CLASSIFICAÇÃO OOCITÁRIA e EMBRIONÁRIA · CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA A transferência de embriões de melhor prognóstico e de elevado potencial para implantação pode ser considerado

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CLASSIFICAÇÃOCLASSIFICAÇÃO

OOCITÁRIA eOOCITÁRIA e

EMBRIONÁRIAEMBRIONÁRIA

Ms. Rita Figueira

Fertility

CHECAGEM DO LÍQUIDO FOLICULAR E CHECAGEM DO LÍQUIDO FOLICULAR E IDENTIFICAÇÃO DOS OÓCITOSIDENTIFICAÇÃO DOS OÓCITOS

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CLASSIFICAÇÃO DO COMPLEXO CÚMULUS CLASSIFICAÇÃO DO COMPLEXO CÚMULUS -- CORONACORONA

Grau I e II: Características: células do cumulus densas e fortemente aderidas.

Grau de maturação: Prófase I (PI) e Metáfase I (MI)


Grau III: Características: células expandidas e frouxamente aderidas.

Grau de maturação: Metáfase II (MII)

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Grau IV: Características: células muito expandidas e frouxas.

Grau de maturação: Hipermaduro

DENUDAÇÃO OOCITÁRIADENUDAÇÃO OOCITÁRIA

Concepção naturalFertilização in vitro (FIV)

Injeção intracitoplasmática de sptz (ICSI)

Etapa enzimáticaEtapa mecânica

ICSI ICSI –– INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICAINJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA

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GRAU DE MATURAÇÃO NUCLEARGRAU DE MATURAÇÃO NUCLEAR

ICSI ICSI –– INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICAINJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA

�PI (Prófase I, Meiose I)

�MI (Metáfase I, Meiose I)

�MII (Metáfase II, Meiose II)

MORFOLOGIA OOCITÁRIA

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OócitoOócito maduro humanomaduro humano

Zona pelúcida

Oolema

Ooplasma

Espaço Perivitelínico

Mitocôndrias

Retículo endoplasmático

Complexo de Golgi

(glicoproteínas)

INTRACITOPLASMÁTICASEXTRACITOPLASMÁTICAS

� FORMA

� CORPÚSCULO POLAR

� ZONA PELÚCIDA

� ESPAÇO PERIVITELINO

� PRESENÇA DE VACÚOLOS

� OOPLASMA GRANULAR

� AGREGADOS DE RETÍCULO

ENDOPLASMÁTICO

� CORPOS REFRÁTEIS

ALTERAÇÕES DA MORFOLOGIA OOCITÁRIA

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MORFOLOGIA OOCITÁRIA – ALTERAÇÕES CITOPLASMÁTICAS

GRANULOSIDADE CITOPLASMÁTICA

VACÚOLOS

CLUSTER RER

MORFOLOGIA OOCITÁRIA – ALTERAÇÕES EXTRACITOPLASMÁTICAS

CORPÚSCULO FRAGMENTADO

FORMA

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MORFOLOGIA OOCITÁRIA – ALTERAÇÕES EXTRACITOPLASMÁTICAS

DEBRIS NO EP

EP AUMENTADO

ZP ESPESSA

CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA

A transferência de embriões de melhor prognóstico e de elevado potencial para implantação pode ser considerado um dos mais importantes aspectos da

reprodução humana assistida.

Apesar dos avanços tecnológicos significativos da área, a seleção dos embriões de melhor qualidade continua sendo predominantemente baseada em

parâmetros morfológicos.

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�Parâmetros morfológicos

�Morfologia pronuclear� blastocisto

�Estudos priorizam aspectos avaliados antes da

transferência (dia+3 ou dia+5)

�Avaliação individual ou coletiva dos critérios disponíveis

� valor preditivo de viabilidade embrionária

CRITÉRIOS MORFOLÓGICOS

-Morfologia pronuclear

-Divisão embrionária precoce

-No de células e ritmo de clivagem nos dias +2 e +3

-Tipo e grau de fragmentação

-Simetria entre os blastômeros

-Presença de multinucleação

-Espessura da zona pelúcida

-Grau de compactação

-Grau de expansão da blastocele / organização MCI e TRF


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CHECAGEM DA FERTILIZAÇÃO

FERTILIZAÇÃO

PAPEL DO ESPERMATOZÓIDE

�Genoma paterno haplóide�Sinal pra início da ativação metabólica do oócito�Centríolo – organização dos microtúbulos – fusos mitóticos

INTERAÇÃO OÓCITO - ESPERMATOZÓIDE

�Capacitação(Alterações na MP, aumento de mensageiros intracelulares,fosforilação de proteínas)�Reconhecimento e ligação a ZP (proteína ZP3 e outras proteínassob investigação + proteína de ligação na MP do sptz, receptor aindanão definido)�Reação acrossômica e incorporação do sptz ao oócito

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FERTILIZAÇÃO

FERTILIZAÇÃO

ATIVAÇÃO OOCITÁRIA

Início e manutenção da resposta oocitária – TEORIAS

�Fusão – liberação de componentes liberadores de Ca+2�Receptor – cascata de transdução de sinal – MP do oócito�Bomba de cálcio – estoque no sptz ou canais de cálcio na MP dosptz

FORMAÇÃO E INTERAÇÃODOS PRONÚCLEOS

�Envoltório nuclear�Centrossomo�Microtúbulos�Outras interações protéicas

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1- Spindle meiótico com cromátides2- 1º corpúsculo polar5- Membrana celular do sptz6- Cauda sptz7- Núcleo compactado do sptz8- Centrossomo proximal do sptz

2 horas após fertilização1-1º corpúsculo polar2- Núcleo do sptz (Desempacotamento da cromatina)3- Centrossomo proximal do sptz4- 2º corpúsculo polar em formação5- Remanescente do spindle meiótico

FORMAÇÃO DOS PRONÚCLEOS

1- PN paterno2- PN materno3- Centrossomo - espermatozóide4- Corpúsculos polares


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6 horas após fertilização1- PN paterno2- PN materno3- Centrossomo paterno4- NPB5- Microtúbulos astrais maternos

18 horas após fertilização1- PN paterno2- PN materno3- Centrossomo paterno duplicado4- NPB

16 – 20 horas


FALHA DE FERTILIZAÇÃO

PAPEL DO OÓCITO

�55% relacionada a falha no processo de penetração do sptz�ICSI - 40% relacionado a falha na ativação oocitária�Falha da cascata do sistema responsivo oocitário�Falha na liberação de Ca+2

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Efeito paterno precoce – deficiência citoplasmática

�Alteração morfológica em zigotos e embriões em estágio inicial dodesenvolvimento�Não correlacionado com fragmentação de DNA no sptz�Disfunções relacionadas a ativação oocitária e aparato centrossomo-citoesqueleto

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Efeito paterno tardio – deficiência nuclear

�Comprometimento do potencial de desenvolvimento embrionárioresultando em falha de implantação�Não correlaciona com presença de alterações morfológicas de zigotos eembriões nos estágios iniciais de desenvolvimento�Disfunções relacionadas a estrutura da cromatina espermática


OUTROS FATORES:

Presença de estruturas do espermatozóide

�Acrossoma intacto e teca peri-nuclear

�Atraso no descondensamento da cromatina

Conteúdo hidrolítico acrossomal

�Sensibilidade oocitária - dano

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PAPEL DA CAUDA NA FERTILIZAÇÃO

�Experimental – ainda não elucidado

�Injeção de segmentos de espermatozóides (cabeça e cauda)

-Ativação oocitária OK

-Identificação da formação de 2PN

-Divisão mitótica anormal

-Alto índice de mosaicismo

Integridade estrutural do sptz contribui para embriogênese normal


Zygote. 1999 May;7(2):157-63.The role of structural integrity of the fertilising spermatozoon in early human embryogenesis.Colombero LT, Moomjy M, Sills ES, Rosenwaks Z, Palermo GD.

�Papel da cauda e da integridade do sptz no desenvolvimento embrionário

�Injeção de segmentos de espermatozóides

Cabeça (N=73), 67% - 2PN e 92% mosaico

Cauda (N=11), 18% - 2PN (único CP) e 100% mosaico

Cabeça + Cauda (N=26), 46% - 2PN e 91% mosaico

Integridade estrutural do sptz contribui para embriogênese normal

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Mol Hum Reprod. 1999 Sep;5(9):836-44.Sperm integrity is critical for normal mitotic divi sion and early embryonic development.Moomjy M, Colombero LT, Veeck LL, Rosenwaks Z, Palermo GD.

�Integridade do sptz e papel do centrossomo

-Formação de 2PN – OK

-Divisão mitótica anormal

-Ausência de fuso

-Mosaicismo

Integridade estrutural do sptz é essencial para o funcionamento correto do aparato mitótico

Somente 1 pronúcleo

� Ativação artificial do oócito (efeitos bioquímicos, mecânico)

� Falha do desenvolvimento do PN paterno ou materno

� Desenvolvimento de envelope nuclear ao redor do 2º grupo de cromossomos em metáfase no oócito

� Pronúcleo haplóide de origem materna: tamanho aumentado

FERTILIZAÇÃO ANORMAL

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Poliploidia

� Falha no bloqueio da polispermia (falha na exositose granular pós inseminação, defeitos na zona pelúcida) (66.4%)

Falha de divisão meiótico paterna e/ou materna resultando em:

� Penetração de espermatozóide binucleado (23.6%)

� Penetração em um oócito binucleado (10%)

FERTILIZAÇÃO ANORMAL

Mechanisms giving rise to triploid zygotes during assisted reproduction

Bernd E. Rosenbusch, Ph.D.

Department of Gynecology and

Obstetrics, University of Ulm, Ulm, Germany

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Mechanisms giving rise to triploid zygotes during assisted reproduction

Bernd E. Rosenbusch, Ph.D.

Department of Gynecology and

Obstetrics, University of Ulm, Ulm, Germany

DETECÇÃO DE 2PN NÃO GARANTE A PRESENÇÃO DE UM CONJUNTO

CROMOSSÔMICO DIPLÓIDE COMPOSTO PELO GENOMA MATERNO E PATERNO

MORFOLOGIA PRONUCLEAR

� Qualidade dos gametas

� Informações complementares para seleção embrionária nos estágiosiniciais da clivagem

� Correlação com aspectos do desenvolvimento embrionário

- Fragmentação- Parada de clivagem- Multinucleação- Constituição cromossômica- Potencial de implantação

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PRONÚCLEO

� Padrão de normalidade:- Semelhança de tamanho- Posição central em relação ao citoplasma- Pronúcleos feminino e masculino – justapostos

PRONÚCLEO

� Diferença de tamanho:- Parada de clivagem- Alterações cromossômicas � embriões aneuplóides

� Afastados:- Alterações cromossômicas � embriões aneuplóides

� Posição periférica:- Falha dos processos de fertilização (formação áster e microtúbulos)

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HALO CITOPLASMÁTICO

� Padrão diferencial de distribuição do citoplasma no zigoto� Dependente dos processos de fertilização� Rotação do citoplasma – ondas de cálcio� Área densa observada próxima aos pronúcleos – organelas e mitocôndrias (ATP)

HALO CITOPLASMÁTICO

� Halo citoplasmático não detectado

- Distribuição desigual de mitocôndrias nas células-filhas – depleção de ATP em alguns blastômeros

- Distribuição desigual de produtos gênicos nas células-filhas

- Ausência de rotação do pronúcleo paterno – alinhamento anormal da cromatina e/ou posicionamento inadequado dos centrossomos

- Ritmo de clivagem lento e aumento da taxa de fragmentação em embriões de dia +3 (ativação genoma)

- Diminuição das taxas de blastocisto

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CORPOS PRECURSORES DE NUCLÉOLOS

� Nucléolos:- Sítios nos quais os genes ribossomais são transcritos – síntese protéica- Formação: Regiões Organizadoras de Nucléolos (RON) – localização dos genes que codificam para os RNAs ribossomais

- Constituição: componente fibrilar denso, centro fibrilar e componente granular.

� Estágio pronuclear – apenas porção do centro fibrilar- Corpos precursores de nucléolos (CPN)


� Nucleogênese:- Crescimento, organização e fusão dos CPN- Dependente da atividade transcricional pronuclear e da presença de fatoresdo ooplasma relacionados a maturação oocitária

- Falta de sincronia – efeitos significativos no desenvolvimento embrionário

MARCADOR NÃO INVASIVO DE QUALIDADE

EMBRIONÁRIA

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CORPOS PRECURSORES DE NUCLÉOLOS MARCADOR NÃO INVASIVO DE QUALIDADE

EMBRIONÁRIA

� Estágio pronuclear inicial-Número elevado de CPN de tamanho relativamente pequeno, distribuídosrandomicamente em cada um dos pronucleos.

� Estágio pronuclear tardio- Pequeno número de CPN de tamanho relativamente maior, distribuiçãopolarizada sendo observado acúmulo próximo ao local de contato entre ospronúcleos.

� Assincronia

- Divisão celular anormal – proteínas de controle do ciclocelular

- Ritmo lento de clivagem

- Aumento de fragmentação

- Diminuição das taxas de blastocisto

- Menor potencial de implantação


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Parâmetros avaliados

� No de PN� No corpúsculo polar� Posicionamento e tamanho dos PN� No de nucléolos� Tamanho de nucléolos (inversamente proporcional ao no de CPN)

� Alinhamento dos nucléolos� Formação do halo citoplasmático� Presença de vacúolos

CHECAGEM DA FERTILIZAÇÃO

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Padrão Descrição

1 Diferença de número de CPN (>3) entre os pronucleos

2Pequeno número de CPN (<7) distribuídos randomicamente em

pelo menos um dos pronucleos

3Grande número de CPN (>7) polarizados em pelo menos um dos

pronucleos

4Número muito pequeno de CPN (<3) em pelo menos um dos

pronucleos

5Distribuição polarizada dos CPN em um dos pronucleos e

distribuição randômica no outro.

CLASSIFICAÇÃO DE PN, Tesarik 1999

0

1

2

3

4

5

Parâmetros avaliados� Sincronia da nucleogênese� Dissociação de diferentes eventos quenormalmente são conectados

Padrão de normalidade (padrão 0)� No maior que 7 de CPN de menortamanho distribuídos randomicamente

� No menor que 7 de CPN de maiortamanho polarizados

� Diferença de no de CPN entre os PNmenor que 3

� No de CPN em ambos os PN maior que 3

Velocidade da nucleogênese �� sem impacto

CLASSIFICAÇÃO DE PN, Scott 2000

Padrão Descrição

Z1 Igual número (3-7) e tamanho dos CPN polarizados

Z2 Igual número de CPN distribuídos randomicamente

Z3Diferença de número e tamanho dos CPN e/ou distribuição polarizada dos CPN em um dos pronucleos e distribuição

randômica no outro

Z4Pronucleos de tamanho diferente e/ou periféricos e/ou não

justapostos

Z1

Z3

Z4

Z2

Z3

Z4

Padrão de normalidade (padrão 0)� CPN polarizados em número de 3-7 de mesmo tamanho� Diferença de no de CPN entre os PN no máximo 1

Velocidade da nucleogênese �� impacto no desenvolvimento

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Zigoto1- Duplicação do DNA nos 2 pronúcleos2- Desestruturação das membranas dos pronúcleos3- Microtúbulos do spindle mitótico

Zigoto em divisão20 a 27 horas após fertilização

CLIVAGEM PRECOCE - PRIMEIRA CLIVAGEM

Divisões celulares embrionárias� Denominação: Clivagem� Ausência da fase S do ciclo celular� Distribuição assimétrica do conteúdo citoplasmático


� Intervalo de tempo� divergência entre os estudos

� Relatos iniciais � ausência de correlação com viabilidade

embrionária

� Shoukir et al., 1997

- Primeira indicação de que a primeira clivagem pudesse

predizer a competência embrionária

- Estabelecimento de intervalo crítico � período avaliado 25-

27 horas após ICSI

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� Shoukir et al., 1997

- Embriões com 2 células observados em 18,9% dos ciclos

- Taxa de gestação� aumento de 2x

- Taxa de implantação� aumento de 3x

- Aumento significativo das taxas de acordo com o número de

embriões com clivagem precoce obtidos por ciclo

- Taxa de gestação � aumento de 3x , detecção de dois ou

mais embriões com clivagem precoce

� Wharf et al., 2004Adição de outras categorias à avaliação da clivagem precoce

Parâmetros avaliados� Presença de PN� Singamia� No de células (2cel)Classificação� Embrião não clivado com PN ainda visíveis� Embrião não clivado com PN não visíveis� Embrião em estágio de 2 células


Relevante na determinação do potencial preditivo da clivagem precoce em ciclos nos quais embriões em

estágio de 2 células não foram detectados.

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CLIVAGEM PRECOCE

Wharf et al., 2004

CLIVAGEM PRECOCE

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Implicações:Aumento significativo do potencial de desenvolvimento embrionário

Alterações no intervalo de clivagem de embriões – razões?

� Exato momento da fertilização e grau de maturidade oocitária � parâmetrosprecisamente controlados em ciclos de ICSI

� Controle genético através de fatores oocitários desconhecidos

� Expressão gênica

� Anomalias cromossômicas

� Condições do ambiente de cultivo

� Competência dos gametas feminino e masculino � ondas transitórias de cálcio(número, freqüência, amplitude e duração)


CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA NOS DIAS CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA NOS DIAS

DOIS E TRÊS DO DESENVOLVIMENTODOIS E TRÊS DO DESENVOLVIMENTO

MSc. Rita FigueiraFertility

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DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO

NÚMERO DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM

Número de células:

�4 a 5 blastômeros em dia +2

�Pelo menos 7 blastômeros em dia +3

Ritmo de clivagem:

�Ritmo lento ou acelerado de clivagem

� Comprometimento significativo do desenvolvimento

embrionário

�Maior incidência de anomalias cromossômicas

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94%

85%

74%

73%

78%

50%


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Categoria No de células d+2A 4B 2 ou 5C 3 ou 6D 1 ou >6

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Categoria No de células d+2 No de células d+3A 4 7 - 8

2 ou 5 >74 >9

2, 3, 4 63 >7

>6 ** <5* aumento de 1 cel

B

C

D


�Parâmetro subestimado na classificação

embrionária

�Indicador clássico da capacidade de

desenvolvimento

�Associado a um aumento da incidência de

anomalias cromossômicas

�Afeta negativamente as taxas de sucesso

SIMETRIA DE BLASTÔMEROS

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�Distribuição desigual de proteínas, mRNA,

mitocôndrias e outras organelas

�Perda da polarização

�Distribuição desigual de material genético

Assimetria x Assincronia



-Simétrico (Si)

-Semelhante (Se)

-Assimétrico (As)

I Regulares: forma e tamanho semelhantes

II

Irregulares – forma ou tamanho

(volume dos blastômeros com diferença

31–50 %)

Presença de blastômeros dominantes

(volume de um dos blastômeros > 50%

superior ao dos demais)

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CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - SIMETRIA

No DE CÉLULAS SIMETRIA ESPERADA

1 CEL GDE2 CEL MENORES =




3

2

8

4

7

6

5

2 CEL =

8 CEL =

4 CEL =

ASSINCRONIA X ASSIMETRIA

CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - SIMETRIA

No DE CÉLULAS SIMETRIA ESPERADA








15

14

13

12

16

11

10

9

16 CEL =

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Estudo IVI Barcelona – 11117 embriões avaliados.

980 ciclos de receptoras e 580 ciclos com oócitos próprios.

Assimetria x Tx de implantação

Tx de implantação

Si 42.52

Se 42.79

As 29.09

BD 0.0 Estudo IVI Barcelona

Assimetria x Aneuploidia

% de embriões aneuplóides

<37a >38a

Si 47 72

Se 46 75

As 55 84

Implicações:

� Comprometimento significativo do desenvolvimento embrionário

�Maior incidência de anomalias cromossômicas

FRAGMENTAÇÃO

�Causas exatas ainda não foram estabelecidas

�Inata ou relacionada a fatores externos

�Fragmentos anucleados resultantes da clivagem

que serão posteriormente reabsorvidos

�Perda de blastômero por apoptose - controvérsias

�41% dos embriões cultivados in vitro

�Um dos mais significantes defeitos morfológicos

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A Ausente

B 1-10%

C 11-20%

D 21-35%

E > 35%

FRAGMENTAÇÃO - QUANTITATIVO

Classificação:

�Presente x Ausente

�Volume comprometido no embrião

�Tamanho e distribuição

TIPO DE FRAGMENTAÇÃO (Alikani et al., 1999)

Tipo I Volume mínimo, fragmentos associados a um blastômero

Tipo IIFragmentos localizados e predominantemente no espaço

perivitelínico

Tipo IIIFragmentos pequenos dispersos entre os blastômeros, no

espaço perivitelínico ou em ambos

Tipo IVFragmentos grandes semelhantes a blastômeros, distribuídos

randomicamente, associados a blastômeros desiguais

Tipo VFragmentos necróticos, granulosidade e contração

citoplasmática característica

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TIPO DE FRAGMENTAÇÃO (Alikani et al., 1999)

TIPO II:

Característica: localizada em uma parte da cavidade de

clivagem (não dispersa), está associada aos blastômeros,

possuindo tamanho e forma regulares. Origem: fragmentação

completa de uma ou mais células. Importância: NÃO AFETA O

POTENCIAL EMBRIONÁRIO (COMPACTAÇÃO).

TIPO III:

Característica: pequenas e dispersas por toda a cavidade de

clivagem, não variando muito seu tamanho e forma. Origem:

inicia-se durante a citocinese, a partir de pequenas vesículas

citoplasmáticas e aumentam de acordo com as sucessivas

divisões. Importância: NÃO AFETA O POTENCIAL

EMBRIONÁRIO, ESPECIALMENTE APÓS REMOÇÃO DE

FRAGMENTOS.

TIPO DE FRAGMENTAÇÃO

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TIPO IV:

Característica: possui tamanho igual ou próximo ao dos

blastômeros, sendo assim, é difícil sua diferenciação.

Origem: a partir da divisão celular desigual.

Importância: COMPROMETE O DESENVOLVIMENTO

MESMO COM A RETIRADA DE FRAGMENTOS

Tipo IITipo I

Tipo IV

Tipo III

Tipo V


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Independente da causa � queda significativa do

potencial de implantação

�Fragmentação tipo II e III � efeito dependente do

volume comprometido no embrião. Controvérsias �

10 a 20%

�Fragmentação tipo IV � efeito negativo

independente do volume comprometido no embrião

FRAGMENTAÇÃO

Implicações:

�Depleção significativa e desigual de organelas e/ou

proteínas regulatórias

�Mosaicismo – fragmentos cromossômicos

Considerações:

�Natureza não estática

�Reabsorção

�Lise

FRAGMENTAÇÃO

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DIA +2

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DIA +3

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