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分子病理診断の基礎技術と原理ー分子病理診断講習会ー
大阪大学大学院医学系研究科
病態病理学・病理診断科
森井 英一
第104回日本病理学会総会COI 開示
筆頭発表者名:森井 英一
演題発表に関連し、開示すべきCIO関係にある企業などはありません。
基本中の基本
染色体(山のような遺伝子の集まり)
DNA
RNA
蛋白質
基本中の基本
染色体(山のような遺伝子の集まり)
DNA
RNA
蛋白質
PCR
基本中の基本
染色体(山のような遺伝子の集まり)
DNA
RNA
蛋白質
PCR
Western Blotting
PCR
欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる
遺伝子 A
遺伝子 B
遺伝子 C
遺伝子 Z
PCR
欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる
遺伝子 A
遺伝子 B
遺伝子 C
遺伝子 Z
PCR
欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる
遺伝子 A
遺伝子 B
遺伝子 C
遺伝子 Z
HybridizationとDNA polymeraseの活用
Hybridization
ある一本鎖DNAと相補的な配列をもつ一本鎖DNAの結合
DNA
Hybridization
ある一本鎖DNAと相補的な配列をもつ一本鎖DNAの結合
DNA
5’-GTAGAAGGCCT-3’
3’-CATCTTCCGGA-5’
DNA polymerase
一本鎖DNAの一部が二本鎖になると、そこからDNAを伸ばして全体を二本鎖にする酵素
DNA
DNA polymerase
一本鎖DNAの一部が二本鎖になると、そこからDNAを伸ばして全体を二本鎖にする酵素
DNA
primer
PCR
HybridizationとDNA polymeraseの活用
遺伝子 A
準備するもの増幅したい部分の両端を認識する短いDNA (primer)Taq polymeraseサーマルサイクラー(温度を時間を決めて上げ下げする装置)
PCR
HybridizationとDNA polymeraseの活用
遺伝子 A
準備するもの増幅したい部分の両端を認識する短いDNA (primer)Taq polymeraseサーマルサイクラー(温度を時間を決めて上げ下げする装置)
PCR
室温
94度
50度(一例)
PCR
50度
72度
94度
PCR
94度
50度
PCR
72度
50度
PCR
94度、50度、72度を繰り返すことで、DNAの一部が増幅できる
PCR
増幅したいDNAの量が、もともと多ければ、、、、、
早くDNAが増幅される。
これを利用すれば、RNAの量を定量することができる。(RT-PCR)
RT-PCR
mRNA
cDNA
逆転写(Reverse Transcription, RT)
cDNAの量をPCRで見積もることで、元のmRNAの量を定量する。
RT-PCR
mRNA
cDNA
逆転写(Reverse Transcription, RT)
PCR
RT-PCR
mRNA
cDNA
逆転写(Reverse Transcription, RT)
PCR
均等に増幅されることが大前提
PCRにおけるサイクル数とDNA量
DNA量
サイクル数
PCRにおけるサイクル数とDNA量
DNA量
サイクル数
PCRにおけるサイクル数とDNA量
DNA量
サイクル数
1サイクル毎に増幅されたDNA量を定量
DNA量
サイクル数
定量的PCR
基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく
定量的PCR
基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく
定量的PCR
基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく
蛍光量をサイクル毎に測定する
定量的PCR
基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく
蛍光量をサイクル毎に測定する
欠点は、非特異的に増幅されたDNAも一緒に測定されてしまうこと
定量的PCR
TaqMan法
プライマー相補的なプローブ
消光物質発光物質
定量的PCR
TaqMan法
プライマー
定量的PCR
TaqMan法
プライマー
定量的PCR
TaqMan法
プライマー
定量的PCR
Western Blotting
あるタンパク質の量を見積もる方法
タンパク質 Aタンパク質 Bタンパク質 C
・・・
タンパク質 Z
膜の上に移す
膜の上での物探し
タンパク質を電気泳動
膜の上に移す
膜の上での物探し
タンパク質を電気泳動
目的のものは、どこにあるのか?
目的の蛋白質
抗原ー抗体反応を利用
目的の蛋白質に特異的な抗体
Western blotting法
Western Blottingの例
ふたたび
染色体(山のような遺伝子の集まり)
DNA
RNA
蛋白質
PCR
Western Blotting