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筋肉の新規タンパク質の発見及びそのｍＲＮＡの測定方法

鹿屋体育大学 体育学部

松田 貞幸

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前置き

本論に入る前の予備知識

・筋肉の構造について

・遺伝子とタンパク質生合成の流れ

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　　筋肉の構造について　　　筋肉の構造について

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遺伝子とタンパク質生合成の流れ ＤＬＳＴ遺伝子

遺伝子が多数コピーされる（転写）

コピーされたものをｍＲＮＡという。

ｍＲＮＡは前駆体で合成される。

前駆体ｍＲＮＡは切断・不要な部分（イントロン）は除去され、必要な部分（エキソン）が

結合して加工される。この工程をスプライシングという。この工程によって、構造的に異な

った複数の mRNA が加工される場合がある。これを選択的スプライシングという。

ＤＬＳＴ－ｍＲＮＡ Ｐ Ｃ Ｐ － ｍ Ｒ Ｎ Ａ

移動 移動 DLST-mRNA PCP-mRNA リボソーム リボソーム上で リボソーム タンパク質は合 成される（翻訳） DLST タンパク質 PCP タンパク質 リーダー リポ酸 Ｃ末端 Ｃ末端 ペプチド

ミトコンドリア内に移行 筋原線維のＺ帯に移行

核 膜

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研究の背景（１）

① 本研究の対象である骨格筋の新規タンパク質は、

ミトコンドリアに局在するα-ケトグルタル酸脱水素酵素複合体の一成分酵素であるジヒドロリポアミド・

サクシニル転移酵素（DLST）遺伝子のオルタネイチブ（選択的）・スプライシングの産物である。

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研究の背景（２）

② 筋原線維のＺ帯は、筋肉の構造形成と保持におい

て、大変重要である。本新規タンパク質は筋原線維

のＺ帯を構成するタンパク質の一つであるので、その

機能は、筋原線維のＺ帯の構造形成を通して筋肉の

構造形成の保持にあると思われる。それゆえ、本新

規タンパク質の研究を行うことは、いまだによくわかっ

ていないＺ帯の構造・機能の解明になると思っている。

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③ 新規タンパク質には二種類あり、その特性は他

のタンパク質とからみやすいということから、そのタ

ンパク質をPCP(Protein Clinging to the other

Proteins)と略記し、分子量の小さいほう（約30KDa）

をPCP-1とし、分子量の大きいほうをPCP-2(約

40KDa)とした。

研究の背景（３）

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ラット下肢筋の筋原線維の抗DLST抗体による免疫組織染色Z帯を中心にして赤色に染まっているところ（つまり、I-Z-I帯）に、PCPが存在する。

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抗DLST抗体で染色されたタンパク質はDLSTといかなる関係があるのか以下の方法で調べた。

① ラット筋肉より筋原線維を調整し、目的のタンパク質を精製して、アミノ酸の配列を部分的に決定する。この精製法は、本タンパク質を精製するための独自のものである。

② そのタンパク質に対応するmRNAをクローニングし、塩基配列を解析して、上記のタンパク質に符合するか確認する。

研究方法の手順

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筋原線維抽出物のウエスタン・ブロット解析によるPCPの存在確認

筋原線維抽出物をサンプルとして使用してSDS-PAGEを行い、抗DLST抗体を用いてウエ

スタン・ブロット解析した。

DLST以外に分子量40 KＤaと30 KＤaの２本のバンドが確認。

量的にはＰＣＰ－１のほうがＰＣＰ－２より数倍多い。

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新規タンパク質PCPの特性

• PCPを筋原線維から抽出するにはピロリン酸が必要である。ピロリン酸非存在下、0.8M NaClの高濃度では、ミオシン、アクチン、α-アクチニン、トロポミオシン等は筋原線維から抽出されるが、PCPは抽出されない。PCPが抽出されない限り、筋原線維はZ帯も含み完全に破壊されない。これは、PCPが筋原線維のZ帯の構造の形成に強く関与しているからであると解釈している。

• PCP-1はPCP-2と比べて抽出されにくい。PCP-1は筋原線維にかなり強く結合していると思われる。

• タンパク質凝集能に関するプログラム検索から、PCPは相当強い凝集能を所持することがわかる。

• 筋原線維におけるPCPの局在部位及びPCPの他のタンパク質へ絡みやすい性質とその強い凝集能から、PCPの生理的役割は、Z帯を強化すること、及びミオシン・フィラメント、アクチン・フィラメントを強固にZ帯に結び付けることにある。

現時点でPCPの役割を総括すると、PCPは筋原線維のZ帯の構造の形成を通して筋肉を強靱にしていると思われる。

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ラットPCP-1のcDNAの塩基配列（筋肉）

CCATCCCGCTGGCTCCGCGATGCTGTCCCGGTCCCGCTGCGTGTCCCGGGCGTTCAGCGCTCCGCTTTCTGCCTTCCAGAAGCATTAACAACAGTAGCTCTTCAGTGTTCGCTTCTTCCAAACCACGGCAGTGTGCAAGAATGATGTGATTACAGTCCAGACCCCAGCGTTTGCAGAGTCTGTCACAGAGGGAGATGTCAGGTGGGAGAAAGCTGTTGGAGATGCAGTTGCAGAAGATGAAGTGGTGTGTGAGATTGAGACAGACAAGACTTCTGTGCAGGTTCCATCACCAGCAAATGGCATCATTGAAGCTCTTTTGGTACCCGATGGGGGCAAAGTTGAAGGAGGAACTCCTCTATTCACACTCAGGAAAACCGGTGCTGCTCCTGCTAAGGCCAAACCAGCTGAAGCCCCTGCTACAGCCCACAAAGCAGCGCCTGAAGCACCGGCGGCCCCTCCT

M P P V P S P S Q P P S S K P V S A I KCCT CCT GTA GCA CCA GTG CCC ACT CAG ATG CCA CCT GTG CCC TCA CCC TCA CAA CCT CCT TCT AGC AAA CCA GTG TCT GCA ATA AAA

P T A A P P L A E A G A A K G L R S E H R E K M N R M R Q CCC ACT GCT GCC CCT CCA CTG GCT GAG GCG GGA GCT GCT AAA GGC CTG CGC TCA GAA CAT CGG GAA AAG ATG AAC AGG ATG CGG CAG

R I A Q R L K E A Q N T C A M L T T F N E V D M S N I Q ECGC ATC GCC CAG CGT CTG AAG GAA GCC CAG AAC ACC TGC GCA ATG CTG ACG ACG TTC AAT GAG GTT GAC ATG AGT AAC ATA CAA GAG

M R A R H K D A F L K K H N L K L G F M S A F V K A S A FATG AGA GCT CGG CAC AAA GAT GCT TTC CTG AAA AAA CAT AAC CTG AAA TTA GGC TTC ATG TCG GCA TTT GTG AAG GCC TCA GCA TTCA L Q E Q P V V N A V I D D A T K E V V Y R D Y I D I S V

GCC TTG CAG GAG CAG CCT GTA GTA AAC GCA GTG ATT GAT GAC GCA ACC AAG GAG GTG GTG TAC AGA GAT TAT ATT GAC ATC AGT GTCA V A T P R G L V V P V I R N V E T M N Y A D I E R T I N

GCA GTT GCT ACC CCA AGG GGT CTC GTG GTT CCT GTC ATC AGG AAT GTG GAA ACT ATG AAT TAT GCA GAT ATT GAA CGG ACC ATT AAT E L G E K A R K N E L A I E D M D G G T F T I S N G G V F

GAA CTA GGA GAG AAG GCC CGG AAG AAT GAA CTT GCC ATC GAA GAC ATG GAT GGG GGC ACC TTC ACC ATC AGC AAT GGA GGA GTT TTC G S L F G T P I I N P P Q S A I L G M H G I F D R P V A V

GGC TCA CTT TTC GGA ACA CCC ATT ATC AAC CCG CCT CAG TCT GCC ATT CTG GGC ATG CAT GGC ATC TTC GAC AGG CCT GTG GCT GTG G G K V E V R P M M Y V A L T Y D H R L I D G R E A V T F

GGG GGC AAG GTG GAA GTC CGA CCT ATG ATG TAT GTA GCC CTG ACC TAC GAC CAC CGG CTG ATT GAT GGC AGA GAG GCT GTG ACT TTC L R K I K A A V E D P A V L L L D L ***

CTC CGA AAA ATC AAG GCA GCA GTA GAA GAT CCA GCA GTC CTC CTC CTA GAC CTT TAG GAG GAA GCC ACA CAT GCC TAC CTA CTG ATC

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ラットのPCP-2のcDNAの塩基配列（筋肉）

CCATCCCGCTGGCTCCGCGATGCTGTCCCGGTCCCGCTGCGTGTCCCGGGCGTTCAGCGCTCCGCTTTCTGCCTTCCAGAAGCATTAACAACAGTAGCGTCTTCAGTGTTCGCTTCTTCCAAACCACGGCAGTGTGCAAGAATGATGTGATTACAGTCCAGACCCCAGCGTTTGCAGAGTCTGTCACAGAGG

M S G G R K T S V Q V P S P A N G I I E A L L V P D G G GAG ATG TCA GGT GGG AGA AAG ACT TCT GTG CAG GTT CCA TCA CCA GCA AAT GGC ATC ATT GAA GCT CTT TTG GTA CCC GAT GGG GGC

K V E G G T P L F T L G K T G A A P A K A K P A E A P A T AAA GTT GAA GGA GGA ACT CCT CTA TTC ACA CTC AGG AAA ACC GGT GCT GCT CCT GCT AAG GCC AAA CCA GCT GAA GCC CCT GCT ACA

A H K A A P E A P A A P P P P V A P V P T Q M P P V P S PGCC CAC AAA GCA GCG CCT GAA GCA CCG GCG GCC CCT CCT CCT CCT GTA GCA CCA GTG CCC ACT CAG ATG CCA CCT GTG CCC TCA CCC

S Q P P S S K P V S A I K P T A A P P L A E A G A A K G LTCA CAA CCT CCT TCT AGC AAA CCA GTG TCT GCA ATA AAA CCC ACT GCT GCC CCT CCA CTG GCT GAG GCG GGA GCT GCT AAA GGC CTG

R S E H R E K M N R M R Q R I A Q R L K E A Q N T C A M L CGC TCA GAA CAT CGG GAA AAG ATG AAC AGG ATG CGG CAG CGC ATC GCC CAG CGT CTG AAG GAA GCC CAG AAC ACC TGC GCA ATG CTG

T T F N E V D M S N I Q E M R A R H K D A F L K K H N L K LACG ACG TTC AAT GAG GTT GAC ATG AGT AAC ATA CAA GAG ATG AGA GCT CGG CAC AAA GAT GCT TTC CTG AAA AAA CAT AAC CTG AAA TTA

G F M S A F V K A S A F A L Q E Q P V V N A V I D D A T KGGC TTC ATG TCG GCA TTT GTG AAG GCC TCA GCA TTC GCC TTG CAG GAG CAG CCT GTA GTA AAC GCA GTG ATT GAT GAC GCA ACC AAG

E V V Y R D Y I D I S V A V A T P R G L V V P V I R N V E GAG GTG GTG TAC AGA GAT TAT ATT GAC ATC AGT GTC GCA GTT GCT ACC CCA AGG GGT CTC GTG GTT CCT GTC ATC AGG AAT GTG GAA

T M N Y A D I E R T I N E L G E K A R K N E L A I E D M D ACT ATG AAT TAT GCA GAT ATT GAA CGG ACC ATT AAT GAA CTA GGA GAG AAG GCC CGG AAG AAT GAA CTT GCC ATC GAA GAC ATG GAT

G G T F T I S N G G V F G S L F G T P I I N P P Q S A I LGGG GGC ACC TTC ACC ATC AGC AAT GGA GGA GTT TTC GGC TCA CTT TTC GGA ACA CCC ATT ATC AAC CCG CCT CAG TCT GCC ATT CTG

G M H G I F D R P V A V G G K V E V R P M M Y V A L T Y DGGC ATG CAT GGC ATC TTC GAC AGG CCT GTG GCT GTG GGG GGC AAG GTG GAA GTC CGA CCT ATG ATG TAT GTA GCC CTG ACC TAC GACH R L I D G R E A V T F L R K I K A A V E D P A V L L L D

CAC CGG CTG ATT GAT GGC AGA GAG GCT GTG ACT TTC CTC CGA AAA ATC AAG GCA GCA GTA GAA GAT CCA GCA GTC CTC CTC CTA GACL ***

CTT TAG GAG GAA GCC ACA CATGCCTACCTACTGATC

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DLST 遺伝子：約23 Kbほどの長さであり、15ケのエキソンから構成されている。

Exons1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

DLST 前駆体：エキソン１のATGから合成される。Exons Mature DLST1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ATG Translation Lipoic acid TAG

エキソン１、２、３、４と５の一部はミトコンドリアへの移行のシグナル・ペプチドである。エキソン６は活性中心の一つであるα—リポ酸が結合する部分である。

DLST遺伝子のエキソン構成の模式図

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PCP-1のエキソン構成の模式図Exons

1 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ATG Translation TAGPCP-2のエキソン構成の模式図

Exons1 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ATG Translation TAG

AG lack

PCP-1、PCP-2ともにミトコンドリアへの移行のシグナル・ペプチドとα—リポ酸が結合するアミノ酸配列部分は所持しない。

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ＰＣＰ-1とPCP-2のｍＲＮＡの特異的検出の開発

大量にあるＤＬＳＴ-ｍＲＮＡが混在するため、PCP-1とPCP-2のｍＲＮＡを特異的に検出することは難しい。疾患診断の実用化のために、PCP-1とPCP-2のｍＲＮＡの特異的検出の特異的プライマーの開発を考案した。

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PCP-1の特異的プライマーの設定ヒト：5’-tccgccttccagaagcat-3’, ラット：5’-tctgccttccagaagcat-3’

塩基数は３~４ケでなければならない。Exons 1 2 3 4 5 14 15

5’ 3’

PCP-2の特異的プライマーの設定塩基数は３~４ケでなければならない。

ヒト：5’-gtcaggtgggagaaagaca-3’, ラット：5’-gtcaggtgggagaaagact-3’Exons 4 5 6 7 14 15

5’ 3’

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PCP-1に特異的なプライマーを設定してのPCP-1-cDNAの検出

PCP-1に特異的な上流プライマー；ヒト：5’-tccgccttccagaagcat-3’, ラット：5’-tctgccttccagaagcat-3’

下線の塩基配列はそれぞれヒト、ラットのエキソン1の末端側の配列であり、下線なしの塩基配列はそれぞれヒト、ラットのエキソン４の最初の３塩基の配列である。

テンプレートはヒト、ラットの筋肉のcDNAライブラリーを使用し、図3のごとく、第一回目のPCRを行い、第二回目のPCRでは、上流はPCP-1に特異的な上流プライマーを使用し、下流はDLSTのエキソン１５の3’-non-coding領域の部分にプライマー(first PCR, 5’-gttgcacgggctagaagactgg-3’とsecond PCR、5’-gatcagtaggtaggc-3’)を設定して行った。Mは分子量マーカー、レーン1と２はそれぞれヒト、ラットのPCRである。

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PCP-2に特異的なプライマーを設定してのPCP-2-cDNAの検出PCP-2に特異的な上流プライマー；

ヒト：5’-ggagatgtcaggtgggagaaagaca-3’, ラット：5’-ggagatgtcaggtgggagaaagact-3’下線の塩基配列はそれぞれヒト、ラットのエキソン5の末端側の配列であり、下線なしの塩基

配列はそれぞれヒト、ラットのエキソン7の最初の３塩基の配列である。テンプレートはヒト、ラットの筋肉のcDNAライブラリーを使用し、図3のごとく、第一回目の

PCRを行い、第二回目のPCRでは、上流はPCP-2に特異的な上流プライマーを使用し、下流はDLSTのエキソン１５の3’-non-coding領域の部分にプライマー(first PCR, 5’-gttgcacgggctagaagactgg-3’とsecond PCR、5’-gatcagtaggtaggc-3’)を設定して行った。

Mは分子量マーカー、レーン1と２はそれぞれヒト、ラットのPCRである。

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PCP-１とPCP-2のmRNAの存在の確認

RNA はClontech社のヒト骨格筋total RNAを使用した。RT-PCRはタカラ社のPrime ScriptTMRT-PCRキットを使用した。第一回目のRT-PCRは、プライマーとしてオリゴdTプライマーを使用して行った。第二回目のPCRでは、上流はヒトPCP-1とPCP-2に特異的なプライマーを使用し、下流はヒトDLST遺伝子のエキソン7、あるいはエキソン8で設定したプライマーを用いて行った。エキソン７でのプライマー：5’-tcacgccatttgctggtgatgg-3’エキソン８でのプライマー：5’-ttcagccggcttggccttagc-3’Mは分子量マーカー、レーン1と2は、PCP-1に特異的なプライマーとエキソン７のプライマー、レーン3と4は、PCP-1に特異的なプライマーとエキソン8のプライマー、レーン5と6は、PCP-2に特異的なプライマーとエキソン７のプライマー。

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想定される用途

• 本タンパク質は、筋肉のZ帯に存在することから、本タンパク質の変異による筋肉の疾患とのかかわりが強く想定される。

特に、心筋症は家族内で発症することが多く、遺伝性が強

いが、原因遺伝子はほとんど不明である。そこで、本タンパク質の遺伝子検査キットとして、その用途が主に想定される。

• また、筋肉の研究という点に着目すると、家畜の肉質検査法の開発の可能性も考えられる。

• 本タンパク質自信の特性から、現在、想定できない用途が将来考えられる可能性がある。

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想定される業界

• 想定されるユーザー① 遺伝子検査を行う医療業界

② 遺伝子検査キットの製造・販売業界

• 想定される市場規模心筋症は人口５００人に約一人の頻度でみられ、めずらしくない病気なので、その検査としては、かなりの数が想定される。

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実用化に向けた課題• 現在、新規タンパク質のmRNAを特異的に検出す

る方法は確立したが、しかし、本タンパク質の変異による疾患探索は、今まさに始めたところである。

• 本タンパク質の変異による疾患が見い出されば、本タンパク質の遺伝子検査キットの開発には、大きな問題はない。

• 本タンパク質に興味を抱かれ、将来、本タンパク質の遺伝子検査キットの開発・製造は夢ではないと期待される企業との共同研究を希望する。

企業への期待

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：筋肉由来の新規タンパク質• 出願番号 ：特願2008-084516• 出願人 ：国立大学法人鹿屋体育大学• 発明者 ：松田貞幸、中野恭子

お問い合わせ先• （株）鹿児島TLO• Address:〒890-0065• 鹿児島県鹿児島市郡元1丁目21番40号 鹿児島大学内• Tel: 099-284-1631 Fax: 099-284-1632• URL: http://www.ktlo.co.jp/• E-mail: info@ktlo.co.jp

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