

Le suivi reste le même pour tous les protocoles. Les frottis sanguins sont réalisés aux

temps H0 (à jour3 post-infection et juste avant traitement), H1h30, H5, H24 et H48 (après

traitement). Les parasites sont observés sur des frottis sanguins minces monoérythrocytaires

réalisés par prélèvement d’une goutte de sang à la queue de la souris. Les lames ainsi obtenues

sont fixées au méthanol 5 minutes, puis on les dépose dans une cuve contenant une solution de

GIEMSA 10% diluée avec du tampon phosphate (5g NaHPO4, 7H2O, 2g KH2PO4 pour un litre

d’eau déminéralisée ; pH 7.2). Après coloration pendant 45 minutes, les lames sont rincées sous

l’eau et séchées à l’air libre. Les noyaux des parasites sont colorés en rouge, le cytoplasme en

bleu et les pigments malariques en brun (Annexe 1).

84

IIIIII.. 22.. 44.. EEttuuddee qquuaannttiittaattiivvee ddeess eeffffeettss ddeess ttrraaiitteemmeennttss ssuurr llaa

ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee

Les trois paramètres de mesure sont les suivants :

- L’indice parasitaire mesure la parasitémie, c'est-à-dire le nombre de parasites intracellulaires

(quelqu’en soit le stade) pour 100 hématies

- L’indice gamétocytaire ou gamétocytémie dénombre les gamétocytes pour 100 hématies

parasitées.

- L’indice de gamétocytogénèse est le ratio de la gamétocytémie à la parasitémie.

� Protocole 1 : comparer l’effet d’une dose unique et de 2 doses subcuratives sur la

gamétocytogénèse.15 souris sont infectées par voie intrapéritonéale (IP) avec un volume

de 150 µL de sang stocké, soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties en trois

lots de 5 souris chacun. A jour 3, le lot 2 est traité par une cure unique de ferroquine (à la

dose infracurative de 5 mg /kg, « Delhaes et al., 2001 » ) et le lot 3 est traité avec deux

doses identiques de ferroquine ; les souris du lot 1 sont les souris témoins ; ayant reçu de

l’eau distillée, elles développent normalement la maladie.

� Protocole 2 : effets comparatifs de la ferroquine et de l’artésunate. Quinze souris sont

infectées par un volume de 150 µL du stock de sang par voie intrapéritonéale (IP). Elles

sont réparties en trois lots de 5 souris. A jour 3, le lot 2 et le lot 3 sont traités par la

ferroquine (à la dose infracurative de 5 mg /kg) et le lot 3 par l’artésunate à la même

dose ; les souris du lot 1 sont témoins.

� Protocole 3 : effet de l’association des artésunate-ferroquine sur la gamétocytogenèse.

Dix souris sont infectées par un volume de 150 µL par voie intrapéritonéale (IP), soit 106

hématies parasitées. Les souris sont réparties en deux lots de 5 souris. A jour 3, le lot 2

est traité par l’association artésunate-ferroquine (à la dose infracurative de 5 mg /kg pour

chaque traitement, soit 90 µL de chaque un) ; les souris témoins parasitées n’ont rien

reçu.

� Protocole 4 : comparaison de trois doses d’artésunate (5mg /kg, 10mg/kg et 50mg/kg)

sur la gamétocytogénèse ; 20 souris sont infectées par un volume de 150 µL de stock de

sang par voie intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties

en 4 lots de 5 souris chacun. A jours 4, les lots 1, 2 et 3 sont traités avec l’artésunate aux

85

doses respectives de 5 mg /kg (60 µL), 10 mg/kg (120 µL) et 50mg/kg (200 µL) ; et le lot

4 joue le rôle de témoin positif parasité non traité.

� Protocole 5 : comparaison des deux doses infracuratives de 5mg /kg et de 10mg/kg pour

l’artésunate et la ferroquine ; 36 souris sont infectées par un volume de 200 µL de stock

de sang par voie intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées. Les souris sont

réparties en quatre lots de 7 souris chacun, le cinquième lot étant de 8 souris (T+). À jour

4 les lots 1 et 2 sont traités avec la ferroquine (à la dose infracuratives de 5 mg /kg

(100 µL) et de 10 mg/kg (200 µL) ; les lots 3 et 4 avec l’artésunate à la mêmes dose, le

lot 5 étant témoin.

IIIIII.. 22.. 55.. EEttuuddee qquuaalliittaattiivvee ddeess eeffffeettss ddeess ttrraaiitteemmeennttss ssuurr ::

IIIIII.. 22.. 55.. 11.. LLaa mmoorrpphhoollooggiiee ddeess ggaammééttooccyytteess ((aallttéérraattiioonnss

mmoorrpphhoollooggiiqquueess eett ccoolloorriimmééttrriiqquueess)) eett llee ppoouurrcceennttaaggee

ddeess ggaammééttooccyytteess aallttéérrééss

IIIIII.. 22.. 55.. 11.. aa)) OObbsseerrvvaattiioonn mmiiccrroossccooppiiqquuee ddeess ggaammééttooccyytteess

Au cours de ces protocoles, une partie des échantillons a été utilisée pour observer en

microscopie l’aspect morphologique des gamétocytes.

1. Microscopie Photonique

La lame est installée sur le portoir du microscope, avec une goutte d’huile à immersion et

examinée à l’objectif 100. Toute la lame a été lue, on a apprécié les gamétocytes altérés à l’aide

des critères morphologiques et colorimétriques, taille, pigmentation, coloration du noyau et du

cytoplasme.

2. Microscopie Electronique

Deux gouttes de sang on été prélevées au niveau de la queue de la souris et sont mêlées à

0.5 mL de fixateur TRUMP (constitué de paraformaldéhyde à 4% et de glutaraldéhyde à 1%).

Les échantillons sont ensuite lavés par une série de 5 à 10 centrifugations successives, le

surnageant étant éliminé entre chaque opération et remplacé par une solution de rinçage de

même pH que le fixateur Trump. Les lipoprotéines des membranes biologiques sont ensuite

fixées par un ajout de tétraoxyde d’osmium OsO4. Les échantillons sont alors rincés puis

déshydratés progressivement dans des bains d’éthanol de plus en plus concentrés (500 à 100°)

86

pendant 5 à 20 minutes, puis dans deux bains d’oxyde de propylène pendant 30 minutes. Par la

suite, les échantillons sont plongés dans un bain de propylène et d’Epon durant 2 heures. Les

pièces sont incluses dans le milieu à l’Epon pendant une nuit à 4°C. Elles sont ensuite déposées

dans une gélule incolore contenant la résine propre. La polymérisation de celle-ci dure 48 heures

à 60°C. Les gélules sont alors suffisamment solides pour être coupées à l’ultramicrotome. Des

coupes semi-fines (0.5 microns) sont d’abord réalisées, puis des coupes ultrafines (70 à 90nm)

qui sont alors recueillies sur des grilles de cuivre de 3 mm de diamètre. Les coupes ultrafines

sont contrastées à l’acétate d’uranyle, dans l’alcool méthylique, puis dans le citrate de plomb.

Elles sont ensuite observées après quelques heures de séchage.

IIIIII.. 22.. 55.. 11.. bb)) PPrroottooccoolleess

� Protocole I : L’effet de 3 doses d’artésunate sur la morphologie et le pourcentage des

gamétocytes : 12 souris sont infectées par un volume de 200 µL de solution stock de sang par

voie intrapéritonéale (IP) soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties en quatre lots

de 3 souris chacun. A jour 3, les lots 1, 2 et 3 sont traités avec l’artésunate aux doses de 5

mg /kg, 10 mg/kg et 50mg/kg, soit respectivement 60, 120 et 220 µL. Le lot 4 est celui des

souris témoins parasitées non traitées.

� Protocole II : L’effet de 3 doses de ferroquine sur la morphologie et le pourcentage des

gamétocytes : 9 souris sont infectées avec 200 µL de solution stock de sang par voie

intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties en 3 lots de 3

souris chacun. A jour 3, les lots 1, 2 et 3 sont traités avec la ferroquine aux doses de 5, 10 et

50 mg/kg.

� Protocole III : L’effet des doses 5 et 10mg/kg de la ferroquine et de l’artésunate sur la

morphologie et le pourcentage des gamétocytes : 36 souris sont infectées par un volume de

200 µL de solution stock de sang par voie intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées.

Les souris sont réparties en quatre lots de 7 souris chacun et le cinquième lot est de 8 souris

(T+). À jour 4, les lots 1 et 2 sont traités pae la ferroquine aux doses infracuratives de 5

mg /kg (100 µL), de 10 mg/kg (200 µL) ; les lots 3 et 4 : 5mg/kg (100 µL) et 10mg/kg (200

µL) d’artésunate. Le lot 5 est le lot témoin parasité non traité.

� Protocole IV : L’effet des doses 5, 10 et 50 mg/kg de la ferroquine et de l’artésunate sur la

morphologie et le pourcentage des gamétocytes : 21 souris sont infectées par un volume de

200 µL de solution stock de sang par voie intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées.

Les souris sont réparties en 7 lots de 3 souris chacun. A jour 4 les lots 1, 2 et 3 sont traités

par la ferroqine à la dose 5 mg /kg (60 µL) 10 mg/kg (120 µL) et 50mg/kg (220 µL) et les

87

lots 4, 5 et 6 par l’artésunate (mêmes doses) ; et le lot 10 est un témoin positive parasité non

traité.

IIIIII.. 22.. 55.. 22.. LL’’iinnffeeccttiivviittéé ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee

IIIIII.. 22.. 55.. 22.. aa)) ÉÉlleevvaaggee ddeess mmoouussttiiqquueess

La méthode d’élevage d’A. stephensi a été adaptée de la méthode de Shute et Marion

(1966). La température et l’humidité relative de l’insectarium sont de 25-26 °C et de 80%

respectivement. Les stades larvaires sont nourris avec des croquettes pour chien ou des biscuits

canins réduits en poudre (sans poisson dans leur composition) et maintenus dans des cuvettes

contenant de l’eau déchlorurée, jusqu’à l’apparition des nymphes. Une fois la mue effectuée et

après émergence, les adultes sont transférés, à l’aide d’un aspirateur, dans une cage où ils sont

nourris avec une solution de saccharose à 5% et gorgés sur un lapin anesthésié une fois par

semaine. Les femelles pondent sur des supports de papier buvard humide environ trois jours

après l’émergence et les pontes sont collectées, puis transférées dans une nouvelle cuvette d’eau.

On conserve les adultes dans des cages autoclavables de 50x50x50 cm et il existe dans chaque

cage des expériences vers 30 femelles âgées de 5à 7 jours.

IIIIII.. 22.. 55.. 22.. bb)) LLee ggoorrggeemmeenntt ddeess mmoouussttiiqquueess

Les souris sont anesthésiées avec une solution de kétamine, afin qu’elles restent

immobiles, puis elles sont déposées sur une cage contenant environ 30 moustiques femelles. Ces

derniers viennent se gorger sur les souris pendant 45 minutes. L’expérience est réitérée une heure

et 30 minutes après le traitement, ce qui correspond à la concentration plasmatique maximale de

la thérapeutique. Les souris sont de nouveau mises collectivement ou individuellement en

contact avec une trentaine de moustiques. De nouveaux moustiques sont mis à gorger, de la

même façon, sur les mêmes souris 5 heures après le traitement. Les frottis sanguins sont réalisés

avant chaque repas sanguin. Les frottis sanguins et le gorgement réalisé à H0 serviront de

témoins.

Les cages contenant les moustiques gorgés sont conservées dans l’insectarium du MNHN

pendant 7 à 9 jours pour laisser le temps aux oocystes de se développer (les oocystes éclatant au

bout de 10 jours pour libérer les sporozoïtes infectant qui gagneront les glandes salivaires).

88

IIIIII.. 22.. 55.. 22.. cc)) DDiisssseeccttiioonn ddeess mmoouussttiiqquueess ggoorrggééss

Elle a lieu huit jours après avoir gorgé les moustiques femelles sur des souris anesthésiées

L’extraction du tube digestif des moustiques femelles est réalisée en étirant les deux extrémités

de l’abdomen à l’aide de deux pinces fines sous loupe binoculaire (Figure 15). Pour l’évaluation

de l’infestation des femelles après gorgement, les tubes digestifs sont disséqués dans une

solution de mercurochrome dilué à 3% dans du tampon « Phosphate Buffer Saline » (PBS), on

observe et compte immédiatement les oocystes sur la paroi du tube digestif par examen

microscopique (X40). Deux paramètres d’évaluation de l’infection sont établis :

� Le pourcentage de moustiques infectés dans chaque lot,

� Le comptage des oocystes sur le tube digestif pour chaque moustique.

IIIIII.. 22.. 55.. 22.. dd)) PPrroottooccoolleess

� Protocoles I, II, III : Etude de l’effet de la thérapeutique à la dose infracurative sur le

développement des gamétocytes chez le moustique. Les souris sont infectées par un

volume de 100 µL de stock de sang contaminé par voie intrapéritonéale (IP), soit 106

hématies parasitées. A jour 3, elles sont traitées avec l’antipaludique par voie orale. Les

souris sont ensuite anesthésiées de façon à ce que les moustiques puissent se gorger

complètement. Le gorgement a lieu pendant une demi-heure dans une cage contenant une

quarantaine de moustiques. La thérapeutique est administrée, puis l’expérience est

réitérée 1h30 après le traitement, ce qui correspond à la concentration plasmatique

maximale de la thérapeutique. Les souris sont de nouveau mises en contact avec une

quarantaine de moustiques qui se gorgent pendant une demi-heure. 5 heures après

administration de la thérapeutique, de nouveaux moustiques sont mis à gorger sur les

mêmes souris pendant une demi-heure. Dans chaque case, on retire les moustiques mâles

à l’aide d’un captateur.

o Protocole I : 5 souris traitées à la ferroquine 5 mg/kg

o Protocole II : 10 souris, dont 5 traitées à la ferroquine 5 mg/kg et, 5 témoins.

o Protocole III : 5 souris traitées à l’artésunate 5 mg/kg

o Protocole IV : Étude de l’effet de la ferroquine et de l’artésunate (10 mg/kg) sur la

transmission. 14 souris sont infectées par un volume de 200 µL par voie

intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties en 2 lots

de 7 souris chacun pour chaque thérapeutique. Les 14 souris sont traitées comme

précédemment.

89

Figure 15. Schéma de l’extraction du tube digestif du moustique. (d’après P.F. Russell et al, 1963, Practical malariology, avec la permission d’Oxford Univ. Press).

o Protocole V : Étude de l’effet de l’artésunate, de la ferroquine et de leur association

(une dose ou trois doses) sur le développement des gamétocytes chez le moustique.

12 souris infectées par 100 µL de stock de sang contaminé par voie intrapéritonéale

(IP), soit 106 hématies parasitées, sont réparties en 4 lots. Le lot1 est traité. Les jours

1 et 2 avec une dose de l’association artésunate-ferroquine. Comme dans les

protocoles précédents, à jour 3, toutes les souris sont anesthésiées puis mises à

gorger pour les moustiques. Une souris de chaque lot non traité (H0) est au préalable

choisie comme témoin. Les lots 2, 3 et 4 reçoivent respectivement chacun une dose

d’AX, de FQ et de l’association AX+FQ pendant que le lot1 reçoit sa troisième dose

d’AX+FQ. Les doses de thérapeutique injectées sont de 5mg/kg pour chaque

traitement. Les gorgements ont été effectués à H0 (3 souris témoins) et à H3 pour les

4 lots où les souris sont mises en contact avec une quarantaine de moustiques qui se

gorgent pendant une demi-heure.

90

Troisième partie :

Résultats

91

Les résultats de ce travail se rapportent aux deux parties du cycle de Plasmodium :

I. le stade hépatique,

II. le stade sexué.

Cette étude a amené deux équipes, l’une parisienne et l’autre tourangelle, à travailler côte à

côte. Les résultats rapportés sont le fruit de mon intégration successive à ces équipes de

recherche :

le Service de Parasitologie-Mycologie-Médecine Tropicale de Tours, responsable du

sujet et de l’élaboration de ma thèse

le Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris, où j’ai pu profiter de stages sur

l’approche entomologique (disséquer les moustiques, pour extraire leurs estomacs et

compter après identification les oocytes qui s’y fixent et les glandes salivaires pour

étudier les sporozoïtes prêts à infecter) et où, par ailleurs, j’ai pu mener à bien le travail

sur le cycle parasite-souris pour suivre le développement du stade hépatique et du stade

sexué érythrocytaire.

L’ensemble des résultats sera donc présenté en deux parties :

� I- La première partie montre l’efficacité des différents antipaludiques, seuls ou en

association, sur la forme intra-hépatique des parasites à l’aide de la technique de PCR

quantitative en temps réel (QT - PCR). Cette technique de biologie moléculaire permet la

détection d’éventuels développements parasitaires dans le foie de souris après

administration des antipaludiques étudiés.

� II- La deuxième partie analyse la gamétocytogénèse et la transmission de l’hôte au

moustique. Elle se présente en deux sous-chapitres :

1. le premier sous-chapitre est consacré à l’étude des effets quantitatifs des deux

antipaludiques, ferroquine et artésunate, sur la gamétocytogénèse. On mesure la

gametocytémie et la gamétocytogénèse deux jours avant et après avoir administré les

deux antipaludiques en doses uniques ou doubles, seuls ou associés,

2. le deuxième sous-chapitre est consacré à l’étude qualitative des effets des deux

antipaludiques : en dose unique ou multiple, sur l’infectivité des gamétocytes traités

chez le moustique. On observa avec précision l’altération qualitative des gamétocytes

dans le sang circulant chez l’hôte, ainsi que et leurs altération morphologique après

administration des antipaludiques et leur développement en oocystes dans l’estomac

de moustique.

92

CChhaappii ttrree 11 -- LLee ssttaaddee hhééppaattiiqquuee

L’ensemble des résultats de cette partie vise une meilleure connaissance de l’activité des

antipaludiques, seuls et associés, sur le stade parasitaire hépatique, par l'étude de de divers

antipaludiques utilisés seuls et en association : Malarone®, primaquine, amodiaquine, ferroquine,

et artésunate. Son but est de mesurer la réduction du développement parasitaire dans le foie de

l’hôte. Cette étude est basée sur l’utilisation de la technique de PCR quantitative en temps réel.

Les premiers protocoles ont été menés pour fixer une référence et préciser les différentes actions

possibles des molécules choisies. L’analyse des résultats obtenus sera faite en fonction des

protocoles réalisés.

.

PPrroottooccoollee II :: ddéétteerrmmiinnaattiioonn dd’’uunnee rrééfféérreennccee

Le but du premier protocole est de déterminer le produit qui pourrait être considéré comme

référent en terme d’activité sur le stade intra-hépatique.

Dans ce protocole, chaque souris est infestée par 10 000 sporozoïtes. L’infestation est

considérée efficace quand les souris contrôles présentent une charge parasitaire détectable en

PCR (> 10 parasites/µL).

Au cours de la réaction QT-PCR, dans les échantillons correspondant aux foies provenant

des souris traitées par la Malarone® (association d’atovaquone et de proguanil), il n’a pas été

permis de détecter de formes intrahépatiques dans les limites de sensibilité de la technique, à la

suite des 50 cycles d’amplification (Figures 16, 17). On a eu des résultats comparables avec les

composants de la Malarone® : atovaquone et proguanil. La Malarone® comme ses deux

composants aurait un effet sur le développement des stades intra-hépatiques (corps bleus).

Les échantillons venant de foies de souris traitées ont des charges parasitaires plus faibles

que celles des souris contrôle, avec une grande significativité pour les souris traitées par la

Malarone® ou ses composants. En revanche, aucune différence significative (au risque 5%), n’a

été notée entre les stades hépatiques des souris traitées avec la Malarone® ou ses composants et

ceux des souris traitées avec la primaquine.

Dans les protocoles qui suivent, la Malarone® sera utilisée comme thérapeutique de

référence.

93

Figure 16. Intensité de fluorescence du SYBR® Green en fonction du nombre de cycles

Figure 17. Stades hépatiques détectés par PCR quantitative en temps réel après traitement avec différents antipaludiques. (PQ = Pimaquine ; MAL = Malarone© ; ATVQ = Atovaquone ; PG = Proguanil ; Contrôle = souris infestées non traitées ; ▬ = seuil de détection : log (10 parasite/*L)

94

PPrroottooccoollee IIII :: ééttuuddee ddee pprriinncciippeess aaccttiiffss pprriiss iissoolléémmeenntt

Ce second protocole a pour but de déterminer l’activité sur les formes parasitaires

hépatiques de différents principes actifs, la ferroquine (FQ), l’artésunate (AX) et l’amodiaquine

(AQ) qui pourraient dans l'avenir être associées selon les normes conseillées par l’OMS (ACT).

45000 sporozoïtes sont injectés pour chaque souris. Le développement parasitaire dans le

globule rouge est suivi par l’étude des frottis sanguins quotidiennement pendant une semaine,

afin de confirmer que l’infestation a bien pu avoir lieu. Seules les souris traitées par la

Malarone® restent négatives (après recherche de formes parasitaires intraérythrocytaires au

microscope optique sur 50 champs à l’objectif x100, à l’immersion).

Les résultats obtenus pour la Malarone®, prise comme référence, confirment ceux du

premier protocole (Figures 18, 19). Une différence significative a été notée entre les stades

hépatiques des souris contrôles et ceux des souris traitées (au risque 5%).

Contrairement au premier protocole, les résultats obtenus avec la primaquine montrent une

différence significative avec le développement des stades hépatiques des souris contrôles, mais la

lecture de frottis sanguins et le suivi de la parasitémie ont été positifs chez les souris traitées.

Significativement, les stades hépatiques restent plus nombreux chez les souris traitées avec

l’artésunate que chez les souris contrôle.

Aucune différence significative n’a été trouvée, par contre, entre les stades hépatiques des

souris traitées par les deux thérapeutiques, ferroquine et amodiaquine, et ceux des souris de

contrôle.

La Malarone® reste le produit le plus efficace et totalement efficace, comparé aux autres

produits actifs : artésunate, amodiaquine et ferroquine qui, testés seuls, ne présentent pas

d’efficacité décelable par la technique de PCR quantitative en temps réel.

.

95


Figure 19. Stades hépatiques détectés par PCR quantitative en temps réel après traitement avec différents antipaludiques. (PQ = Pimaquine ; MAL = Malarone© ; AQ = Amodiaquine ; AX = Artésunate ; FQ = Ferroquine ; Contrôle = souris infestées non traitées).

Protocole II

0

1

2

3

4

FQ AX MAL PQ AQ Contrôle

Drogues

Sta

des

hépa

tique

s

(loga

rithm

e de

la c

harg

e

para

sita

ire)

96

PPrroottooccoollee IIIIII :: ééttuuddee ddeess aassssoocciiaattiioonnss tthhéérraappeeuuttiiqquueess

Dans ce protocole préliminaire, 20000 sporozoïtes sont injectés pour chaque souris. La

réussite de l’infestation est confirmée par les frottis sanguins des souris maintenues en vie dans

chaque lot.

Conformément aux deux protocoles précédents, l’activité de la Malarone® sur les formes

hépatiques est confirmée.

Par contre, l’administration des associations artésunate + amodiaquine (AX+AQ) et

ferroquine + artésunate (FQ+AX) ne montre pas d’efficacité suffisante sur les stades hépatiques

de P. y. yoelii (Figures 20, 21). Il n’existe pas de différence significative entre les stades

hépatiques des souris contrôles et ceux des traitées avec les associations (AX+AQ) ou

(FQ+AX).

PPrroottooccoollee IIVV :: ééttuuddee ddeess aassssoocciiaattiioonnss tthhéérraappeeuuttiiqquueess eenn ccuurreess mmuullttiipplleess

À la suite des résultats des expériences précédentes, on a été conduit à réaliser un

quatrième protocole pour étudier à nouveau les mêmes associations à des doses différentes et

répétées. 80 000 sporozoïtes ont été injectés à chaque souris.

Les souris des lots traités avec artésunate, association artésunate + amodiaquine (AX+AQ)

et association ferroquine + artésunate (FQ+AX), ont reçu deux doses (même dose et même voie),

la deuxième dose étant administrée sept heures après la première.

L’analyse graphique (Figures 22, 23) et statistique des résultats obtenus a confirmé a

nouveau l’activité de la Malarone®.

Aucune différence significative n’a été notée (au risque 5%) entre la quantification des

stades hépatiques des souris contrôles et celle des souris traitées par l’association (AX+AQ).

En revanche, on a retrouvé des différences significatives entre l’artésunate (AX) et

l’association (FQ+AX).

97

Figure 20. Intensité de fluorescence du SYBR® Green en fonction du nombre de cycles.

Figure 21. Stades hépatiques détectés par PCR quantitative en temps réel après traitement avec différents antipaludiques. (MAL = Malarone© ; AX =Artésunate ; FQ = Ferroquine ; Contrôle = souris infestées non traitées)

P ro toco le III

0

1

2

3

4

MAL AX+AQ F Q +AX Contrô le

Drogues

stad

es h

épat

ique

s

(loga

rithm

e de

la c

harg

e

para

sita

ire)

98


P ro toco le IV

0

1

2

3

4

A X+A Q A X FQ+A X M A L Contrôle

Drogues

Sta

des

hépa

tique

s

(loga

rithm

e de

la c

harg

e

para

sita

ire)

Figure 23. Stades hépatiques détectés par PCR quantitative en temps réel après traitement avec différents antipaludiques.

99

Avec 2 ème dose d’AX pour (AX+AQ, AX et FQ+AX) à 7 h d’intervalle. (MAL = Malarone ; AX =Artésunate ; FQ = Ferroquine ; Contrôle = souris infestées non traitées).

L’analyse comparative effectuée entre l’artésunate et FQ+AX face à la Malarone® sur les

stades intra-hépatiques est toujours en faveur de la Malarone®.

Le test Student n’a pas permis de montrer de différences significatives entre les souris

ayant reçu double dose d’artésunate et celles n’en ayant reçu qu’une dose.

L’addition d'une deuxième dose n’expliquerait pas la différence des résultats trouvés avec

les souris traitées par l’artésunate et celles par l’association ferroquine + artésunate, dans les

protocoles III et IV.

Enfin, l'étude des extraits en duplicate ne met pas en évidence une différence significative

entre les stades hépatiques de deux prélèvements différents sur un foie. La répartition des corps

bleus parait donc globalement homogène.

Conclusions générales sur les résultats obtenus

sur le stade hépatique :

� La MALARONE® (atovaquone et proguanil) présente une efficacité totale

sur le stade hépatique dans la limite de sensibilité de la technique (seuil : 9

parasite/µL).

� L’efficacité de la primaquine à la dose 20mg/kg sur le stade hépatique est

partielle.

� L’amodiaquine, l’artésunate, la ferroquine et leurs associations manquent

d’efficacité.

100

CChhaappii ttrree 22 -- LLee ssttaaddee sseexxuuéé :: llaa

ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee eett llaa ttrraannssmmiissssiioonn dduu

ppaalluuddiissmmee

AA// ETUDE QUANTITATIVE DES EFFETS DES TRAITEMENTS SUR LA GAMETOCYTOGENESE

Cette partie a pour but d’étudier l’efficacité des antipaludiques sur la gamétocytogénèse et

les gamétocytes circulants. Les différents protocoles précisent l’effet qualitatif de la ferroquine et

de l’artésunate ou de leur association, à différentes doses, unique et double, sur la

gamétocytogénèse et la gamétocytémie.

PPrroottooccoollee II :: ééttuuddee ddee ll’’eeffffeett dd’’uunnee ddoossee uunniiqquuee eett ddee ddeeuuxx ddoosseess

ssuucccceessssiivvee «« ssuubbccuurraattiivveess »» ddee ffeerrrrooqquuiinnee ssuurr llaa ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee

A. Au troisième jour, dès l’apparition d’une parasitémie, on injecte le traitement (H0). La

figure 24 résume les résultats.

Les résultats des 3 lots (lot1 témoin, lot2 traité par dose unique de ferroquine 5mg/kg et

lot3 traité par deux doses de ferroquine 5mg/kg) comparent les différents indices, avant et après

traitement.

Les indices parasitaires des trois lots à 1 heure (H1) post-traitement (lot1 = 3.15,

lot2 = 2.68 et lot3 = 2.76), ont diminué de près de 15% dans les deux lots traités par rapport au

lot témoin. Cette diminution s’amplifie à 3 heures après traitement (H3), elle est de 15% pour le

lot traité avec une seule dose à 5mg/kg et de 20% pour le lot traité avec deux doses, comparé au

lot témoin (lot1 = 3.87, lot2 = 3.28 et lot3 = 3.07). Cinq heures après les traitements (H5), la

réduction de la parasitémie était de 5% pour les souris traitées avec une dose et d'environ 30%

pour les souris traitées avec deux doses, par rapport aux souris de contrôle (lot1 = 3.67,

lot2 = 3.47 et lot3 = 2.61).

101

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

H0 H1 H3 H5 H8 H22 H24 H48

Temps

% d

e p

ara

sité

mie

T+

FQ (1 CURE)

FQ (2 CURES)

Figure 24. Evolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; FQ = ferroquine)

À H8, les résultats par lot : lot1 = 3.78, lot2 = 3.56 et lot3 = 2.32, montraient une réduction

par rapport au lot témoin, réduction de 5% pour le lot traité avec dose unique et de 40% pour le

lot traité avec double dose. La réduction est significative dans le cas du lot traité par double cure

de ferroquine (P<0.01).

À partir de H22 (lot1 = 4.57, lot2 = 5.25 et lot3 = 3.4), H24 (lot1 = 4.57, lot2 = 6.08 et

lot3 = 4.32) et jusqu’à H48 (lot1 = 4.33, lot2 = 4.73 et lot3 = 3.23), la parasitémie des lots traités

avec une seule dose, a augmenté par rapport au témoin : 15%, 30% et 10% respectivement. La

parasitémie des lots traités avec double dose, reste toujours moins importante que celle du lot

témoin : à H22, H24 et H48, la réduction y était d'environ 25%, 5% et 25%.

B. Pour ce qui concerne la gamétocytémie (Figure 25), les traitements infracuratifs

expliquent ces premiers résultats attendus. Cet indice a augmenté à H1 post-traitement pour les

deux lots traités par rapport au lot témoin (lot1 =7.31, lot2 =9.58 et lot3 = 7.27) ; cette

augmentation était notable pour le lot traité avec une dose (30%), alors que l’augmentation pour

le lot traité avec double dose, était très faible (1%).

102

0

5

10

15

20

25

H0 H1 H3 H5 H8 H22 H24 H48

Temps

% d

e g

am

éto

cyté

mie

T+

FQ (1 CURE)

FQ( 2 CURES)

Figure 25. Evolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; FQ = ferroquine)

À H3 (lot1 = 6.17, lot2 = 9.75 et lot3 = 8.76), l’augmentation pour les deux lots traités, par

rapport au lot témoin, était inférieure à 60% pour le lot traité à dose unique et de 40% pour le lot

traité à double dose.

À H5, concernant la gamétocytémie des lots traités, par rapport au lot témoin (lot1 =6.54,

lot2 =7.03 et lot3 = 11.65), et jusqu’à H8 (lot1 = 12.07, lot2 = 13.39 et lot3 = 14.1), on note une

augmentation pour le lot traité à dose unique : 20% à H5 et 10% à H8, alors que pour le lot traité

à double dose, on avait une augmentation de 80% à H5 de 15% à H8.

À H22 (lot1 = 8.85, lot2 = 6.41 et lot3 = 10.08) et H24 (lot1 = 6.29, lot2 = 4.53 et

lot3 = 9.39), la gamétocytémie du lot3 reste supérieure à celle des lots 1 et 2.

À H48 (lot1 = 2.92, lot2 = 2.38 et lot3 = 4.52), les gamétocytémies (dose unique)

diminuent, la gamétocytémie pour le lot traité à deux doses de ferroquine se maintient jusqu’à la

fin (55%).

C. L’augmentation de l’index de gamétocytogénèse (Tableau 7) à H1 post-traitement était

d'environ 50% pour le lot2, 15% pour le lot3, par rapport au lot1. A H3 post-traitement, cet index

a fortement augmenté, d'environ 80% pour les lots 2 et 3 par rapport au lot1.

103

Index de gamétocytogénèse (gamétocytèmie/parasitémie)

Témoin ferroquine 5mg/kg Heures- post

traitement 1 cure 2 cures

H0 1.62 ± 0.37 3.00 ± 1.11 2.02 ± 2

H1 2.32 ±0.24 3.57 ± 2.55 2.69 ± 1.69

H3 1.60 ±1.35 2.96 ± 1.90 2.85 ± 1.59

H5 1.78 ± 0.70 2.32 ± 0.88 4.47 ± 3.97

H8 3.19 ± 2.28 3.78 ± 3.01 6.10 ± 3.55

H22 1.93 ± 1.86 1.22 ± 1.23 2.96 ± 1.12

H24 1.38 ± 1.05 0.75 ± 0.61 2.18 ± 4.22

H48 0.67 ± 1.31 0.50 ± 1.42 1.40 ± 1.86

Tableau 7. Étude de l’effet de la dose unique et de 2 doses subcuratives successives de ferroquine sur la gamétocytogénèse

A H5, l’index de gamétocytogénèse augmentait d'environ 30% pour le lot2 et de 150%

pour le au lot3 par rapport au lot1. Son augmentation à H8 était d’environ 20% pour le lot2 et de

90% pour le lot3 par rapport au lot1. Mais pour le lot2, l’index a diminué à H22 et jusqu’à H48,

de manière plus franche que pour le lot3.

L’index de gamétocytogénèse a donc fortement augmenté pour le lot2 à H3 (80%), alors

qu’il était de 150% pour le lot3 à H5.

Ce protocole permet une heureuse conclusion :

La double dose subcurative de ferroquine (5m/kg) a un effet plus important sur

l’index de gamétocytogénèse qu’à dose unique.

D’autre part, le pic d’augmentation de l’index de gamétocytogénèse est observé

8 heures (H8) après le traitement.

104

PPrroottooccoollee IIII :: ééttuuddee ccoommppaarraattiivveess ddeess eeffffeettss ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee eett ddee

ll’’aarrttééssuunnaattee eenn ddoosseess ssuubbccuurraattiivveess

A. La parasitémie (Figure 26) au troisième jour à H1 post-traitement a diminué pour les

deux lots traités (avec la ferroquine 5mg/kg (lot2=2.49) et l’artésunate 5mg/kg (lot3=2.47)) de

près de 30% (27%) par rapport au lot témoin (lot1= 3.43).

Trois heures (H3) plus tard, la parasitémie, pour le lot traité par la ferroquine, a diminué de

15%, et, pour le lot traité par l’artésunate, de 20% (lot1 =3.49, lot2 = 2.90 et lot3 = 2.76).

A H5, la diminution de la parasitémie du lot traité par la ferroquine, par rapport au lot

contrôle, était d’environ 20%, alors que la parasitémie du lot traité par l’artésunate

(significativité, P<0.01), était de 40% par rapport au lot témoin (lot1=4.93, lot2= 3.85 et

lot3=6.87).

À H24 (lot1=2.27, lot2= 3.17 et lot3 =2.44), on observe une augmentation de la

parasitémie des deux lots traités par rapport au lot témoin : 40% pour le lot traité par la

ferroquine et 10% pour le lot traité par l’artésunate.

B. La gamétocytémie (Figure 27) à la première heure (H1) post-traitement a augmenté

parallèlement dans les deux lots traités par rapport au lot témoin, soit de 95% (lot1=2.87, lot2=

5.68 et lot3=9.76).

A H3 (lot1=14.26, lot2= 13.39 et lot3=18.93), on note une légère baisse de la

gamétocytémie du lot traité par la ferroquine par rapport au lot témoin, alors que celle du lot

traité par l’artésunate a augmenté de près de 30%.

Cinq heures (H5) après le traitement, la gamétocytémie (lot1=2.77, lot2= 13.77 et

lot3=5.37) a augmenté fortement pour les deux lots traités, d’environ 400% pour celui traité par

la ferroquine (significative< 0.02) et de 95% pour celui traité avec l’artésunate.

Une chute de la gamétocytémie est remarquée dès H 24 post-traitement (lot1=5.46, lot2=

2.61 et lot3=4.81) pour les deux lots traités par rapport au lot témoin (près de 50% pour le lot

traité par la ferroquine et de 10% pour la chute le lot traité par l’artésunate).

C. L’index de gamétocytogénèse (Tableau 8) à H1 post-traitement a augmenté, pour les

deux lots des souris traitées avec la ferroquine et l’artésunate (lot1 et 2), de presque 200%

(170%) par rapport au lot témoin.

105

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

H0 H1 H3 H5 H24

Temps

% d

e p

ara

sité

mie

T+

FQ

AX

Figure 26. Évolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; FQ = ferroquine ; AX = artésunate)

0

5

10

15

20

25

30

H0 H1 H3 H5 H24

Temps

% d

e g

am

éto

cyté

mie

T+

FQ

AX

Figure 27. Evolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; FQ = ferroquine ; AX = artésunate)

106

Index de gamétocytogénèse

(gamétocytèmie/parasitémie)

T+ FQ 5mg/kg AX 5mg/kg

H0 1.18 ± 0.90 3.29 ± 2.76 4.98 ± 4.84

H1 2.39 ± 2.10 6.42 ± 8.85 6.48 ± 8.82

H3 4.09 ± 2.70 4.52 ± 2.30 6.86 ± 1.92

H5 0.56 ± 0.35 3.58 ± 4.11 0.78 ± 0.96

H24 2.41 ± 1.36 0.82 ± 1.10 1.97 ± 2.18

Tableau 8. Étude de l’effet de doses subcuratives de ferroquine et d’artésunate sur la gamétocytogénèse

A H3, l’index de gamétocytogénèse pour les lots 2 et 3 est toujours en augmentation par

rapport au lot témoin (10% pour le lot2 et 65% pour le lot3 (significative P<0.02).

L’augmentation de l’index de gamétocytogénèse est la plus importante à H5, soit 500%

pour le lot2 (significative P<0.04) et 40% pour le lot3 par rapport au lot témoin. A H24, l’index

de gamétocytogénèse du lot1 est plus important que pour le lot 2 (190%), et de 20% supérieur au

lot3.

Conclusion de ce protocole :

La dose subcurative (5m/kg) de ferroquine et d’artésunate a un effet sur la

gamétocytogénèse dès la première heure post traitement. Cet effet continue jusqu'à H3

pour l’artésunate.

PPrroottooccoollee IIIIII :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee ll’’aassssoocciiaattiioonn aarrttééssuunnaattee--ffeerrrrooqqiinnee ssuurr llaa

ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee

A. La parasitémie (Figure 28) du lot traité par association de ferroquine et d’artésunate à

doses infracuratives a augmenté de H1 (témoin : lot1= 6.05 / lot2=5.04) jusqu’à H24 (lot1 =3.32

107

0

2

4

6

8

10

12

14

H0 H1 H3 H5 H8 H24 H48

Temps

% d

e p

aras

itém

ieT+

AXFQ

Figure 28. Evolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; AX FQ = artésunate + ferroquine)

et lot2 = 4.26) par rapport à celle du lot témoin, mais à H48, la parasitémie du lot traité est plus

faible (3%) que celle du lot témoin.

B. La gamétocytémie (Figure 29) du lot traité par association de ferroquine et d’artésunate

a très peu augmenté par rapport au lot témoin (lot1=2.46 et lot2= 3.08), et elle diminue à H3

(lot1=4.8 et lot2= 4.66) et H5 (lot1=4.55 et lot2= 3.72).

Par contre, à H8 (lot1=2.38 et lot2= 7.03) et H24 (lot1=1.05 et lot2= 3.87), elle augmente à

nouveau (d’environ 200% et 300% respectivement) comparativement au témoin.

C. L’index de gamétocytogénèse (Tableau 9), en général est faible dans les deux lots (traité

et non traité) ; l’index de gamétocytogénèse du lot2 a augmenté à H1 de 17% et a diminué à H3

et à H5 d’environ 3% et 42% respectivement, bien que l’index du lot2 par rapport au lot1 ait

augmenté jusqu’à 110% à H8. Mais à partir de H24 et H48, l’index de gamétocytogénèse était de

moins 1% pour les deux lots.

On en conclut que l’association ferroquine-artésunate (5mg/kg de chaque molécule)

diminue la gamétocytogénèse à partir de la huitième heure suivant la thérapeutique.

108

0

2

4

6

8

10

12

14

H0 H1 H3 H5 H8 H24 H48

Temps

% d

e ga

mét

ocy

tém

ieT+

AXFQ

Figure 29. Evolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; AX FQ = artésunate + ferroquine)



T+ AXFQ

H0 0.28 ± 0.30 0.58 ± 0.21

H1 0.41 ± 0.43 0.48 ± 0.92

H3 0.96 ± 0.90 0.93 ± 0.89

H5 1.16 ± 0.76 0.67 ± 0.81

H8 0.56 ± 0.45 1.19 ± 2.42

H24 0.32 ± 0.50 0.84 ± 1.39

H48 0.21 ± 0.19 0.12 ± 0.17

Tableau 9. Effet de l’association ferroquine–artésunate sur la gamétocytogénèse.

(dose de 5mg/kg pour chaque traitement)

109

PPrroottooccoollee IIVV :: EEttuuddee ccoommppaarraattiivvee ddee ttrrooiiss ddoossaaggeess dd’’aarrttééssuunnaattee ((55mmgg //kkgg,,

1100mmgg//kkgg eett 5500mmgg//kkgg)) ssuurr llaa ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee

A. A H1h30 post-traitement, la parasitémie (Figure 30) des lots traités avec deux dosages

d’artésunate : 5 mg/kg (lot2= 0.99) et 10 mg/kg (lot3=1.10), a augmenté par rapport au lot

témoin (lot1=0.97), alors qu’elle a diminué pour le lot dosé à 50mg/kg (lot4=0.91), qui est une

dose curative.

A H5, la parasitémie des 3 lots traités : 2, 3 et 4 (lot1= 1.22, lot2 =1.01, lot3 = 1.04 et lot4

= 1.06) a diminué de près de 15% par rapport au lot1.

A H24 post-traitement (lot1= 3.02, lot2 =2.18, lot3 = 2.11 et lot4 = 1.31), la réduction de la

parasitémie est importante : près de 30% pour les lots 2 et 3, et de 60% pour le lot 4

(significative P<0.0005). A la fin de l’expérience, à H48 (lot1= 3.94, lot2 =2.60, lot3 = 1.93 et

lot4 = 1.97), la réduction de la parasitémie reste importante.

B. La gamétocytémie (Figure 31) à H1h30 post-traitement (lot1= 2.33, lot2 =2.74, lot3 =

3.55 et lot4 = 3.56) a augmenté, pour les 3 lots traités, de 20% pour le lot2, de 55% pour les ots 3

et 4. Cinq heures plus tard (à H5) (lot1= 3.77, lot2 =4.35, lot3 = 6.89 et lot4 = 3.59), on note un

pic de la gamétocytémie des lots traités, notamment du lot 3 (10 mg/kg) dont la gamétocytémie a

augmenté de 80 %. À H24, l’augmentation de la parasitémie des lots 2 et 3 est d’environ 30% et

20% respectivement (lot1= 3.60, lot2 =4.69, lot3 = 4.27 et lot4 = 3.59). À la fin de l’expérience,

à H48 (lot1= 3.33, lot2 =5.62, lot3 = 2.64 et lot4 = 4.38), l’augmentation était d’environ 70%

pour le lot2 et de 30% pour le lot 4 par rapport au lot témoin.

C. A H1h30 post-traitement l’augmentation de l’index gamétocytogénèse (Tableau 10) des

trois lots traité avec les doses 5, 10 et 50mg/kg par rapport au lot témoin était de 15%, 35% et

65% respectivement. L’index de gamétocytogénèse a augmenté pour les trois lots traités quelle

que soit la dose jusqu’ à H48

Conclusion :

L’artésunate (5, 10 et 50mg/kg) a un effet majeur sur la gamétocytogénèse à H5 post

traitement surtout à la dose 5mg/kg.

110

0

1

2

3

4

5

6

H0 H1h30 H5 H24 H48

Temps

% d

e p

ara

sité

mie

AX5mg

AX10mg

AX50mg

T+

Figure 30. Evolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps

(T+ = témoin positif ; AX = artésunate ; 3 dosages 5, 10 et 50mg/kg)

0

2

4

6

8

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14

H0 H1h30 H5 H24 H48

Temps

% d

e g

am

éto

cyté

mie

AX5mg

AX10mg

AX50mg

T+

Figure 31. Evolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps.

(T+ = témoin positif ; AX = artésunate ; 3 dosages 5, 10 et 50mg/kg)

111



AX5mg AX10mg AX50mg T+

H0 2.53 ± 3.37 5.2 ± 3.56 2.98 ± 3.73 5.17 ± 10.31

H1h30 2.77 ± 4.47 3.23 ± 4.44 3.91 ± 2.50 2.4 ± 5.11

H5 4.32 ± 12.24 6.64 ± 11.63 4.03 ± 4.59 3.08 ± 3.10

H24 2.15 ± 1.73 2.03 ± 7.20 2.74 ± 2.11 1.19 ± 1.11

H48 2.16 ± 3 1.37 ± 0.96 2.22 ± 2.24 0.84 ± 1.28

Tableau 10. Effet de 3 dosages (5, 10, 50 mg/kg) d’artésunate sur la gamétocytogénèse

PPrroottooccoollee VV :: CCoommppaarraaiissoonn ddeess ddeeuuxx ddoossaaggeess iinnffrraaccuurraattiivveess 55mmgg //kkgg eett

1100mmgg//kkgg dd’’aarrttééssuunnaattee eett ddee ffeerrrrooqquuiinnee

A. H1h30 après le traitement, la parasitémie (Figure 32) des deux lots d’artésunate à

5mg /kg 5 (lot2= 2.40) et 10 mg/kg (lot3= 2.33) a diminué de près de 30% par rapport au lot

témoin (lot1 = 3.35) ; pour les lots traités avec la ferroquine à 5mg/kg (lot4= 2.95)

l’augmentation est discrète. A H5 post-traitement, la parasitémie des lots 2 (2.42) et 4 (2.51) a

diminué de 30% par rapport au lot témoin. La parasitémie des lots 3 (2.05) et 5 (2.99) a diminué

de 43% et 20% respectivement, par rapport au lot1 (3.61) ; la diminution est significative avec le

lot2 (P=0.02). Vingt quatre heures après les traitements, la parasitémie a diminué mais pas avec

la ferroquine à 5mg/kg.

B. La gamétocytémie à H1h30 post-traitement (lot1= 5.42, lot2= 7.88, lot3= 3.6, lot4=

9.24 et lot5= 7.01) (Figure 33) a augmenté dans les lots 2, 4 et 5 (45%, 70% et 30%) par rapport

aux souris témoins ; la différence est significative avec le lot4 traité par la ferroquine à 5mg/kg

(P=0.05), alors que le nombre de gamétocytes chez les souris traitées avec l’artésunate à

10mg/kg a diminué. A H5 post-traitement (lot1= 7.14, lot2= 7.26, lot3= 7.40, lot4= 9.36 et lot5=

7.49), la gamétocytémie des lots 2, 3 et 4 est proche de celle des souris témoins du lot1. À partir

de H24 (lot1= 2.17, lot2= 5.17, lot3= 5.19, lot4= 3.11 et lot5= 6.08), le nombre de gamétocytes a

augmenté dans les lots 2, 3 et 5 de près de 140%, et l’on note une augmentation importante du

nombre de gamétocytes du lot4, par rapport au lot1.

112

0

1

2

3

4

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7

H0 H1h30 H5 H24 H48

Temps

% d

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ara

sité

mie

AX 5mg

AX10mg

FQ5mg

FQ10 mg

T+

Figure 32. Évolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps.

(T+ = témoin positif ; AX = artésunate; FQ = ferroquine ; 2 dosages 5 et 10 mg/kg pour chaque traitement)

0

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H0 H1h30 H5 H24 H48

Temps

% d

e g

am

éto

cyé

mie

AX 5 mg

AX 10mg

FQ 5mg

FQ10mg

T+

Figure 33. Évolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps.

(T+ = témoin positif ; AX = artésunate ; FQ = ferroquine ; 2 dosages 5 et 10 mg/kg pour chaque traitement)

113

C. L’augmentation de l’index de gamétocytogénèse (Tableau 11) est notée dès H1h30

post-traitement, pour tous les lots traités, sauf pour le lot 3 qui, lui, a diminué de 15% par rapport

au lot1.

On peut remarquer à H5 post-traitement, une augmentation générale de tous les lots traités

par rapport au lot témoin. L’index de gamétocytogénèse de tous les lots diminue à H24 bien que

celui des lots traités soit toujours supérieur aux témoins. Celui du lot 4 est un peu supérieur à

celui du lot témoin.

Conclusions de ce protocole :

La ferroquine et l’artésunate (5, 10 mg/kg) ont un effet sur la gamétocytogénèse,

surtout à H5 post thérapeutique.

Conclusions générales sur l’étude quantitative des effets des traitements sur la

gamétocytogénèse :

� La ferroquine (5, 10 mg/kg) et l’artésunate (5, 10 et 50mg/kg), ont un effet quantitatif

sur l’index de gamétocytogénèse à partir de la première heure post traitement et

jusqu’à H24. La gamétocytogénèse est à son maximum 5 heures après la prise de

traitements.

� L’index de gamétocytogénèse est supérieur chez les souris traitées par deux et trois

dosages subcuratives de ferroquine successive, à celui mesurés chez les souris

traitées avec une dose unique.

� L’association ferroquine-artésunate a un effet quantitatif léger sur l’index de

gamétocytogénèse à partir de la huitième heure post thérapeutique

114



ferroquine (mg/kg) artésunate (mg/kg)

Temps post-

traitement 5 10 5 10

control

H0 2.63 ± 2. 38 1.72 ± 0. 98 1.07 ± 1.1 2.64 ± 2.07 2.52 ± 2.04

H1h30 3.13 ± 2. 56 2.68 ± 2.72 3.28 ± 2.93 1.55 ± 2. 28 1.62 ± 1.07

H5 3.73 ± 7.37 2.51 ± 1.89 3 ± 2.52 3.61 ± 4.75 1.98 ± 2.9

H24 0.99 ± 3.17 1.98 ± 5.66 2.78 ± 3.14 3.05 ± 4.15 0.92 ± 0.94

H48 0.81 ± 0.93 0.22 ± 0.32 0. 31 ± 0.39 0.86 ± 1.67 0.62 ± 1.17

Tableau 11. Étude de l’effet de 2 dosages différentes d’artésunate et de ferroquine (5, 10mg/kg) sur la gamétocytogénèse

115

BB// ETUDE QUALITATIVE DES EFFETS DES TRAITEMENTS SUR LES GAMETOCYTES

Qualitativement, l’effet des traitements sur les gamétocytes circulants, a été étudié dans deux

directions :

� L’étude des changements morphologiques des gamétocytes altérés par microscopie

optique et électronique.

� L’étude de l’infectivité des gamétocytes passés chez le moustique vecteur gorgé de sang

de souris traitées et non traitées.

II.. LLaa mmoorrpphhoollooggiiee ddeess ggaammééttooccyytteess cciirrccuullaannttss

L’analyse en microscopie par des techniques classiques d’étude des globules rouges a

permis de reconnaître les types d’altérations liés à l’agression des antipaludiques, principalement

la ferroquine et l’artésunate :

� En microscopie optique

L’examen des frottis sanguins révèle une dégénérescence rapide des gamétocytes

commençant 1heure après l’administration de traitement. On observe alors un regroupement des

grains de pigment en mottes ou amas, et un cytoplasme dont la coloration est très pâle par

rapport aux différents stades normaux des gamétocytes (Figure 34).

� En microscopique électronique

Le parasite semble s’extérioriser du globule rouge, on note des protrusions vers l’extérieur

dans la majorité des cas. L’analyse fine des structures parasitaires internes montre l’altération

des mitochondries et un aspect feuilleté et enroulé des membranes parasitaires (Figure 35).

116

A)

B)

Figure 34. Gamétocytes altérés : femelles (A), mâles (B)

Figure 35. Gamétocytes de Plasmodium yoelii yoelii altérés dans l'hématie, 1h30 après traitement à la ferroquine 5mg/kg

117

IIII.. LLee ppoouurrcceennttaaggee ddeess ggaammééttooccyytteess aallttéérrééss

Plusieurs protocoles ont été menés pour estimer les pourcentages de gamétocytes altérés

(changements morphologiques et colorimétriques) avant et après le traitement par la ferroquine

et l’artésunate à doses différentes.

PPrroottooccoollee II :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee 33 ddoossaaggeess ((55,, 1100,, 5500 mmgg//kkgg)) dd’’aarrttééssuunnaattee

ssuurr llee ppoouurrcceennttaaggee ddee ggaammééttooccyytteess aallttéérrééss

Le pourcentage d’altération (Figure 36) des gamétocytes pour le lot témoin est nul. Au

contraire, pour les lots ayant été traités, le pourcentage d’altération de gamétocytes a

globalement augmenté. Après H1h30, post-traitement, le pourcentage d’altération des

gamétocytes entre les 3 lots traités a été proche de 15% ; à H5 ce pourcentage par rapport à

H1h30 a diminué pour les deux doses 5 et 50mg /kg, mais a été supérieur avec le lot traité à la

dose de 10mg/kg. Le pourcentage d’altération des gamétocytes, vingt-quatre et quarante-huit

heures après le traitement, a été de 15% avec la dose de 10mg/kg et de 10% avec la dose de

5mg/kg.

PPrroottooccoollee IIII :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee 33 ddoossaaggeess ddee ffeerrrrooqquuiinnee ssuurr llee

ppoouurrcceennttaaggee ddee ggaammééttooccyytteess aallttéérrééss

On note que le pourcentage des gamétocytes altérés a augmenté quelle que soit l’heure

d’examen post-traitement et la dose (Figure 37). Le pourcentage augmente avec la dose ;à H5

post-traitement, le pourcentage, nul à la dose 5mg/kg, est de 5% à 10mg/kg et 10% à 50mg/kg ; à

H24 post-traitement le pourcentage est de10% à la dose 5mg/kg, 20% à la dose 10mg/kg et un

pourcentage des gamétocytes altérés 3 fois supérieur à la dose 50mg/Kg par rapport à celle de

5mg/kg .

118

0

5

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20

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HO H1h30 H5 H24 H48

Temps

% d

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ga

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tocy

tes

alt

éré

s

AX 5 mg/kg

AX 10 mg/kg

AX 50 mg/kg

T +

Figure 36. Évolution du nombre de gamétocytes après traitement à 3 dosages d'artésunate en fonction du temps

0

5

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15

20

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H0 H1h30 H5 H24

Temps

% d

es

ga

mé

tocy

tes

alt

éré

s

FQ 5 mg/kg

FQ 10 mg/kg

FQ 50 mg/kg

Figure 37. Évolution du nombre de gamétocytes après traitement à 3 dosages de ferroquine en fonction du temps

119

PPrroottooccoollee IIIIII :: EEttuuddee ccoommppaarrééee ddee ll’’aallttéérraattiioonn ddeess ggaammééttooccyytteess àà ppaarrttiirr ddee 22

ddoossaaggeess ((55,, 1100mmgg//kkgg)) ddee ffeerrrrooqquuiinnee eett dd’’aarrttééssuunnaattee

Le pourcentage d’altération des gamétocytes pour le lot témoin reste faible et constant

(Figure 38). Au contraire, pour les lots ayant été traités, le pourcentage d’altération a

globalement augmenté.

Après H1h30, le pourcentage d’altération des gamétocytes est semblable entre les 5 lots

différent tout en restant nettement supérieur aux quelques altérations visibles sur les frottis des

souris témoins non traitées. Le pourcentage d’altération a été légèrement plus important à la dose

de 5mg/kg qu’à la dose de 10mg/kg pour les deux traitements. Comme pour les protocoles I et II,

le pourcentage des gamétocytes altérés a eu tendance à diminuer légèrement à H5 post-

traitement. Les pourcentages sont proches pour les 4 lots traités à H24 et H48. L’augmentation

des altérations parait peu importante avec la ferroquine, comparée à l’artésunate.

PPrroottooccoollee IIVV :: eeffffeett ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee eett ddee ll’’aarrttééssuunnaattee ((55,, 1100 eett 5500 mmgg//kkgg))

ssuurr ll’’aallttéérraattiioonn ddeess ggaammééttooccyytteess

Comme précédemment, le pourcentage d’altération des gamétocytes pour le lot témoin

reste faible et constant (Figure 39), contrairement aux lots traités par la ferroquine, quelle que

soit la dose, et le moment post thérapeutique. Dans le cas de l’artésunate, l’altération des

gamétocytes était moindre que celle des lots traités par la ferroquine.

En conclusion des 4 protocoles précédents, on constate l’apparition de gamétocytes

altérés une heure après le traitement. De plus, la dose subcurative de ferroquine parait

entraîner davantage d’altérations des gamétocytes que l’artésunate.

120

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H0 H1h30 H5 H24 H48

Temps

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tocy

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alt

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s

FQ 5 mg/kg

FQ 10 mg/k!g

AX 5 mg/kg

AX 10 mg/kg

T +

Figure 38. Évolution du nombre de gamétocytes après traitement à 2 dosages différents de ferroquine et d’artésunate en fonction du temps

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H0 H1h30 H5 H24 H48

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s

FQ 5 mg/kg

FQ 10 mg/kg

FQ 50 mg/kg

AX 5 mg/kg

AX 10 mg/kg

AX 50 mg/kg

T +

Figure 39. Évolution du nombre de gamétocytes après traitement à 3 dosages différents de ferroquine et d’artésunate en fonction du temps

121

IIIIII.. IInnffeeccttiivviittéé ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee

La transmission du paludisme dépend d’un certain nombre de facteurs, sur lesquels

peuvent jouer les antipaludiques : ils peuvent avoir un effet sur l’infectivité des gamétocytes. Les

protocoles suivants cherchent à mesurer l’effet de la ferroquine et de l’artésunate à doses

subcuratives différentes sur l’infectivité des gamétocytes chez le moustique. Les effets éventuels

sont mesurés une heure et demie (H1h30) et cinq heures (H5) après le traitement.

PPrroottooccoollee II eett IIII :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee ((55mmgg//kkgg)) ssuurr llee

ddéévveellooppppeemmeenntt ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee

Ce protocole a fait l’objet de deux expérimentations : dans la première expérimentation, les

souris sont leurs propres témoins, dans la deuxième, les moustiques sont gorgés sur des souris

traitées et des souris témoins, à H1h30 et H5.

Expérimentation 1

Les paramètres de mesure de l’infectivité des gamétocytes chez le moustique sont la

présence et la quantité d’oocystes observés après dissection de l’appareil digestif du moustique.

Tout au long de ce protocole, les souris infestées sont leur propre témoin dans la comparaison

pré et post- thérapeutique.

On observe l’effet des thérapeutiques sur la gamétocytémie entre H1h30 et H5 après

administration. L’augmentation d’environ 50% et 5% respectivement.

Comme déjà démontré, le nombre de gamétocytes est supérieur après traitement par la

ferroquine ; néanmoins, cette augmentation n’est pas statistiquement significative, quelle que soit

la durée d’action de la thérapeutique : on ne peut parler que de tendance.

Le nombre d’oocystes mesuré après dissection des moustiques diminue (Figure 40) de

manière importante et significative, après administration de la ferroquine. La réduction est de

presque 70%, que ce soit à H1h30 ou à H5 et par rapport aux résultats avant le traitement (H0).

Avant administration de ferroquine, le pourcentage des anophèles femelles gorgés et

infestés est supérieur à 60% ; après H1h30 d’action de la ferroquine, le pourcentage de

moustiques infectés tombe à 50% (48% après H5 de traitement).

122

Figure 40. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à la ferroquine (5mg/kg)

Expérimentation 2

La parasitémie des souris traitées a diminué après le traitement de près de 10% à H1h30 et

de 15% à H5 ; le nombre de gamétocytes est proche de celui du lot témoin et du lot traité par la

ferroquine.

La quantité d’oocystes a diminué entre H1h30 et H5, que ce soit chez les moustiques

nourris sur des souris traitées ou non (Figure 41). La diminution des oocystes chez les

moustiques nourris sur des souris traitées est de 60% à H1h30 et 80% à H5. Cette diminution

est statistiquement significative entre le nombre d’oocystes avant traitement à H0 et le nombre

d’oocystes après traitement à H1h30 (P< 0.04), et à H5 (P< 0.005).

Le pourcentage d’anophèles gorgés et infestés à H0 avant traitement est de 90%. À H1h30

post-traitement à la ferroquine, il est de près de 80%, alors que ce pourcentage atteint 95% dans

le lot témoin non traité. À H5, le nombre d’anophèles infectées et gorgées sur des souris traitées

et des souris témoins représente, respectivement, environ 70% et 85% mais ces réduction en

pourcentages d’anophèles gorgés et infestés ne sont pas significatives.

123

Figure 41. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à la ferroquine

(5mg/kg) comparé avec des témoins

PPrroottooccoollee IIIIII :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee ll’’aarrttééssuunnaattee ((55mmgg//kkgg)) ssuurr llee

ddéévveellooppppeemmeenntt ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee

La parasitémie a diminué légèrement à partir de H1h30, alors que la gamétocytémie a

diminué d’environ 40% à H1h30 et d’environ 60% à H5 post-traitement.

La moyenne d’oocystes comptés chez les moustiques a diminué fortement (plus de 80 %) à

H1h30 post-traitement par l’artésunate (Figure 42). Cette diminution est de près de 90% (93%) à

H5 post-traitement par rapport à H0 avant traitement ; la diminution est donc statistiquement

significative à H5 (P<0.001).

A H0, les anophèles gorgés sont infectés à plus de 80% (83%), mais ce pourcentage

diminue régulièrement en fonction du temps : 52% à H1h30 48% à H5.

124

Figure 42. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à l’artésunate (5mg/kg)

PPrroottooccoollee IIVV :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee eett ddee ll’’aarrttééssuunnaattee àà 1100 mmgg//kkgg

ssuurr llee ddéévveellooppppeemmeenntt ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee

Le nombre moyen d’oocystes par moustique gorgé sur les souris traitées à la ferroquine et

à l’artésunate 10mg/kg diminue régulièrement en fonction du temps.

A H1h30 post-traitement à la ferroquine et à l’artésunate, la réduction est de l’ordre de

65% (P<0.001) et 80% (83%) (P<0.0001) respectivement.

A H5 post-traitement, la réduction était forte : de l’ordre de 90% (93%) (P<0.0001) et

100% (98%) (P< 0.001) chez les moustiques gorgés sur les souris traitées à la ferroquine et à

l’artésunate.

Avant administration du traitement, le pourcentage de femelles gorgées et infectées est

supérieur à 85%, alors qu’il diminue après 1h30 de traitement à la ferroquine (Figure 43) et à

l’artésunate (Figure 44) (53% et 57%), la diminution s’accentuant jusqu’à 33% et 30% à H5.

125

Figure 43. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à la ferroquine (10mg/kg)

Figure 44. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à l’artésunate (10mg/kg)

126

PPrroottooccoollee VV :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee,, ddee ll’’aarrttééssuunnaattee eett ddee lleeuurr

aassssoocciiaattiioonn ((11 eett 33 ddoossaaggeess)) ssuurr llee ddéévveellooppppeemmeenntt ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz

llee mmoouussttiiqquuee

La parasitémie des souris traitées avec la ferroquine, l’artésunate et leur association à dose

unique a diminué à H3 post-traitement. Alors que celle des souris traitées avec l’association

ferroquine-artésunate 3 doses est restée comparable à celle des témoins.

La gamétocytémie des souris traitées avec l’association ferroquine-artésunate 3 doses a

diminué d’environ 55%, tandis que la quantité de gamétocytes sur les souris traitées avec

l’association ferroquine-artésunate 1 dose et avec l’artésunate a augmenté d’environ 400% et

10% respectivement, par rapport aux témoins.

A H3 post-traitement, on constate que le nombre d’oocystes présents dans l’estomac des

moustiques gorgés sur toutes les souris traitées a diminué (Figure 45).

Cette baisse du nombre d’oocystes à H3 post-traitement est de l'ordre de 60% chez les

moustiques gorgés sur les souris traitées à l’artésunate et de 70% (66%) chez les moustiques

gorgés sur les souris traitées par la ferroquine, ceci par rapport aux résultats à H0 avant

traitement.

La réduction d’oocystes chez les moustiques gorgés sur les souris traitées avec

l’association ferroquine-artésunate à une dose ou trois doses est de l'ordre 70% par rapport à H0.

Le pourcentage des moustiques gorgés et infectés est de l'ordre de 90% (92%) avant

administration du traitement. Après traitement à H3, le pourcentage dans les lots traités par

l’artésunate et la ferroquine est du même ordre, un peu plus faible pour l’association ferroquine-

artésunate (une dose 70% et 3 doses 85%).

127

Figure 45. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à l’artésunate, la ferroquine l’association AXFQ 1 dose et AXFQ 3 doses (5mg/kg pour chaque dose)

Conclusion générale sur l’étude qualitative des effets des traitements sur les

gamétocytes :

Les doses subcuratives de ferroquine et d’artésunate et de leur association, diminuaient

l’infectivité des gamétocytes pour le moustique, en diminuant le nombre d’oocystes présents

dans l’estomac du moustique dans les cinq premières heures post-traitement

128

Discussion

129

Le stade hépatique Un des objectifs de notre travail était d’évaluer l’efficacité de divers antipaludiques sur le

stade intra-hépatique en utilisant comme outil de mesure la PCR quantitative en temps réel. Le

stade intra-hépatique précédant le stade intra-érythrocytaire semble être une cible de choix pour

les thérapeutiques prophylactiques destinées à d’empêcher le développement de la maladie, ainsi

que, secondairement, sa transmission.

Il y a plusieurs manières d’évaluer l’efficacité des antipaludiques sur le stade parasitaire :

l’une d’elles se fait en fonction des charges de sensibilité au parasitisme tissulaire surveillé en

microscopie classique ; elle est souvent laborieuse et source d’erreurs. La PCR classique

présente un risque de contaminations étrangères au protocole. Le besoin d’une nouvelle

technique était nécessaire, la PCR quantitative en temps réel paraissait un bon outil, ayant une

bonne sensibilité et sans risque excessif de contamination.

La quantification des effets thérapeutiques antiparasitaires sur les stades hépatiques n’est

que semi quantitative, mais avec une approximation technique suffisante, compte tenu de la

précision des charges de sporozoïtes infectants injectés dans la veine caudale des souris, de la

sensibilité individuelle des souris à l’infection, et du fait, en outre, que la répartition des « corps

bleus » (cellule hépatique gonflée de formes parasitaires) n’est pas homogène dans tous les foies

et que le parasitisme est souvent faible.

Gego et ses collaborateurs en 2006, ont développé une nouvelle approche pour le criblage

de l'activité du médicament sur les stades hépatiques de Plasmodium in vitro, basé sur un

système de balayage de fluorescence infrarouge. Cette méthode a permis de compter

automatiquement et rapidement Plasmodium hépatocytes infectés. Cette nouvelle technique

devrait faciliter l'identification de nouveaux antipaludiques actifs sur les stades hépatiques de

Plasmodium.

L’ensemble de nos résultats décrits précédemment confirme, de façon répétitive et

statistique, l’efficacité incontestable de la MALARONE® sur les stades hépatiques des souris,

quelle que soit la quantité de sporozoïtes injectée. Ceci, démontré clairement par la technique de

PCR quantitative en temps réel, est confirmé par le suivi des frottis sanguins des souris de

différents protocoles qui sont maintenues en vie une semaine après l’infestation. Des études

faites en Thaïlande et dirigées sur les formes sanguines, ont indiqué que la MALARONE® reste

très efficace contre les souches multi-résistantes de P. falciparum, que ce soit in vivo (Krudsood

130

et al., 2007) ou bien in vitro (Khositnithikul et al., 2008). On a pu confirmer également l’effet

des deux composants de la MALARONE®, l’atovaquone et le proguanil, utilisés séparément, sur

le stade intra-hépatique. L’activité prophylactique d’atovaquone contre Plasmodium falciparum

a été déterminé et afin d’éviter l’apparition de résistance, l’atovaquone doit être administré

uniquement en combinaison avec le proguanil (Shapiro et al., 1999).

Pour la primaquine, l’activité thérapeutique déjà connue sur les formes parasitaires intra-

hépatiques déjà connue est confirmée mais son efficacité n’a jamais été complète. La primaquine

a été longtemps utilisée pour la gestion des rechutes du paludisme, mais dans la dernière

décennie, il a été réexaminé pour une utilisation dans la prévention du paludisme, son activité sur

le stade hépatique a été confirmée (Shanks et al., 2001). Mais là encore, jamais l’efficacité n’a

été jugée complète. L’utilisation de la primaquine, comme gamétocytocide dans la République

d'Azerbaïdjan et la République populaire démocratique de Corée, a réduit considérablement les

cas de paludisme dans des régions épidémiques où l’on manque de moyens de lutte contre la

malaria à P. vivax (Kondrashin et al., 2010). On a trouvé des différences significatives entre

l’activité de la MALARONE® et celle de la primaquine, surtout dans le protocole I. Mais il est

possible que ce résultat global soit le fait d’échantillons indétectables par le thermocycleur en

deçà d’une charge seuil limite de 9 parasites/µL. Il est possible que pour des foies issus de souris

traitées par la MALARONE®, l’ADN ne soit jamais détecté, alors qu’au contraire il existe une

détection d’ADN parasitaire dans certains cas pour des souris traitées par la primaquine, mais

cette détection a lieu au-delà du seuil de sensibilité et n’est pas prise en compte dans cette étude.

Il faut ajouter que le suivi des frottis sanguins des souris traitées par la primaquine révèle une

parasitémie qui prouve au moins l’efficacité partielle de la primaquine sur les stades intra-

hépatiques, contrairement à la MALARONE®, et ceci quelle que soit la charge sporozoïtique de

départ. Une étude a trouvé la même efficacité de la primaquine sur le stade hépatique de P.

berghei chez des souris injectées avec 85 000 sporozoïtes ou sur des souris injectées avec 2 000

sporozoïtes. (Baruteau et Girard, 1999). Par ailleurs, Chattopadhyay et al., (2010) ont démontré

une activité inhibitrice in vitro sur les cellules d'hépatome infectées avec P. vivax.

Des chercheurs ont démontré in vitro l’activité de trois médicaments de quinolones et

fluoroquinolones (grépafloxacine, l'acide piromidic, et la trovafloxacine) contre les stades

hépatiques de Plasmodium yoelii yoelii et P. falciparum. (Mahamoudi et al., 2003). Cinq ans

plus tard des nouveaux médicaments actifs contre les stades hépatiques de Plasmodium ont été

prédits par topologie moléculaire. Ces médicaments antirétroviraux (4), antifongique (1), et

cardiotonique (1) ont été jugées hautement actif (nanomolaires 50% des valeurs de concentration

131

inhibitrice), et deux ionophores complètement inhibé le développement du parasite. (Mahamoudi

et al., 2008).

L’amodiaquine et la ferroquine ont une activité sur les stades érythrocytaires des plasmodies,

mais leur efficacité n’est pas suffisante ni décelable par la technique de PCR quantitative sur le

stade hépatique. Les dérivés appartenant à la base de Mannich, comme l’amodiaquine, (4-

quinoléines) et la pyronaridine (amino-9-acridines), n'ont pas aucun effet sur les stades

hépatiques des parasites du paludisme (Basco et al., 1999).

L’artésunate a une activité décelable sur le stade intra-hépatique, mais peu comparable à celle de

la MALARONE® ou de la primaquine.

Strychnopsis thouarsii est une plante traditionnellement utilisée contre le paludisme à

Madagascar. Tazopsine, qui est un roman morphinane alcaloïde, isolé à partir de cette plante.

Ce composé et ses dérivés semi-synthétiques facilement obtenus, ont montré une activité

inhibitrice contre le développement au stade hépatique in vitro avec P. falciparum et P. yoelii et

in vivo avec P. yoelii. (Carraz et al., 2006)

Les tests visant à examiner plusieurs associations de ces principes actifs entre eux

(ferroquine et artésunate, artésunate et amodiaquine), n'atteignent pas les résultats souhaités et

des études ultérieures devraient comporter des dosages différents. On a observé des charges

parasitaires très élevées chez les souris traitées avec l’association de l’artésunate plus la

ferroquine et l’artésunate plus l’amodiaquine, et proches de celles des souris témoins non

traitées. Les modifications apportées au cours d’un quatrième protocole (deux associations

contenant de l’artésunate) améliorent faiblement nos résultats souhaités, en termes d’efficacité.

L’activité de l’association artésunate plus amodiaquine paraissait nulle, tandis que l’association

artésunate plus ferroquine a montré une activité modeste sur le stade hépatique. En effet, d’un

côté, l’efficacité de l’association artésunate plus ferroquine était significativement différente de

celle de la MALARONE®, mais d’un autre coté aussi, cette activité sur le stade intra-hépatique

est significativement supérieure à celle sur le stade hépatique chez les souris de contrôle.

Il pourrait être intéressant d’établir un protocole dans lequel l’efficacité de la ferroquine, en

association avec l’artésunate, serait étudiée en faisant varier uniquement la dose de ferroquine

administrée et en augmentant la taille des échantillons.

132

Le fait d’administrer une deuxième dose d’artésunate n’a entraîné aucune amélioration de

son activité sur le stade hépatique, comparé avec celle obtenue avec une dose unique. La

deuxième dose d’artésunate administrée en plus de l‘association artésunate plus amodiaquine a

diminué les stades hépatiques significativement, comparé aux résultats obtenus avec une seule

dose d’artésunate.

L’étude réalisée permet d’établir la validité de la PCR quantitative en temps réel pour ce

type de recherches. Cette technique présente l’intérêt majeur de permettre une approche à la fois

qualitative et quantitative. Son utilisation permet de compléter les résultats d’études

précédemment réalisées sur le même sujet. Rosanas-Urgell et al. (2010), ont confirmé que cette

technique est sensible et spécifique dans la détection des quatre espèces de Plasmodium humain.

Les résultats obtenus de la technique qPCR en temps réel s’accordent bien avec les autres

techniques moléculaires, telles que la nPCR (Nested PCR) et la PCR_LDR_FMA (mutiplex

PCR-ligase detection reaction-fluorescent microsphere assay).

En conclusion, l’efficacité de la MALARONE® sur le stade intra-hépatique est totale. Elle

est plus efficace à celle de la primaquine et sans commune mesure avec les résultats faibles

obtenus avec les autres molécules prises isolément ou associées :

- L’action de l’artésunate et de la primaquine sur le stade intra-hépatique existe et

constatée, elle n’est pas totale et ne saurait entraver complètement les développements

sanguins parasitaires en rapport avec les signes cliniques du paludisme. Leur efficacité

sur ce stade apparaît donc partielle.

- Associer les antipaludiques a amélioré légèrement leur efficacité sur le stade intra-

hépatique, comme l’association de l’artésunate plus la ferroquine.

- En fait, une deuxième dose d’artésunate a un effet sur le stade intra-hépatique, soit en

antipaludique seul, soit en association artésunate avec l’amodiaquine.

- Une étude révèle une nouvelle approche pour designer et évaluer les antipaludiques

basées sur la combinaison covalente de molécules (l’hybride de primaquine-artémisinine)

agissant sur différents stades de cycle de vie (Capela et al., 2011)

133

Le stade sexué

Le paludisme est sans doute l’une des infections parasitaires la plus étudiée. On pensait

pouvoir l’éradiquer par épandage d’insecticides actifs contre un vecteur qui apparaît de plus en

plus résistant aux nouveaux pesticides qu’on lui oppose. Une autre voie incontournable consiste

à assurer un traitement rapide des malades et impaludés porteurs sains de parasites, afin de les

protéger et d’assurer autant que possible un arrêt de la chaîne épidémiologique assurant la

transmission vers des sujets sains. Mais moustiques et souches de Plasmodium développent des

résistances aux différentes armes qu’on leur oppose. Des cibles thérapeutiques complémentaires

peuvent être envisagées : la stérilisation du réservoir de parasites dans le foie avant son

expression dans le sang circulant, et l’arrêt de la transmission en agissant en amont sur la

gamétocytogénèse, les gamétocytes et la transmission vectorielle.

Si l’on admet que la transmission du paludisme se divise en quatre phases cycliques :

1) le développement chez l'hôte, incluant la gamétocytogénèse,

2) le passage de l'hôte vers le moustique,

3) le développement du parasite chez le moustique,

4) le passage du moustique vers l'hôte (Robert et al.,, 2003),

nous dirons que notre étude aborde les trois premières phases.

Deux études ont été réalisées, l’une quantitative et l’autre qualitative, selon deux objectifs :

� étudier quantitativement l’action des antipaludiques (artésunate, ferroquine) sur la

gamétocytogénèse et sur le nombre de gamétocytes dans le sang circulant (le

développement du parasite chez l'hôte).

� étudier qualitativement :

1. l’action des antipaludiques sur la qualité de gamétocytes à la suite d’observations

morphologiques et colorimétriques en microscopie optique et électronique,

2. l’action des antipaludiques sur l’infectivité des gamétocytes se développant en

oocystes dans l’estomac du moustique.

134

�� Etude quantitative des effets des traitements sur la

gamétocytogénèse

Le dosage des médicaments actifs étudiés doit être suffisamment faible pour permettre le

développement à bas bruit des parasites asexués et suffisant pour juger d’une éventuelle activité

sur la gamétocytogénèse, les gamétocytes circulants de l’impact sur la transmission (en agissant

sur la transformation chez le moustique des gamètes en sporozoïtes infectants).

La parasitémie

Quel que soit le protocole, nous constatons une légère baisse de la parasitémie des souris

traitées (à doses infra curatives) à partir d’H1 post-traitement, avec une décroissance plus

franche attendue chez les souris traitées par deux doses, cela sans disparition complète des

parasites sanguins. Par contre, les effets des thérapeutiques diminuent dès la huitième heure pour

pratiquement disparaître 24 à 48 heures plus tard. .

Des études à doses curatives pourraient être poursuivies mais la quantité de gamétocytes

serait sans doute faible, malgré le fait que la souche de Plasmodium yoelii utilisée soit

asynchrone et forte productrice de gamétocytes, et les analyses seraient plus complexes.

Une étude (Dupin et Vildeuil, 2001), est en accord avec certains de nos résultats

concernant l’efficacité de l’artésunate à la dose de 50mg/kg : elle a montré que l’artésunate

administré en trois cures semble ralentir le passage des formes mérozoïtes hépatiques vers le

secteur sanguin, mais en montrant un net ralentissement dans le développement parasitaire.

Il semble donc que les deux antipaludiques, ferroquine et artésunate, contrôlent la

parasitémie dans les premières heures post-traitement, quelle que soit la dose subcurative.

24 heures plus tard, l’effet est presque absent, ceci s’expliquant par la demi-vie courte des

deux antipaludiques qui perdent leur efficacité précocement. En effet, la demi-vie de l’artésunate

est de vingt minutes. Par ailleurs, on ne peut éliminer le fait que les souris puissent

individuellement réagir différemment aux thérapeutiques, ce qui expliquerait en partie des

résultats apparemment discordants selon les protocoles.

La gamétocytémie

Une augmentation du nombre des gamétocytes a été remarquée chez les souris traitées

avec une ou deux doses de ferroquine, en comparaison avec les souris témoins. Cette

augmentation était maximale (d’environ 60%) à H3 pour le lot traité par dose unique de

135

ferroquine. Tandis que l’augmentation maximale pour le lot traité avec deux doses (80%) a eu

lieu à H5.

La gamétocytémie a augmenté, une heure après les deux traitements (ferroquine et

artésunate), de presque 100% par rapport au lot témoin. La gamétocytémie de la ferroquine est

restée presque stable pendant les 5 premières heures post-traitement comparé au témoin, mais

celle de l’artésunate a diminué à H5 post-traitement.

Dans le cas de l’association ferroquine-artésunate, le nombre de gamétocytes a augmenté

dès la première heure, ce nombre étant deux fois plus important à H8 et 3 fois plus à H24 par

rapport à celui du témoin non traité.

En accord avec ces résultats, l’effet des 3 doses d’artésunate : 5, 10, 50mg/kg, augmente la

gamétocytémie dès H1h30 et H5 ; le nombre maximum de gamétocytes à H5 post-traitement est

atteint avec la dose de 5mg/kg.

On peut dire que les deux antipaludiques, ferroquine et artésunate, ainsi que leur

association, ont des effets stimulant sur la production de gamétocytes dans les premières heures

post-traitement.

L’index de gamétocytogénèse

L’index de gamétocytogénèse est le rapport de la gamétocytémie sur la parasitémie.

Plusieurs études cliniques sur des patients infectés avec P. falciparum ont étudié les

antipaludiques qui induisent une augmentation de la gamétocytogénèse (Buckling et al., 1997),

mais pour des raisons éthiques, il est difficile de prolonger les activités comparées

d’antipaludiques prescrits chez l'homme, et dans ces études, les antipaludiques ont été utilisés à

doses curatives qui bloquaient très rapidement la gamétocytogénèse. Dans notre étude

expérimentale, nous avons utilisé des doses subcuratives pour nous permettre de mieux suivre les

antipaludiques et leurs effets sur la gamétocytogénèse et les gamétocytes circulants.

Quantitativement, l’index de gamétocytogénèse a permis, dans le cas de prescription de

ferroquine ou d’artésunate, de noter une augmentation de 2 à 5 fois plus importante que dans le

cas des souris témoins non traitées (à H5, l’index de gamétocytogénèse de la ferroquine a atteint

cinq fois celui du témoin).

.

A la suite de l’analyse des différents protocoles où interviennent des molécules différentes

à des doses uniques ou multiples, on peut en déduire que deux antipaludiques, ferroquine,

136

artésunate et leur association, prescrite à doses subcuratives, ont un effet stimulant sur la

gamétocytogénèse. Price et al., (1996) ont montré l’action de l’artésunate sur la

gamétocytogénèse chez P. falciparum. Ces résultats corroborent le fait que toute forme de stress

envers le parasite, sans le supprimer, comme l’administration de doses subcuratives

d’antipaludiques (Taylor et Read, 1997), provoque une réaction du parasite qui se traduit par une

activation de sa gamétocytogénèse. La ferroquine est une molécule de chloroquine à laquelle un

noyau ferrocène a été ajouté. On peut comparer les actions de ces deux antipaludiques pour

déterminer si la présence du noyau ferrocénique renforce l’action de la molécule de chloroquine.

L’administration de chloroquine provoque une stimulation de la gamétocytogénèse chez les

souches résistantes de P. falciparum (Strickland et al., 1986) comme pour chez les souches

sensibles (Sokhna et al.,, 2001). Des résultats comparables ont également été obtenus chez P.

vinckei petteri (Gautret et al.,, 2001).

Buckling et al.,, (1997 et 1999) ont démontré, après avoir traité par la chloroquine, que la

gamétocytogénèse in vivo avait augmenté 5 fois plus que dans les cultures non traitées, et in

vitro, 2,5 fois plus que chez les témoins. La gamétocytogénèse obtenue avec la ferroquine était 5

fois (protocole II) et 3 fois (protocole III) plus importante que chez le témoin. En désaccord avec

nos résultats, Gautret et al.,, 2000 n’ont montré aucun effet sur la gamétocytogénèse dans le cas

de P. c. petteri, pendant les 3 jours suivant les traitements.

Nos résultats sur l'effet de l'artésunate sur la gamétocytogénèse sont différents de ceux de

Pukrittayakamee et al., 2004, qui indiquent que l'artésunate a un effet inhibiteur de la

gamétocytogénèse de P. falciparum en utilisant des doses subcuratives plusieurs fois par jour

(3,3 mg/kg le premier jour, puis 1,65 mg/kg pendant 6 jours). Leurs conditions expérimentales

« in vivo » et « in vitro » sont elles les mêmes que celles que nous avons suivies ?

�� Etude qualitative des effets des traitements

La morphologie des gamétocytes dans le sang circulant

Ces premiers résultats ne sont donnés qu’à titre indicatif, des expériences complémentaires

étant en cours, en particulier sur l’analyse en microscopie électronique des différentes formes de

gamétocytes à différents temps post thérapeutiques.

Dans nos lots traités avec la ferroquine et l’artésunate, on a remarqué que le pourcentage

de gamétocytes altérés a globalement augmenté dans les premières heures post-traitement

comparé aux pourcentages très faibles de gamétocytes altérés dans les lots témoins. Il existe

137

cependant une altération des gamétocytes même chez les témoins non traités. Landau et al., 1979

ont indiqué qu’une parasitémie très élevée altérait les gamétocytes quel que soit leur stade et

diminuait leur pouvoir infestant pour le moustique. Dans nos protocoles, la parasitémie ne

dépasse pas 3% et ce facteur ne parait pas influer. Smalley 1977, a remarqué in vitro que le

pourcentage de gamétocytes altérés de P. falciparum était important lorsqu’ils sont exposés à la

chloroquine dans les deux jours suivant le traitement. Kombila et al., 1997, a observé in vivo que

tous les stades de P. falciparum (trophozoïtes, schizontes et gamétocytes) sont altérés dans les 20

heures suivant un traitement par l’artéméther, dérivé de l’artémisinine.

L’infectivité des gamétocytes chez le moustique

L’étude qui aurait pu être poussée jusqu’au décompte des sporozoïtes dans les glandes

salivaires des moustiques gorgés s’est contentée, pour des raisons techniques, d’une première

approche posant comme préambule que le décompte des oocystes sur les feuillets externes de

l’estomac des moustiques est considéré comme parallèle à la concentration définitive des

sporozoïtes dans les glandes salivaires et que leur infectivité est conservée.

Pour l'estimation de l’infectivité des gamétocytes chez les moustiques, nous remarquons

que pour toutes les expériences, le nombre d’oocystes par moustique diminue dès H1h30 après le

traitement à la ferroquine et à l’artésunate et que cet effet se prolonge également cinq heures plus

tard. Cette baisse en nombre d’oocystes a démontré que les deux antipaludiques et leur

association, quelle que soit la dose, avaient diminué l’infectivité des gamétocytes pour le

moustique. Dans le même temps, nous remarquons que le nombre absolu de gamétocytes chez

ces souris a diminué dans quelques expériences et a augmenté dans d’autres, sans pour autant

que l’on puisse corréler les deux paramètres : gamétocytes circulants et infectivité. La variation

du nombre de gamétocytes ne peut pas être directement liée à une variation parallèle de

l’infectivité. L’infectivité n’est pas systématiquement et uniquement liée à la quantité de

gamétocytes circulants. Il serait intéressant de connaître la quantité et la biodisponibilité des

gamétocytes pompés par le moustique au niveau des capillaires superficiels, et en particulier de

préciser plus exactement les stades de développement des gamétocytes atteints par les

thérapeutiques et leur rapport avec leur infectivité et leur rôle dans la transmission. Des études

ont noté que le maximum d’infectivité des gamétocytes de P. gallinaceum chez le moustique

Aêdes aegypti ne coïncide pas toujours avec le maximum de production de gamétocytes

(Lumsden et Bertram, 1940 ; Cantrell et Jordan, 1946).

Nos résultats ont montré une réduction de l'infectivité, quels que soit le médicament et la

dose. Des résultats comparables ont été observés, in vitro chez P. falciparum par Chotivanich et

138

al., 2006, qui ont noté que l'artésunate a un puissant effet sur l'infectivité des gamétocytes dans

A. dirus, l’artésunate à faible concentration (1,5 mg/ml) a inhibé environ 90% de l'infectivité.

In vivo, l'artésunate à la dose totale de 100 mg en 6 jours inhibe l'infectivité des gamétocytes de

P falciparum (Chen et al., 2008).

Chen et al., (1994) et Price et al., (1996) ont indiqué que les dérivés de l'artémisinine

peuvent réellement influencer l'infectivité des gamétocytes de P. falciparum ; ils ont trouvé que

les dérivés de l'artémisinine sont plus efficaces que la méfloquine pour bloquer la transmission

du paludisme à P. falciparum. Puri et Dutta (2005) ont constaté une réduction drastique de

l'infectivité des gamétocytes de P. cynomolgi chez des singes rhésus, en terme de

développement des oocystes en post-traitement avec l’elubaquine à doses subcuratives : 0,63,

1,25, 1,87, 2,5 mg / kg. L'inhibition complète a été obtenue avec des doses de 3,75 à 5 mg / kg.

À H5 post-traitement, les gamétocytes matures perdent leur infectivité pour les moustiques.

La réduction de l'infectivité des gamétocytes de P. c. petteri est obtenue à H1 et H12 post-

traitement par la chloroquine (5 mg/kg), avec une baisse de 40% (41%) et 60% (61%)

respectivement, alors qu'il n'y avait pas d'effet significatif sur la transmission post-traitement par

la chloroquine à H12 après une prescription de 1 mg / kg (Gautret et al., 2000). Des résultats

comparables ont été observés par Klein et al., (1991), qui ont noté une inhibition temporaire de

la transmission de gamétocytes de P. vivax par Anopheles darlingi à H4 post-traitement avec 600

mg de chloroquine/kg. Gautret et al., (2000) sur P.vinckei petteri et P. chabaudi, et Bulking et

al., (1997) n’ont observé aucun effet de la chloroquine sur l’infectivité chez le moustique, alors

que Ichimori et al., (1990) sur P. yoelii nigeriensis et Gautret et al., (2001) sur

P. chabaudi,montrent une augmentation de l'infectivité des gamétocytes pour les moustiques

après traitement par la chloroquine.

Nos résultats montrent que les doses subcuratives de ferroquine et d'artésunate et leur

association ont un effet inhibiteur sur l'infectivité des gamétocytes de P. yoelii yoelii à H1h30 et

H5 post-traitement (la réduction de l'infectivité à H1h30 est de 60-70% et de 70-80% à H5 post-

traitement avec une dose de ferroquine de 5 mg/kg. Cette réduction de l’infectivité est d'environ

70% à H1h30, 90% à H5 post-traitement si la ferroquine est prescrite à raison de 10mg/kg. Pour

l’artésunate, le nombre d'oocystes est réduit d'environ 80% à H1h30 et 90% à H5 post-traitement

à la dose de 5 mg/kg. À la dose de 10 mg/kg d’artésunate, la réduction est d’environ 80% à

H1h30 et 100% à H5 post traitement. Nos résultats sont en accord avec ceux d’autres travaux

(Chotivanich et al., 2006;. Puri et Dutta, 2005).

139

Conclusions et perspectives

140

I. Le stade parasitaire hépatique

La MALARONE® (atovaquone + proguanil) présente une efficacité totale sur le stade

hépatique, alors que l’efficacité de la primaquine à la dose 20mg/kg semble partielle.

L’efficacité de l’amodiaquine, de l’artésunate, de la ferroquine et de leur association est nulle

ou plus modeste.

L’utilisation de la technique de PCR quantitative en temps réel ne se limite pas au

secteur de la recherche : elle est également transposable à la médecine humaine (Rougemont

et al, 2004). Cette technique permet une détection plus spécifique et plus sensible des

plasmodies humaines. L’application de cette technique sur les patients sous traitement

antipaludique semble intéressante

Une etude a trouvé que la techniqe de l’amplification en temps basée sur la séquence

d’acides nucléiques QT-NASBA, est plus performante que la PCR quantitive en temps réel

sur la détection de P. falciparum (Schneider et al., 2005).

II. Le stade parasitaire sexué

Dans notre étude, on a pu interrompre le cycle parasitaire en utilisant des doses

subcuratives de ferroquine et d’artésunate ; on a pu noter un effet notable sur la

gamétocytogénèse et la morphologie des gamétocytes (altération), et sur l’infectivité des

gamétocytes chez le moustique.

On en conclut :

1- la production d’un grand nombre de gamétocytes sous la pression des antipaludiques

2- l’apparition d’altérations morphologues sur les gamétocytes

3- l’augmentation du pourcentage des gamétocytes altérés

4- la diminution de l’infectivité des gamétocytes pour le moustique

141

.

Marfurt et ses collaborateurs 2011 ont montrè que l'activité puissante de ferroquine contre des

isolats résistants à la fois de P. falciparum et P. vivax, met en évidence un rôle prometteur pour

la ferroquine comme un antipaludique plomb contre CQ-résistance de Plasmodium et un

médicament partenaire utile pour la thérapie à base d'artémisinine.

� L’application de la technique de PCR quantitative en temps réel sur les stades hépatiques

semble intéressante.

� Sa comparaison à une nouvelle technique QT-NASBA, est souhaitable

(Schneider et al., 2005).

� Une étude colorimétrique et morphologique sur différents stades des gamétocytes serait

intéressante à poursuivre

� Il serait intéressant de différencier l’action des thérapeutiques sur les différents stades des

gamétocytes afin de définir précisément la cible de la ferroquine et de l’artésunate.

� Une étude comparant l’effet de la ferroquine et de l’artésunate sur la gamétocytogénèse et

sur l’infectivité des gamétocytes à des doses différentes, avec des souches résistantes

et/ou sensibles et sur de plus longues périodes, serait utile pour compléter nos recherches.

�� Une relation entre les modes d’actions connus de la ferroquine et de l’artésunate sur les

formes asexuées serait à rapprocher des altérations observées sur les gamétocytes

142

Bibliographie

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155

Annexes

156

Annexe 1 Technique de coloration des lames

FFrr oott tt iiss ssaanngguuiinn ddee ssoouurr iiss

Technique : le manipulateur attrape tout d’abord la souris par la queue, il fait remonter par

frottement le sang au bout de celle-ci puis, coupe l’extrémité de la queue avec des ciseaux. La

première goutte de sang sortant de la queue est éliminée afin de pouvoir déposer la deuxième

goutte sur une lame. Avec le biseau d’une autre lame, la goutte est étirée pour qu’il y ait du sang

sur toute la lame. Enfin, le frottis est séché en agitant la lame.

CCoolloorr aatt iioonn aauu GGiieemmssaa

Technique : On fixe les frottis au méthanol pendant 5 minutes, puis, une fois sèches, on dépose

les lames dans une cuve contenant une solution de Giemsa 10% diluée avec du tampon

phosphate. Après 45 minutes, on vide la cuve, on récupère les lames que l’on rince sous l’eau

distillée et on les laisse sécher à l’air libre.

Composition du Giemsa 10% dilué pour un volume de 100mL :

• 10mL de Giemsa

• 9mL de Tampon phosphate

• 81mL d’eau distillée

Figure 46. Frottis sanguin de souris après coloration au Giemsa

157

PPrr ééppaarr aatt iioonn ddee ll ’’ aanneesstthhééssiiqquuee

Préparation pour 4mL :

• 2 mL de Kétamine (Imalgène®, Merial, Lyon, France)

• 0,5 mL de Xylazine (Rompun® 2%, Bayer santé, Puteaux, France)

• 1,5 mL de sérum physiologique

EEvvaalluuaatt iioonn ddee llaa ppaarr aassii ttéémmiiee

Technique : la lame est installée sur le portoir du microscope, avec une goutte d’huile à

immersion et l’objectif 100 est réglé. Le champ observé dans l’oculaire est divisé en quatre

quart. Sur un quart, toutes les hématies parasitées et saines sont dénombrées. La somme obtenue

est multiplié par 4 afin de connaître le nombre d’hématies par champ. Cette opération est répétée

sur d’autres champs de la même lame, puis pour estimer la parasitémie, il suffit de diviser la

somme des hématies parasitées par la somme totale d’hématies. Les valeurs obtenues sont

traduites ensuite en pourcentage.

158

Résumé

Les objectifs de ce travail étaient d’évaluer qualitativement et quantitativement l’effet d’antipaludiques

« classiques » (primaquine, Malarone®, amino-4-quinoléines) et « d’avenir» (artésunate, ferroquine,

seuls ou associés) sur les formes hépatiques et les stades sexués du parasite responsable de la

transmission du paludisme. Le modèle expérimental comprend des souris swiss femelle infestées par

Plasmodium yœlii et Anopheles stephensi comme moustique vecteur. L’action de la Malarone®

(proguanil-atovaquuone) sur les stades hépatiques est quasi totale et plus importante que celle,

incomplète, de la primaquine, de la ferroquine ou de l’artésunate. Si les molécules précédentes

(ferroquine, artésunate), prescrites à doses subcuratives, entraînent souvent une augmentation de la

gamétocytogénèse, elles altèrent certains stades de gamétocytes et inhibent statistiquement chez le

moustique la formation d’oocystes et leur nombre et, par là même, interviennent négativement dans la

transmission du parasite.

Mots clés : paludisme, stade intra-hépatique, antipaludiques, gamétocytogénèse, transmission

Résumé en anglais

The objective of this study is to evaluate qualitatively and quantitatively the effect of "classic"

(primaquine, Malarone®, amino-4-quinoline) and "future" (artesunate, ferroquine, alone or associated)

antimalarials on the liver forms and sexual stages of the parasite responsible for malaria transmission.

The experimental model was: swiss mouse female infected with Plasmodium yoelii and Anopheles

stephensi as the vector. The action of Malarone® (proguanil-atovaquuone) on liver stages is almost

complete and more than that, incomplete, primaquine, the ferroquine or artesunate. If the previous

molecules (ferroquine, artesunate), prescribed at subcurative doses, often lead to an increase in

gametocytogenesis, they alter certain stages of gametocytes and statistically inhibit the formation of

oocysts in the mosquito; hence, their number involve negatively in the transmission of the parasite.

Key words: malaria, intra-hepatic stage, antimalarial, gametocytogenesis, transmission

Kamla MUSTFA EFFETS DES ANTIPALUDIQUES SUR LES STADES HEPATIQUES

ET LES STADES SEXUES (TRANSMISSION) D’UNE

PLASMODIE MURINE PLASMODIUM YOELII

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ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté