Magisterprogrammet i diagnostisk cytologi för framtidens behov.

Katalin Dobra, överläkare och universitetslektor i molekylär patologi vid Karolinska Institutet inledde Cellabdagarna 2016.

Bland de faktorer som påverkar den framtida cytologin nämndes den logistiska utmaning som framtiden kommer att ställa krav på. Det innebär att hela provflödet kommer att bli annorlunda och dessutom kommer ett flertal avancerade molekylära analyser att genomföras på cytologiska prover dvs. diagnostisk cytologi är i förändring och därmed ställs krav på en vidareutbildning för att möta dagens och framtidens krav på diagnostisk cytologi. Denna vetskap lade grunden till den nya magisterutbildningen, som inte ska ses som en yrkes-inriktad utbildning. Syftet är att ge en starkare och förbättrad koppling mellan grundutbildning och avancerad utbildning till cytodiagnostiker. Detta innebär en akademisk förstärkning av programmet med inslag av basala statistiska metoder och i förlängningen en fördjupning av vetenskapligt arbets- och förhållningssätt. Målet är att utveckla förmågan att hantera den framtida komplexiteten i analysarbetet och att kunna vidare- utveckla och kvalitetssäkra den cytologiska diagnostiken.

CYTOLOGIMÅNDAG 5/9

Hur får man till ett rationellt flöde – samverkan över specialiteter.

Leg. BMA Christina Frykman och Cytodiagnostiker Margareta Åkerblom från Region Gävleborg, Division Diagnostik redovisade ”Prostataprojektet”.

Målet med projektet är att fastställa i vilken utsträckning diagnostiken av prostatabiopsier kan göras av cyto- diagnostiker. I Gävleborgs län diagnostiseras nästan

Katalin Dobra

CELLABVECKAN 2015Cellabdagarna är ett årligt evenemang som i år arrangeras för sjätte året i rad. Dag ett ägnades åt cytologi och de andra två dagarna hade histologi på programmet. Deltagare från hela Sverige bjöds på intressanta föreläsningar kring aktuella och relevanta ämnen. Tid fanns också till diskussion och

utbyte av erfarenheter.

CELLABDAGARNA 2016

800 fall av prostatacancer/år och totalt genereras ca. 250.000 glas vilka skall diagnostiseras. För närvarande ligger man på en ledtid av 21 dagar och målet är att halvera den med bibehållen kvalitet. Grundtanken är att cytodiagnostiker skall kunna selektera fram de fall som definitivt skall valideras av en patolog. Projektet startade med en noggrann analys av alla ingående parametrar i flödet från provtagning till utsvar och man insåg att flera vårdenheter är berörda för att kunna göra flödet mer rationellt; ex vis cancersamordnare, urologkliniker osv. Var och en av dessa funktioner har naturligtvis en större eller mindre påverkan på processflödet. Genom noggranna studier av existerande flöden och kontinuerliga förslag till förbättringar har man nu startat den nya processen.

Rutinflödet på patologi/cytologilaboratoriet är Hema- toxilin-eosinfärgning av glas, som kompletteras med immunohistokemi med PIN cocktail; p63+P504S+CK5

Två cytodiagnostiker fastställer sedan diagnos oberoende av varandra och denna diagnos valideras mot läkardiagnos som fasställts som ”Golden Standard”. Uppföljning och validering sker kontinuerligt för att fastställa hur kompetens utvecklas över tid.

Efter 150 fall kan man redan nu konstatera att överens-stämmelse mellan utsaga från cytodiagnostiker och erfaren patolog är mycket god.

Hur kommer kvalitetssäkringen att utformas i framtiden?

PhD Keng-Ling Wallin från Equalis stod för denna genomgång. Målet med kvalitetssäkring inom laboratoriemedicin är att säkerställa en säker och korrekt diagnostik av laboratorieresultatet för att kunna genomföra rätt åtgärd och ge rätt behandling. Det kvalitetssäkringsarbete som genomförs

på patologiavdelningarna i Sverige bedrivs av huvud-männen och omfattar intern kvalitetssäkring och kvalitets-kontroll. Den externa kvalitetssäkringen erbjuds av NordicQC och Equalis – i ett nära samarbete med Svensk förening för patologi (SvFP) och KVAST- grupperna.

En viktig startpunkt för kvalitetsarbetet blev den statliga utredningen Svensk patologi, en översyn och förslag till åtgärder, som presenterades 2012. Sammanfattningsvis konstaterades att det finns goda intentioner till kvalitetssäkring, men att dessa inte har genomförts. Slutsatsen blev att det behövs ett starkt nationellt stöd för utveckling och genomförande.

Sveriges Kommuner och Landsting (SKL) redovisar 2014 i rapporten Kvalitetsarbetet i klinisk patologi att kvalitetsarbetet ofta drivs ideellt av eldsjälar vilket innebär att kvalitetsarbetet inom vissa organområden kan vara välutvecklat medan det är eftersatt inom andra. Orsaken kan vara att det inte finns tillräckligt med tid, eller andra resurser, för läkare eller laboratoriepersonal att aktivt delta i kvalitetsarbete. I rapporten finns klara siffror hur kvalitetsarbetet varierar från landsting till landsting. Enligt SKL-rapporten är det huvudmannen d.v.s. landstinget som ytterst är ansvarig för kvalitetsarbetet.

Vi bör utveckla flera andra program för att kvalitetssäkra diagnostiskt arbete inom allmän cytologi, exempelvis urin- och luftvägscytologi. Utveckling gäller också för cervixcancerprevention, där införandet av primärscreen-ing med HPVtest bör kvalitetssäkras och innefatta vali-dering både på teknisk och klinisk nivå. Inom cervixcy-tologi måste det fastställas nya kvalitetsmarkörer och bl.a. klargöras hur man ska tolka ett samtidigt positivt cytologifynd med ett HPVnegativt resultat, samt hur antalet falskt negativa resultat ska minskas.

Redan nu tas steg att säkra diagnoskvaliten genom att diagnosklassificering kommer att harmonieras i Sverige och dessa data ligger till grund för att dra framtida slut-satser vad beträffar effekt av åtgärder.

Margareta Åkerblom och Christina Frykman

Keng-Ling Wallin

För att nå fram till att stärka kvalitetsarbetet krävs ett starkare och tätare samarbete mellan Equalis, Kvalitets- och standardiseringskommittén inom Svensk förening för Patologi (KVAST) och Nationella Kvalitetsregistret för Cervixcancerprevention (NKCx).

Vad innebär det nya vårdprogrammet – för kvinnorna och cytodiagnostikerna?

Björn Strander gynekolog och ordförande Nationellt Vårdprogram för Cervixcancerprevention fortsatte under den programpunkten. Sedan införandet av cervix-screening (år 1958) i har antalet kvinnor som drabbats av skivepitelcancer halverats till ca 10 kvinnor per 100.000. Något motstridigt till de positiva talen har man under senare tid konstaterat en fördubbling av antalet icke normala prover, eller annat uttryckt, antalet cytologiska atypier till ca 7.000 kvinnor per 100.000. Orsaken till den ökning anges vara spridning av HPV infektion, som i sin tur ger en ökning av atypier och genom ett ökat delta-gande hittar sjukvården fler icke normala prover.

Avgörande för framtiden är att det finns ett välfungerande kvalitetsregister vilket skall inkludera en monitorering av kvalitén. Den rekommendation som nu har utgått från Socialstyrelsen anger att cytologi bör användas i unga år 23-29 år och i kombination då kvinnan är 41 år.

Totalt handlar det om 12 screeningrundor under kvinnans livstid och cytologi skall alltid användas då HPV-test visar positivt utslag (Triage). Det program som nu skall sjösät-tas innebär att det nationella vårdprogrammet ger krav som huvudmännen ska uppfylla.

Genom den organisation som byggts upp i form av sex regionala cancercentra (RCC) i Sverige finns ett hopp om att kraven kring infrastruktur kan infrias eftersom det kommer att ställas krav på samordning, monitorering, kommunikation, kvalitetssäkring osv.

En diskussion följde som bl.a. tog upp att det är ett problem i dagsläget med variation av avvikande prover, där antalet icke bedömbara cytologiskt kan lig-ga i spannet 4-8 % procent och tyvärr kan konstateras att få cytologisk prover eftergranskas. Kliniska (indic-erade) prover skall inte ingå i rapporteringen eftersom de inte göra att jämförelsen klinik till klinik kan göras. Hela Sverige måste gå över till vätskebaserad cytologisk provtagning för att följa Socialstyrelsens rekommenda-tioner och även här är det på plats att notera att dessa system måste kvalitetssäkras eftersom det finns skillnader mellan provtagningsmetod, hantering och upparbetning av prov. Dessutom kompliceras bilden av att olika HPV-tester har olika specificitet och sensitivitet. För att göra saken ännu mer komplicerad kan man konstatera att även excision (konisering) kan göras och görs på olika sätt. Det viktiga är att veta vad man gör för att kunna göra en validering av förväntad kvalitet. Det föreslagna vård-programmet bör vara etablerat i alla steg innan det blir en övergång till HPV som primärscreening.

HPV-diagnostik, underlaget som ledde fram till beslutet om primär-screening ur en mikrobiologs synvinkel

Ämnet belystes av laboratoriesamordnare Carina Eklund, Karolinska Institutet.

Redan 1997 startade världens första randomiserade prövning, screening med HPV i Sverige. Nästan 13.000 kvinnor i åldrarna 32-38 år som deltog i den organiserade gynekologiska cellprovtagningen ingick. Provtagningen gjordes och varje kvinna fick ett PAPtest och ett HPVtest och det visade sig att antalet som var HPVpositiva, vid den efterföljande uppföljningen, som hade CIN2+ var större än förväntat. 10 år senare kunde man konstatera att HPVtest minskar risken för livmoderhalscancer in situ med 50%.

Efter 20 år ser man som huvudfynd att HPVtest ”skyddar” mot CIN3 i sex år och cytologi i tre år i den undersökta gruppen av kvinnor. Negativt cytologisvar ger i tre års tid samma skydd mot invasiv cancer som negativt HPV i fem år. Dessutom konstateras att det är en försumbar vinst att utföra cytologisk provtagning bland HPV-negativa kvinnor.

Björn Strander

Bland de fördelar som nämndes är förbättrad specificitet i screeningen som medför färre onödiga remitteringar, vilket i sin tur måste ställas mot kvalitetssäkringen av HPV tester. I det Europeiska samarbetet som också innefattar utskick av s.k. paneler som innehåller inter- nationella standardpreparationer av DNA visar det sig att träffsäkerheten varierar mellan olika typer av bestämningsmetoder och mellan olika laboratorier. D.v.s. det nationella kvalitetsregistret som är på plats i Sverige är av yttersta vikt för att kunna göra olika stringenta jämförelser.

ROSE och EBUS-TBNA, cytodiagnostikernas roll?

Cytodiagnostiker Vedrana Roger från Labmedicin, Skåne var dagens sista talare. Akronymerna står för Rapid On Site Evaluation (ROSE), Endo Bronkiellt Ultraljud (EBUS) och Trans Bronkiell Nål Aspiration (TBNA) och alla är metoder för att skapa en säker diagnos vid misstanke om

lungcancer.

Lungcancer är den femte vanligaste cancerformen i Sverige och årligen drabbas nästan 4.000 personer, dvs. 10 personer per dag och man ser en ökande trend bland kvinnor - kanske beroende på ändrade rökvanor.

I den kliniska utredningen är det avgörande att känna till anatomin. Inte enbart lungorna med dess lober, luftvägar; struphuvud, luftstrupe, bronker och alveoler är i fokus för utredning utan även mellanrummet mellan lungorna. Mediastinum innefattar matstrupe, hjärta, de stora blod-kärlen och lymfkörtlar.

Den kliniska utredningen har tre huvudsyften; fastställa diagnos, kartlägga tumörens utbredning och att göra en bedömning av patientens funktionsstatus – med hänsyn till planerade behandling. I Lund ansvarar Cytodiagnos-tiker för den morfologiska utredningen och självständigt svarar de ut benign lungcytologi.

Framgångarna har uppmärksammats av lokala media under rubriken ”snabb diagnos utan operation”. EBUS-TBNA är metoden som används för att ta prover från lymfkörtlar som finns på anatomiskt besvärliga ställen. Kombinationen av ROSE och EBUS-TBNA har visat sig ge färre komplikationer vid undersökning och vidare har man visat att Cytodiagnostiker är mycket träffsäkra i sin diagnostik av de morfologiska proverna.

Carina Eklund

Vedrana Roger

The art and Science of Sectioning Paraffin Embedded and Frozen Specimens

Janet Minshew, histoteknisk konsult, HT/HTL (ASCP) från Texas, USA inledde med en kort historisk tillbakablick på mikrotomens utveckling från 1600- talet fram till dags datum. Den mikrotom vi använder idag utvecklades på 1950-talet. Snittningen är den mest tekniska och viktigaste delen i framställningen av ett histologiskt preparat. Det som har hänt tidigare i processen blir uppenbart vid snittningen, som i sin tur är avgörande för de efterföljande stegen, färgning och diagnosticering. För att snittning ska kunna ske utan problem krävs att preparatet är välfixerat, väl dehydrerat och fullständigt infiltrerat.

Korrekt orientering vid bäddning av preparatet är viktigt. Knivbladets kvalitet kan också vara avgörande.

Många av de problem som uppkommer vid snittning orsakas inte av mikrotomen, utan kan härledas till andra yttre orsaker. Fixeringen är tyvärr ett undervärderat steg i processen. Om den inte utförs korrekt kommer det att påverka alla följande steg. I dehydreringsstegen är det viktigt att man inte tar bort det vatten som är bundet i vävnaden utan endast det fria vattnet. Både alkohol och clearing påverkar det bundna vattnet. Om det bundna

HISTOLOGIONSDAG 7/9

vattnet avlägsnas kommer vävnaden att bli hård och torr, vilket resulterar i ett svårsnittat preparat.

Vid snittning bör man också undvika aggressiv trimning. Man bör inte trimma för tjockt och inte med för hög hastighet. Artefakter i snittningen kan även bero på mikrotomens tillbehör, som t.ex. knivblads – och preparat-hållarens skick. Det är även viktigt att de rengörs noggrant.

Vidare bör man tänka på kassettens placering i preparathållaren, skärpan på knivbladets egg, knivvinkel, renhet i vattenbadet och temperatur.

Janet Minshew

CELLABVECKAN 2015Cellabdagarna är ett årligt evenemang som i år arrangeras för sjätte året i rad. Dag ett ägnades åt cytologi och de andra två dagarna hade histologi på programmet. Deltagare från hela Sverige bjöds på intressanta föreläsningar kring aktuella och relevanta ämnen. Tid fanns också till diskussion och

utbyte av erfarenheter. Här följer en sammanfattning av Janet Minshew:s föredrag.

CELLABDAGARNA 2016

The Art and Science of Sectioning Frozen Specimens

Som vid snittning av paraffininbäddad vävnad handlar fryssnittning mycket om förberedelse innan snittning. Exempelvis hur infrysningen av preparatet har skett. Den bör ske snabbt för att undvika bildning av iskristaller. En blandning av isopentan och kolsyreis är en lösning för att optimera infrysningen.

Om snitten ser ut som en ”schweizerost” har infrysningen varit för långsam, varvid iskristaller har bildats, intra- och extracellulärt. Man måste optimera temperaturerna i kammaren och på kniv- och preparathållare om dessa funktioner finns på kryostaten. Man bör också minimera antalet olika vävnadstyper per block, fet vävnad bör snittas vid en högre hastighet än annan vävnad. Statisk elektricitet kan minskas genom att en öppen bägare med 50% alkohol ställs i kammaren.

Det är också viktigt att sköta sin utrustning! Nedisning kan tas bort med 70% alkohol. Se till att hålla kryokammaren ren. Om man har en kryostat med ”inbyggd dammsugare” underlättar det rengöring. Ett desinfektionssystem underlättar också rengöringen.

Troubleshooting and Finding a Fix for Sectioning Artifacts

Den inleddes med artefakter som uppkommer vid snittning av paraffininbäddade preparat. Janet framförde, på ett mycket pedagogiskt sätt, alla varianter som kan förekomma, orsak och hur det kan rättas till.

Följande varianter gicks igenom: - omväxlande tunna-tjocka snitt - vertikala linjer genom alla snitt - komprimerade snitt- snitt som krullar sig - inga band av snitt, - snitt som krullar sig på ena sidan- chatter – tunna linjer som löper horisontellt - venetian blinds – grövre linjer som löper horisontellt - snitt som lyfter på den uppgående rörelsen - snitt som är mjuka i mitten - snitt som hoppar ur inbäddningen vid snittning

Därefter fortsatte Janet med att konstatera att de flesta artefakter som uppstår under snittning även kan uppstå under kryosnittning. Det som skiljer är temperatur.

Slutsatsen är att snittning med mikrotom eller kryostat är den sanna blandningen av vetenskap och konst och beror på den som gör arbetet. Den personen bör vara utrustad med känsla, talang och konstnärlighet!

A Scientific Understanding of Com-mon Special Stains for Microorgan-isms

Janet Minshew, histoteknisk konsult, HT/HTL (ASCP) från Texas USA började med avsnittet specialfärgningar av mikroorganismer. Dessa färgmetoder påvisar bak-terier och svamp. De flesta bakterier har en cellvägg av peptidoglykan - en linjär polymer av aminosyror och socker. Giemsa och Metylenblått används för att konstatera om det finns bakterier eller ej. Klassificering kan göras i grupper, grampositiv eller gramnegativ, syra-fast eller inte. Grunden för att lyckas med färgningen är: - Fixering i 4% buffrad formalin. - Kontroll med både gramnegativa och positiva bakterier. - Snitta 4-5 µm - Använd rent vatten i vattenbadet - Låt aldrig preparatet torka ut.

Grams jodlösning och aceton tar bort lipidmembranen så att de gramnegativa bakterierna färgas röda i basisk fuchsin. Kontrastfärga med pikrinsyra som ger en gul bakgrund. Som alternativ till pikrinsyra, kan tartrasinlös-ning användas. En jämförelse kan göras med Brown–Hopps och i det fallet blir cellkärnan svagt rödfärgad. Ytterligare en färgmetod är Brown-Brenn, som framför allt används för Grampositiva bakterier.

Till gruppen av Gramnegativa bakterier räknas Helico-baktor pylori, där yttermembranet består av fosfolipider och lipopolysackarider. Giemsafärgning är att föredra eftersom morfologiska karakteristika framträder tydligt. Färger som innehåller lösningar av silver (Warthin-Star-ry, Dieterle, Steiner) används för att påvisa H. Pylori, spirocheter, legionella och bartonella. Silvret reduceras till metalliskt silver varvid bakterierna framträder i svart och bakgrunden blir svagt gul/brun.

Mycobakterier, M tuberculosis och M leprae, är syrafasta och har en mycket komplex cellvägg, vilket utnyttjas i samband med färgning. Karbolfuchsin färgar mikroor-ganismer och vävnadskomponenter, syra-alkohol avfär-gar bakgrunden, medan de syrafasta mikroorganismerna behåller sin röda färg. Kontrastfärgning av bakgrunden i blått eller grönt görs för att få fram kontrast. Exempel på färgmetoder är Ziehl-Neelson och Kinyoun´s. För färgn-ing av M Leprae används Fite eller Putt.Svamp (fungus). Ett flertal metoder används för påvisn-ing av svamp. Val av metod beror på vad man vill se. Fungus kännetecknas bl a av att väggarna är mycket kol-

HISTOLOGITORSDAG 8/9

hydratrika. Fungus indelas i fyra olika klasser.De flesta svampinfektionerna angriper lungor, hud eller naglar, några återfinns i hjärnhinnor eller i blodet.H&E visar närvaro av pigmenterad svamp. Special-färgningar väljs för bättre visualisering av organismerna, såsom t ex Grocott (GMS). Det inflammatoriska svaret efter en svampinfektion kan påvisas med hjälp av PAS.Gridley använder en starkare syra (kromsyra) som även löser upp förkalkningar, vilket man finner i granulom. Kan lätt misstolkas som fungi.

Microorganisms, Troubleshooting and Helpful Hints For Improvement

Janet Minshew fortsatte.

Gramfärgning; om alla bakterier färgas blå – validera mot en kontroll som består både av grampositiva och gram-negativa. Glasen kan ha torkat och olösliga ämnen kan ha bildats.

Grampositiva organismer färgar inte blått, kontrollera jodlösningen, den kan ha blivit gammal. Öka tiden i kristallviolett och jodlösning. Minska tiden för lösningsm-edlet efter jodbadet. Använd en annan färgningsmetod för att hitta skadade celler.

Om alla bakterier blir röda så jämför kontroll och patient-fall på samma glas, det kan vara så att det enbart finns gramnegativa organismer. Kristallviolett färg försvinner under differentieringen - kontrollera att jodlösningen är fräsch.

Gramnegativa organismer är för ljusa – öka exponerings-tiden, men var observant på att bakgrunden kan bli för mörk.

Färgen visar inte normalt resultat – kör minst två glas med olika avfärgning eller använd en annan färgteknik. Det syns kristaller i samband med mikroskoperingen – filtrera kristallviolett före användning, se till att noggrant lösa upp kristallviolett i arbetslösningen. Se också till att alla lösningar är färska.

Felsökning Giemsa; om färgningen är negativ eller mycket svag så kan det bero på att snitten är alldeles för tunna – snitten måste vara tjockare än 3µm.

För lång tid i differentieringslösningen som kommer eft-er färgningen – korta tiden alternativt byt ut vatten mot ättiksyra 0,1-0,5%. Förstärk färgningen genom att köra den en gång till, inklusive differentieringssteg.

Warthin-Starry färgning. Om bakgrunden färgas, undersök ev. kontamination från orena kärl eller användning av metallpincett. Kvaliten på kemikalier inklusive vatten (trippeldestillerat) måste kontrolleras. Det kan finnas andra reducerande ämnen i vävnaden som färgar positivt(svart).

Om färgningen inte är optimal, organismen är

1/ för ljus - exempel på åtgärd för att undvika detta för-behandla med uranylnitrat, men se till att temperaturen är optimal för processen.

2/ för mörk - kontrollera framkallningstiden. Om vissa delar överframkallas, behandla med jod och natriumtiosulfat för att ta bort färg och sedan återfärga.Syrafasta bakterier färgas för blekt eller inte alls - försök färga en gång till eller färga ett annat glas. Om karbolfuchsinfärgningen blir för svag - ersätt den. Om kontrastfärgningen maskerar bakterier kan man avfärga med saltsur sprit, skölj i vatten och färga igen.

1/ Negativt patientprov men positiv kontroll kan tyda på att provet varit utsatt för felaktig fixering/urkalkning.

2/ Syrafasta organismer har förlorat fettet i kapsel och är därmed inte syrafasta, då måste en annan färgnings- metod väljas. Längre fixeringstid i formalin kräver för-längd färgningstid.

Om bakgrunden inte färgas vid kontrastfärgning antyder detta att sköljningen är otillräcklig efter differen-tieringssteget.

Utfällningar på glaset efter färgning - filtrera karbolfuchs-inlösningen och kontrollera utgångsdatum.

Viktigt - se till att ha rent destillerat vatten i vattenbadet! Var uppmärksam på att den positiva kontrollen kan kon-taminera vattenbadet!

Felsökning av syrafasta organismer typ M Leprae är främst inriktad på svag eller ingen färgning. Se till att skydda cellväggarna under avparaffinering och rehydrering– håll tiden! Ibland kan kontrastfärgningen göra det svårare att se bakterien. Viktigt att skölja väl efter kontrastfärgning.

Ett flertal metoder används för påvisning av svamp (fungus). Val av metod beror på vad man vill se. Fungus kännetecknad bla av att väggarna är mycket kolhydrat- rika. Trots att många aspekter är tillgodosedda i dagens laborativa verksamhet finns hela tiden behov av validera de resultat som presteras. Det gäller att exakt följa de anvisningar som finns. Se till att hela tiden sköta uppdateringar i arbetsbeskrivningar. Om leverantör byts ut måste en validering alltid ske innan ex vis den nya färgen används i kliniskt arbete. Om en automatisk färgmaskin inte fungerar normalt – kontakta alltid tillverkare/återförsäljare. Kom ihåg att en vanlig felkälla är vattenkvaliten – kontrollera den regelbundet. Använd alltid kontrollglas som motsvarar de som finns i kliniskt arbete. Kom ihåg att tjockleken på snitten spelar en avgörande roll för infärgningen.

.