UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE "IULIU HAŢIEGANU"

CLUJ – NAPOCA

REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT

CERCETĂRI PRIVIND OBȚINEREA, CARACTERIZAREA

ȘI EVALUAREA ACȚIUNII TERAPEUTICE A UNOR FORME

FARMACEUTICE TOPICE CU PRODUSE MELIFERE

Elaborat de: Drd. Adriana DĂRĂBAN

Conducător ştiinţific: Prof. Univ. Dr. Marius BOJIŢĂ

2015

CUPRINS

INTRODUCERE............................................................................................................ 13

STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII.................................................................... 15

1. Generalități despre propolis............................................................................ 17 1.1. Proprietăţi fizico-chimice ale propolisului...................................................................................... 18 1.2. Compoziţia propolisului........................................................................................................................... 19 1.3. Activitatea biologică a extractelor de propolis............................................................................... 21

1.3.1 Activitatea antibacteriană......................................................................................................... 21 1.3.2 Activitatea antivirală................................................................................................................... 22 1.3.3 Activitatea citostatică (antitumorală).................................................................................. 23 1.3.4 Activitatea antiprotozoarică.................................................................................................... 25 1.3.5 Activitatea antioxidantă............................................................................................................. 25 1.3.6 Alte aplicaţii farmacologice ale propolisului.................................................................... 25

1.4. Efectele fiziologice ale propolisului.................................................................................................... 25 1.4.1 Efectul propolisului asupra sângelui.................................................................................... 26 1.4.2 Efectul propolisului în afecţiuni hepatice.......................................................................... 26 1.4.3 Efectul propolisului asupra pancreasului endocrin....................................................... 26 1.4.4 Acţiunea antiinfecţioasă-antimicrobiană a propolisului............................................. 26 1.4.5 Acţiunea epitelizantă a propolisului..................................................................................... 27 1.4.6 Acţiunea antiedematoasă.......................................................................................................... 27 1.4.7 Acţiunea anestezică locală şi generală................................................................................. 28 1.4.8 Alte acţiuni ale propolisului: radioprotectoare, antiastmatică................................. 28

2. Generalități despre miere................................................................................. 29 2.1. Clasificarea mierii....................................................................................................................................... 30 2.2. Condiţii de calitate a mierii..................................................................................................................... 31 2.3. Compoziţia mierii........................................................................................................................................ 32 2.4. Efectele biologice ale mierii.................................................................................................................... 33

3. Folosirea produselor apicole ca materie primă pentru industria farmaceutică...............................................................................................................

39

3.1. Tipuri de produse pentru menținerea sănătății care conţin propolis.................................. 40 3.2. Tipuri de produse pentru menținerea sănătății care conţin miere....................................... 42

CONTRIBUŢIA PERSONALĂ................................................................................ 45

1. Ipoteza de lucru/obiective............................................................................ 47

2. Studiul 1 – Analiza fizico-chimică a propolisului................................... 49

Introducere ............................................................................................................. 49

Ipoteza de lucru..................................................................................................... 50

2a. Studiu fizico-chimic asupra unor probe de propolis din vestul României...................................................................................................................

51

2a.1. Material și metodă............................................................................................................................... 51 2.a.1.1 Extracţia propolisului......................................................................................................... 54 2.a.1.2 Determinarea proprietăţilor fizice................................................................................ 54 2.a.1.3 Determinarea conţinutului de zahăr............................................................................ 54 2.a.1.4 Determinarea elementală.................................................................................................. 54

2a.2. Rezultate și discuții.............................................................................................................................. 54 2a.3. Concluzii................................................................................................................................................... 64

2b. Studiu comparativ al polifenolilor din extractele de propolis de diferite origini........................................................................................................

65

2b.1. Material și metodă............................................................................................................................... 65 2b.2. Rezultate și discuții............................................................................................................................. 66 2b.3. Concluzii................................................................................................................................................... 74

3. Studiul 2 – Analiza fizico-chimică a mierii................................................ 75

3a. Analiza calităţii diferitelor sortimente de miere................................. 75 3a.1. Introducere............................................................................................................................................. 75 3a.2. Ipoteza de lucru..................................................................................................................................... 75 3a.3. Material și metodă............................................................................................................................... 75 3a.4. Rezultate și discuții............................................................................................................................. 76 3a.5. Concluzii................................................................................................................................................... 79

3b. Analiza metalelor din diferite sortimente de miere........................... 79 3b.1. Introducere............................................................................................................................................. 79 3b.2. Ipoteza de lucru.................................................................................................................................... 79 3b.3. Material și metodă............................................................................................................................... 77 3b.4. Rezultate și discuții............................................................................................................................. 80 3b.5. Concluzii................................................................................................................................................... 82

3c. Analiza zaharurilor din diferite sortimente de miere........................ 83 3c.1. Introducere.............................................................................................................................................. 83 3c.2. Ipoteza de lucru..................................................................................................................................... 83 3c.3. Material și metodă................................................................................................................................ 83 3c.4. Rezultate și discuții.............................................................................................................................. 84 3c.5. Concluzii................................................................................................................................................... 85

4. Studiul 3 – Studiul efectelor terapeutice a unor formulări conținând miere și propolis...............................................................................

87

4a. Capacitatea antioxidantă a extractelor de propolis............................ 87 4a.1. Introducere............................................................................................................................................. 87 4a.2. Ipoteza de lucru..................................................................................................................................... 88 4a.3. Material și metodă............................................................................................................................... 88 4a.4. Rezultate și discuții.............................................................................................................................. 90 4a.5. Concluzii................................................................................................................................................... 93

4b. Formularea cremelor cosmetice cu produse apicole......................... 93 4b.1. Introducere............................................................................................................................................. 93 4b.2. Ipoteza de lucru.................................................................................................................................... 94 4b.3. Material și metodă............................................................................................................................... 94 4b.4. Rezultate și discuții............................................................................................................................. 96 4b.5. Concluzii................................................................................................................................................... 99

4c. Hidrogeluri cu propolis................................................................................. 99 4c.1. Introducere.............................................................................................................................................. 99 4c.2. Ipoteza de lucru..................................................................................................................................... 100 4c.3. Material și metodă................................................................................................................................ 100 4c.4. Rezultate și discuții.............................................................................................................................. 103 4c.5. Concluzii................................................................................................................................................... 116

4d. Gel antiinflamator cu tinctură de propolis şi venin de albine......... 117 4d.1. Introducere............................................................................................................................................. 117 4d.2. Ipoteza de lucru.................................................................................................................................... 118 4d.3. Material și metodă............................................................................................................................... 118 4d.4. Rezultate și discuții............................................................................................................................. 120 4d.5. Concluzii................................................................................................................................................... 122

5. Concluzii generale (sinteză).......................................................................... 123

6. Originalitea și contribuțiile inovative ale tezei...................................... 125

REFERINȚE.............................................................................................................. 127

Cuvinte cheie: propolis, miere, antioxidanți, polifenoli, flavonoide, HPLC, CSS, spectrofotometrie

INTRODUCERE Apiterapia reprezintă folosirea în scop medicinal a produselor apicole (miere, venin, lăptișor de

matcă, propolis, ceară de albine). Această formă de terapie este la fel de veche ca medicina umană, fiind utilizată în Egiptul antic, Grecia și China. Există numeroase precizări, încă din timpuri străvechi, privind utilizarea mierii şi a produselor melifere, fie ca aliment, fie în scopuri medicale.

Prima civilizaţie care a utilizat apicultura este cea egipteană, probabil încă înainte de anul 5000 î.C., aşa cum o dovedesc desenele rupestre care înfăţişează utilizarea fumului pentru calmarea albinelor. În Europa timp de secole mierea a fost considerată îndulcitorul ideal, fiind utilizată pentru mult timp de civilizaţiile antice în special ca aliment şi mai puţin ca remediu medical. Hipocrate, considerat "Părintele Medicinei", a folosit produsele apicole pentru tratarea artritei. În aria de răspândire a Apis mellifera, propolisul a căpătat o multitudine de utilizări tradiţionale.

STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

1. Generalităţi despre propolis

Cuvântul propolis provine din limba greacă semnificând în apărarea oraşului (sau a stupului), este un produs răşinos produs de albine (Apis mellifer L.), care apare sub diferite forme fizice. Culoarea poate varia de la ocru la roşu, brun, brun deschis sau verde, de consistenţă solidă cu aspect de gumă elastică. [1].

În compoziţia chimică a propolisului brut s-au determinat răşini, ceruri, ulei volatil, polen, glucide, aminoacizi, vitamine, enzime, săruri minerale şi impurităţi [2].

Propolisul produs de albina comună Apis melifera este caracterizat de o varietate de culori, respectiv de profilul lor palinologic. Originea florală şi compoziţia palinologică depinde într-o oarecare măsură de speciile vegetale prezente în arealul albinelor.

Propolisul este cunoscut ca unul dintre produsele naturale cu nenumărate acţiuni biologice şi efecte terapeutice cum ar fi: antimicrobiană, antibiotică, antifungică, antiinflamatoare, analgezică, antioxidantă şi antitumorală.

2. Generalităţi despre miere

Astăzi mierea este privită mai curând drept un aliment dulce şi dorit mai ales datorită faptului că este un produs natural de o savoare aparte. În comunităţile din antichitate era considerată mai degrabă un remediu medical pentru tratarea multor probleme de sănătate .

După provenineţă, mierea de albine se clasifică în: miere monofloră, polifloră şi miere de pădure. În funcţie de modul de prelucrare, mierea de albine se clasifică în [3]:

- miere în fagure; - miere obţinută prin presare; - miere obţinută prin centrifugare

Controlul calităţii mierii (în general al produselor apicole) este reglementat la nivel: - internaţional de către comisia F.A.O / O.M.S. – Codex Alimentarius Standard - regional (european) de către Comisia Uniunii Europene pentru Alimentaţie – Directivele C.E. - naţional de către Ministerul Agriculturii, Ministerul Sănătăţii şi A.C.A. România prin: I.C.D. Mierea conţine peste 200 de substanţe, incluzând glucide, apă, proteine, vitamine, minerale, enzime,

flavonoide, acizi fenolici, compuşi volatili şi altele. Pentru o perioadă foarte lungă de timp în istoria omenirii, mierea a reprezentat o sursă importantă

de carbohidrați și totodată, singurul îndulcitor disponibil până la apariția industriei zahărului după anul 1800. În tradiția omului, mierea a fost utilizată nu numai ca hrană, dar și ca medicament. În ultimii ani, o ramură alternativă a medicinii a luat amploare – Apiterapia, oferind tratamente bazate pe miere și alte produse împotriva multor boli.

CONTRIBUŢIA PERSONALĂ

Ipoteza de lucru

Cercetarea doctorală a plecat de la beneficiile produselor apicole, având ca rezultat studiul unor produse apicole, în scopul folosirii lor ca materii prime pentru industria farmaceutică și efectele terapeutice a unor formulări care conțin propolis și miere. Studiul s-a efectuat asupra unor probe de propolis și miere din vestul României, recoltate de la diverşi apicultori din judeţele Arad și Bihor.

Obiectivele cercetării 1. Analiza fizico-chimică a propolisului, respectiv a extractului etanolic de propolis prin

spectrofotometrie, cromatografie pe strat subțire și cromatografie lichidă de înalta performanță 2. Analiza fizico-chimică a mierii prin cromatografie pe strat subțire și spectrofotometrie de absorbție

atomică 3. Studiul efectului antioxidant al unor produse apicole 4. Studiul efectelor terapeutice a unor formulări conținând miere și propolis

Studiul 1 – Analiza fizico-chimică a propolisului

1.1. Studiu fizico-chimic asupra unor probe de propolis din vestul României[4]

Fig.1. Locurile de colectare a probelor de propolis studiate

Evaluarea valorilor pentru zaharuri, scoate în evidență faptul că, probele din Bata prezintă nivelul cel mai ridicat. Prezența acestora influențează acţiunea farmaceutică a propolisului. Probele de la Conop și Păuliș sunt cele mai bogate în azot, proteine și fosfor. Rezultatele relevă un conţinut destul de mare în metale, fără a depăşi însă normele naţionale și internaţionale, fapt care certifică, că propolisul provenit de la aceşti apicultori poate fi folosit în studii specifice de aplicare în compoziţii farmaceutice, cosmetice sau ca şi suplimente nutritive. Pentru probele din Bata, indicele de refracție și randamentul de extracție au valori mari. Conductivitatea susține valorile pH-ului acid, confirmând dependența compoziţiei de la locul de recoltare.

1.2. Studiu comparativ a polifenolilor din extractele de propolis de diferite origini[5]

Analiza cromatografică arată prezența mai multor polifenoli în proba de la Covăsânț, Dorgoș și Ștei precum și Livada Beiuș. Mai puțin concentrată în polifenoli este proba de la Lipova. Se pot observa multe similitudini precum și diferențe între probele studiate, atât din punct de vedere cantitativ, cât și calitativ. Similitudinile sunt cauzate probabil de colectarea polenului și a rășinii de la aceeași specie, iar diferențele sunt cauzate de speciile specifice zonei de recoltare a albinelor. În proba de la Dorgoș, se pot observa compuși specifici colorați în roșu care nu sunt prezenți în celelalte probe analizate.(fig.2)

Fig.2. Cromatograma în lumină vizibilă, după pulverizare cu reactiv anisaldehidă și acid fosfomolibdenic

Se poate observa prezența acidului cafeic în toate probele analizate, a acidului ferulic în probele din Conop, Arad, respectiv în toate celelalte trei probe din zona Bihor. Acidul galic a fost găsit doar în proba din Ștei. Dintre flavonoide, s-a identificat kampferol în probele de la Covăsânț, Dorgoș, Ștei și Beiuș, respectiv crizina în probele din Conop, Covăsânț și Ștei.

Se pot observa de asemenea câteva picuri (fig.3,4), care nu pot fi identificate datorită lipsei de etaloane, dar par să fie similare în câteva probe. Compușii s-au separat la: 1,7 min în toate probele, mai puțin în cea de la Beiuș; 7,6-7,8 min în toate probele; 10,2-10,9 min respectiv 22,2-23,4 min în toate probele mai puțin în cea de la Ștei; 39,5-41,0 min. Aceste similitudini pot fi datorate speciilor similare din zona de recoltare a albinelor. Compușii separați numai din anumite probe pot fi probabil corelaţi cu speciile specifice zonei de recoltare a albinelor.

Fig. 3. Cromatograma HPLC a probelor din județul Arad

Fig. 4. Cromatograma HPLC a probelor din județul Bihor

Dacă am compara rezultatele noastre, cu cele obținute la propolisul european, chinezesc și argentinian (2-4% crizină), se poate observa că proba din Conop (2,53%) are un conținut de crizină comparabil (1,95 mg/mL în extract 1:10 respectiv 1,95 % în propolis ca și materie primă). Concentrația de flavonoide totale din probele de la Covăsânț (4,28%) și Dorgoș (6,88%), este mai mare decât cea observată în extractul de propolis verde brazilian (4,3%), sau în extractul metanolic studiat de diferiți cercetători.

Chiar dacă România a fost una dintre primele țări care au promovat studiul propolisului, această lucrare este una din primele care raportează caracteristicile chimice și capacitatea antioxidantă a propolisului provenind din partea de vest a țării, și anume din județele Arad și Bihor. Acest studiu a evidențiat faptul că, propolisul din vestul României are un conținut ridicat de polifenoli, flavonoide și acizi fenolici. Rezultatele arată valori mai mari decât cele raportate, pentru propolisul care provine din China, Europa sau Brazilia. Aceste rezultate se pot constitui într-o recomandare a propolisul colectat din această parte a României, în vederea utilizării în industria alimentară, cosmetică și farmaceutică, ca și materie primă sigură și eficientă pentru preparatele farmaceutice, cosmetice sau suplimente alimentare.

Studiul 2 – Analiza fizico-chimică a mierii 2.1. Analiza calităţii diferitelor sortimente de miere

Probele de miere prelevate de la apicultori sunt de calitate superioarǎ, au aspect omogen, iar caracteristicile fizico-chimice se încadreazǎ în standardele prevǎzute de legislaţia în vigoare. În ceea ce priveşte mierea polifloră comercializatǎ de un agent industrial, este de calitate inferioarǎ, nu numai caracteristicile organoleptice sunt modificate ci şi parametrii fizico-chimici.

În urma analizelor efectuate, s-a constatat cǎ în probele de miere prelevate de la apicultori, nu sunt prezenţi agenţi de falsificare, în timp ce în mierea poliflorǎ comercializatǎ de agentul industrial, s-a constatat o cantitate mai mare de apǎ (peste limita maximǎ admisǎ de standardele în vigoare), prezenţa gelatinei şi a siropului de zahǎr.

2.2. Analiza unor metale din diferite sortimente de miere Aprecierea gradului de contaminare cu metale grele, ne permite să prevenim pericolul potenţial

pentru sănătatea consumatorilor. Există şi metale a căror prezenţă poate fi benefică sănătății. Mg/kg

00,5

11,5

22,5

33,5

4

1 2 3 4 5

Cu

Cd

Zn

Fe

Fig.5. Concentraţiile metalelor în probele de miere

Conform rezultatelor experimentale, observǎm o concentraţie crescutǎ peste limitele maxime admise în toate probele de miere analizate pentru zinc şi fier. Cele mai ridicate valori s-au înregistrat în probele de miere poliflorǎ comercializate pe piaţǎ de un agent industrial: 3,98 mg/kg pentru Zn şi 3,5 mg/kg pentru Fe. Valorile înregistrate pentru metalele grele, Cu și Cd, sunt sub limita maximă admisă.

Determinarea metalelor din miere, poate fi o bună metodă de evaluare a purității și a modului corect de recoltare și prelucrare a mierii. De asemenea, produsele apicole de calitate se obţin numai dacǎ se respectǎ normele cu privire la recoltarea, prelucrarea, ambalarea şi depozitarea acestora.

2.3. Analiza zaharurilor din diferite sortimente de miere

Determinarea zaharurilor din miere s-a realizat prin cromatografie pe strat subțire (fig.6). Analiza arată amprenta zaharurilor din probele studiate și pot fi evaluate diferențele sau similitudinile. Cromatogramele arată prezența abundentă a fructozei și glucozei în toate probele de miere. Cromatograma arată prezența zaharozei în proba de la Covăsânț, 1,2,5,6,7. Mai puțin concentrate sunt probele de la Lipova, polifloră, 3,4,8,10.

Fig.6. Cromatograma probelor de miere

Conținutul de fructoză și glucoză din miere variază de la un tip de miere la altul. Această proporționalitate între cele două zaharuri este factorul principal al cristalizării mierii și totodată cel care decide, dacă este o cristalizare rapidă sau lentă. Singura diferență este că zaharurile, în loc să fie sub formă de soluție, se prezintă sub forma de cristale. Zaharurile sunt principalele componente ce dau gustul mierii.

Studiul 3 – Studiul efectelor terapeutice ale unor formulări conținând

miere și propolis

3.1. Capacitatea antioxidantă a extractelor de propolis[6] Capacitatea antioxidantă a fost evaluată prin cinci metode spectrofotometrice diferite: DPPH, TEAC,

FRAP, CUPRAC și SNP. Rezultatele evaluării capacității antioxidante, ne arată că în județul Bihor probele de propolis au efect antioxidant mai puternic. Proba de la Dorgoş, cu conținutul cel mai mare în flavonoide și acizi fenolici are, de asemenea, o capacitate antioxidantă semnificativă.

Fig.7. Corelațiile dintre conținutul total de flavonoide și efectul antioxidant Metodele de evaluare chimico-spectrale a capacităţii antioxidante, pot fi folosite pentru o evaluare

mai completă din punct de vedere calitativ a propolisului. În această direcţie, acest studiu a evidențiat faptul că nu numai polifenolii sunt responsabili pentru efectul antioxidant. Utilizarea uneia dintre metodele DPPH și ABTS, respectiv FRAP și CUPRAC de evaluare a capacității antioxidante, ar putea fi de mare ajutor în evaluarea calității propolisului pe lângă evaluarea compozițională realizată prin cromatografie și metode spectrale.

3.2. Formularea cremelor cosmetice cu produse apicole

S-au realizat trei emulsii cosmetice pe bază de ceară de albine, tinctură de propolis, miere și lăptișor

de matcă. S-a urmărit calitatea preparatelor realizate pentru selectarea celor mai bune formule.

Tabel I. Compoziţia cremelor cosmetice cu produse apicole (g) Componente C I C II C III Alcool cetilic 2 1 1,5

Ceară 8 9 9 Lanolină 10 8 8 Parafină 10 7 7

Ulei de parafină 25 30 25 Lăptişor de matcă 1,5 1 2

Span 60 2 4 2 Tinctură de propolis 1,5 1,5 2

Miere de tei 2 - 2,5 Miere de salcâm - 2 -

Soluţie conservantă q.s. 100 q.s. 100 q.s. 100

Tabel II. Rolul componentelor în formularea cremelor cosmetice Componenta Rol

Alcool cetilic Emulgator primar A/U Ceară Stabilizator al emulsiilor Lanolină Emulgator primar A/U Parafină Emolient lipofil Ulei de parafină Emolient lipofil Lăptişor de matcă Regenerator celular Span 60 Emulgator primar A/U Tinctură de propolis Antimicrobian, cicatrizant Miere de tei şi salcâm Antiinflamator, Emolient hidrofil Soluţia conservantă Faza hidrofilă

Preparatele au prezentat un aspect estetic elegant, plăcut, o textură omogenă şi cremoasă, un pH apropiat de cel al pielii. Sunt emoliente fără să fie uleioase sau lipicioase. Cremele cosmetice au prezentat imediat după preparare valori extensiometrice mari, dovadă că preparatele au o consistenţă potrivită şi o mare capacitate de întindere, proprietăți ce se mențin în timp.

Studiile de stabilitate au evidenţiat o menţinere a aspectului omogen în intervalul de temperatură 2 – 40°C pentru toate cele trei formule, dovada că emulsiile sunt stabile la variaţii normale de temperatură.

Putem concluziona că, preparatele apicole pot fi utilizate în practica farmaceutică pentru efectul emolient şi nutritiv.

3.3. Hidrogeluri cu propolis

Au fost formulate o serie de hidrogeluri, având la bază tinctură de propolis în diverse concentraţii:

1%, 3%, 5% şi 7%. Tinctura de propolis s-a dispersat în gel de carbopol 1%, utilizat ca bază de încorporare a principiului activ.

Toate preparatele au prezentat un aspect omogen, translucid, iar caracteristicile organoleptice s-au menţinut constante şi după 10 zile de la preparare. Studiile preliminare efectuate au demonstrat că extractul etanolic de propolis, poate fi încorporat în baza hidrofilă, în concentraţii maxime de până la 7%. La concentraţii mai mari de 7%, hidrogelul obţinut are consistenţă scăzută şi devine opac, pierzând aspectul translucid.

pH-ul gelurilor s-a menţinut în intervalul 5,5 – 6, fiind compatibil cu pH-ul pielii. Toate formulele au prezentat o capacitate apropiată de cea a bazei utilizate. Preparatele se întind uşor pe piele şi lasă o senzaţie plăcută la aplicare.

Prin compoziţia chimică complexă pe care o prezintă tinctura de propolis, aceasta favorizează cicatrizarea plăgilor produse la nivelul tegumentelor. Gelul luat în studiu a fost bine tolerat de tegument şi a prezentat o acţiune cicatrizantă asupra leziunilor experimentale produse la şobolani, mai eficientă decât cea a unguentului Cicatrizin® luat ca referinţă.

În concluzie, s-a constatat că după 10 zile de tratament, preparatul de tip gel cu tinctură de propolis 5% a scăzut suprafaţa plăgilor cu 87%, producând vindecarea totală după 12 zile. La lotul tratat cu unguentul Cicatrizin®, suprafaţa plăgilor a scăzut cu 81,81% după 10 zile, 93,83% după 12 zile, iar vindecarea totală s-a produs după 13-14 zile de tratament. La lotul martor, vindecarea totală s-a produs după 15-16 zile, iar după 10 zile, suprafaţa plăgilor a scăzut cu 57,25%.

Prin testarea acţiunii antiinflamatoare a preparatelor luate în studiu, s-a constat că gelul cu tinctură de propolis 5% prezintă efect antiinflamator semnificativ, atât asupra edemului produs de suspensie de caolin 10%, precum şi asupra edemului produs de soluţia de dextran 6%. Aceasta se datorează compoziţiei complexe a tincturii de propolis. În cazul edemului produs cu suspensie de caolin 10%, efectul antiinflamator cel mai intens, s-a produs după 2 ore de la inducerea edemului pentru toate gelurile luate în studiu, precum şi pentru fenilbutazonă. În cazul edemului produs cu soluţie de dextran 6%, s-a remarcat efectul antiinflamator cel mai intens după 90 minute de la inducerea edemului, pentru gelul cu tinctură de propolis 5%, după 60 minute de la inducerea edemului, pentru gelul cu tinctură de propolis 3% şi după 30 minute pentru gelul cu fenilbutazonă.

3.4. Gel antiinflamator cu tinctură de propolis şi venin de albine[7]

S-a preparat un gel cu principii active naturale (tinctură de propolis, tinctură de ardei iute, ulei

volatil de pin şi venin de albine) destinat tratamentului afecţiunilor reumatismale şi inflamatorii de altă origine, cu acţiune antiinflamatoare, imunomodulatoare, antiseptică, calmantă şi revulsivă. Înainte de utilizarea gelului antiinflamator, pacienţii trebuie să-şi facă testul de toleranţă pentru a fi siguri că nu apare vreo reacţie alergică.

Caracteristicile gelului antiinflamator preparat: aspect omogen; culoare brun-roşcat; miros aromat-caracteristic; pH 5,5 – 6. Prin testarea acţiunii antiinflamatoare a gelului preparat, s-a constatat că acesta prezintă efecte antiinflamatoare semnificative, atât asupra edemului produs de suspensie de caolin 10%,

precum şi asupra edemului produs de soluţia de dextran 6%. Aceasta se datorează compoziţiei complexe a gelului.

Principalele avantaje ale gelului antiinflamator sunt următoarele: - Prin asocierea principiilor naturale se obţine o acţiune antimicrobiană şi antifungică eficientă

ceea ce conferă preparatului o stabilitate bună; - Un efect antiinflamator şi revulsiv semnificativ şi rapid; - Efect imunomodulator prin mecanisme nespecifice; - Are acţiune calmantă şi anestezică evidentă de la prima utilizare; - O îmbunătăţire a circulaţiei periferice (uleiul volatil de pin şi tinctura de ardei iute); - Asocierea unor produse apicole cu efect sinergic: tinctura de propolis şi veninul de albine.

4. Concluzii generale (sinteză) Studiile au evidențiat faptul că propolisul din vestul României are un conținut ridicat de polifenoli,

flavonoide (crizină și kampferol) și acizi fenolici (acid cafeic, acid ferulic), și o capacitate antioxidantă importantă. Rezultatele arată valori mai mari ca cele raportate pentru propolisul care provine din China, Europa sau Brazilia. Aceste rezultate recomandă ca propolisul colectat din această parte a României pentru utilizarea în industria alimentară, cosmetică și farmaceutică, ca și materie primă sigură și eficientă pentru preparatele farmaceutice, cosmetice sau suplimente alimentare.

Evaluarea capacităţii antioxidante a evidențiat faptul că, nu numai polifenolii sunt responsabili pentru acest efect antioxidant, iar utilizarea uneia dintre metodele DPPH și ABTS respectiv FRAP și CUPRAC de evaluare a capacității antioxidante, ar putea fi de mare ajutor în evaluarea calității propolisului pe lângă evaluarea compozițională realizată prin cromatografie și metode spectrale.

În urma investigaţiilor efectuate s-a constatat cǎ în probele de miere prelevate de la apicultori, nu sunt prezenţi agenţi de falsificare, în timp ce în mierea poliflorǎ comercializatǎ de un agentul industrial, a fost relevată o cantitate mai mare de apǎ (peste limita maximǎ admisǎ de standardele în vigoare), precum și prezenţa gelatinei şi a siropului de zahǎr. Prezenţa siropului de zahǎr este evidenţiatǎ de caracteristicile fizico-chimice: conţinut crescut de zaharozǎ, conţinut scǎzut de zahǎr invertit, indice diastazic mic, conţinut crescut de apǎ.

Rezultatele au evidenţiat un conţinut destul de mare în metale, fără a depăşi însă normele naţionale, respectiv internaţionale, fapt care certifică faptul că, propolisul provenind de la aceşti apicultori, poate fi folosit la studii specifice de aplicare în compoziţii farmaceutice, cosmetice sau ca şi suplimente nutritive.

Propolisul şi mierea studiate s-au folosit pentru formularea unor preparate cosmetice – creme şi geluri. Preparatele cosmetice cu produse apicole au prezentat un aspect estetic elegant, plăcut, o textură omogenă şi cremoasă, un pH apropiat de cel al pielii. Sunt emoliente fără să fie uleioase sau lipicioase. Cremele cosmetice au prezentat imediat după preparare valori extensiometrice mari, dovadă că preparatele au o consistenţă potrivită şi o mare capacitate de întindere.

Toate hidrogelurile cu propolis au prezentat un aspect omogen, translucid, iar caracteristicile organoleptice s-au menţinut constante şi după 10 zile de la preparare. Cu alte cuvinte, proprietăţile reologice ale gelurilor variază în funcţie de compoziţia acestora.

Acțiunea cicatrizantă, se remarcă în urma unui tratament de 10 zile cu unguentul cu gel cu tinctură de propolis 5% pe un lot de șobolani rasa Wistar. S-a constatat că suprafaţa plăgilor la nivelul tegumentului a scăzut cu 87% producând vindecarea totală după 12 zile. La lotul tratat cu unguentul Cicatrizin® suprafaţa plăgilor a scăzut cu 81,81% după 10 zile, 93,83% după 12 zile iar vindecarea totală s-a produs după 13-14 zile de tratament.

Prin testarea acţiunii antiinflamatoare a gelurilor luate în studiu s-a constat că gelul cu tinctură de propolis 5% prezintă efecte antiinflamatoare semnificative, atât asupra edemului produs de suspensia de caolin 10%, precum şi asupra edemului produs de soluţia de dextran 6%. Aceasta se datorează compoziţiei complexe a tincturii de propolis.

Arsurile tratate cu crema cu propolis, au avut un aspect mai puțin inflamat, decât cele tratate cu produse farmaceutice concepute pentru tratarea arsurilor, iar pacienții care ar utiliza această cremă naturală pentru piele, ar beneficia de o vindecare mai rapidă. Propolisul este de asemenea, mai puțin

costisitor și s-a constatat că are poteniţial alergenic relativ scăzut, astfel că ar fi mai puțin probabil să producă efecte secundare alergice.

Acţiunea gelului antiinflamator cu tinctură de propolis și venin de albine, este determinată în principal de principiile active care intră în compoziţia sa. Se poate utiliza în tratamentul afecţiunilor reumatismale şi inflamatorii de altă origine, precum şi pentru îmbunătăţirea circulaţiei periferice, datorită faptului că se obţine prin asocierea unor produse naturale, fiecare cu efecte cunoscute asupra organismului uman: tinctura de propolis, tinctura de ardei iute, ulei volatil de pin şi veninul de albine.

5. Originalitatea și contribuțiile inovative ale tezei Evaluarea sorturilor de produse apicole pentru uz farmaceutic din vestul României. Alegerea sorturilor cu rezultatele cele mai bune pentru a fi folosite în formule. Realizarea de formule și verificarea calității și eficacității. Demonstrarea eficacității produselor apicole în produsele de uz extern cu acțiune antiinflamatoare

și cicatrizantă. Sorturile din vestul României au calitate corespunzătoare pentru a fi folosite în formulări

farmaceutice. Lucrarea evaluează propolisul și mierea, principalele produse apicole alegând sorturile/probele

având compozițiile optime pentru formularea de produse de uz topic. Lucrarea prezintă realizarea și evaluarea calității și eficacității unor formule de uz extern,

demonstrând că folosirea unor materii prime apicole de calitate corespunzătoare, asigură eficiența produselor finite cu efect antiinflamator și cicatrizant.

Concluzia finală este că, flora județelor Arad și Bihor asigură albinelor posibilitatea de producere de propolis și miere de calitate superioară, aplicabile ca materii prime de uz farmaceutic.

Metodele analitice prezentate, pot fi folosite cu succes la evaluarea calității produselor apicole folosite ca materii prime de uz farmaceutic.

Lucrarea realizează evaluarea sorturilor apicole provenite din principalele centre apicole din județele Arad și Bihor, fiind printre primele lucrări care prezintă date comparative, pe un număr de probe statistic reprezentative, pentru a furniza o imagine cât mai completă a calității produselor apicole din această parte a României.

REFERINȚE SELECTIVE 1. Salatino A., É. Weinstein Teixeira, G. Negri and D. Message Origin and Chemical Variation of Brazilian

Propolis. eCAM (2005) 2:33- 38.

2. GHISALBERTI, E L Propolis: a review. Bee World (1978) 60:59 - 84

3. ***http://www.agir.ro

4. Dărăban A., Toma C.C., Neag T.A., Olah N.K., Dehelean Gh., Assay about heavy metals contamination in the perspective to use the propolis in agroturism domain, Studia Universitatis Vasile Goldiș, Seria Științe Inginerești și Agro-Turism2011; 6(2): 49-54. CNCSIS B+ (studiu cuprins în capitolul 2a)

5. Dărăban A., Olah N.K., Câmpean R.F., Furtuna F., Cobzac C., Dehelean Gh., Bojiță M., Hanganu D., Comparative study of polyphenols from propolis extracts of different origin, Studia UBB Chemia 2015; LX(2): 125-136. CNCSIS A / ISI

6. Dărăban A., Olah N. K., Câmpean R. F., Furtuna F., Hanganu D., Dehelean Gh., Bojiţă M., Atyim P., The evaluation of antioxidant capacity of propolis originating from West part of Romania, J Apicult. Sci (in press). ISI

7. Dărăban A., Mititelu M., Dehelean Gh., The antiinflammatory effects of a hydrogel formulation with bee

venom, Studia Universitatis Vasile Goldiș, Seria Științele Vieții 2013;23(4):451-455. CNCSIS B+

UNIVERSITY OF MEDICINE AND PHARMACY "IULIU HAŢIEGANU"

CLUJ- NAPOCA

THESIS ABSTARCT

RESEARCH REGARDING THE CHARACTERIZATION AND

EVALUATION OF THERAPEUTIC ACTION OF TOPICAL

PHARMACEUTICAL FORMS WITH HONEY PRODUCTS

Prepared by: Drd. Adriana DĂRĂBAN

Scientific adviser: Prof. Univ. Dr. Marius BOJIŢĂ

2015

SUMMARY

INTRODUCTION........................................................................................................... 13

ACTUAL STAGE OF KNOWLEDGE............................................................................ 15

1. Generalities about propolis................................................................................. 17 1.1. Physico-chemical properties of propolis......................................................................................... 18 1.2. The composition of propolis................................................................................................................... 19 1.3. The biological activity of propolis extracts...................................................................................... 21

1.3.1 The antibacterial activity......................................................................................................... 21 1.3.2 Antiviral activity......................................................................................................................... 22 1.3.3 Cytotoxic activity (antitumoral)........................................................................................... 23 1.3.4 Antiprotozoaric activity................................................................................................................ 25 1.3.5 The antioxidant activity............................................................................................................. 25 1.3.6 Another pharmacological applications of propolis....................................................... 25

1.4. Physiological effects of propolis.......................................................................................................... 25 1.4.1 Propolis effect of on blood....................................................................................................... 26 1.4.2 Propolis effect in liver diseases................................................................................................ 26 1.4.3 Propolis effect on the endocrine pancreas....................................................................... 26 1.4.4 The antibiotic, antimicrobial action of propolis.............................................................. 26 1.4.5 Epitelizant action of propolis................................................................................................... 27 1.4.6 Antiedematous action................................................................................................................ 27 1.4.7 Local and general anesthezic action.................................................................................... 28 1.4.8 Another actions of propolis: radioprotective, antiasthmatic................................. 28

2. Generalities about honey................................................................................. 29 2.1. Honey classification.................................................................................................................................... 30 2.2. Quality conditions of honey..................................................................................................................... 31 2.3. The composition of honey.......................................................................................................................... 32 2.4. The biological effects of honey................................................................................................................. 33

3. The use of bee products as raw material for pharmaceutical industry.......................................................................................................................

39

3.1. Types of products to maintain the health which contain propolis...................................... 40 3.2. Types of products to maintain the health which contain honey........................................... 42

PERSONAL CONTRIBUTION................................................................................ 45

1. The work hypothesis / objectives................................................................. 47

2. Study 1 - Physico-chemical analysis of propolis....................................... 49

Introduction ............................................................................................................. 49

The work hypothesis.............................................................................................. 50

2a. Physico-chemical study on propolis samples from western Romania...................................................................................................................

51

2a.1. Material and method............................................................................................................................ 51 2.a.1.1 Propolis extraction................................................................................................................. 54 2.a.1.2 Determination of physical properties............................................................................ 54 2.a.1.3 Sugar content.............................................................................................................................. 54 2.a.1.4 Elemental determination.................................................................................................. 54

2a.2. Results and discussion......................................................................................................................... 54 2a.3. Conclusions................................................................................................................................................ 64

2b. Comparative study of polyphenols from propolis extracts of different origins........................................................................................................

65

2b.1. Material and method............................................................................................................................... 65 2b.2. Results and discussion............................................................................................................................. 66 2b.3. Conclusions................................................................................................................................................... 74

3. Study 2 – Physico-chemical analysis of honey............................................. 75

3a. Quality analysis of different types of honey.......................................... 75 3a.1. Introduction............................................................................................................................................. 75 3a.2. The work hypotesis..................................................................................................................................... 75 3a.3. Material and method............................................................................................................................... 75 3a.4. Results and discussion............................................................................................................................. 76 3a.5. Conclusions................................................................................................................................................... 79

3b. Metals analysis of different types of honey.............................................. 79 3b.1. Introduction............................................................................................................................................. 79 3b.2. The work hypotesis.............................................................................................................................. 79 3b.3. Material and method............................................................................................................................ 77 3b.4. Rezults and discutions......................................................................................................................... 80 3b.5. Conclusions............................................................................................................................................... 82

3c. Sugar analysis of different types of honey............................................... 83 3c.1. Introduction.............................................................................................................................................. 83 3c.2. The work hypotesis................................................................................................................................ 83 3c.3. Material and method.............................................................................................................................. 83 3c.4. Rezults and discutions........................................................................................................................... 84 3c.5. Conclusions................................................................................................................................................... 85

4. Study 3 - The study of the therapeutic effects of some formulations containing honey and propolis...........................................................................

87

4a. Antioxidant capacity of propolis extracts................................................ 87 4a.1. Introduction............................................................................................................................................. 87 4a.2. The work hypotesis............................................................................................................................... 88 4a.3. Material and method............................................................................................................................. 88 4a.4. Rezults and discutions.......................................................................................................................... 90 4a.5. Conclusions................................................................................................................................................ 93

4b. Formulation of cosmetic creams with bee products............................ 93 4b.1. Introduction............................................................................................................................................. 93 4b.2. The work hypotesis............................................................................................................................... 94 4b.3. Material and method............................................................................................................................ 94 4b.4. Rezults and discutions......................................................................................................................... 96 4b.5. Conclusions................................................................................................................................................ 99

4c. Hydrogels with propolis................................................................................. 99 4c.1. Introduction............................................................................................................................................. 99 4c.2. The work hypotesis............................................................................................................................... 100 4c.3. Material and method............................................................................................................................ 100 4c.4. Rezults and discutions......................................................................................................................... 103 4c.5. Conclusions................................................................................................................................................ 116

4d. Antiinflammatory gel with propolis tincture and bee venom......... 117 4d.1. Introduction............................................................................................................................................. 117 4d.2. The work hypotesis............................................................................................................................... 118 4d.3. Material and method............................................................................................................................ 118 4d.4. Rezults and discutions......................................................................................................................... 120 4d.5. Conclusions................................................................................................................................................ 122

5. General conclusion (summary)...................................................................... 123

6. The originality and innovative contributions of the thesis................... 125

REFERENCES.............................................................................................................. 127

Keywords: propolis, honey, antioxidants, polyphenols, flavonoids, HPLC, TLC, spectrophotometry

INTRODUCTION The apitherapy represents the use for medicinal purposes of bee products (honey, venom, royal

jelly, propolis, beeswax). This form of therapy is as old as human medicine, being used in ancient Egypt, Greece and China. There are numerous explanation, since ancient times, concerning the use of honey and bee products, either as food or for medicinal purposes.

The first civilization that used beekeeping is Egyptian, perhaps even before the year 5000 BC, as evidenced the rupestrial drawings that depict the use of smoke to calm the bees. In Europe for centuries, the honey has been considered the ideal sweetener, being used for long time by ancient civilizations, especially as food and less as a medical remedy. Hippocrates, considered the "father of medicine" has used the bee products to treat arthritis. In the range of the Apis mellifera, propolis has acquired a variety of traditional uses.

CURRENT STAGE OF KNOWLEDGE 1. Generalities about propolis

The word propolis comes from the Greek, meaning to defend the city (the hives), it is a resin

produced by bees (Apis mellifera L.), which occurs in different physical forms. The color can vary from red to ocher, brown, light brown or green, with solid consistency of elastic gum. [1].

In the chemical composition of the raw propolis were determined resins, waxes, volatile oil, pollen, carbohydrates, amino acids, vitamins, enzymes, mineral salts and impurities [2].

Propolis produced by honey bees Apis mellifera is characterized by a variety of colors, namely their palinological profile. The floral origin and palinological composition depend to some measure of the plant species present in the bee area.

Propolis is known as one of many natural products with biological activities and therapeutic effects such as antimicrobial, antibiotic, antifungal, antiinflammatory, analgesic, antioxidant and antitumor.

2. Generalities about honey

Today the honey is regarded rather as a sweet and desirable food, especially because it is a natural product with a special flavor. In communities of antiquity it was considered rather a medical remedy to treat many health problems.

After provenance, the bee honey are classified into: flower, polyfloral and forest honey. Depending on processing mode, the honey is classified in [3]: - honey obtained by pressing; - honey obtained by centrifuging. The quality control of honey (apiculture products in general) is regulated at: - F.A.O international commission / O.M.S. - Codex Alimentarius Standard - regional (European) by the EU Food Commission - EC Directives - national by the Ministry of Agriculture, Ministry of Health and A.C.A. Romania through: I.C.D. The honey contains more than 200 substances, including carbohydrates, water, proteins, vitamins,

minerals, enzymes, flavonoids, phenolic acids, volatile compounds and others. For a very long period of time in human history, the honey was an important source of

carbohydrates and also the only sweetener available to the emergence of the sugar industry after 1800. In the tradition of people, the honey was used not only as food but also as medicine. In the last years a branch of alternative medicine has grown - Apitherapy, offering treatments based on honey and other products against many diseases.

PERSONAL CONTRIBUTIONS

The work hypotesis

The doctoral research started from the benefits of bee products, resulting the study of bee products, in order to use them as raw materials for pharmaceutical and therapeutic effects of formulations containing propolis and honey. The study was performed on samples of propolis and honey from the western Romania, harvested from various beekeepers in Arad and Bihor counties.

Research objectives 1. Physico-chemical analysis of propolis, namely ethanol extract of propolis by spectrophotometry, thin layer chromatography and high performance liquid chromatography 2. Physico-chemical analysis of honey by thin layer chromatography and atomic absorption spectrophotometry 3. The study of the antioxidant effect of bee products 4. The study of the therapeutic effects of formulations containing honey and propolis

Study 1 – Physico – chemical analysis of propolis

1.1. Physico – chemical study on propolis samples of western Romania [4]

Fig.1. Places for the collection studied of propolis samples The assessment of values for sugars, highlights the fact that samples from Bata presents the highest

level. Their presence influences the pharmaceutical action of propolis. The samples from Conop and Păuliş are the richest in nitrogen, protein and phosphorus. The results reveal a fairly large metal content, without exceeding the national and international standards, which certifies that the propolis from these beekeepers it can be used in studies for application in pharmaceutical formula, cosmetics or as food supplements. For samples of Bata, the refractive index and the yield extraction have higher values. The conductivity maintains the acid pH values, confirming the composition dependence of the place of harvest.

1.2. Comparative study of polyphenols from propolis extracts of different origins [5]

The chromatographic analysis revealed the presence of several polyphenols in Covăsânţ, Dorgoş and Ştei sample as well as Livada Beiuş. Less concentrated in polyphenols is Lipova sample. We can observe many similarities and differences between the studied samples, both quantitatively and qualitatively. The similarities are probably due by the resin and pollen collection from the same species, and the differences are caused by specific species of bees harvest area. In the Dorgoş sample it can be observed specific compounds colored in red which are not present in other analyzed samples.(fig.2)

Fig.2. The chromatogram in visible light after spraying with anisaldehyde reagent and phosphomolybdic acid

It can be observed the presence of caffeic acid in all analyzed samples, the ferulic acid in Conop,

samples from Arad area, respectively in all three samples from Bihor area. The gallic acid it was found only in Ştei samples. Between the flavonoids, the kaempferol was identified in Covăsânţ, Dorgoş, Ştei and Beiuş samples respectively chrysine in Conop, Covăsânţ and Ştei samples.

Can be also observed a few peaks (fig.3,4), which can not be identified due to lack of standards, but appear to be similar in several samples. The compounds were separate at: 1.7 minute in all samples, except the Beiuş; 7.6-7.8 minute in all samples; 10.2 to 10.9 minute respectively 22.2 to 23.4 minute in all samples except in one at Ştei; 39.5 to 41.0 minutes. These similarities may be due to similar species in the harvest bees area. The separated compounds only from certain samples can be probably related to the specific species of bees harvest area.

Fig. 3. The HPLC chromatogram samples from Arad County

Fig. 4. The HPLC chromatogram samples fromv Bihor County

If we compare our results with those obtained from European, Chinese and Argentine propolis (2-4% chrysine), it can be observed that the Conop sample (2.53%) has a comparable chrysine content (1.95 mg / mL 1:10 to extract respectively 1.95% in propolis as raw material). The total flavonoid concentration from Covăsânţ (4.28%) and Dorgoş (6.88%) samples is higher than that observed in Brazilian green propolis extract (4.3%) or in methanol extract studied by different researchers.

Even if Romania it was one of the first countries to promote the study of propolis, this work is one of the first that report the chemical and antioxidant capacity of propolis from the western part of the country, namely Arad and Bihor Countys. This study has revealed that, the propolis from western Romania has a high content of polyphenols, flavonoids and phenolic acids. The results show higher values than those reported for propolis originating from China, Europe or Brazil. These results can constitute in a recommendation for the propolis collected from this part of Romania, for use in the food, cosmetic and pharmaceutical industry, safe and effective as raw material for pharmaceuticals, cosmetics or food supplements.

Study 2 – Physico – chemical analysis of honey 2.1. Quality analysis of different types of honey

The honey samples collected from the beekeepers are of superior quality, they are homogenous and the physicochemical characteristics are according to specific standards, printed by applicable law. Regarding the polyfloral honey marketed by an industrial agent, it is of inferior quality, not only the organoleptic characteristics are altered but also the physicochemical parameters.

After the analysis, it was found that in honey samples collected from the beekeepers, there are not present falsification agents, while in polyfloral honey marketed by the industrial agent, there was a larger amount of water (over the maximum limit), also the presence of gelatine and sugar syrup was determinated.

2.2. Analysis of metals from different types of honey Findings of the degree of contamination by heavy metals, allows us to prevent the potential danger

to consumers' health. There are also metals whose presence can be beneficial to health. Mg/kg

00,5

11,5

22,5

33,5

4

1 2 3 4 5

Cu

Cd

Zn

Fe

Fig.5. Metal concentrations in honey samples

According to experimental results, we notice an increased concentration above the maximum limits

in all analyzed honey samples for zinc and iron. The highest values were recorded in samples of polyfloral honey marketed by an industrial agent: 3.98 mg / kg for Zn and 3.5 mg / kg for Fe. The recorded values for heavy metals, Cu and Cd are below the maximum limits.

The determination of metals in honey can be a good method for assessing the purity and the proper way of harvesting and processing honey. Also, the quality bee products are obtained only if the rules are respected regarding the harvesting, processing, packaging and storage.

2.3. Sugar analysis of different types of honey

The sugar determination in honey was performed by thin layer chromatography (Fig. 6). The analysis shows the sugar fingerprint from the studied samples and can be evaluated the differences or similarity. The chromatograms show the abundant presence of fructose and glucose in all honey samples. The chromatogram shows the presence of saccharose in Covăsânţ, 1,2,5,6,7 samples. Less concentrates are the Lipova, polyfloral honey, 3,4,8,10 samples.

Fig.6. The honey samples chromatogram

The fructose and glucose content from honey vary from one type of honey to another. This

proportionality between the two sugars is the main factor of honey crystallization, and also the one that decides if it is fast or slow crystallization. The only difference is that the sugars, instead of being in form of a solution, they are in form of crystals. The sugars are the main components which give the honey taste.

Study 3 - The study of therapeutic effects of the formulations

containing honey and propolis 3.1. The antioxidant capacity of propolis extracts [6]

The antioxidant capacity was evaluated by five different spectrophotometric methods: DPPH, TEAC,

FRAP, CUPRAC and SNP. The evaluation results of the antioxidant capacity show us that the propolis samples from Bihor County have stronger antioxidant effect. The Dorgoş sample, with the highest content of flavonoids and phenolic acids has also a significant antioxidant capacity.

Fig.7. Correlations between total flavonoid content and antioxidant effect The evaluation of antioxidant capacity by chemical spectral methods, can be used for a more

complete assessment in terms of the qualitative point of view of propolis. In this direction, this study revealed that the polyphenols are responsible for antioxidant effect. Using one of the methods DPPH or ABTS respectively FRAP or CUPRAC of evaluating the antioxidant capacity, could be helpful in evaluating the propolis quality besides the compositional evaluation performed by chromatographic and spectral methods.

3.2. The formulation of cosmetic creams with bee products

Three cosmetic emulsions were performed based on beeswax, propolis tincture, honey and royal jelly. It was followed the quality of preparations, to can selecting the best formula.

Tabel I. The composition of cosmetic creams with bee products (g)

Components C I C II C III Cetyl alcohol 2 1 1,5 Wax 8 9 9 Lanoline 10 8 8 Paraffin 10 7 7 Paraffin oil 25 30 25 Royal jelly 1,5 1 2 Span 60 2 4 2 Propolis tincture 1,5 1,5 2 Lime honey 2 - 2,5 Acacia honey - 2 - Preservative solution q.s. 100 q.s. 100 q.s. 100

Tabel II. The role of components in the formulation of cosmetic creams

Components Role Cetyl alcohol Primary emulsifier / U Wax Emulsions stabilization Lanoline Primary emulsifier / U Paraffin Lipophilic emollient Paraffin oil Lipophilic emollient Royal jelly Cell regenerator Span 60 Primary emulsifier / U Propolis tincture Antimicrobial, healing Lime and acacia honey Anti-inflammatory, emollient hydrophilic Preservative solution The hydrophilic phase

The preparations presented an aesthetically elegant, pleasant, smooth and creamy texture, a pH close to the skin. There are emollient without being oily or sticky. The cosmetic creams presented immediately after preparation, great extensiometric values, proving that the preparations have a suitable consistency and a high stretching capacity, properties which is maintained over time.

The stability studies revealed that the homogenous appearance is maintained in the temperature range between 2-40 ° C for all three formulations, proving that the emulsions are stable at normal temperature variations. We can conclude that the bee preparations can be used in pharmaceutical practice for the nutritional and emollient effect.

3.3. Hydrogels with propolis

They are formulated a series of hydrogels based on propolis tincture in different concentrations:

1%, 3%, 5% and 7%. The propolis tincture was dispersed in 1% carbopol gel, as the basis for incorporation of the active ingredients.

All the preparations showed a homogenous, translucent appearance and the organoleptic characteristics remained constant after 10 days of preparation. The preliminary studies have demonstrated that the ethanol extract of propolis can be incorporated into the hydrophilic base, in a concentration of not more than 7%. At concentrations more than 7%, the obtained hydrogel has a low consistency and becomes opaque, losing the translucent appearance.

The pH of the gel was maintained in the range of 5.5 - 6, being compatible with the skin pH. All the formulations have presented a capacity close to that of the used basis. The preparations stretches easily on the skin and leaves a pleasant sensation upon the application.

Through the complex chemical composition which presents the propolis tincture it helps to the healing of wounds. The gel in the study was well tolerated by the skin and presented a healing action on experimental lesions produced at the rats, more effective than the Cicatrizin® ointment taken as reference.

In conclusion, it was found that after 10 days of treatment, the preparation of the gel with 5% propolis tincture, the wound area decreased with 87%, resulting the complete healing after 12 days. The group treated with Cicatrizin® ointment, the wound surface decreased with 81.81% after 10 days, with 93.83% after 12 days and the complete healing occurred after 13-14 days of treatment. In the control group, the complete healing occurred after 15-16 days, and after 10 days the wound area has decreased with 57.25%.

By testing the antiinflammatory action of the studied preparations, it was found that the gel with 5% propolis tincture presents a significant antiinflammatory effect, both on the edema produced by 10% kaolin, and on the edema produced by 6% dextran solution. This is due to the complex composition of the propolis tincture. In the case of edema produced by 10% kaolin suspension, the most intense antiinflammatory effect was produced after 2 hours from the induction of the edema for all studied gels, as well as for phenylbutazone. In the case of edema produced by 6 % dextran solution, it was noted the most intense antiinflammatory effect after 90 minutes from the induction of edema, for the gel with 5% propolis tincture, after 60 minutes, for the gel with 3 % propolis tincture, and after 30 minutes for the gel with phenylbutazone.

3.4. Inflammatory gel with propolis tincture and bee venom [7]

It was prepared a gel with natural active ingredients (propolis tincture, capsicum tincture, pine

essential oil and bee venom) for the treatment of inflammatory and rheumatic diseases of other origin, with antiinflammatory, immunomodulatory, antiseptic, sedative and revulsion effects. Before using the antiinflammatory gel, the patients should make their tolerance test, to be sure that no allergic reaction occurs.

The characteristics of antiinflammatory gel are: homogenous appearance; red-brown color; characteristic aromatic odor; pH 5.5 - 6. By testing the antiinflammatory action of the gel, it was found

that it has significant effect, both on the edema by produced by 10% kaolin suspension and on those produced by 6% dextran solution. This is due to the complex composition of the gel.

The main advantages of the antiinflammatory gel are: - By combining the natural principles is obtain an effective antimicrobial and antifungal action

which gives it a good stability; - An antiinflammatory, revulsive and rapid effect; - Immunomodulatory effect through nonspecific mechanisms; - It has a calming and anesthezic action at the first use; - An improvement of the peripheral circulation (pine essential oil and capsicum tincture); - The combination of certain bee products with synergic effect: propolis tincture and bee venom.

4. General conclusion (summary)

The studies have revealed that the propolis in western Romania has a high content of polyphenols, flavonoids (chrysine and kaempferol) and phenolic acids (caffeic acid, ferulic acid), and important antioxidant capacity. The results show higher values than those reported for the propolis originating from China, Europe or Brazil. These results recommends that the collected propolis from this part of Romania for use in the food, cosmetics and pharmaceutical industry, safe and effective as raw material, for pharmaceuticals, cosmetics or food supplements.

The evaluation of antioxidant capacity revealed that not only the polyphenols are responsible for the antioxidant capacity and one of the methods DPPH or ABTS respectively FRAP or CUPRAC could be helpful in evaluating the quality of propolis in addition to assessing the compositional accomplished by chromatographic and spectral methods.

Following the investigations it was found that in honey samples collected from beekeepers are not present the falsification agents, whereas in the polyfloral honey marked by an industrial agent, it was revealed a larger amount of water (above the maximum limit allowed by current standards), and the presence of gelatine and the sugar syrup. The presence of the sugar syrup is highlighted by the physicochemical characteristics: increased sucrose content, decreased invert sugar content, low diastatic index, increased water content.

The results showed a quite high content in metals, without exceeding the national respectively international standards, which certifies that propolis from these beekeepers can be used to study the specific application in pharmaceutical compositions, cosmetics or as nutritional supplements.

The studied propolis and honey were used for the formulation of cosmetic preparations - creams and gels. The cosmetic preparations with bee products showed an aesthetically, elegant, pleasant appearance, smooth and creamy texture, a pH close to the skin. There are emollient without being oily or sticky. The cosmetic creams showed a high extensiometric values immediately after the preparation, proving that the preparations have a suitable consistency and a great spreadability.

All hydrogels with propolis have shown a clear and homogenous appearance, translucent and the organoleptic characteristics remained constant after 10 days of preparation. In other words, the rheological properties of the gel vary depending on their composition.

The healing action it is noted after 10 days of treatment with gel having 5% propolis tincture on a batch of Wistar rats. It was found that the surface of the wound has decreased with 87% causing the complete healing after 12 days. In the group treated with Cicatrizin® ointment the wound area decreased with 81.81% after 10 days, with 93.83% after 12 days and the complete healing occurred after 13-14 days of treatment.

By testing the antiinflammatory action of the studied gels it was found that the gel with 5% propolis tincture show a significant antiinflammatory effect, both on the edema produced by the 10% kaolin suspension and on those produced by the 6% dextran solution. This is due to the complex composition of propolis tincture.

The burns treated with the propolis cream had a less inflammatory appearance than those treated with pharmaceuticals designed to treat the burns and the patients who would use this natural cream for skin would benefit from faster healing. Propolis is also less expensive, and it was found that have a relatively low allergenic poteniţial, so it would be less probably to cause allergic side effects.

The antiinflammatory action of gel with propolis tincture and bee venom is determined mainly by the active ingredients contained into. It can be used in the treatment of rheumatic and inflammatory diseases of different origin, and to improve the peripheral circulation, because it is made by combining the natural products, each with its known effects on the human body: propolis tincture, capsicum tincture, volatile oil of pine and bee venom.

5. The originality and the innovative contributions of the thesis

The evaluation of bee products for pharmaceutical use in western Romania. The choice of the sorts with the best results to be used in the formulations. Performing the formulas and checking the quality and efficacy. Demonstrating the efficacy of bee products for external use products having antiinflammatory and

healing action. The sorts of western Romania have adequate quality to be used in pharmaceutical formulations. This paper evaluates the propolis and the honey, the main bee products choosing the sorts/samples

having an optimal compositions for the formulation of topical use. The paper presents the development and evaluating the quality and efficiency of formulations for

external use, demonstrating that the use of bee raw materials of adequate quality, ensuring the efficiency of finished products with antiinflammatory and healing effects.

The final conclusion is that the flora from Arad and Bihor Counties provides the possibility of producing high quality propolis and honey, applicable as raw materials for pharmaceutical purposes.

The analytical methods presented can be used successfully to evaluating the quality of bee products, used as raw materials for pharmaceutical purposes.

The paper performed the bee sorts evaluating from the main bee centers from Arad and Bihor counties, being among the first works presenting the comparative data on the number of samples statistically representative, to provide a more complete picture of the quality of bee products from this part of Romania.

SELECTIVE REFERENCES

1. Salatino A., É. Weinstein Teixeira, G. Negri and D. Message Origin and Chemical Variation of Brazilian Propolis. eCAM (2005) 2:33- 38.

2. GHISALBERTI, E L Propolis: a review. Bee World (1978) 60:59 - 84

3. ***http://www.agir.ro

4. Dărăban A., Toma C.C., Neag T.A., Olah N.K., Dehelean Gh., Assay about heavy metals contamination in the perspective to use the propolis in agroturism domain, Studia Universitatis Vasile Goldiș, Seria Științe Inginerești și Agro-Turism2011; 6(2): 49-54. CNCSIS B+ (studiu cuprins în capitolul 2a)

5. Dărăban A., Olah N.K., Câmpean R.F., Furtuna F., Cobzac C., Dehelean Gh., Bojiță M., Hanganu D., Comparative study of polyphenols from propolis extracts of different origin, Studia UBB Chemia 2015; LX(2): 125-136. CNCSIS A / ISI

6. Dărăban A., Olah N. K., Câmpean R. F., Furtuna F., Hanganu D., Dehelean Gh., Bojiţă M., Atyim P., The evaluation of antioxidant capacity of propolis originating from West part of Romania, J Apicult. Sci (in press). ISI

7. Dărăban A., Mititelu M., Dehelean Gh., The antiinflammatory effects of a hydrogel formulation with bee

venom, Studia Universitatis Vasile Goldiș, Seria Științele Vieții 2013;23(4):451-455. CNCSIS B+