Chemia koloru cz.6

Luminescencja c.d.Prof. Daniel T. Gryko

Plan wykładu

• Chemoluminescencja

• Bioluminescencja

• Sondy fluorescencyjne – obrazowanie optyczne

• Białka fluorescencyjne (Green fluorescent proteins)

Podstawy zjawiska

LuminescencjaEmisja fotonów (w zakresie ultrafioletu, widzialnym

i podczerwonym) z elektronowych stanów wzbudzonych.

FotoluminescencjaPod wpływem światła

ElektroluminescencjaPod wpływem prądu elektrycznego

ChemiluminescencjaPod wpływem reakcji chem.

Podstawy zjawiska

ChemiluminescencjaEmisja fotonów z elektronowych stanów wzbudzonych

na które cząsteczka dostała się wskutek reakcji chemicznej

1838-1914

Co i jak?

NHNH

O

ONH2

OH-, H2O2

-N2 COO-

NH2

COO-

+hv (425 nm)

NN

O

NH2 O-OOHON

O

NH2 O

NH

O- COO-

NH2

COO- *

‘Lofina’

B. Radziszewski, Chem. Ber. 1885, 18, 355-358.

NH

N OH-, O2

+hv (530 nm)

*

O

O

CHO

+HOAc, NH4OAc

Ar

N

N

ArR

OHO

Ar

N

N

ArR

OO

Ar

N

N

ArR

OO N

NR

O

O

R

R

N

NR

O

O

R

R

Zastosowania chemiluminescencji

• Rozrywka (latawce, ‘świecące patyki’)

• Analiza gazów (np. NO 1ppb)

• Analiza związków organicznych

• Sekwencjonowanie DNA

• Detekcja biomolekuł

‘Sticks’

• American Cyanamide Company 1960

hv

O O

OO

ArAr+ H2O2 O O

O O

+ 2ArOH

OH

COONat-BuOH+

H2O2

Cl

2CO2+

Emiter

Emiter*

Wzmocniona chemiluminescencja

• Peroksydaza chrzanowa jest przyłączana do interesującej nas biocząsteczki

• Ten kompleks katalizuje przekształcenie chemiluminoforu w wzbudzony emiter, który dalej utleniany H2O2 przechodzi w stan trypletowy (C=O)

• Ten ostatni przechodząc w stan podstawowy emituje światło

Bioluminescencja

BioluminescencjaProdukcja i emisja światła przez żywy organizm.

Świetlik (Photinus pyralis) Common glowworm (Lampyris Noctiluca)

Co i dlaczego?

S

N

S

N

HO

COOH

S

N

S

N

HO

OO2 + ATP, lucyferaza + CO2

AMP

PP

hv (562 nm)

Grzyb (Panellus stipticus)

S

N

S

N

N

COOH

Me

J. Am. Chem. Soc. 2010,

Sondy fluorescencyjne

• Jedna z najważniejszych metod badania komórek

• Znakowanie (labelling)

• Możliwość wielokrotnego znakowania

Sondy fluorescencyjne - wymagania

• Selektywne wiązanie z pewnych typem komórek, organelli lub cząsteczek

• Brak toksyczności

• Wysoka

• Fotostabilność

• Pozostawanie w komórce…

• Kompatybilność ze źródłłem wzbudzenia

Sondy fluorescencyjne – potrójne znakowanie

• Niebieskie (Oregon green), zielone/żółte (Alexa 588), Cy5 (czerwone)

Przykładowe sondy fluorescencyjne

Białka fluorescencyjne

• Odkrycie w 1962 (Aequorea victoria)

• Nagroda Nobla w 2008

Roger TsienMartin ChalfieOsamu Shimomura

Białka fluorescencyjne

"Roger Y. Tsien - Nobel Lecture". Nobelprize.org. 30 Oct 2010 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/tsien-lecture.html"Osamu Shimomura - Nobel Lecture". Nobelprize.org. 30 Oct 2010 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/shimomura-lecture.html

GFP- jak to działa?

• Właściwości spektroskopowe to rezultat interakcji chromoforu z resztami aminokwasowymi ‘dookoła’

Dlaczego GFP

• Właściwości spektroskopowe mogą być zmieniane za pomocą technik biologii molekularnych

• Łatwo przyłączalne do innych białek

• Tylko tlen niezbędny

• Nieinwazyjne

• Wzbudzenie 450-650 nm

Modyfikacje genetyczne

GFP – modyfikacje genetyczne

GFP dziś

GFP – zachód słońca

GFP - zastosowania

• Sensory

• Wizualizacja związków biologicznie czynnych w komórkach

• Mikroskopia fluorescencyjna

• Polarność rozpuszczalnika

• Pomiary gęstości cieczy