Upload
tranthuy
View
216
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
Carla Maria Osório Silva
CONDROITINASE ABC E CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NO
TRATAMENTO DE Rattus norvegicus SUBMETIDOS A TRAUMA AGUDO DA
MEDULA ESPINHAL
Belo Horizonte
UFMG - Escola de Veterinária
2013
Tese apresentada à Universidade Federal de Minas
Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Ciência Animal na área de Medicina e
Cirurgia Veterinárias.
Orientadora: Profª Eliane Gonçalves de Melo
Co-orientadores: Profª Drª Rogéria Serakides
Prof. Dr. Alfredo Miranda de Goes
5
Aos meus pais, José Carlos e Sônia
Ao Mikael, meu amor
Aos meus filhos, Caio e Davi, presentes da vida, que se tornaram instantaneamente a parte mais
importante dela.
6
AGRADECIMENTOS
Ao Divino Espírito Santo que nos ilumina
Aos meus pais pelo amor, apoio e incentivo sempre! Por serem meus exemplos de vida e meu
porto seguro e, também pelo tempo cuidando dos netos que permitiram que eu me dedicasse a
esse trabalho mais tranquilamente.
Ao meu marido e filhos por completarem, alegrarem e encherem minha vida de amor, tornando
tudo melhor.
À Professora Eliane por acreditar no meu potencial, obrigada pela confiança, paciência e
valiosas orientações.
À Professora Rogéria pelas preciosas orientações, colaborações e ensinamentos.
Ao professor Alfredo, Juliana e toda equipe do laboratório de Imunologia Celular e Molecular
do ICB por me receberem tão bem e contribuírem tanto com o trabalho.
À amiga Karen pela amizade, apoio pessoal, profissional e grandiosa ajuda durante todo o
doutorado.
Aos amigos Mário, Jankerle, Fátima, Fabíola, Tati, Juneo, Isabel e Endrigo pelo apoio, amizade
e contribuição.
Aos colegas Pablo, Bernardo, Bruno e toda equipe de neurologia e, aos alunos de iniciação
científica Guilherme, Laís e Anna pela ajuda na fase experimental.
Ao pessoal do laboratório de patologia especialmente o Juneo e a Leimar pela grandiosa ajuda.
Aos professores Milene Rachid, Alexandre Mazzanti, Natália Laporte e Vitor Márcio, que
compuseram a banca de defesa, pela contribuição na finalização desse trabalho.
Ao professor Rubens pela contribuição durante a qualificação.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.
A todos os funcionários do Hospital Veterinário, da esterilização, da secretária de pós-
graduação e da portaria do departamento pela convivência agradável, disponibilidade e
colaboração.
Aos animais, especialmente Peçanha e Mendonça, pelo apoio emocional e também aos animais
experimentais, que involuntariamente cederem a vida para realização desse estudo.
A todos que de alguma forma contribuíram para realização desse trabalho.
7
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA – Análise de variância
ATP – Adenosina tri-fosfato
BBB – Escala de escores motores proposta por Basso, Beatie e Bresnahan
BDNF – Fator neurotrófico derivado do encéfalo
CETEA/UFMG – Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de
Minas Gerais
CD – Cluster of differentiation
cDNA – Ácido desoxirribonucléico complementar (cDNA).
CDT – Condroitinase ABC
CDT+CTM – Condroitinase ABC mais células tronco mesenquimais
CN – Controle negativo
CT – Ciclo limiar
CTM – Células tronco mesenquimais
DCCV – Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias da Escola de Veterinária
DMEM – Dulbecco’s modified Eagle’s médium
DNA – Ácido desoxirribonucléico
eGFP – Enhanced green fluorescent protein (proteína verde fluorescente melhorada)
EV – Escola de Veterinária
FACScan – Fluorescence Activated Cell Analyser
FC – Fold change (expressão gênica relativa)
GAG – Glicosaminoglicanos sulfatados
GFAP – Proteína ácida fibrilar glial
GFP – Green fluorescent protein (proteína verde fluorescente)
HE – Hematoxilina e eosina
HGF – Fator de crescimento do hepatócito
HLA-DR – Antígeno-DR leucocitário humano classe II
ICB – Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas
IGF-1 – Fator de crescimento semelhante à insulina
IV – Intravenosa
8
KDR – Kinase insert domain receptor (receptor do VEGF)
KW – Kruskal-Wallis
MAG – Glicoproteína associada à mielina
NGF – Fator de crescimento do nervo
NT-3 – Neurotrofina -3
OMgp – Glicoproteína oligodendrocito-mielina
PBS – Phosphate buffered saline (Tampão fosfato salino)
PCR – Reação em cadeia da polimerase
PECAM-1 – Molécula de adesão celular endotélio plaquetária
PGSC – Proteoglicanos sulfato de condroitina
PLA – Grupo placebo
RNA – Ácido ribonucléico
RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro
RT-PCR – Reação em cadeia da polimerase transcriptase-reversa
SC – Subcutânea
SDF-1 – Fator 1 derivado de células estromais
S-N-K – Student-Newman-Keuls
TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais
VEGF – Fator de crescimento do endotélio vascular
9
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................
LISTA DE TABELAS ...................................................................
LISTA DE FIGURAS ....................................................................
LISTA DE QUADROS ..................................................................
RESUMO ........................................................................................
ABSTRACT ...................................................................................
7
11
11
16
17
18
1. INTRODUÇÃO ............................................................................. 19
2. HIPÓTESE ..................................................................................... 21
2.1. Hipótese geral .................................................................................. 21
2.2. Hipóteses particulares ...................................................................... 21
3. OBJETIVOS................................................................................... 22
3.1
3.2
Objetivo geral ..................................................................................
Objetivos específicos .......................................................................
22
22
4. REVISÃO DE LITERATURA ................................................ 24
4.1. Fisiopatologia da lesão medular ...................................................... 24
4.2. O efeito inibitório da cicatriz glial e a enzima bacteriana
condroitinase ABC ..........................................................................
25
4.3. Ação das células tronco e das neurotrofinas na lesão medular ........ 27
5. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................... 30
5.1. Coleta da medula óssea, isolamento e cultivo das células tronco
mesenquimais da medula óssea transgênicas para proteína verde
fluorescente ......................................................................................
30
5.1.1. Caracterização fenotípica das células tronco mesenquimais da
medula óssea transgênicas para proteína verde fluorescente por
citometria de fluxo ...........................................................................
31
5.2. Uso de condroitinase e células tronco mesenquimais da medula
óssea, isoladas ou associadas ...........................................................
31
5.2.1. Animais ............................................................................................ 31
5.2.2. Grupos experimentais ...................................................................... 32
10
5.2.3. Protocolos anestésico e cirúrgico .................................................... 32
5.2.4. Injeção intramedular de condroitinase ABC ou líquido
cefalorraquidiano artificial ..............................................................
33
5.2.5.
5.2.6.
5.2.7.
5.2.8.
5.2.9.
5.2.10.
Injeção de células tronco mesenquimais da medula óssea ou PBS..
Avaliação da capacidade motora .....................................................
Eutanásia ..........................................................................................
Avaliação da expressão gênica relativa do BDNF, NT-3, VEGF,
KDR, PECAM-1 e caspase 3 por RT-PCR em tempo real ............
Avaliação anatomopatológica e imunoistoquímica .........................
Análise estatística ............................................................................
33
35
36
37
39
40
6. RESULTADOS .............................................................................. 41
6.1. Isolamento e cultivo das células tronco mesenquimais da medula
óssea transgênicas para proteína verde fluorescente .......................
41
6.2. Protocolos anestésico e cirúrgico .................................................... 41
6.3.
6.4.
6.5.
Injeção intramedular de condroitinase ABC ou líquido
cefalorraquidiano artificial ..............................................................
Avaliação da capacidade motora .....................................................
Avaliação da expressão gênica relativa do BDNF, NT-3, VEGF,
KDR, PECAM-1 e caspase 3 por RT-PCR em tempo real .............
41
41
43
7. DISCUSSÃO .................................................................................. 54
8. CONCLUSÕES .............................................................................. 66
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………… 67
10. ANEXOS …………………………………………………………. 78
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Genes com a respectiva sequência de nucleotídeos dos primes
iniciadores para RT-PCR em tempo real ...............................................
37
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema demonstrando a expansão da lesão primária frente à ocorrência
dos eventos secundários que resulta na formação de cistos e cavidades
exacerbando a disfunção neurológica (Adaptado de Taoka e Okajima,
1998) ...........................................................................................................
25
Figura 2. Genes com a respectiva sequência de nucleotídeos dos primes
iniciadores para RT-P Fotografias a, b e c demonstram animal em
procedimento cirúrgico de trauma medular experimental. a)
Visualização, após laminectomia, da medula espinhal com aspecto
normal (seta); b) Lesão compressiva da medula com peso de 70,5 g
(seta); c) Visualização da medula com hemorragia após o trauma (seta).
d) Infusão intramedular de condroitinase ou líquido cefalorraquidiano
artificial, observa-se a micro bomba de infusão (estrela) conectada a uma
seringa de Hamilton (seta) ..........................................................................
34
Figura 3. Linha de tempo demonstrando a localização temporal dos
procedimentos: cirurgia de laminectomia com ou sem trauma
(laminectomia ou trauma); injeção intramedular de condroitinase ou
placebo (injeção CDT ou placebo); injeção de células tronco
mesenquimais da medula óssea ou placebo (injeção CTM ou placebo);
avaliação da capacidade motora pela escala de escores motores proposta
por Basso, Beatie e Bresnahan (BBB) e eutanásia .....................................
36
Figura 4. Gráfico com o perfil das medianas dos escores motores de ratos Lewis
submetidos à laminectomia ou trauma medular espinhal e tratados com
células tronco e/ou condroitinase, ou veículo, em cada um dos oito dias
da avaliação após o procedimento cirúrgico. (CN=controle negativo,
12
PLA= placebo, CDT= condroitinase, CTM= células tronco
mesenquimais e CDT+CTM= condroitinase e células tronco). Observa-
se que na oitava avaliação, 28 dias após o trauma, o grupo CDT
apresenta escores motores semelhantes ao CN, mas não se difere dos
demais grupos. Letras minúsculas diferentes expressam diferença
estatística (p<0,05) .....................................................................................
42
Figura 5. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão
médio) de BDNF em ratos submetidos a trauma agudo da medula
espinhal associado ao tratamento com placebo (PLA), condroitinase
(CDT), células tronco mesenquimais (CTM) e condroitinase mais células
tronco mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o
trauma medular. Os dados estão expressos em relação ao controle
negativo (linha tracejada). * p<0,05 ...........................................................
43
Figura 6. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão
médio) de NT-3 em ratos submetidos a trauma agudo da medula espinhal
associado ao tratamento com placebo (PLA), condroitinase (CDT),
células tronco mesenquimais (CTM) e condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma
medular. Os dados estão expressos em relação ao controle negativo
(linha tracejada). (p<0,05) .................................................................. ........
44 Figura 7. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão
médio) de VEGF em ratos submetidos a trauma agudo da medula
espinhal associado ao tratamento com placebo (PLA), condroitinase
(CDT), células tronco mesenquimais (CTM) e condroitinase mais células
tronco mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o
trauma medular. Os dados estão expressos em relação ao controle
negativo (linha tracejada). * p<0,05. ..........................................................
44
Figura 8. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão
médio) do receptor do VEGF, KDR (kinase insert domain receptor), em
ratos submetidos a trauma agudo da medula espinhal associado ao
tratamento com placebo (PLA), condroitinase (CDT), células tronco
mesenquimais (CTM) e condroitinase mais células tronco mesenquimais
13
(CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma medular. Os
dados estão expressos em relação ao controle negativo (linha tracejada).
* p<0,05 ......................................................................................................
45
Figura 9. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão
médio) de PECAM-1 em ratos submetidos a trauma agudo da medula
espinhal associado ao tratamento com placebo (PLA), condroitinase
(CDT), células tronco mesenquimais (CTM) e condroitinase mais células
tronco mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o
trauma medular. Os dados estão expressos em relação ao controle
negativo (linha tracejada). * p<0,05. ..........................................................
45
Figura 10. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão
médio) de caspase 3 em ratos submetidos a trauma agudo da medula
espinhal associado ao tratamento com placebo (PLA), condroitinase
(CDT), células tronco mesenquimais (CTM) e condroitinase mais células
tronco mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o
trauma medular. Os dados estão expressos em relação ao controle
negativo (linha tracejada). * p<0,05 ...........................................................
46
Figura 11. Fotomicrografias de secções transversais de cortes seriados da medula
espinhal de um rato 30 dias após trauma medular agudo grave. Pode-se
observar o agravamento da lesão nas regiões craniais (A a D) até o
epicentro (E) e posterior retorno a normalidade tecidual nas secções
caudais (F a I). A) Presença de área de mielomalácia focalmente extensa,
limitada ao funículo dorsal, com perda de substância; B) e C) Área de
necrose focalmente extensa intensa que se estende do funículo dorsal ao
lateral da substância branca passando pela substância cinzenta,
predominantemente em um dos lados. Distensão intensa do canal central;
D) Mielomalácia difusa intensa com áreas de degeneração axonal na
periferia da substância branca, predominantemente em um dos lados; E)
Mielomalácia difusa F) Mielomalácia multifocal a coalescente intensa
que se estende tanto na substância branca quanto na cinzenta; G) e H)
Área focalmente extensa de mielomalácia de moderada a intensa no
funículo dorsal e ventral associada a áreas de degeneração axonal
multifocal moderada em toda substância branca; I) Área de mielomalácia
14
focalmente extensa limitada ao funículo dorsal. (Barra = 264 µm). J)
Gliócitos reativos; K) Células de Gitter. (Barra = 17 µm). ........................
48
Figura 12. Média da intensidade integrada de pixels (± erro padrão médio) da
marcação por imunoistoquímica para anticorpo anti-neuN em ratos
submetidos à laminectomia (CN) ou trauma medular agudo associado ao
tratamento com placebo (PLA), condroitinase (CDT), células tronco
mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma
medular. * p<0,05. .....................................................................................
49
Figura 13. Média da intensidade integrada de pixels (± erro padrão médio) da
marcação por imunoistoquímica para anticorpo GFAP em ratos
submetidos à laminectomia (CN) ou trauma medular agudo associado ao
tratamento com placebo (PLA), condroitinase (CDT), células tronco
mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma
medular. * p<0,05.......................................................................................
50
Figura 14. Média da intensidade integrada de pixels (± erro padrão médio) da
marcação por imunoistoquímica para anticorpo anti-vimentina em ratos
submetidos à laminectomia (CN) ou trauma medular agudo associado ao
tratamento com placebo (PLA), condroitinase (CDT), células tronco
mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma
medular. * p<0,0. .......................................................................................
50
Figura 15. Fotomicrografias de secções transversais da medula espinhal de ratos
submetidos à imunoistoquímica com anti-nenN trinta dias após a
realização da laminectomia, com ou sem trauma medular. A) Controle
negativo da bateria, secção que não recebeu o anticorpo; B) Medula
espinhal de animal pertencente ao grupo controle negativo (CN); C)
Medula espinhal de animal pertencente ao grupo placebo (PLA); D)
Medula espinhal de animal pertencente ao grupo condroitinase (CDT);
E) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo células tronco
mesenquimais da medula óssea (CTM); F) Medula espinhal de animal
pertencente ao grupo que recebeu a condroitinase e as células tronco
15
mesenquimais (CDT+CTM). Pode-se observar imunomarcação intensa
nas secções pertencentes a animais dos grupos CN, CTM e CDT+CTM.
(Barra = 44 µm). .........................................................................................
51
Figura 16. Fotomicrografias de secções transversais da medula espinhal de ratos
submetidos à imunoistoquímica com anti-GFAP trinta dias após a
realização da laminectomia, com ou sem trauma medular. A) Controle
negativo da bateria, secção que não recebeu o anticorpo; B) Medula
espinhal de animal pertencente ao grupo controle negativo (CN); C)
Medula espinhal de animal pertencente ao grupo placebo (PLA); D)
Medula espinhal de animal pertencente ao grupo condroitinase (CDT);
E) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo células tronco
mesenquimais da medula óssea (CTM); F) Medula espinhal de animal
pertencente ao grupo que recebeu a condroitinase e as células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). As secções pertencentes aos animais do
grupo PLA e CDT+CTM tiveram imunomarcação maior do que as do
CN (Barra = 44 µm). ..................................................................................
51
Figura 17.
Figura 18.
Fotomicrografias de secções transversais da medula espinhal de ratos
submetidos à imunoistoquímica com anti-vimentina trinta dias após a
realização da laminectomia, com ou sem trauma medular. A) Controle
negativo da bateria, secção que não recebeu o anticorpo; B) Medula
espinhal de animal pertencente ao grupo controle negativo, submetido à
laminectomia sem trauma medular (CN); C) Medula espinhal de animal
pertencente ao grupo placebo (PLA); D) Medula espinhal de animal
pertencente ao grupo condroitinase (CDT); E) Medula espinhal de
animal pertencente ao grupo células tronco mesenquimais da medula
óssea (CTM); F) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo que
recebeu a condroitinase e as células tronco mesenquimais (CDT+CTM).
Pode-se observar que todas as secções pertencentes a animais
submetidos a trauma medular apresentam imunomarcação mais intensa
do que a secção pertencente ao CN e, que a secção do grupo PLA possui
imunomarcação mais intensa do que a do grupo CDT (Barra = 44 µm). ..
Fotomicrografias de secções transversais da medula espinhal de ratos
submetidos à imunoistoquímica com anti-GFP 30 dias após a realização
52
16
da laminectomia com trauma medular. A) Medula espinhal de animal
pertencente ao grupo placebo (PLA); B) Medula espinhal de animal
pertencente ao grupo células tronco mesenquimais da medula óssea
(CTM). Pode-se observar imunomarcação somente na secção
pertencentes ao animal do grupo CTM (Barra = 500 µm). ........................
52
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Escala de escores para a capacidade motora de ratos proposta por Basso,
Beatie e Bresnahan (1995) ...................................................................
20
17
RESUMO
A lesão da medula espinhal atinge pessoas e animais ocasionando déficits motores e sensoriais
que comprometem consideravelmente a qualidade de vida e, no caso dos animais, muitas vezes,
levam à eutanásia. O tratamento dessa afecção é um desafio para os pesquisadores, pois ainda
não há terapia efetiva para essa complexa patologia. Nesse contexto, a utilização de células
tronco surge como recurso terapêutico particularmente promissor, pois além de secretarem
fatores neurotróficos, essas células podem se diferenciar em neurônios e componentes gliais,
contudo essas ações parecem ser prejudicadas pela cicatriz glial formada após a lesão medular.
A enzima bacteriana condroitinase ABC tem a capacidade de digerir essa cicatriz o que poderia
favorecer a ação dessas células bem como a regeneração axonal. Com o objetivo de estudar o
efeito da condroitinase ABC e das células tronco mesenquimais da medula óssea, em terapia
única ou associada, no tratamento do trauma à medula espinhal foram utilizados 50 Rattus
norvegicus divididos em cinco grupos. Os animais do grupo controle negativo (CN) foram
submetidos à laminectomia, enquanto os demais sofreram adicionalmente trauma medular
compressivo e foram tratados com placebo (PLA), condroitinase ABC (CDT), células tronco
mesenquimais da medula óssea (CTM) ou condroitinase e células tronco associadas
(CDT+CTM). A CDT, ou PLA, foram administrados via intralesional, sete dias após a
laminectomia; enquanto as CTM, ou PLA, foram injetados via intravenosa, 14 dias após a
laminectomia. Os animais foram avaliados quanto à capacidade motora e, 30 dias após a
laminectomia, procedeu-se a eutanásia e posterior verificação das alterações histopatológicas da
medula espinhal. As medulas espinhais foram avaliadas também por meio da PCR, para
quantificação da expressão gênica do BDNF, NT-3, VEGF, KDR, PECAM-1 e caspase 3; e da
imunoistoquímica, para detecção das células tronco injetadas (anti-GFP) e quantificação de
astrócitos (anti-GFAP), neurônios (anti-NeuN) e vimentina. Não houve diferença estatística na
capacidade motora dos animais submetidos ao trauma. Quanto à expressão gênica, o CTM foi
superior na quantificação do BDNF e do VEGF e, não houve diferença entre os tratamentos
quanto ao NT-3, KDR, PECAM-1 e caspase-3. Na avaliação imunoistoquímica, as células
tronco transgênicas foram detectadas nos grupos que a receberam. A marcação dos neurônios
foi maior no grupo CDT+CTM em relação ao PLA. A imunomarcação para o GFAP foi maior
nos grupos PLA e CDT+CTM do que no CN. Quanto à vimentina, a imunomarcação do CN foi
menor e se diferiu de todos os grupos com trauma, sendo que entre esses, o CDT obteve a
menor marcação. Concluiu-se que as células tronco mesenquimais foram eficientes para
promover aumento na expressão dos fatores tróficos BDNF e VEGF ocasionando
neuroproteção. A condroitinase ABC se mostrou efetiva na redução da cicatriz glial, verificada
pela imunomarcação da vimentina. Não se observou sinergismo da associação CDT+CTM.
Palavras-chaves: trauma da medula espinhal, condroitinase, células tronco mesenquimais da
medula óssea, ratos
18
ABSTRACT
The spinal cord injury affects people and animals causing sensory and motor deficits that
greatly affect the quality of life and, in the case of animals, often lead to euthanasia. The
treatment of this condition is a challenge for researchers because there is still no effective
therapy for this complex pathology. In this context, the use of stem cells as a therapeutic
resource appears particularly promising, because in addition to secrete neurotrophic factors,
these cells can differentiate into neurons and glial components, however these actions appear to
be harmed by the glial scar formed after spinal cord injury. The bacterial enzyme chondroitinase
ABC is able to digest this scar which could favor the action of these cells as well as axonal
regeneration. The present study aimed to evaluate the effect of chondroitinase ABC and bone
marrow mesenchymal stem cells in single or combination therapy, in the treatment of rats
subjected to spinal cord injury. Fifty Rattus norvegicus were divided into five groups. The
animals in the negative control group (CN) underwent laminectomy, while the others suffered
addictionaly spinal cord compression and were treated with placebo (PLA), chondroitinase
ABC (CDT), bone marrow mesenchymal stem cells (CTM) or chondroitinase and stem cells
associated (CDT + CTM). The chondroitinase or placebo were administered intralesionally,
seven days after laminectomy, while the stem cells, or placebo, were injected intravenously 14
days after laminectomy. The animals were assessed for motor skills and, 30 days after
laminectomy, proceeded to euthanasia and subsequent verification of histopathological changes
in the spinal cord. The spinal cords were also evaluated by PCR for quantification of gene
expression of BDNF, NT-3, VEGF, KDR, PECAM-1 and caspase 3; and by
immunohistochemistry to detect the injected stem cells (anti-GFP) and quantification of
astrocytes (anti-GFAP), neurons (anti-NeuN) and vimentin.There was no statistical difference in
motor ability of animals subjected to trauma. The group CTM had the highest gene expression
of BDNF and VEGF. There was no statistical difference between treatments for the gene
expression of NT-3, KDR, PECAM -1 and caspase-3. In immunohistochemistry, labeling of
neurons was higher in the CDT + CTM compared to PLA. Immunostaining for GFAP was
higher in PLA and CDT+CTM than in CN. As for immunostaining of vimentin, the CN was
lower and differed from all groups with trauma, and among these, CDT showed the lowest
expression. It was concluded that the mesenchymal stem cells were effective in promoting
increased expression of trophic factors BDNF and VEGF. The chondroitinase ABC was
effective in reducing glial scar, verified by immunostaining of vimentin. There was no
synergistic effect on use associated stem cells with chondroitinase.
Keywords: spinal cord injury, bone marrow mesenchymal stem cells, chondroitinase, rats
19
1. INTRODUÇÃO
Estima-se que dois milhões e meio de
pessoas convivam com lesão da medula
espinhal e que mais de 130 mil novos casos
ocorram por ano no mundo (Thuret et al.,
2006; Hu et al., 2010). Essa afecção
acomete cerca de 10.000 brasileiros
anualmente, sendo a maioria constituída por
jovens adultos, em plena fase produtiva
(Campos et al., 2008). Em medicina
veterinária de pequenos animais, embora
não se conheça a incidência exata dessa
patologia (Webb et al., 2010), ela é
frequentemente encontrada (Tator e
Fehlings, 1991; Bergman et al., 2000) e
muitas vezes determina a morte ou
eutanásia desses animais (Colter e Rucker,
1988).
O reparo do sistema nervoso central é muito
limitado após uma lesão. O trauma leva a
morte celular, particularmente de neurônios,
oligodendrócitos, astrócitos e precursores
celulares. Qualquer cavidade ou cisto
resultante dessas mortes pode interromper
os tratos axonais (Ryu et al., 2009; Kundi et
al., 2013) levando a várias anormalidades
neurológicas, notadamente paresia e
paralisia (Webb et al., 2010). Dessa forma,
o trauma espinhal pode deixar sequelas
debilitantes e permanentes com influências
negativas sobre a qualidade e perspectiva de
vida do paciente. O prognóstico ainda é
desfavorável, pois as terapias disponíveis
têm resultados limitados na recuperação
neurológica. Sendo assim, essa afecção
constitui problema desafiador para os
pesquisadores (Brown e Hall, 1992; Thuret
et al., 2006; Ng et al., 2011).
A utilização das células tronco nesse tipo de
lesão surge como possibilidade de terapia
particularmente promissora, pois além de se
diferenciarem em neurônios e componentes
da glia, repondo as células perdidas, elas
também atuam como ponte de apoio para a
regeneração axonal (Dasari et al., 2007). As
células tronco adultas podem se diferenciar
em fenótipos neuronais apropriados em
uma medula espinhal danificada
(Boulenguez e Vinay, 2009; Ryu et al.,
2009), entretanto, seu principal potencial
não vem dessa propriedade, mas sim da
capacidade de produção, ou estímulo à
liberação endógena, de fatores tróficos
(Chen et al., 2005; Lu et al., 2005; Sasaki et
al., 2009). Dentre as células utilizadas, as
mesenquimais têm sido estudadas
intensivamente devido ao seu potencial para
tratar doenças neurodegenerativas e injúrias
traumáticas (Dasari et al., 2007). A
utilização desse tipo celular, proveniente da
medula óssea, é clinicamente atraente
devido à facilidade de obtenção, expansão e
reprodutibilidade, além da possibilidade de
realização de transplante autólogo,
minimizando o risco de rejeição (Wright et
al., 2011).
Quando as células tronco são transplantadas
para uma medula espinhal lesionada
geralmente encontram ambiente
desfavorável ao seu crescimento e à
diferenciação devido a existência de uma
barreira, a cicatriz glial (Karimi-
Abdolrezaee et al., 2010). Essa cicatriz é
resultante de processo multifatorial no qual
ocorre proliferação e hipertrofia de
astrócitos (Taoka e Okajima, 1998; Yiu e
He, 2006; Hu et al., 2010) e, envolve ainda
a participação de progenitores gliais,
micróglias, macrófagos, fibroblastos e
células de Schwann (Ryu et al., 2009).
Os proteoglicanos sulfato de condroitina
(PGSC) estão entre os principais
componentes desse tecido cicatricial e têm
propriedades que impedem o crescimento
axonal (Ikegami et al., 2005; Rolls et al.,
20
2008; Wright et al., 2011). Essa ação
inibitória depende substancialmente das
cadeias de glicosaminoglicanos presentes
na molécula do PGSC (Iaci et al., 2007;
Galtrey et al., 2008; Iseda et al., 2008).
Com intuito de digerir essa cadeia de
glicosaminoglicanos no PGSC e reduzir o
efeito negativo no crescimento neural, tem
sido testada a enzima bacteriana
condroitinase ABC (CDT) na injúria
medular (Iaci et al., 2007; Galtrey et al.,
2008; Garcia-Alias et al., 2008; Iseda et al.,
2008; Karimi-Abdolrezaee et al., 2010;
Wright et al., 2011).
Para esse problema multifatorial que
constitui a lesão medular, estudos
envolvendo a combinação de terapias
parecem mais promissores em conseguir
abranger os diferentes aspectos patológicos
e promover a completa reparação da medula
lesionada (Lee et al., 2005; Boulenguez e
Vinay, 2009; Ryu et al., 2009; Webb et al.,
2010; McCreedy e Sakiyama-Elbert, 2012;
Quertainmont et al., 2012; Zhao e Fawcett,
2013). A combinação de terapias incluindo
a condroitinase têm demonstrado efeitos
benéficos em lesões medulares (Massey et
al., 2008; Huang et al., 2010; Karimi-
Abdolrezaee et al., 2010; Lee et al., 2010;
Garcia-Alías et al., 2011; Hwang et al.,
2011), sendo esta enzima boa opção para
esse tipo de abordagem por ter mecanismo
de ação que não interfere com outros
tratamentos (Zhao e Fawcett, 2013).
Neste contexto, a utilização de CTM da
medula óssea em lesões da medula espinhal
previamente tratadas com a CDT otimizaria
os dois tratamentos. A CDT, além de
reduzir os efeitos inibitórios da cicatriz
glial, tornaria a matriz extracelular mais
favorável à cinética das CTM e, estas,
incrementariam a regeneração neuronal por
meio da secreção de fatores neurotróficos,
remielinização e/ou reconexão dos circuitos
neuronais interrompidos (Ikegami et al.,
2005; Karimi-Abdolrezaee et al., 2010).
Essa enzima já foi testada com sucesso em
associação com células progenitoras da
mucosa olfatória adulta (Huang et al., 2010)
e com células progenitoras neuronais
(Ikegami et al., 2005; Karimi-Abdolrezaee
et al., 2010), mas não foram encontrados
estudos associando a enzima às CTM da
medula óssea.
21
2. HIPÓTESE
2.1. Hipótese geral
A CDT e as CTM da medula óssea agem de
forma isolada e sinérgica no tratamento da
lesão à medula espinhal, promovendo
regeneração axonal e plasticidade neuronal,
com consequente recuperação funcional.
2.2. Hipóteses particulares
1. A CDT digere a cadeia de
glicosaminoglicanos na cicatriz glial e
reduz seu efeito inibitório no crescimento
axonal.
2. As CTM da medula óssea promovem
regeneração neuronal e neuroproteção por
meio da secreção de fatores tróficos e/ou
reconexão dos circuitos neuronais
interrompidos.
3. A utilização de CTM da medula óssea
em lesões da medula espinhal previamente
tratadas com CDT otimiza os dois
tratamentos, pois a CDT promove ambiente
mais favorável à cinética e à integração das
CTM.
22
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Estudar o efeito da CDT e das CTM, em
terapia única ou associada, no tratamento
do trauma experimental à medula espinhal
de ratos Lewis.
3.2. Objetivos específicos
1. Avaliar a capacidade motora de ratos
Lewis após trauma experimental à medula
espinhal e tratamento com CDT e CTM, em
terapia única ou associada;
2. Avaliar as alterações anátomo
patológicas da medula espinhal, após
trauma experimental e terapia com CDT e
CTM, com realização de cortes seriados e
coloração com hematoxilina-eosina;
3. Quantificar por meio de avaliação
imunoistoquímica os astrócitos (anti-
GFAP), neurônios (anti-NeuN) e vimentina
na medula espinhal após trauma
experimental e terapia com CDT e CTM;
4. Avaliar a expressão gênica do fator
neurotófico derivado do encéfalo (BDNF),
neurotrofina 3 (NT-3), fator de crescimento
do endotélio vascular (VEGF) e seu
receptor KDR, molécula de adesão
endotélio plaquetária (PECAM-1) e caspase
3 na medula espinhal após trauma
experimental e terapia com CDT e CTM.
23
4. REVISÃO DE LITERATURA
4.1. Fisiopatologia da lesão medular
Quando a medula espinhal é submetida à
ação traumática, dependendo da força
inicial, ocorre rompimento de axônios e de
vasos, por ação mecânica primária. A
barreira hemato-espinhal fica
comprometida levando a influxo de
elementos vasculares, como células
inflamatórias, para o parênquima espinhal
(Ng et al., 2011). Essa lesão inicial
desencadeia uma série de acontecimentos,
os eventos secundários, causados por
interrupção na perfusão vascular normal,
mudanças eletrolíticas, e por uma cascata
de mediadores da degeneração tecidual:
produtos dos leucócitos, prostaglandinas,
leucotrienos, radicais livres e excitotoxinas
(Colter e Rucker, 1988; Braund et al., 1990;
Tator e Fehlings, 1991; Summers et al.,
1995; Kornegay, 1998; Lu et al., 2000; Lee
et al., 2005). A ocorrência de isquemia, o
aumento de cálcio intracelular, a
peroxidação de lipídios pelos radicais livres
(Coughlan, 1993) e a apoptose
desempenham papéis essenciais na
ocorrência desses eventos secundários
(Springer, 2002).
A isquemia progressiva pós-traumática
desempenha função ímpar na patogênese do
trauma medular agudo (Hedeman e Sil,
1974; Tator e Fehlings, 1991; Kornegay,
1998; Han et al., 2012). Além das
alterações locais na vasculatura, como
lesões diretas aos pequenos vasos e perda
da autorregularão, esse tipo de trauma
também causa mudanças circulatórias
sistêmicas como hipotensão, diminuição do
débito cardíaco e redução da perfusão
tecidual (Tator e Fehlings, 1991; Taoka e
Okajima, 1998; Ng et al., 2011). Essa
perfusão tecidual deficiente resulta em
hipóxia celular, com diminuição do
oxigênio e da glicose e conversão para o
metabolismo anaeróbico. Vias anaeróbicas
produzem quantidades deficientes de
adenosina trifosfato (ATP) e ainda formam
substâncias potencialmente lesivas como
lactato, prostaglandinas e radicais livres de
oxigênio (Janssens, 1991). O acúmulo de
metabólitos do ácido lático determina
acidose e morte celular com liberação do
conteúdo lisossomal composto de enzimas
hidrolíticas que agravam o dano tecidual
(Colter e Rucker, 1988). A depleção de
ATP leva a falência das bombas da
membrana que mantém a concentração
iônica, levando ao acúmulo de sódio e
cálcio dentro das células (Janssens, 1991;
Jeffery e Blackmore, 1999).
O excesso de sódio resulta em edema
celular e o cálcio ativa enzimas lesivas a
proteínas e lipídios intracelulares levando
ao rompimento de membranas celulares
(Jeffery e Blackmore, 1999). Uma
importante enzima ativada pelo excesso de
cálcio intracelular é a fosfolipase A2 que
cliva o ácido araquidônico da membrana
fosfolipídica iniciando uma resposta
inflamatória em cascata (Hausmann, 2003;
Talac et al., 2004; Grill, 2005; Kwon et al.,
2005). Esse ácido é metabolizado através da
via das cicloxigenases para formar
prostaglandinas e pela via das lipoxigenases
para originar os leucotrienos (Janssens,
1991; Coughlan, 1993). As prostaglandinas
e os leucotrienos causam aumento da
permeabilidade vascular resultando em
extravasamento de plasma, edema tecidual
e hemoconcentração. A partir do ácido
araquidônico também é formado
tromboxano que causa estase nos vasos e
potencializa a agregação plaquetária (Colter
e Rucker, 1988).
Paralelamente, ocorre quimiotaxia de
leucócitos, principalmente neutrófilos, e
macrófagos. Esse infiltrado inflamatório,
24
junto com a micróglia residente, liberam
enzimas proteolíticas e oxidativas, e
também citocinas pró-inflamatórias que
acentuam o processo de morte celular no
tecido que circunda o local original da lesão
(Hausmann, 2003; Rowland et al., 2008).
Em decorrência da destruição celular ocorre
liberação de radicais livres que reagem com
diversos componentes celulares causando
peroxidação dos lipídios (Janssens, 1991).
Os radicais livres atacam todos os
componentes celulares, mas reagem
principalmente com os ácidos graxos
insaturados da membrana fosfolipídica
(Coughlan, 1993). A peroxidação dessa
camada causa desalinhamento dos lipídios,
alterando a integridade da membrana, a
fluidez e a manutenção dos gradientes
iônicos (Brown e Hall, 1992). Os radicais
livres também podem causar lesões diretas
ao tecido neuronal e contribuir para as
lesões isquêmicas através de danos à
microvascularização (Janssens, 1991).
As lesões agudas são frequentemente
acompanhadas por hemorragia, reação
inflamatória e edema, que começam na
substância cinzenta, e em algumas horas se
expandem envolvendo a substância branca
e os segmentos medulares adjacentes
(Colter e Rucker, 1988; Braund et al.,
1990). No primeiro momento, essa
expansão ocorre por necrose das células
adjacentes, quase imediatamente após o
trauma e, depois por um processo de morte
mais tardio, caracterizado por apoptose
neuronal, seguida por ativação microglial e
apoptose de oligodendrócitos (Lu et al.,
2000; Beattie, 2004). A ativação de
proteases da família caspase é considerada
como um processo chave para a apoptose e,
tem sido relatada que a caspase 3 tem um
papel crucial nesse tipo de morte celular
desencadeada pela lesão da medula espinhal
(Springer, 2002; Dasari et al., 2007).
A cascata de eventos secundários continua a
ocorrer nas semanas que seguem a lesão
medular, levando a formação de cistos e
cavidades no centro da lesão que exacerbam
a disfunção neurológica levando a perda de
funções motora e/ou sensoriais (Colter e
Rucker, 1988; Gril, 2005) (Fig. 1). O
epicentro então se torna necrótico,
macrófagos são recrutados para remover
debris celulares e restos de mielina e,
fibroblastos da meninge migram para a
ferida (Kundi et al., 2013). As alterações
patológicas que acompanham esses
acontecimentos são caracterizadas por
hemorragias, extravasamento de plasma,
edema intracelular, necrose, cavitações,
gliose e perda da arquitetura histológica
(Hedeman e Sil, 1974; Tator e Fehlings,
1991).
25
Figura 1. Esquema demonstrando a expansão da lesão primária frente à ocorrência dos eventos
secundários que resulta na formação de cistos e cavidades exacerbando a disfunção neurológica
(Adaptado de Taoka e Okajima, 1998).
O processo de reparação após a lesão
medular é acompanhado de angiogênese
(Xin-min et al., 2005; Mahoney et al., 2009;
Ng et al., 2011), que auxilia na redução do
dano secundário levando oxigênio e
nutrientes para o sítio de regeneração e
removendo os restos metabólitos. Dessa
forma, a necrose que acompanha a lesão
medular pode ser minimizada por esses
novos vasos, que protegem o tecido nervoso
da isquemia e melhoram a recuperação pós-
lesão. Essa angiogênese é regulada por
proteínas produzidas em resposta à privação
de oxigênio, como o fator de crescimento
do endotélio vascular (VEGF), o fator de
crescimento do fibroblasto e matriz
metaloproteinases (Kundi et al., 2013).
O VEGF é um dos fatores angiogênicos
mais importantes que atuam após a lesão
medular. Ele tem funções múltiplas que
incluem estímulo à mitose de células
endoteliais e aumento de sua sobrevivência
por vias antiapoptóticas, vasodilatação,
aumento da permeabilidade vascular (Patel
et al., 2009), estímulo a morfogênese do
vaso sanguíneo e regulação da função das
células endoteliais (Kundi et al., 2013).
Além disso, ele ainda tem ação
neuroprotetora direta em neurônios da
medula espinhal de ratos, provavelmente
mediada por seu receptor kinase (Xin-min
et al., 2005), promovendo maior
crescimento dos axônios após lesão
medular (Jin et al., 2011).
Considerando as implicações da isquemia
na fisiopatologia do trauma medular,
entender o mecanismo pelo qual a
revascularização ocorre e manipulá-lo pode
ser ferramenta interessante para limitar o
avanço dos danos secundários e obter
neuroproteção (Ng et al., 2011; McCreedy e
Sakiyama-Elbert, 2012). Dessa forma,
estratégias terapêuticas que promovem a
angiogênese costumam ser efetivas em
reduzir o dano secundário, promover
brotamento axonal e melhorar a
recuperação funcional (Xin-min et al.,
2005; Mahoney et al., 2009; Patel et al.,
2009; Jin et al. 2011; Han et al., 2012;
Kundi et al., 2013).
4.2. O efeito inibitório da cicatriz glial e a
enzima bacteriana condroitinase ABC
Frente às injúrias ocorridas no trauma
medular agudo, os astrócitos reagem com
hipertrofia e aumento da expressão de
filamentos intermediários, como a proteína
26
ácida fibrilar glial (GFAP) e a vimentina, é
a chamada gliose reativa (Silver e Miler,
2004; Xia et al., 2008; Luna et al., 2010). A
ativação e hipertrofia dessas células,
associada à resposta inflamatória ao trauma,
levam à formação da cicatriz glial (Hu et
al., 2010). Os astrócitos reativos são o
principal componente dessa cicatriz e atuam
como uma barreira física e química à
regeneração axonal. Eles produzem os
PGSC (Silver e Miler, 2004; Tom e Houlé,
2008) considerados os principais
responsáveis por prejudicar o brotamento
axonal (Ikegami et al., 2005; Yiu e He,
2006; Iaci et al., 2007; Garcia-Alías et al.,
2008; Rolls et al., 2008; Buffo et al., 2010).
Os PGSC consistem em um núcleo proteico
ao qual muitas cadeias de
glicosaminoglicanos sulfatados (GAG)
estão covalentemente ligadas (Tom et al.,
2004; Crespo et al., 2007). Durante a fase
de desenvolvimento do sistema nervoso
central, essas moléculas formam barreiras
que guiam o crescimento axonal (Ikegami
et al., 2005; Iseda et al., 2008), coincidindo
com o final do período crítico da
plasticidade (Galtrey et al., 2008). Eles
também estão presentes nas redes
perineurais de mamíferos adultos, sendo os
principais constituintes da matriz
extracelular que circunda neurônios e
células da glia. A presença dos PGSC ao
redor das sinapses maduras parece limitar a
plasticidade nesses locais (Yiu e He, 2006;
Iaci et al., 2007; Garcia-Alías et al., 2008;
Zhao e Fawcett, 2013). A expressão dessas
moléculas é aumentada frente à ocorrência
de danos no sistema nervoso central. Na
injúria medular, a expressão de PGSC é
máxima na segunda semana, com níveis
progressivamente mais baixos até o 49º dia
(Iseda et al., 2008).
Apesar do conhecido efeito inibitório na
regeneração neuronal, os PGSC exercem
um papel dúbio, com crescente evidência de
prover benefícios funcionais ao estabilizar o
sistema nervoso central logo após a lesão
(Silver e Miller, 2004; Jin et al. 2011;
Sofreniew, 2012). Na fase aguda, após uma
lesão, essas moléculas atuam na ativação da
micróglia/macrófagos causando aumento na
expressão de fator de crescimento
semelhante à insulina (IGF-1) e
metaloproteinase da matriz e, diminuição
dos níveis de fator de necrose tumoral alfa.
Portanto, nessa fase, os PGSC têm papel
benéfico, e possivelmente também atuam
como uma barreira física, limitando a
extensão das lesões. Entretanto, torna-se
deletério na fase crônica, ou quando
presente em quantidade excessiva (Crespo
et al., 2007; Rolls et al., 2008), causando a
falha em regenerar os axônios da medula
espinhal e formar sinapses funcionais (Iaci
et al., 2007; Buffo et al., 2010).
A cicatriz glial, além dos PGSC, contém
outras moléculas inibitórias que incluem
proteínas associadas à mielina, como a
glicoproteína associada à mielina (MAG),
Nogo-A, e glicoproteína oligodendrocito-
mielina (OMgp), expressas por
oligodendrócitos (Sun e He, 2010; Wright
et al., 2011; Kundi et al., 2013). A presença
dessas moléculas está relacionada com a
menor capacidade regenerativa dos axônios
no sistema nervoso central (Silver e Miller,
2004; Iseda et al., 2008; Webb et al., 2010)
que, somada ao acúmulo de compostos
relacionados a degeneração e ao mau
funcionamento da resposta imune (Colter e
Rucker, 1988; Rolls et al., 2008), podem
levar a uma paralisia permanente (Bradbury
et al., 2002).
Quando os axônios danificados se
confrontam com a natureza inibitória da
cicatriz glial, conferida por moléculas como
PGSC, eles se tornam distróficos (Tom et
al., 2004) e, em alguns casos, apresentam-se
27
contorcidos nas proximidades da cicatriz
como se estivessem desviando dela (Davies
et al., 1997 citado por Tom et al., 2004). Hu
et al. (2010) observaram que quatro
semanas após a lesão medular, a
demarcação entre a cicatriz glial e o tecido
normal adjacente se torna claramente
definida. Apenas poucos axônios
conseguem penetrar a camada externa da
cicatriz e, uma quantidade ainda menor na
parte mais interna. Esses dados oferecem
evidências diretas indicando o potencial
regenerativo dos axônios e sua inibição pela
cicatriz glial. Além disso, nota-se que a
redução ou supressão dessa cicatriz pode
ser uma estratégia terapêutica capaz de
promover regeneração axonal (Iaci et al.,
2007; Galtrey et al., 2008; Garcia-Alias et
al., 2008; Iseda et al., 2008; Wright et al.,
2011).
A enzima bacteriana condroitinase ABC
fragmenta as GAGs do núcleo protéico dos
PGSC (Iaci et al., 2007; Garcia-Alias et al.,
2008; Iseda et al., 2008; Hyatt et al., 2010;
Wright et al., 2011), as quais conferem a
maioria de suas propriedades inibitórias
(Tom et al., 2004; Crespo et al., 2007). A
utilização dessa enzima tem demonstrado
aumentar a regeneração e brotamento
axonal (Garcia-Alias et al., 2009; Tom et
al., 2009; Lin et al., 2011), promover
melhor desempenho funcional após lesão da
medula espinhal (Bradbury et al., 2002;
Ikegami et al., 2005; Huang et al., 2006; Hu
et al., 2010; Karimi-Abdolrezaee et al.,
2010) e aumentar a plasticidade sináptica
(Massey et al., 2006; Tom e Houlé, 2008;
Zhao e Fawcett, 2013). Além disso, a
degradação dos PGSC pela condroitinase
ABC resulta na formação do 6-sulfato
dissacarídeo que possui potentes
propriedades neuroprotetoras (Lin et al.,
2011) , sendo capaz de modular a micróglia
e promover aumento dos níveis de IGF-1 e
BDNF in vivo e in vitro promovendo
recuperação funcional. Esse dissacarídeo
possivelmente contribui aumentando os
efeitos benéficos dessa enzima (Rolls et al.,
2008).
4.3. Ação das células tronco e das
neurotrofinas na lesão medular
As células tronco adultas têm sido
intensamente estudadas devido a sua
potencial ação reparadora para tratar
diversas doenças (Pittenger et al., 1999),
como isquemias e injúrias traumáticas e
neurodegenerativas (Syková e Jendelová,
2007; Vaquero e Zurita, 2011). O interesse
por essas células também se justifica devido
à ausência de implicações éticas à sua
utilização, o que não ocorre com as células
tronco embrionárias (Jiang et al., 2002;
Kitada, 2012).
Uma das fontes mais promissoras de células
tronco adultas é a medula óssea, que
contém população heterogênea de células
divididas em células tronco
hematopoiéticas, células progenitoras
hematopoiéticas e células tronco
mesenquimais (CTM) (Syková e Jendelová,
2007; Kitada, 2012). As células tronco
hematopoiéticas e mesenquimais podem se
diferenciar, respectivamente, em células de
linhagens hematopoiéticas e mesenquimais
(Wright et al., 2011), embora essa última
também possa se diferenciar in vitro em
células com características da linhagem
mesoderma visceral, neuroectoderma e
endoderma (Jiang et al., 2002).
As CTM representam população de células
indiferenciadas e de crescimento rápido. Da
mesma maneira que ocorre com as células
hematopoiéticas, um marcador molecular
exclusivamente expresso por essas células
ainda não foi identificado. Para resolver
esse problema, a International Society for
Cellular Therapy propôs três critérios para
28
definir essas células: aderência ao plástico,
expressão específica de antígenos de
superfície e potencial de diferenciação
multipotente. Dessa forma, elas precisam
aderir ao plástico quando mantida em
condições de cultura padrão; 95% ou mais
devem expressar CD105, CD73 e CD90,
mensurado por citometria de fluxo,
adicionalmente 2% ou menos devem
expressar CD45, CD34, CD14 ou CD11b,
CD79a ou CD19 e antígeno-DR
leucocitário humano classe II (HLA-DR); e,
além disso, devem ter a capacidade de
diferenciação em osteoblastos, adipócitos e
condrócitos sob condições de diferenciação
padrão in vitro (Dominici et al., 2006;
Vaquero e Zurita, 2011; Wright et al.,
2011).
Para o transplante clínico, as CTM são
bastante atrativas, pois são isoladas
facilmente após aspiração da medula óssea,
expandidas e reintroduzidas no paciente
como enxerto autólogo (Vaquero e Zurita,
2011; Wright et al., 2011), eliminando a
necessidade de imunossupressão (Paul et
al., 2009; Kitada, 2012). Além disso, em
caso de dano ou isquemia grave, elas são
atraídas para o local da injúria, dispensando
a necessidade de aplicação diretamente no
local lesionado (Syková e Jendelová, 2007).
Outra vantagem de sua utilização é a
pequena expressão de antígenos do
complexo de histocompatibilidade maior
(classe II), implicando em baixa
antigenicidade, uma grande vantagem para
consideração no protocolo de terapia celular
(Chen et al., 2005; Vaquero e Zurita, 2011).
Essas células primeiramente despertaram a
atenção como potenciais candidatas ao
tratamento de doenças que afetam os
tecidos mesodérmicos. Entretanto, tornou-
se evidente que elas poderiam ser usadas
para tratar afecções do sistema nervoso
(Maltman el al., 2011), com base em
pesquisas que comprovam recuperação
funcional em modelos animais de vários
distúrbios neurológicos, como lesão
medular, isquemia e trauma encefálico
(Chen et al., 2001; Mahmood et al., 2005;
Honma et al., 2006; Vaquero et al., 2006;
Takeuchi et al., 2007; Osaka et al., 2010;
Walker et al., 2010; Carvalho, 2011;
Quertainmont et al., 2012; Nakajima et al.,
2012).
O mecanismo preciso no qual as CTM
transplantadas promovem recuperação
funcional após uma lesão medular ainda
não está esclarecido, mas várias hipóteses
têm sido sugeridas para explicar sua ação
terapêutica (Osaka el al., 2010; Vaquero e
Zurita, 2011). Em modelos animais, o
transplante dessas células tem promovido
neuroproteção (Honma et al., 2006;
Rodrigues Hell et al., 2009), angiogênese
(Syková e Jendlová, 2005), brotamento
axonal (Hofstetter et al., 2002; Vaquero et
al., 2006; Liu et al., 2007; Sasaki et al.,
2009; Nakajima et al., 2012),
remielinização (Akiyama et al., 2002),
redução na apoptose (Caldeira, 2011),
imunomodulação (Rodrigues Hell et al.,
2009) e redução na cicatriz glial (Nakajima
et al., 2012).
O principal mecanismo de ação dessas
células relaciona-se com a influência
exercida no meio ambiente da lesão
medular devido à secreção de fatores
solúveis e à promoção de matrix
extracelular que fornece proteção e
favorece o reparo axonal (Paul et al., 2009;
Kitada, 2012; Quertainmont et al., 2012). As CTM sintetizam uma série de fatores
neurotróficos, ou neurotrofinas, que
estimulam o crescimento do nervo, entre
elas o fator neurotrófico derivado do
encéfalo (BDNF), o fator de crescimento do
endotélio vascular (VEGF), a neurotrofina -
3 (NT-3), a neurotrofina-4 (NT-4) e o fator
de crescimento do nervo (NGF). Essas
29
proteínas são fatores de crescimento que
promovem o desenvolvimento, crescimento
e sobrevivência neuronal (Mahmood et al.,
2005), características que fazem dessas
células ferramenta terapêutica capaz de
promover crescimento axonal e melhorar
aspectos comportamentais após lesão
medular (Webb et al., 2010).
Outra maneira pela qual essas células
modificam o ambiente é por meio da
imunomodulação (Uccelli et al., 2011;
Kitada, 2012). Dessa forma, as CTM levam
a redução da astrogliose e da ativação
microglial, consequentemente há uma
menor expressão de GFAP, o que pode
contribuir para melhorar a sobrevivência
neuronal e estabilidade sináptica (Rodrigues
Hell et al., 2009). Adicionalmente, ocorre a
liberação de moléculas anti-apoptóticas e
citocinas anti-inflamatórias (Uccelli et al.,
2011). Ao modificar a inflamação do
ambiente, elas reduzem a formação da
cicatriz glial e criam ambiente mais
permissivo ao crescimento axonal e, com
isso, contribuem para diminuir a formação
de cavidades (Paul et al., 2009).
Portanto, após o transplante celular, pelo
menos numa fase inicial, diferente
processos regenerativos, incluindo a
liberação de fatores neurotróficos ou
ativação de mecanismos endógenos, podem
trabalhar juntos para restaurar funções
neurológicas (Vaquero e Zurita, 2011;
Quertainmont et al., 2012).
Outro mecanismo proposto para explicar o
efeito terapêutico das CTM é a
neurogênese. Embora controversa, a
transdiferenciação de células da medula
óssea em células neuronais parece ocorrer
após o transplante celular em resposta a
vários estímulos genéticos, químicos e/ou
fisiológicos (Honma et al., 2006; Osaka el
al., 2010; Uccelli et al., 2011). Três teorias
principais tentam explicar a neurogênese
mediada pelas CTM: transdiferenciação,
fusão celular e atividade parácrina por meio
da liberação de fatores solúveis (Maltman el
al., 2011). Na maioria das vezes, a
caracterização fenotípica das células
transdiferenciadas se limita a detecção de
um marcador específico, sem constatação
de nenhuma atividade específica, ou seja,
não fica comprovado, por exemplo, que a
CTM transdiferenciada em célula glial seja
capaz de sintetizar mielina. Entretanto,
alguns estudos comprovam essas
particularidades, como o de Cho et al.
(2005) que evidencia atividade
eletrofisiológica, caracterizando função
neuronal, nas CTM transplantadas. Um fato
interessante é que quando se compara CTM
induzidas e não induzidas, antes do
transplante na medula espinhal lesionada,
não ocorre diferença na regeneração axonal
promovida pelos dois tipos de células.
Além disso, a diferenciação glial ou
neuronal antes do transplante dessas células
não é necessária para promover
remielinização, regeneração axonal e
recuperação funcional (Wright et al., 2011).
30
5. MATERIAL E MÉTODOS
Esse projeto foi desenvolvido de acordo
com as normas estabelecidas pelo Comitê
de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Federal de Minas Gerais
(CETEA/UFMG), aprovado sob protocolo
de nº145/11 (Anexo 1).
Foram utilizadas as bases físicas e a
infraestrutura do Departamento de Clínica e
Cirurgia Veterinárias (DCCV) da Escola de
Veterinária (EV) e do Departamento de
Bioquímica e Imunologia do Instituto de
Ciências Biológicas (ICB), ambos
localizados na Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG), sendo o trabalho
desenvolvido principalmente nas seguintes
estruturas:
- Biotério Experimental do Centro de
Experimentação de Pequenos Animais do
DCCV da EV/UFMG;
- Sala de Cirurgia Experimental de
Pequenos Animais do DCCV da
EV/UFMG;
- Laboratório de Patologia e
Imunoistoquímica do Setor de Patologia
Veterinária do DCCV da EV/UFMG;
- Núcleo de Célula Tronco e Terapia
Celular do DCCV da EV/UFMG;
- Laboratório de Patologia Molecular do
Setor de Patologia Veterinária do DCCV da
EV/UFMG;
- Laboratório de Imunologia Celular e
Molecular do ICB/UFMG.
5.1. Coleta da medula óssea, isolamento e
cultivo das células tronco mesenquimais
da medula óssea transgênicas para
proteína verde fluorescente
As CTM da medula óssea foram obtidas e
cultivadas segundo protocolos já
estabelecidos (Tropel et al., 2004; Boeloni
et al., 2009; Caldeira, 2011).
Foram utilizados três Rattus norvegicus da
linhagem Lewis, machos, com dois meses
de idade, transgênicos para proteína verde
fluorescente – GFP (LEW-Tg eGFP
F455/Rrrc). Os animais foram provenientes
do Biotério do ICB da UFMG, sendo suas
matrizes oriundas da Universidade de
Missouri nos Estados Unidos da América.
As alterações genéticas desses animais
foram caracterizadas pela presença do vetor
lentivirus, contendo o gene eGFP sob o
controle do promotor de ubiquitina C.
Os ratos receberam sobredose de tiopental
sódico1 (180 mg/kg), via intraperitoneal e,
durante o período de latência da droga,
foram submetidos à tricotomia dos
membros posteriores. Em seguida, foi
realizada punção cardíaca com retirada de
sangue para diminuir a contaminação
durante a coleta dos ossos. Após esse
último procedimento, todos os animais
sofreram parada cardíaca.
Após antissepsia, os fêmures e as tíbias dos
animais foram coletados cirurgicamente,
dissecados de tecidos musculares e
conectivos adjacentes, e colocados em um
tubo de 50 mL estéril contendo o meio
DMEM2 acrescido de gentamicina
3 (60
mg), penicilina4 (10.000 un/mL),
estreptomicina (1.000 µg/mL) e
anfotericina5 (25 µg/mL).
Na sala de cultura celular, dentro do fluxo
laminar, foram removidas as epífises
proximal e distal de cada osso e, com o
auxílio de uma seringa com o meio descrito
acima, o canal medular foi limpo. O lavado
1 Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos
Ltda, Itapira, SP, Brasil. 2 Dulbecco’s modified Eagle’s médium, Gibco,
Grand Island, NY, USA. 3 Ariston Indústrias e Farmacêuticas Ltda, São
Paulo, SP, Brasil. 4 Penicillin and streptomycin, Invitrogen, Life
Technologies, USA. 5 Amphotericin, Invitrogen, Life Technologies,
USA.
31
oriundo dos canais medulares foi coletado
em tubo de 50 mL estéril, formando ao final
um pool das medulas ósseas dos ratos. O
tubo foi centrifugado a 1.400 rpm durante
10 minutos. Após descarte do sobrenadante,
o pellet foi suspenso novamente em 20 mL
do meio descrito acrescido de 10% de soro
fetal bovino6. As células foram cultivadas
em garrafas T 757, contendo 10 mL do meio
acrescido do soro fetal bovino, em estufa a
37ºC e 5% de CO2. O meio de cultivo foi
trocado duas vezes por semana e quando
era observada 80 a 90% de confluência das
células, elas eram suspensas utilizando a
enzima tripsina8 e replicadas. Esse
procedimento foi feito quatro vezes até o
dia da inoculação celular nos animais.
5.1.1. Caracterização fenotípica das
células tronco mesenquimais da medula
óssea transgênicas para proteína verde
fluorescente por citometria de fluxo
O fenótipo celular foi analisado por meio da
expressão de moléculas de superfície (CD –
cluster of differentiation). As células
aderentes foram suspensas com a utilização
de tripsina, centrifugadas por cinco minutos
a 1200g e diluídas em PBS. Incubou-se
alíquotas contendo 1 x 106 células com os
anticorpos monoclonais primários de
camundongo9 anti-CD45 (clone 69), anti-
CD73 (clone 5F/B9), anti-CD54 (clone
1A29) e anti-CD90 (clone 0X-7) por 30
minutos a 4ºC. Após serem lavadas com
PBS e incubadas com o anticorpo
secundário IgG anti-camundongo Alexa
488 conjugado 10
por mais 30 minutos a 4º
6 Soro fetal bovino estéril, LGC Biotecnologia
Ltda, Cotia, SP, Brasil. 7 TPP (Techno Plastic Products),Trasadingen,
Switzerland 8 Trypsin 0,05%EDTA, Gibco, Grand Island,
NY,USA. 9 BD Biosciences, San Jose, CA, EUA.
10 Invitrogen, Life Technologies, CA, USA.
C, as células foram fixadas em formalina
10%. Como controle negativo da reação,
adicionou-se o anticorpo secundário às
células não marcadas com o anticorpo
primário. Realizou-se a leitura e as análises
em citômetro de fluxo FACScan
(Fluorescence Activated Cell Analyser)11
com o emprego do software Cell Quest12
,
com aquisição de 20.000 eventos. A
expressão dos marcadores de superfície
celular foi determinada pela comparação
com o controle em gráfico de histograma e
os dados foram analisados usando WinMDI
2.8 software análises (Castanheira et al.,
2009).
5.2. Uso de condroitinase e células tronco
mesenquimais da medula óssea, isoladas
ou associadas
5.2.1. Animais
Foram utilizados 50 ratos adultos, linhagem
Lewis, machos, com três meses de idade e
peso médio de 321g, oriundos do Biotério
da Universidade Estadual de Campinas.
Os ratos foram divididos, aleatoriamente,
em cinco grupos de dez animais e
colocados em caixas plásticas com quatro
animais cada. Eles receberam ração
comercial para roedores13
e água ad libitum,
sendo submetidos a ciclos de claro-escuro
de 12 horas, em ambiente com temperatura
controlada. Eles foram acomodados no
Biotério do Centro de Experimentação de
Pequenos Animais da EV-UFMG por pelo
menos 14 dias antes do início do período
experimental, para aclimatação e
11
FACScan, Becton Dicknson Immunocytometry, San Jose, CA, EUA. 12
The Cell QuestTM
Sftware, Becton Dickinson Dicknson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, EUA. 13
Nuvilab CR-1®, Nuvital Nutrientes S/A, Colombo, PR, Brasil
32
condicionamento à manipulação dos
experimentadores.
5.2.2. Grupos experimentais
Grupo CN – Controle negativo (n=10): os
animais foram submetidos à exposição da
medula espinhal por meio de laminectomia.
Após sete dias foi realizada reexposição
medular e aos 14 dias aplicação intravenosa
de PBS.
Grupo PLA – Tratamento com placebo (n=10): os animais foram submetidos à
laminectomia seguida de trauma medular
compressivo. Após sete dias foi realizada
reexposição medular com aplicação
intramedular de líquido cefalorraquidiano
artificial e, aos 14 dias aplicação
intravenosa de PBS.
Grupo CDT – Tratamento com
condroitinase ABC (n=10): os animais
foram submetidos à laminectomia seguida
de trauma medular compressivo. Após sete
dias foi realizada reexposição medular com
aplicação intramedular de condroitinase
ABC e aos 14 dias aplicação intravenosa de
PBS.
Grupo CTM – Tratamento com células
tronco mesenquimais (n=10): os animais
foram submetidos à laminectomia seguida
de trauma medular compressivo. Após sete
dias foi realizada reexposição medular com
aplicação intramedular de líquido
cefalorraquidiano artificial e aos 14 dias
aplicação intravenosa de CTM.
Grupo CDT+CTM – Tratamento com
condroitinase ABC e células tronco
mesenquimais (n=10): os animais foram
submetidos à laminectomia seguida de
trauma medular compressivo. Após sete
dias foi realizada reexposição medular com
aplicação intramedular de condroitinase e
aos 14 dias aplicação intravenosa de CTM.
5.2.3. Protocolos anestésico e cirúrgico
Os animais receberam indução e
manutenção anestésicas com isoflurano14
,
fornecido por meio de máscara facial em
sistema semiaberto. Com os animais
anestesiados, foi realizada a tricotomia da
região dorsal, antibiótico profilático com
cefalotina sódica15
(60 mg/kg, IV) e
medicação pré-anestésica com cloridrato de
tramadol16
(4 mg/kg, SC).
Os ratos foram então posicionados em
decúbito esternal em uma plataforma de
polietileno com aquecimento, sendo que
nos animais dos grupos com trauma essa
plataforma era conectada ao aparelho
estereotáxico desenvolvido na EV da
UFMG (Torres et al., 2010). A incisão de
pele e tecido subcutâneo foi realizada na
linha média dorsal estendendo-se de T10 a
L1. Os músculos epiaxiais foram afastados
lateralmente após a incisão de suas
inserções nos processos espinhosos de T11
a T13. Com auxílio de uma pinça de
Kocher realizou-se ostectomia do processo
espinhoso de T12, e empregando-se drill
pneumático neurológico17
retirou-se a
lâmina dorsal da vértebra (laminectomia). A
broca do drill foi irrigada com solução
fisiológica18
para evitar o aquecimento do
tecido.
14
Isofluorane, Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda, Itapira, SP, Brasil. 15
Cefalotina, Ariston Indústrias e Farmacêuticas Ltda, São Paulo, SP, Brasil. 16
Tramadol, Laboratórios Pfizer, São Paulo, SP, Brasil. 17
ECCOS® Aesculap, Laboratório B. Braun, São
Gonçalo-RJ, Brasil. 18
Cloreto de sódio a 0,9%, solução eletrolítica injetável, Laboratório Sanobiol Ltda, Brasil
33
Após a visualização da medula espinhal
(Fig. 2a), a haste metálica do aparelho
estereotáxico foi colocada em contato com
a dura-máter e solta suavemente
permanecendo cinco minutos exercendo
pressão de 70,5 g sobre a medula (Fig. 2b),
provocando assim trauma compressivo
(Fig. 2c) de acordo com modelo pré-
estabelecido (Torres et al., 2010). Esse
procedimento não foi realizado nos animais
pertencentes ao grupo CN, que sofreram
apenas laminectomia, sem trauma. Em
seguida, foi realizada a aproximação dos
músculos seccionados com sutura padrão
Reverdin e redução do espaço morto com
sutura simples contínua, ambas
empregando-se fio polipropileno 4-019
. A
dermorrafia foi realizada com o fio
mononylon 4-020
e pontos simples
separados.
Após a cirurgia, os animais foram mantidos
em caixas aquecidas até completa
recuperação anestésica. Eles receberam
analgesia com cloridrato de tramadol (2
mg/kg, SC) e antibioticoterapia com
cefalexina sódica (30 mg/kg), ambos a cada
12 horas, por via oral, durante cinco dias.
Os animais foram examinados a cada 12
horas e receberam massagem vesical para
esvaziamento da bexiga durante sete dias,
quando todos os animais já apresentavam
completo retorno da função vesical. Os
pontos de pele foram removidos no sétimo
dia após a cirurgia.
5.2.4. Injeção intramedular de
condroitinase ABC ou líquido
cefalorraquidiano artificial
Após uma semana da intervenção cirúrgica
(Fig. 3), os ratos foram submetidos à
19
Prolene®, Polypropylene sutere, Ethicon Incorporations, São Paulo, SP, Brasil. 20
Fio inabsorvível sintético, Johnson & Johnson, Brasil.
reexposição da medula espinhal, adotando-
se os mesmos protocolos anestésico e
cirúrgico descritos anteriormente. Em
seguida à identificação da área submetida à
laminectomia e com auxílio de uma micro
bomba de infusão conectada a uma seringa
de Hamilton21
, foram infundidos no
epicentro da lesão 4 µL de condroitinase
ABC (0,55 u/µL) nos animais dos grupos
CDT e CDT+CTM; ou, 4 µL de líquido
cefalorraquidiano artificial nos animais do
grupo PLA e CTM, ambos à velocidade de
0,8 µL/min (Fig. 2d). Após o término da
aplicação, a agulha permaneceu no local
por mais um minuto para evitar o
extravasamento do líquido. Terminado esse
procedimento, foram realizadas a
aproximação dos músculos seccionados, a
redução do espaço morto, a dermorrafia e
os procedimentos pós-operatórios seguindo-
se o protocolo descrito no item anterior.
5.2.5. Injeção de células tronco
mesenquimais da medula óssea ou PBS
Imediatamente antes da inoculação nos
animais, as células foram avaliadas quanto
à viabilidade celular pelo azul de tripan.
Após suspensão com tripsina e adição de
DMEM com 10% de soro fetal bovino, as
células foram colhidas, centrifugadas e, o
pellet contendo as células suspenso
novamente em 2 mL de DMEM. Retirou-se
2 µL dessa suspensão e adicionou-se a 49
µL de PBS e 49 µL de azul de tripan e, na
câmara de Neubauer foi determinado o
número total de células e o número de
células viáveis. Esse número de células
viáveis foi utilizado para determinar o
volume de tampão fosfato salino (PBS)
estéril a ser adicionado ao pellet de células
para uma concentração final de 5 x 106
células/mL, utilizada para o transplante
21
Seringa 1701 RN-HP 10µL SYR, Hamilton Company, Reno, NV, USA.
34
celular. Antes de serem colocadas nessa
concentração final, as células foram lavadas
três vezes com PBS para retirada de
resquícios de soro fetal bovino que poderia
causar reação de rejeição nos animais.
A injeção das células ou do PBS foi
realizada após duas semanas da primeira
intervenção cirúrgica (Fig. 3). Para esse
procedimento, os ratos foram contidos
manualmente e receberam uma injeção de
0,2 mL na veia caudal. Os animais dos
grupos CN, PLA e CDT receberam PBS e,
os dos grupos CTM e CDT+CTM
receberam o mesmo volume de PBS
contendo cerca de 1 x 106 de CTM.
Figura 2. Fotografias a, b e c demonstram animal em procedimento cirúrgico de trauma medular
experimental. a) Visualização, após laminectomia, da medula espinhal com aspecto normal (seta); b)
Lesão compressiva da medula com peso de 70,5 g (seta); c) Visualização da medula com hemorragia após
o trauma (seta). d) Infusão intramedular de condroitinase ou líquido cefalorraquidiano artificial, observa-
se a micro bomba de infusão (estrela) conectada a uma seringa de Hamilton (seta).
35
5.2.6. Avaliação da capacidade motora
A avaliação da capacidade motora foi
realizada em todos os animais 24 horas
antes e após a primeira cirurgia, bem como
a cada quatro dias até dois dias antes da
eutanásia (Fig. 3). Antes do início das
avaliações, os animais foram colocados no
campo plano por duas vezes, com o intuito
acostumá-los ao ambiente do teste. A
avaliação realizada 24 horas após o
primeiro procedimento cirúrgico foi
intitulada avaliação 1, por ser a primeira
após a submissão dos animais a
procedimento experimental potencialmente
lesivo. Foi utilizada a escala de escores
motores proposta por Basso, Beatie e
Bresnahan (BBB) (Basso et al., 1995)
(Quadro 1). Os animais foram colocados
em campo plano de 1m2 e filmados durante
dois minutos. Os filmes foram
posteriormente assistidos por dois
avaliadores indiferentes aos grupos dos
animais. Eles classificaram o padrão
locomotor e atribuíram escores de zero a 21
de acordo com a escala proposta.
Quadro 1. Escala de escores para a capacidade motora de ratos proposta por Basso, Beatie e Bresnahan
(1995).
Escore Capacidade Motora
0 Nenhum movimento observável nos membros posteriores
1 Movimento discreto de uma ou duas articulações, normalmente o quadril (coxofemoral) ou joelho
(femerotibiopatelar)
2 Movimento extenso de uma articulação ou
Movimento extenso de uma articulação e discreto de outra
3 Movimento extenso de duas articulações
4 Movimento discreto das três articulações do membro posterior
5 Movimento discreto de duas articulações e extenso da terceira
6 Movimento extenso de duas articulações e discreto da terceira
7 Movimento extenso das três articulações do membro posterior
8 Andar tocando no chão mas sem apoio do peso ou
Posição plantar do membro sem apoio do peso
9 Posição plantar do membro com apoio do peso quando parado ou
Apoio de peso ocasional, frequente ou consistente na passada dorsal e sem passada plantar
10 Suporte de peso ocasional na passada plantar, sem coordenação dos membros torácicos e pélvicos
11 Apoio do peso frequente a consistente na passada plantar sem coordenação dos membros torácicos
com os pélvicos
12 Apoio do peso frequente a consistente na passada plantar com ocasional coordenação dos membros
torácicos e pélvicos
13 Apoio do peso frequente a consistente na passada plantar com frequente coordenação dos membros
torácicos e pélvicos
14 Consistente apoio de peso na passada plantar, consistente coordenação dos membros torácicos e
pélvicos, e a posição predominante do membro quando em locomoção é rotacionado (externa ou
internamente) quando faz contato inicial com a superfície, bem como imediatamente antes de ser
levantado no final da postura; ou
Passada frequentemente plantar com consistente coordenação dos membros torácicos e pélvicos e
passadas dorsais ocasionais
15 Passada plantar consistente com consistente coordenação dos membros torácicos e pélvicos, sem
levantar dos dedos dos pés; ou ocasional levantar dos dedos do pé ao avançar do membro, a posição
predominante do membro é paralela ao corpo ao contato inicial
16 Passada plantar consistente com consistente coordenação dos membros torácicos e pélvicos durante
36
a marcha, e o levantar dos dedos dos pés ocorre frequentemente durante o avançar do membro para
frente; a posição predominante do membro é paralela ao corpo ao contato inicial e rotacionada ao
final do movimento
17 Passada plantar consistente com consistente coordenação dos membros torácicos e pélvicos durante
a marcha, e o levantar dos dedos dos pés ocorre frequentemente durante o avançar do membro para
frente; a posição predominante do membro é paralela ao corpo ao contato inicial e final do
movimento
18 Passada plantar consistente com consistente coordenação dos membros torácicos e pélvicos durante
a marcha, o levantar dos dedos dos pés ocorre consistentemente durante o avançar do membro para
frente; a posição predominante do membro é paralela ao corpo ao contato inicial e rotacionada ao
final do movimento
19 Passada plantar consistente com consistente coordenação dos membros torácicos e pélvicos durante
a marcha, o levantar dos dedos dos pés ocorre consistentemente durante o avançar do membro para
frente; a posição predominante do membro é paralela ao corpo ao contato inicial e ao final do
movimento; e a cauda está abaixada em parte ou todo o tempo
20 Passada plantar e marcha coordenada consistentes, levantar dos dedos dos pés consistente, posição
predominante do membro é paralela ao corpo ao contato inicial e ao final do movimento; cauda
consistentemente para cima e instabilidade do tronco
21 Passada plantar e marcha coordenada consistentes, levantar dos dedos dos pés consistente, a
posição predominante do membro é paralela o movimento todo, consistente estabilidade do tronco,
cauda constantemente levantada
5.2.7. Eutanásia
Trinta dias após o trauma ou laminectomia
(Fig. 3), todos os animais foram submetidos
à eutanásia com sobredose de tiopental
sódico (180 mg/kg), por via intraperitoneal,
seguida de punção cardíaca com retirada de
sangue. De cada grupo experimental
composto por dez animais, seis foram
destinados à avaliação anatomopatológica e
imunoistoquímica e quatro foram
destinados à avaliação da expressão gênica
por meio da reação em cadeia da
polimerase.
Figura 3. Linha de tempo demonstrando a localização temporal dos procedimentos: avaliação da
capacidade motora pela escala de escores motores proposta por Basso, Beatie e Bresnahan (BBB) desde a
avaliação zero (Aval. 0), realizada antes do procedimento cirúrgico, até a última (Aval. 8) ; cirurgia de
laminectomia com ou sem trauma (laminectomia ou trauma); injeção intramedular de condroitinase ou
placebo (injeção CDT ou placebo); injeção de células tronco mesenquimais da medula óssea ou placebo
(injeção CTM ou placebo) e eutanásia.
37
5.2.8. Avaliação da expressão gênica
relativa do BDNF, NT-3, VEGF, KDR,
PECAM-1 e caspase 3 por RT-PCR em
tempo real
Quatro animais de cada grupo foram
submetidos à técnica de reação em cadeia
da polimerase transcriptase-reversa (RT-
PCR) em tempo real para avaliação da
expressão gênica do fator neurotrófico
derivado de encéfalo (BDNF), da
neurotrofina 3 (NT-3), do fator de
crescimento do endotélio vascular (VEGF)
e do seu receptor KDR (kinase insert
domain receptor), da molécula de adesão
celular endotélio plaquetária (PECAM-1) e
do fator de apoptose caspase 3.
Imediatamente após a eutanásia, um
segmento de 1,5 cm da medula espinhal,
contendo o epicentro da lesão em sua região
central, foi retirado assepticamente. Ele foi
dividido em três segmentos menores de 0,5
cm cada, e colocado em criotubos
identificados como cranial, epicentro ou
caudal. Os criotubos foram congelados
prontamente em nitrogênio líquido e, em
seguida, transferidos para um freezer à
temperatura de -80ºC.
Para avaliação da expressão dos genes
descritos acima, e do gene normalizador da
beta-actina, foram utilizados os segmentos
medulares identificados como epicentros e
os primers iniciadores Forward (F) e
Reverse (R) indicados na tabela 1 (Tab.1).
Tabela 1. Genes com a respectiva sequência de nucleotídeos dos primes iniciadores para RT-PCR em
tempo real
Gene Sequência de nucleotídeos No acesso
BDNF F: CCACAATGTTCCACCAGGTG
R: TGGGCGCAGCCTTCAT NM_012513.3
Neurotrofina-3 F: TGTGACAGTGAGAGCCTGTGG
R: TGTAACCTGGTGTCCCCGAA NM_031073.2
VEGF F: GCCCAGACGGGGTGGAGAGT
R: AGGGTTGGCCAGGCTGGGAA NM_001110336.1
KDR F: GTCCGCCGACACTGCTGCAA
R: CTCGCGCTGGCACAGATGCT NM_013062.1
Caspase 3 F: TGGAGGAGGCTGACCGGCAA
R: CTCTGTACCTCGGCAGGCCTGAAT NM_012922.2
PECAM-1 F: GAAGGTTTCTGAGCCCAGTG
R: TCAAGGGAGGACACTTCCAC
NM_031591.1
Beta-actina F: GCGTCCACCCGCGAGTACAA
R: ACATGCCGGAGCCGTTGTCG NM_031144.2
38
O RNA foi extraído utilizando-se o
reagente Trizol22
de acordo com as
instruções do fabricante. Cada segmento
com o epicentro da medula foi transferido
para um tubo cônico, adicionou-se 1 mL de
trizol, e em seguida ele foi macerado com
pistilo de plástico estéril livre de RNAse e
DNAse. Após cinco minutos no gelo, foi
adicionado 0,2 mL de clorofórmio em cada
tubo que foi agitado manualmente por 15
segundos e colocado no gelo por mais dois
minutos. As amostras foram centrifugadas a
11400 rpm durante 15 minutos e, então,
observou-se a formação de três fases
distintas. A superior, transparente, contendo
o RNA foi transferida cuidadosamente para
um tubo cônico novo ao qual foi adicionado
0,5 mL de álcool isopropílico para
precipitação do RNA. Após congelamento
das amostras a -80ºC durante 30 minutos,
elas foram descongeladas e centrifugadas a
11400 rpm e 4ºC por 10 minutos. O
sobrenadante foi transferido para outro
tubo, centrifugado mais uma vez a 11400
rpm e 4ºC por 10 minutos, sendo então
descartado. Os tubos contendo os pellets
com o RNA, proveniente das duas
centrifugações receberam 1,0 mL de etanol
75% cada, sendo novamente centrifugados,
o etanol descartado e os tubos colocados
para secar. Após a secagem, o RNA foi
homogeneizado adicionando-se 20 µL de
água ultrapura23
seguido de incubação por
10 minutos a 55ºC. Desse RNA foi retirada
uma amostra para quantificação e o restante
foi congelado a -80ºC para posterior
confecção do DNA complementar (cDNA).
Para quantificação do RNA, 2,0 µL de cada
amostra foi adicionado a 98 µL de água
ultrapura. A mensuração foi realizada em
espectrofotômetro de luz UV por meio da
22
Invitrogen, Life Technologies, CA, USA. 23
Ultra-pure®DEPC-treated water, Gibco, Invitrogen, CA, USA.
avaliação das absorbâncias a 260 nm e da
relação entre as absorbâncias 260/280 nm.
A confecção do cDNA foi realizada com a
utilização de kit comercial24
de acordo com
as instruções do fabricante. Os reagentes
foram estimados para utilização com 1,0 µg
de RNA, que foi calculado pelo grau de
pureza da amostra. Foi feito um mix para
cada amostra com o 2xRT e o RT
(transcriptase reversa) contidos no kit. Os
tubos contendo o mix, água ultrapura e
RNA foram colocados no termociclador a
25°C durante 10 minutos, 42°C por 50
minutos e 85°C durante 5 minutos. Após a
adição de 1,0 µL de RNAse H, as amostras
foram incubadas no termociclador a 37ºC
durante 20 minutos, e congeladas a -20ºC
para posterior realização do PCR em tempo
real.
A PCR em tempo real foi realizada com a
utilização dos reagentes SYBR green e Rox
do kit comercial acima, além dos primers
iniciadores forward e reverse, e do cDNA
sintetizado. As reações de amplificação do
cDNA dos genes foram realizadas na
plataforma de instrumentação ABI Prism
7900, adotando-se 45 ciclos de 15 segundos
a 95ºC para desnaturação da fita dupla, um
minuto a 60ºC para anelamento dos
iniciadores dos respectivos genes, um
minuto a 75ºC para extensão dos amplicons
e mais 10 minutos a 75ºC para término da
reação. O Software 7500 v.2.0.1 Applied
Biosystems apresentou os resultados em
gráfico de fluorescência em relação ao
número de ciclos, sendo o ciclo limiar, ou
threshold (CT), o ciclo em que foi detectada
fluorescência acima do limite basal
estabelecido.
24
SuperScript III Platinum® Two-Step qRT-PCR Kit with SYBR® GreenInvitrogen, CA, USA.
39
A expressão gênica relativa ou fold change
(FC) de cada gene foi calculada utilizando-
se o método do 2-∆∆C
T. Assim, o delta CT
(∆CT) foi determinado pela subtração do CT
do gene pesquisado pelo CT do gene
normalizador beta actina. O delta delta CT
(∆∆CT) foi encontrado pela diferença entre
o ∆CT e a média do ∆CT do grupo controle.
E a expressão gênica relativa foi dada pela
fórmula: FC = 2-∆∆C
T. (Livak e Schmittgen,
2001; Yuan et al., 2006).
5.2.9. Avaliação anatomopatológica e
imunoistoquímica
Seis animais de cada grupo, imediatamente
após a eutanásia, foram submetidos à
perfusão transcardíaca em bomba de
infusão com 250mL de PBS (0,15M,
pH=7,4) seguida de 250mL de solução
fixadora formol 10% tamponado, ambos a
uma velocidade de 450mL/h. Em seguida, o
local do trauma foi inspecionado para
verificação de aderência, seroma ou
hematoma e a medula espinhal foi removida
e colocada em formol 10% tamponado.
Após a remoção da medula espinhal, os
animais foram submetidos à necropsia para
verificação de alterações macroscópicas.
Um segmento de 2,7cm de cada medula
espinhal, contendo o epicentro da lesão em
sua região central, foi processado pela
técnica de rotina para inclusão em parafina.
Antes de ser inserido no bloco de parafina,
cada segmento foi dividido em três partes
iguais que foram identificadas como
cranial, epicentro ou caudal.
Os animais foram submetidos a cortes
seriados dos três segmentos para
caracterização da lesão. A realização desses
cortes iniciou-se com a retirada de 20 cortes
de quatro micrômetros cada, colocados em
quatro lâminas previamente gelatinizadas,
cinco cortes por lâmina. Em seguida,
380µm foram desbastados e mais vinte
secções foram cortadas e colocadas em
quatro lâminas, assim sucessivamente, até o
final da área lesionada. A primeira lâmina
de cada série de 20 foi corada com
hematoxilina e eosina e utilizada para
avaliação histológica em microscopia óptica
e análise das possíveis alterações.
Para a avaliação imunoistoquímica,
selecionou-se para cada anticorpo, uma
lâmina por animal contendo área de necrose
focalmente extensa moderada no corno
dorsal, localizada na região caudal
adjacente ao epicentro da lesão. As lâminas
foram colocadas em xilol para retirada da
parafina, hidratadas em concentrações
decrescentes de álcool e colocadas em
solução de peróxido de metanol 0,3%
durante 30 minutos para bloqueio da
peroxidase endógena. Após lavagem em
PBS, as secções foram incubadas por 30
minutos com solução bloqueio, e depois
incubadas overnight a 4ºC com os
anticorpos primários. Cortes controles, com
omissão do anticorpo primário, foram feitos
em todas as reações para verificar a
especificidade da marcação. No dia
seguinte foi realizada a ligação com
anticorpo secundário, bloqueio da biotina
com estreptovidina-peroxidase, revelação
da relação com 3-3’diaminobenzidina25
e,
contra coloração com hematoxilina.
Foram utilizados os anticorpos primários
para marcação dos componentes dos
filamentos intermediários dos astrócitos:
vimentina26
(1:200) e GFAP27
(1:200),
permitindo uma avaliação da cicatriz glial;
e anti-NeuN28
(1:500) para uma avaliação
indireta da ação das células tronco pela
25
DAB, Dako, Carpinteria, CA, USA. 26
V9,Dako, Carpintería, CA, USA. 27
Anti-GFAP, Invitrogen, Life Technologies, USA. 28
Anti-neuN - Chemicon Internacional Inc., Temecula, CA, USA.
40
detecção de neurônios íntegros. As lâminas
marcadas por esses anticorpos foram
fotografadas e analisadas pelo software de
análise de imagem ImageJ®29
, sendo que,
para cada imagem, quantificou-se a média
da densidade integrada de pixels das células
subtraída do background. Utilizou-se ainda
o anticorpo anti-GFP30
(1:1500) para
análise qualitativa da presença das células
tronco transgênicas na medula espinhal
lesionada dos animais receptores.
5.2.10. Análise estatística
O delineamento utilizado foi inteiramente
casualizado. Verificou-se a normalidade
dos parâmetros pelo teste Kolmogorov-
Smirnov e as variâncias foram comparadas
pelo teste F. Os dados referentes às
expressões gênicas e imunomarcações
foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) a ao teste de Student-Newman-
Keuls (S-N-K) para comparação das
médias. Os escores da avaliação da
capacidade motora foram submetidos ao
procedimento não paramétrico de Kruskal-
Wallis (KW), seguido de comparações
múltiplas entre pares de tratamentos pelo
teste de Dunn. As análises foram realizadas
com o auxílio do Prism 5 for Windows,
version 5.01, GraphPad Software Inc., La
Jolla, CA, USA. O nível de significância
adotado foi de 5%.
29
National Institutes of Health, USA. 30
Anti-GFP ab 290 – Abcam, UK.
41
6. RESULTADOS
6.1. Isolamento e cultivo das células
tronco mesenquimais da medula óssea
transgênicas para proteína verde
fluorescente
As células cultivadas apresentaram
características morfológicas típicas de
células tronco mesenquimais, com formato
fusiforme semelhante ao fibroblasto,
aderência ao plástico e alta taxa de
proliferação. Durante a fase de divisão
celular e/ou quando eram submetidas à ação
da tripsina, essas células tornavam-se
esféricas, mas ao aderirem à garrafa de
cultura, tornavam-se espiculadas e
rapidamente se fundiam em uma
monocamada (Maltman et al., 2011).
Após a terceira passagem, as células foram
caracterizadas fenotipicamente por
citometria de fluxo utilizando os anticorpos
CD90, CD73, CD54 e CD45. A população
examinada expressou CD90, CD73 e CD54,
considerados marcadores fenotípicos de
células tronco mesenquimais, nas
porcentagens respectivas de 86,77%,
93,99% e 95,10%. Além disso, 96,94% das
células não expressaram CD45, que é
característico de precursor hematopoiético
(Castanheira et al., 2009).
6.2. Protocolos anestésico e cirúrgico
Após as cirurgias, de trauma medular ou
aplicação intramedular, nenhum animal
apresentou alteração de comportamento ou
de apetite condizente com dor. Também
não foi observado nenhum sinal compatível
com infecção da ferida cirúrgica ou reação
ao fio empregado. No momento da retirada
dos pontos, sete dias após a cirurgia, todos
os animais apresentaram ferida
completamente fechada e sem secreção.
Dos 40 animais submetidos ao trauma
medular, 26 (65%) apresentaram retenção
urinária e/ou hematúria, sendo que 20
(50%) manifestaram ambos os sintomas,
cinco (12,5%) apenas retenção e um (2,5%)
rato teve somente hematúria. A duração
média desses sintomas foi de três dias para
hematúria e cinco dias para retenção. Os
animais submetidos apenas à laminectomia
não apresentaram qualquer alteração vesical
ou comportamental.
6.3. Injeção intramedular de
condroitinase ABC ou líquido
cefalorraquidiano artificial
A administração intramedular de
condroitinase ou líquido cefalorraquidiano
artificial (placebo), sete dias após o trauma
medular, foi de realização simples e rápida.
No momento do acesso cirúrgico, a ferida
anterior estava cicatrizada, e a ausência do
processo espinhoso de T12 facilitou a
localização do epicentro da lesão medular.
Os animais tiveram ótima recuperação após
essa intervenção e, não apresentaram
aumento dos déficits motores ou alterações
comportamentais e vesicais.
6.4. Avaliação da capacidade motora
A avaliação da capacidade motora pela
escala de escores BBB foi de realização
simples, rápida, prática e econômica. A
submissão dos animais ao teste ao longo da
semana anterior ao trauma medular facilitou
a aplicação do mesmo. Quanto aos
avaliadores, o treinamento prévio se
mostrou extremamente importante para
evitar escores discrepantes atribuídos a um
mesmo animal.
Todos os animais, além desse
condicionamento prévio, foram avaliados
24 horas antes do procedimento cirúrgico e
apresentaram escore máximo, 21, indicando
42
ausência de anormalidades sensoriais e
motoras relacionadas à deambulação antes
da primeira cirurgia.
Na avaliação 1, realizada 24 horas após o
primeiro procedimento cirúrgico, o grupo
CN apresentou escore máximo, enquanto os
demais apresentaram déficits neurológicos
graves, com paraplegia e escores
caracterizados por movimentação ausente
ou discreta em uma ou duas articulações do
membro posterior analisado. Não houve
diferença estatística entre os grupos que
sofreram o trauma medular, assim como
ocorreu na avaliação 2 (Fig. 4).
1 2 3 4 5 6 7 80
5
10
15
20
25
CN
PLA
CDT
CTM
CDT+CTM
a
a,b
bb
Avaliação
Esco
re m
oto
r
Figura 4. Gráfico com o perfil das medianas dos escores motores de ratos Lewis submetidos à
laminectomia ou trauma medular espinhal e tratados com células tronco mesenquimais e/ou
condroitinase, ou veículo, em cada um dos oito dias da avaliação após o procedimento cirúrgico.
(CN=controle negativo, PLA= placebo, CDT= condroitinase, CTM= células tronco mesenquimais e
CDT+CTM= condroitinase e células tronco). Observa-se que na oitava avaliação, 28 dias após o trauma,
o grupo CDT apresenta escores motores semelhantes ao CN, mas não se difere dos demais grupos. Letras
minúsculas diferentes expressam diferença estatística (p<0,05).
Na avaliação 3, realizada um dia após a
administração intramedular de
condroitinase ou placebo, os escores médios
foram maiores do que os da segunda
avaliação, sugerindo que a aplicação
intramedular não causou deterioração da
função motora. Até essa avaliação, o grupo
CN se diferiu de todos os outros, entretanto,
a partir da quarta avaliação, o grupo CDT
se igualou ao CN sem, contudo se diferir do
PLA.
Na última avaliação, todos os grupos
submetidos ao trauma medular
apresentaram escores médios condizentes
com a fase inicial de recuperação do teste
BBB, onde os membros posteriores
arrastavam no chão durante a deambulação
e, apresentavam ou não movimentos nas
articulações, com amplitude discreta ou
extensa. A exceção foi o CDT, que
apresentou escore médio pertencente à fase
intermediária de recuperação que é
caracterizada pela presença de passada
dorsal ou plantar com apoio de peso
ocasional, consistente ou frequente. Até
essa avaliação esse grupo continuou
43
apresentando resultados semelhantes ao
CN, mas sem se diferir do PLA.
6.5. Avaliação da expressão gênica
relativa do BDNF, NT-3, VEGF, KDR,
PECAM-1 e caspase 3 por RT-PCR em
tempo real
Em relação ao número de cópias criadas do
RNAm do BDNF, o grupo CTM teve a
maior expressão gênica relativa, em seguida
os grupos CDT e CDT+CTM tiveram
expressões iguais e significativamente
maior do que a expressão do PLA (Fig. 5).
PLA CDT CTM CDT+CTM0
50
100
150 ** *
*
*
Grupos
BD
NF
/
-acti
na (
2-ct)
Figura 5. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão médio) de BDNF em
grupos de ratos submetidos a trauma agudo da medula espinhal e tratados com placebo (PLA),
condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma medular. Os dados estão
expressos em relação ao controle negativo (linha tracejada). * p<0,05.
A análise de variância, considerando a
interação entre os grupos e os fatores
neurotróficos, constatou que o BDNF e o
NT-3 apresentaram o mesmo padrão de
distribuição entre os tratamentos, sendo que
em ambos, o grupo CTM teve a maior
expressão, enquanto o PLA teve a menor,
entretanto, no caso do NT-3 não houve
diferença estatística entre os tratamentos
(Fig. 6).
44
PLA CDT CTM CDT+CTM0
2
4
6
8
Grupos
NT
-3/
-acti
na (
2-ct)
Figura 6. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão médio) de NT-3 em
grupos de ratos submetidos a trauma agudo da medula espinhal e tratados com placebo (PLA),
condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma medular. Os dados estão
expressos em relação ao controle negativo (linha tracejada). (p<0,05).
Com relação ao VEGF, o grupo tratado com
CTM obteve a maior expressão gênica
relativa, sendo que os demais grupos
tratados (CDT e CDT+CTM) obtiveram
resultados estatisticamente semelhantes ao
PLA (Fig. 7). O gráfico de expressão média
do receptor kinase do VEGF, o KDR , não
apresentou diferença estatística entre os
tratamentos (Fig. 8).
PLA CDT CTM CDT+CTM0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Grupos
VE
GF
/
-acti
na (
2-ct)
*
* *
Figura 7. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão médio) de VEGF em
grupos de ratos submetidos a trauma agudo da medula espinhal e tratados com placebo (PLA),
condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma medular. Os dados estão
expressos em relação ao controle negativo (linha tracejada). * p<0,05.
45
PLA CDT CTM CDT+CTM
0
2
4
6
8
Grupos
KD
R/
-acti
na (
2-ct)
Figura 8. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão médio) do receptor do
VEGF, KDR (kinase insert domain receptor), em grupos de ratos submetidos a trauma agudo da medula
espinhal e tratados com placebo (PLA), condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais (CTM) ou
condroitinase mais células tronco mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma
medular. Os dados estão expressos em relação ao controle negativo (linha tracejada). * p<0,05.
Quanto à molécula de adesão PECAM-1,
apesar de sua expressão ter sido maior no
grupo CDT, não houve diferença estatística
entre os grupos (Fig. 9).
PLA CDT CTM CDT+CTM0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Grupos
PE
CA
M-1
/
-acti
na (
2-ct)
Figura 9. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão médio) de PECAM-1 em
grupos de ratos submetidos a trauma agudo da medula espinhal e tratados com placebo (PLA),
condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma medular. Os dados estão
expressos em relação ao controle negativo (linha tracejada). * p<0,05.
46
A expressão gênica da caspase 3 não
demonstrou diferença estatística entre os
grupos (Fig. 10).
PLA CDT CTM CDT+CTM0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Grupos
Casp
ase 3
/
-acti
na (
2-ct)
Figura 10. Quantificação relativa das médias da expressão gênica (± erro padrão médio) de caspase 3 em
grupos de ratos submetidos a trauma agudo da medula espinhal e tratados com placebo (PLA),
condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma medular. Os dados estão
expressos em relação ao controle negativo (linha tracejada). * p<0,05.
6.6. Avaliação anatomopatológica e
imunoistoquímica
Nenhuma alteração macroscópica foi
encontrada nos animais à necropsia. O sítio
cirúrgico estava totalmente cicatrizado e, na
12a vértebra torácica pode-se observar o
defeito ósseo da laminectomia indicando o
local onde, nos animais dos grupos PLA,
CDT, CTM e CDT+CTM, foi realizado o
trauma mecânico na medula espinhal.
Na avaliação histológica, não foi
evidenciada nenhuma alteração nos cortes
pertencentes aos animais do grupo CN,
corados com HE e avaliados em
microscopia óptica. A medula espinhal
apresentava características normais, com
arquitetura celular preservada, substância
cinzenta com o formato característico de
‘H’, ocupando a região interna do órgão,
sendo envolvida pela substância branca.
Foram observadas alterações histológicas
semelhantes em todos os animais
submetidos ao trauma medular,
independente do grupo. O corte seriado
permitiu boa caracterização da lesão
permitindo acompanhar a progressão de sua
gravidade por meio da visualização das
regiões adjacentes, cranial e caudal, com
aspecto normal, e o epicentro da lesão, com
alterações bem intensas. Nos cortes mais
craniais encontraram-se secções de medula
espinhal íntegra e, ao seguir caudalmente,
notaram-se vacuolizações, passando por
regiões de necrose focalmente extensa que
se agravavam progressivamente, até serem
encontradas secções com mielomalácia
difusa intensa. Prosseguindo com os cortes
caudais, verificou-se o processo inverso,
47
com o retorno gradativo à normalidade
tecidual (Fig. 11A-I). Em todos os animais,
independente do grupo, foram visualizadas
secções histológicas onde a medula
espinhal apresentava cavitações com perda
de substância associada a células de Gitter,
gliócitos reativos (Fig. 11J-K), degeneração
e tumefação axonal, além de vasos
sanguíneos neoformados, visualizados
principalmente nos grupos que receberam
condroitinase. Em vários animais, as
secções da região cranial ao trauma
apresentavam canal central distendido (Fig.
11B-C) e, em alguns deles, na região
imediatamente caudal ao epicentro o canal
estava diminuído (Fig. 11G). Verificou-se
pelo menos uma lâmina por animal na qual
a mielomalácia envolvia toda a medula,
sendo considerada a região do epicentro do
trauma (Fig. 11E).
Os segmentos da medula espinhal,
contendo alterações histológicas, resultaram
em média de 18,6 lâminas coradas por HE,
sendo o intervalo entre essas lâminas de
aproximadamente 440 µM. Dessa forma, a
distância média entre a primeira e a última
lâmina com alguma alteração histológica
foi de cerca de 7744 µM, ou seja, o
tamanho médio aproximado da lesão foi de
7,744mm.
Figura 11: Fotomicrografias de secções transversais de cortes seriados da medula espinhal de um rato 30
dias após trauma medular agudo grave. Pode-se observar o agravamento da lesão nas regiões craniais (A a
D) até o epicentro (E) e posterior retorno a normalidade tecidual nas secções caudais (F a I). A) Presença
de área de mielomalácia focalmente extensa, limitada ao funículo dorsal, com perda de substância; B) e
C) Área de necrose focalmente extensa intensa que se estende do funículo dorsal ao lateral da substância
branca passando pela substância cinzenta, predominantemente em um dos lados. Distensão intensa do
canal central; D) Mielomalácia difusa intensa com áreas de degeneração axonal na periferia da substância
branca, predominantemente em um dos lados; E) Mielomalácia difusa F) Mielomalácia multifocal a
coalescente intensa que se estende tanto na substância branca quanto na cinzenta; G) e H) Área
focalmente extensa de mielomalácia de moderada a intensa no funículo dorsal e ventral associada a áreas
de degeneração axonal multifocal moderada em toda substância branca; I) Área de mielomalácia
focalmente extensa limitada ao funículo dorsal. (Barra = 264 µm). J) Gliócitos reativos; K) Células de
Gitter. (Barra = 17 µm).
49
Quanto à avaliação imunoistoquímica dos
animais com trauma, a marcação dos
neurônios com o anticorpo anti-neuN foi
maior no grupo CDT+CTM em relação ao
PLA. O grupo que recebeu a associação de
tratamentos teve número de neurônios
marcados semelhante ao CN, enquanto os
demais grupos não se diferiram do placebo
(Fig. 12 e 15).
CN PLA CDT CTM CDT+CTM0.0
1.01007
2.01007
3.01007
4.01007
***
*
GruposInte
nsid
ad
e d
e e
xp
ressão
em
pix
els
do
nen
N
Figura 12: Média da intensidade integrada de pixels (± erro padrão médio) da marcação por
imunoistoquímica para anticorpo anti-neuN em ratos submetidos à laminectomia (CN) ou trauma medular
agudo associado e tratados com placebo (PLA), condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais
(CTM) ou condroitinase mais células tronco mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias
após o trauma medular. * p<0,05.
A imunomarcação para o GFAP foi maior
nos grupos PLA e CDT+CTM do que no
grupo sem trauma (CN), sendo que os
grupos CDT e CTM permaneceram
semelhantes tanto ao CN quanto aos grupos
PLA e CDT+CTM (Fig.13 e 16).
50
CN PLA CDT CTM CDT+CTM0.0
2.01007
4.01007
6.01007
8.01007
1.01008*
*
GruposInte
nsid
ad
e d
e e
xp
ressão
em
pix
els
da G
FA
P
Figura 13: Média da intensidade integrada de pixels (± erro padrão médio) da marcação por imunoistoquímica
para anticorpo GFAP em ratos submetidos à laminectomia (CN) ou trauma medular agudo associado e tratados
com placebo (PLA), condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células
tronco mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma medular. * p<0,05.
Quanto à vimentina, a imunomarcação do
CN foi menor e se diferiu de todos os
grupos com trauma, sendo que entre esses,
o CDT teve a menor expressão e foi o único
que se diferiu estatisticamente do placebo.
Os demais grupos tratados (CTM e
CDT+CTM) tiveram resultados
semelhantes tanto ao PLA quanto ao CDT
(Fig. 14 e 17).
CN PLA CDT CTM CDT+CTM0.0
1.01007
2.01007
3.01007
4.01007
5.01007
**
** *
GruposInte
nsid
ad
e d
e e
xp
ressão
em
pix
els
da v
imen
tin
a
Figura 14: Média da intensidade integrada de pixels (± erro padrão médio) da marcação por imunoistoquímica
para anticorpo anti-vimentina em ratos submetidos à laminectomia (CN) ou trauma medular agudo e tratados
com placebo (PLA), condroitinase (CDT), células tronco mesenquimais (CTM) ou condroitinase mais células
tronco mesenquimais (CDT+CTM). Avaliação realizada 30 dias após o trauma medular. * p<0,05.
51
Figura 15: Fotomicrografias de secções transversais da medula espinhal de ratos submetidos à
imunoistoquímica com anti-nenN 30 dias após a realização da laminectomia, com ou sem trauma
medular. A) Controle negativo da bateria, secção que não recebeu o anticorpo; B) Medula espinhal de
animal pertencente ao grupo controle negativo (CN); C) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo
placebo (PLA); D) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo condroitinase (CDT); E) Medula
espinhal de animal pertencente ao grupo células tronco mesenquimais da medula óssea (CTM); F)
Medula espinhal de animal pertencente ao grupo que recebeu a condroitinase e as células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). Pode-se observar imunomarcação intensa nas secções pertencentes a
animais dos grupos CN, CTM e CDT+CTM. (Barra = 177 µm).
Figura 16: Fotomicrografias de secções transversais da medula espinhal de ratos submetidos à
imunoistoquímica com anti-GFAP 30 dias após a realização da laminectomia, com ou sem trauma
medular. A) Controle negativo da bateria, secção que não recebeu o anticorpo; B) Medula espinhal de
animal pertencente ao grupo controle negativo (CN); C) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo
placebo (PLA); D) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo condroitinase (CDT); E) Medula
52
espinhal de animal pertencente ao grupo células tronco mesenquimais da medula óssea (CTM); F)
Medula espinhal de animal pertencente ao grupo que recebeu a condroitinase e as células tronco
mesenquimais (CDT+CTM). As secções pertencentes aos animais do grupo PLA e CDT+CTM tiveram
imunomarcação maior do que as do CN (Barra = 177 µm).
Figura 17: Fotomicrografias de secções transversais da medula espinhal de ratos submetidos à
imunoistoquímica com anti-vimentina 30 dias após a realização da laminectomia, com ou sem trauma
medular. A) Controle negativo da bateria, secção que não recebeu o anticorpo; B) Medula espinhal de
animal pertencente ao grupo controle negativo, submetido à laminectomia sem trauma medular (CN); C)
Medula espinhal de animal pertencente ao grupo placebo (PLA); D) Medula espinhal de animal
pertencente ao grupo condroitinase (CDT); E) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo células
tronco mesenquimais da medula óssea (CTM); F) Medula espinhal de animal pertencente ao grupo que
recebeu a condroitinase e as células tronco mesenquimais (CDT+CTM). Pode-se observar que todas as
secções pertencentes a animais submetidos a trauma medular apresentam imunomarcação mais intensa do
que a secção pertencente ao CN e, que a secção do grupo PLA possui imunomarcação mais intensa do
que a do grupo CDT (Barra = 177 µm).
A imunoistoquímica com o anticorpo GFP
permitiu a visualização das células
transgênicas para proteína verde
fluorescente na medula espinhal dos
animais receptores. As células marcadas
não foram encontradas nos animais que não
receberam as CTM (Fig. 18).
B A
53
Figura 18: Fotomicrografias de secções transversais da medula espinhal de ratos submetidos à
imunoistoquímica com anti-GFP 30 dias após a realização da laminectomia com trauma medular. A)
Medula espinhal de animal pertencente ao grupo placebo (PLA); B) Medula espinhal de animal
pertencente ao grupo células tronco mesenquimais da medula óssea (CTM). Pode-se observar
imunomarcação somente na secção pertencentes ao animal do grupo CTM (Barra = 50 µm).
54
7. DISCUSSÃO
As células cultivadas apresentaram formato
típico de CTM, esféricas durante a fase de
divisão celular e/ou quando submetidas à
ação da tripsina e, espiculadas ao aderirem
à garrafa de cultura, como também
observado por Maltman et al. (2011) e
Quertainmont et al. (2012). Contudo, a
confirmação do tipo celular isolado foi feita
por meio da citometria de fluxo com os
marcadores CD90, CD73, CD54 e CD45, o
que permitiu constatar que a população
celular isolada e cultivada era homogênea e
distinta da linhagem hematopoiética. A
confirmação da população de CTM envolve
a análise de moléculas de superfície celular,
entretanto, ainda não foi definido nenhum
marcador específico para esse tipo de
célula. Portanto, normalmente é utilizada a
monitoração de várias moléculas com o
intuito de se criar um perfil de expressão
descritivo. A citometria de fluxo é
frequentemente utilizada para confirmar o
fenótipo das CTM utilizando moléculas que
são expressas por essas células (CD29,
CD44, CD54, CD55, CD73, CD90, CD105,
CD106, CD117 e CD166), assim como
marcadores que sabidamente não são
encontrados nas CTM, geralmente
antígenos das células hematopoiéticas,
como CD11b, CD14, CD31, CD33, CD34 e
CD45 (Pittenger et al., 1999; Maltman et
al., 2011). Cada grupo de pesquisadores
deve escolher os marcadores que são mais
adequados ao seu laboratório (Dominici et
al., 2006).
Quanto aos protocolos anestésico e
cirúrgico utilizados, a ausência de
alterações comportamentais nos animais
durante o pós-cirúrgico pode ser atribuído à
analgesia preemptiva e pós-operatória com
cloridrato de tramadol. Também contribuiu
para esse fato a boa cicatrização da ferida
cirúrgica, que ocorreu sem secreções ou
edemas, provavelmente devido aos
princípios de assepsia cirúrgica utilizados
rigorosamente no experimento.
As alterações da micção que ocorreram com
os animais submetidos ao trauma medular
são manifestações comuns após lesão
medular (Mitsui et al., 2005; Torres, 2008;
Costa, 2010; Caldeira, 2011; Oliveira,
2012) e, muitas vezes, podem levar a cistite
e infecções ascendentes do trato urinário. A
realização de esvaziamento vesical por
meio de massagem abdominal no pós-
operatório, assim como o antibiótico
profilático, colaboraram para a prevenção
de cistite bacteriana clínica e possíveis
infecções ascendentes, melhorando o
conforto e a sobrevida dos animais. Essas
disfunções vesicais ocorrem porque as
funções do trato urinário inferior dependem
de circuitos neurais localizados na medula
lombossacra, incluindo as projeções
aferentes da bexiga no corno dorsal, o
motor somático dorsolateral e o núcleo
parassimpático que coordenam as
atividades da bexiga, uretra e esfíncter
uretral. Essas regiões na medula
lombossacra são inervadas por vias
descendentes oriundas do tronco cerebral,
como axônios contendo fator liberador de
corticotrofina e axônios serotoninérgicos e
noradrenérgicos. Lesões espinhais acima do
nível lombossacral danificam as vias
descendentes e alteram as vias aferentes
primárias para a medula lombossacral,
prejudicando assim a função do trato
urinário inferior (Mitsui et al., 2005). A
hematúria é um sinal precoce de cistite
hemorrágica e, pode levar a distensão e
dificuldade para expressão vesical devido a
formação de coágulos que obstruem as vias
urinárias (Meyer et al., 2003).
Em relação à administração intramedular de
CDT, assim como observamos nesse
experimento, Iseda et al. (2008), Tom et al.
55
(2009) e Jefferson et al. (2011) também
constataram que é uma forma viável de
administração da enzima. Tom e Houlé
(2008) demonstraram que essa via de
aplicação é relativamente atraumática e não
causa resposta inflamatória considerável.
Alguns autores relatam o risco de
deterioração neurológica ao utilizar essa via
(Paul et al., 2009; Guest et al., 2011;
Whight et al., 2011), contudo, a
administração única, o pequeno volume
injetado (4 µL), a baixa velocidade (0,8
µL/min) e com agulha fina (30 G), são
fatores que podem ter contribuído para a
preservação da função motora no presente
estudo.
A aplicação da CDT nesse estudo, em dose
única de 2,2U, sete dias após a lesão
medular, foi baseada em dados que sugerem
sucesso na aplicação nesse período (Garcia-
Alías et al., 2008), ressaltando que a
atividade da enzima ainda se mantém cerca
de 50% após sete dias de sua administração
(Ikegami et al., 2005). Apesar de muitos
trabalhos utilizarem a CDT em doses
múltiplas, ficou comprovado por Iseda et al.
(2008) que dose única administrada in
bolus pode digerir os PGSC durante várias
semanas in vivo. Nesse último trabalho, a
enzima foi aplicada diretamente na medula,
a dose total de 3,375U foi dividida em três
sítios de administração, sendo 1,125U
injetada no epicentro da lesão e dose igual
nas regiões cranial e caudal. Entretanto,
existe enorme variação em relação à dose
na literatura. Alguns autores utilizaram a
via intramedular em ratos com aplicação de
0,04U a cada dois dias durante quatro dias
(Tom e Houlé, 2008) ou a dose única de
0,1U a 0,225U (Tom et al., 2009). Já as
doses aplicadas por via intratecal variaram
de 0,06U a cada dois dias durante 10 dias
(Brandbury et al., 2002; Shields et al.,
2008) a 0,3U a cada dois dias durante 14
dias (Huang et al., 2006).
Rools et al. (2008) determinaram que a
inibição dos PGSC, imediatamente após a
lesão medular em ratos comprometeu a
recuperação funcional motora e aumentou a
perda tecidual. Essa inibição alterou a
organização espacial do infiltrado de
células mielóides em volta do local da
lesão, levando a diminuição do fator de
crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-
1) produzido pela micróglia/macrófagos e,
causou aumento dos níveis do fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α). Em
contraste, quando eles inibiram a síntese
dos PGSC somente dois dias após a lesão, a
recuperação funcional foi melhorada. Esses
autores verificaram assim que os PGSC são
requeridos nos estágios iniciais da
recuperação para ativação da
micróglia/macrófagos, possivelmente por
limitar a extensão dos danos criando uma
barreira física, enquanto que na fase
crônica, eles inibem o crescimento axonal e
a regeneração. Esse resultado indica que o
efeito dos PGSC após uma lesão medular
não é um fenômeno ‘tudo ou nada’, mas
uma função de tempo e quantidade. Assim,
é possível explicar alguns dos resultados
descritos na literatura, nos quais, várias
condições de degradação enzimática levam
a diferentes estágios de recuperação. Dessa
forma, uma importante consideração para o
desenvolvimento de estratégias que visam a
ablação da cicatriz glial é definir uma janela
terapêutica apropriada para a terapia (Hu et
al., 2010), assim como a dose e frequência
ótimas de administração (Shields et al.,
2008).
Quanto à via de aplicação das CTM, optou-
se pela intravenosa, pois os animais já
haviam sido submetidos a duas cirurgias,
sendo uma delas para realização de injeção
intramedular. A imunomarcação com GFP
verificou a presença dessas células na
medula espinhal dos animais receptores,
demonstrando que após serem injetadas na
56
veia caudal elas migraram até a área
lesionada da medula espinhal e,
permaneceram lá por pelo menos 16 dias
após sua inoculação, momento em que foi
realizada a imunoistoquímica. A via
intravenosa é considerada menos
traumática, mais viável clinicamente e tem
demonstrado resultados favoráveis em
estudos de trauma medular (Xin-min et al.,
2005; Takeuchi et al., 2007; Mahoney et al.,
2009; Osaka et al., 2010; Carvalho, 2011;
Han et al., 2012), cerebral (Chen et al.,
2001; Mahmood et al., 2005; Walker et al.,
2010) e isquemia cerebral (Honma et al.,
2006).
Em modelos animais de trauma espinhal, o
método comumente empregado para o
transplante de células é a injeção
intramedular (Hofstetter et al., 2002; Dasari
et al., 2007; Parr et al., 2008; Kamada et al.,
2011), a qual garante a chegada de número
definido de células ao local alvo,
possibilitando maior eficiência das células
aplicadas (Vaquero et al., 2006; Paul et al.,
2009; Vaquero e Zurita, 2011). Contudo,
essa via exige procedimento cirúrgico com
retirada da lâmina dorsal da vértebra, o que
implica na possibilidade de lesão adicional
à medula com deterioração neurológica
(Paul et al., 2009; Whight et al., 2011),
além dos riscos advindos da anestesia geral,
que são maiores em pacientes com lesão
medular (Hambly e Martin, 1998). A
injeção em si pode causar injúrias devido à
penetração da agulha, movimentação da
medula ou da agulha durante a aplicação,
criação de gradiente de pressão
intraparenquimal e dissecação
hidrodinâmica, instilação de uma massa de
células deformante e possível isquemia
medular (Guest et al., 2011). Em casos que
necessitem de múltiplas aplicações, as
dificuldades e os riscos aumentariam
progressivamente a cada acesso cirúrgico
devido à formação de cicatriz, inflamação e
adesão na dura-máter e no tecido espinhal.
Dessa forma, pode ser bastante complicado
transportar a aplicação de células por meio
de injeção intramedular para a prática
clínica (Paul et al., 2009).
O emprego clínico do transplante celular
requer estratégia segura e eficiente para
administração das células (Paul et al.,
2009). A injeção intravenosa tem a
vantagem de ser minimamente invasiva,
segura, fácil e simples de ser praticada, e
permitir a introdução de grande número de
células que podem potencialmente atingir a
área da lesão medular (Osaka et al., 2010).
Como as CTM possuem tropismo para
tecidos danificados, essa característica pode
dispensar a necessidade de injetar as células
diretamente no local da lesão (Syková e
Jendelová, 2007; Spaeth et al., 2008 citado
por Wright et al., 2011). Embora no estudo
de Oliveira et al. (2013), tenha se
constatado o efeito benéfico da terapia
intravenosa das células, sem comprovar
seu alojamento no sítio da lesão, tem se
demonstrado que as células podem migrar
em direção ao tecido danificado e integrá-lo
(Paul et al., 2009; Osaka et al., 2010;
Carvalho, 2011) promovendo recuperação
funcional (Mahmood et al., 2005; Xin-min
et al., 2005; Vaquero et al., 2006; Osaka et
al., 2010; Carvalho, 2011), remielinização
(Akiyama et al., 2002) e podendo se
diferenciar em células neuronais ou gliais
(Takeuchi et al., 2007).
O mecanismo preciso de migração das
células infundidas para a área danificada
ainda não é completamente esclarecido,
mas provavelmente envolve a interrupção
da barreira hemato-espinal (Chen et al.,
2001; Akiyama et al., 2002; Osaka et al.,
2010), que pode permanecer comprometida
por semanas após o trauma (Popovich et al.,
1996; Whetstone et al., 2003) permitindo a
entrada seletiva de células no epicentro da
57
lesão. Takeuchi et al. (2007) observaram
que células tronco neuronais humanas
implantadas por via intravenosa com três,
sete ou 10 dias após o trauma medular em
ratos migraram para o sítio da lesão,
principalmente quando aplicadas no sétimo
dia, coincidindo com o pico de expressão de
mRNA do fator de crescimento do
hepatócito (HGF) e do fator 1 derivado de
células estromais (SDF-1). As células foram
detectadas por imunofluorescência, sete
dias após a aplicação, no local da injúria e
nenhuma célula foi detectada em
localização rostral, caudal ou ventral ao
epicentro. Mahmood et al. (2005)
demostraram que células estromais da
medula óssea humana aplicadas via
intravenosa para tratamento de lesão
cerebral traumática em ratos, sobreviveram
e promoveram recuperação funcional por
pelo menos três meses. Em concordância,
Vaqueiro et al. (2006) também observaram
melhora funcional em ratos paraplégicos
que receberam células estromais da medula
óssea na veia dorsal da cauda três meses
após o tratamento, embora tenham
verificado melhora mais intensa e durante
período mais prolongado, de seis meses,
nos animais que receberam as células
diretamente na lesão. Contudo, esses
últimos autores administraram o mesmo
número de células (3 x 106) em ambas as
vias em período crônico, três meses após a
lesão medular, o que não favoreceu a
migração das células para o local da lesão
(Osaka et al., 2010; Vaquero e Zurita,
2011).
Em geral, as células infundidas nos vasos
estão vulneráveis ao sistema imunológico.
A eliminação parcial dessas células pelo
sistema imune do receptor, enquanto estão
na corrente sanguínea é uma das
explicações para a menor eficiência da via
venosa (Paul et al., 2009), pois o efeito
terapêutico das células parece ser dose-
dependente (Honma et al., 2006; Vaquero e
Zurita, 2011). Corroborando esse fato,
Mahmood et al. (2003) citado por
Mahmood et al. (2005) demonstraram
melhora funcional com administração
intravenosa de 2 × 106 células estromais da
medula óssea humana um mês após injúria
traumática cerebral, entretanto o mesmo
não foi detectado com a injeção de 1 x 106
células. Já Osaka el al. (2010) observaram
melhora funcional em ratos com lesão
medular após a aplicação intravenosa de 1 x
106 CTM no 14º dia após a lesão, período
mais precoce do que Mahmood et al. (2003)
e, semelhante ao utilizado nesse estudo.
Além disso, grande preocupação que
envolve a aplicação intravenosa de células é
a distribuição inadequada para outros
órgãos como efeito de primeira passagem
(Paul et al., 2009). Esse efeito não foi
observado por Paul et al. (2009) que
injetaram 1 x 106 células estromais da
medula óssea humana por via intravenosa
em ratos, um dia após a lesão medular
experimental. Depois de quatro ou 21 dias,
as células foram localizadas na região
dorsomedial e dorsolateral da substância
branca no sítio da lesão, sendo que
nenhuma célula foi detectada na região
cranial ou caudal à lesão ou no encéfalo,
assim como não foram encontradas células
nos órgãos não neuronais examinados:
coração, pulmão, fígado e rins. Chen et al.
(2001) encontraram pouquíssimas células
em outros órgãos um dia após a
administração intravenosa de 3 x 106 CTM
em experimento de isquemia cerebral,
sendo que a maioria dessas células se
encontravam dentro dos vasos sanguíneos.
Eles também verificaram que as células
injetadas se dirigiam principalmente para o
hemisfério isquêmico em relação ao
normal. Takeuchi et al. (2007), após a
infusão de 1 x 107 células tronco neuronais,
detectaram algumas células no fígado,
58
pulmão e rim quando injetadas três dias
após o trauma medular, entretanto, quando
elas foram infundidas após sete ou 10 dias
da lesão, não foram encontradas nesses
órgãos. Contudo, no presente estudo, assim
como nos citados acima não foi observado
qualquer efeito colateral que possa ser
correlacionado com a presença das células
em órgãos não desejados.
Considerando a recuperação funcional, o
teste de avaliação da capacidade motora
pela escala de escores BBB foi escolhido
por ser uma das ferramentas mais comuns e
aceitas para avaliar os resultados, a
progressão e/ou recuperação de lesões
medulares experimentais em ratos (Ma et
al., 2001; Agrawal et al., 2008; Sedy et al.,
2008). Além disso, ele é padronizado e
apresenta resultados realistas, confiáveis
(Basso et al., 1996b) e correlacionados com
as alterações histopatológicas (Ma et al.,
2001). Apesar do BBB não requerer
treinamento prévio dos animais, por se
basear em seus movimentos naturais (Basso
et al., 1995; Basso et al., 1996a; Muir e
Webb, 2000), foi constatado que o
condicionamento minimizou a ocorrência
de estresse e, conforme observado por
Basso et al. (1995), aumentou a
movimentação do rato no campo aberto.
Em concordância com esses autores, Sedy
et al. (2008) verificaram que embora o
treinamento não seja necessário, ele é
altamente recomendado.
Assim como Basso et al. (1996a) também
constatou-se que o treinamento prévio dos
avaliadores é extremamente importante para
evitar escores discrepantes atribuídos ao
mesmo animal, influenciando diretamente
na confiabilidade dos escores. Essa
dificuldade na interpretação do BBB ocorre
devido à subjetividade dos parâmetros
analisados que podem levar a dupla
interpretação. Contudo, verificou-se nesse
estudo que o treinamento rigoroso dos
avaliadores, de forma a padronizar os
escores, minimiza a subjetividade,
especialmente quando a avaliação é feita
por dois avaliadores independentes, fato
também observado por Muir e Webb
(2000), Agrawal et al. (2008) e Sedy et al.
(2008).
Durante todo o período de avaliação da
capacidade motora não foi encontrada
nenhuma diferença entre os grupos que
sofreram lesão medular. O grupo CN
apresentou escores máximos na escala BBB
em todas as avaliações.
Na avaliação ‘1’, realizada 24 horas após o
primeiro procedimento cirúrgico, o escore
21 do grupo CN atesta que os animais não
sofreram lesões devido ao procedimento
cirúrgico de acesso à medula espinhal com
laminectomia dorsal confirmando que a
técnica foi realizada de maneira cuidadosa e
precisa. Giglio et al. (2006) relataram
pequenas alterações em testes
comportamentais em ratos submetidos a
laminectomia, fato que não foi observado
nos estudos da EV-UFMG (Silva, 2006;
Torres, 2008; Drummond, 2010; Costa,
2010; Caldeira, 2011; Fukushima, 2012;
Oliveira, 2012). Os grupos submetidos ao
trauma apresentaram déficits neurológicos
graves nessa avaliação, com paraplegia e
escores caracterizados por movimentação
ausente ou discreta em uma ou duas
articulações do membro posterior analisado.
Não houve diferença estatística entre os
grupos que sofreram o trauma medular, o
que indica padronização e homogeneidade
do trauma entre os animais, e confirma a
precisão do modelo de lesão medular
utilizado.
Na avaliação ‘3’, realizada um dia após a
administração intramedular de
condroitinase ou placebo, os escores médios
59
foram maiores do que os da avaliação ‘2’,
sugerindo que a aplicação intramedular não
causou comprometimento adicional da
função motora. Esse achado foi
interessante, pois sugere que a
administração intramedular, apesar de ser
invasiva e requerer procedimento cirúrgico
adicional, pode ser ferramenta terapêutica
viável, pois não resulta em deterioração da
função motora. Resultados semelhantes
foram encontrados por Parr et al. (2008)
com a injeção de 5 µL de células tronco em
suspensão a velocidade de 2,5 µL/min na
região cranial e caudal à lesão medular; por
Hofstetter et al. (2002) que aplicaram 5 µL
de células tronco em suspensão no
epicentro da lesão medular, associado a 2,5
µL cranial e 2,5 µL caudal, a velocidade de
0,5 µL/min e, por Dasari et al. (2007) e
Kamada et al. (2011) que também
administraram o volume de 5 µL na medula
espinhal de ratos sem manifestação de
danos a função motora.
Outro fato interessante é que até a avaliação
‘3’, o CN se distinguiu dos demais,
entretanto a partir da avaliação ‘4‘, o grupo
CDT se igualou estatisticamente a ele e, se
manteve assim até a última avaliação, 28
dias após o trauma medular. Era esperado
que o CN fosse superior aos outros em
todas as avaliações, pois enquanto o
primeiro foi submetido apenas a
laminectomia, os demais sofreram trauma
medular grave. Segundo Taoka e Okajima
(1998), a lesão medular experimental
compressiva produz
paralisia caudal parcialmente reversível e
que geralmente a função motora melhora
gradualmente, mas não completamente.
Embora não tenha apresentado recuperação
completa e nem se diferido do placebo, o
grupo CDT apresentou a melhor
recuperação funcional e, esse resultado
pode ser indicativo de uma possível ação
benéfica da enzima na função motora. Essa
ação talvez possa ser atribuída à digestão
enzimática dos PGSC da cicatriz glial
reduzindo seu efeito inibitório no
crescimento axonal e/ou ser decorrente de
possível efeito da enzima na matriz
extracelular que, ao torna-la mais propícia à
invasão por células endoteliais, levaria à
maior vascularização com consequente
aporte de nutrientes, diminuição ao dano
secundário e neuroproteção.
A recuperação funcional, após traumas
medulares experimentais não apresenta
resultados homogêneos na literatura
consultada. Em relação à condroitinase,
enquanto alguns autores relatam melhor
recuperação funcional (Brandbury et al.,
2002; Huang et al., 2006; Garcia-Alias et
al., 2008; Tester e Howland, 2008; Huang
et al., 2010; Lee et al., 2010), outros
descrevem crescimento axonal mas sem
incremento funcional (Tom et al., 2009).
Garcia-Alias et al. (2009) embora não
tenham observado melhora em testes
comportamentais em ratos com lesão
medular tratados com condroitinase,
verificaram que a enzima associada a
treinamento fisioterápico específico,
resultou em aumento da capacidade de
adaptação do membro pós-lesão e do
desempenho quando comparada a essas
terapias aplicadas isoladamente, semelhante
ao encontrado por Jefferson et al. (2011) em
gatos.
Quanto à ação das células no escore motor,
alguns trabalhos relataram melhora rápida
após a aplicação (Dasari et al. 2007; Osaka
el al., 2010; Carvalho, 2011), outros
estudos encontraram escores maiores
somente após cinco (Hofstetter et al., 2002;
Kamada et al., 2011) ou sete (Lee et al.,
2007) semanas do trauma; e ainda algumas
pesquisas não relataram qualquer melhora
funcional (Lu et al., 2005; Parr et al., 2008)
mesmo avaliando os animais por seis
60
semanas ou mais após o trauma. Caldeira
(2011) verificou que os animais tratados
com CTM obtiveram melhor desempenho
nesse teste a partir do 20º dia pós trauma,
entretanto no 40º dia os escores entre o
grupo tratado e o placebo se igualaram.
Contudo, é difícil comparar os resultados
entre os trabalhos, pois os traumas
experimentais são diferentes, assim como
os tratamentos, períodos, doses e vias de
aplicação.
Esperava-se que os grupos tratados
apresentassem melhor desempenho
locomotor, pois, tanto a terapia celular
(Ohta et al., 2004; Vaquero et al., 2006;
Dasari et al. 2007; Osaka el al., 2010)
quanto a condroitinase (Huang et al., 2006;
Tester e Howland, 2008; Lee et al., 2010;
Jefferson et al., 2011), ou a associação
(Huang et al., 2010; Karimi-Abdolrezaee et
al., 2010) têm demonstrado resultados
funcionais em lesões medulares. A
recuperação motora é o resultado da
combinação de regeneração, brotamento e
alterações na plasticidade, sendo assim,
depende da interação adequada entre as vias
remanescentes (Rossignol e Frigon, 2011).
Dessa forma, supunha-se que a ação dos
fatores tróficos propiciaria neuroproteção
com maior preservação dessas vias e,
ambiente mais propício à regeneração por
maior aporte nutricional pela angiogênese
ou diminuição da cicatriz glial.
Adicionalmente, as células serviriam de
apoio ao brotamento axonal, favorecendo a
plasticidade com consequente recuperação
funcional, fato que não foi constatado. A
ausência de resultados positivos na
recuperação locomotora dos animais
tratados, possivelmente pode ser atribuída a
algum dos seguintes fatores: método e
período de avaliação; gravidade da lesão
medular experimental, ou mesmo protocolo
terapêutico não adequado para promover
melhora na deambulação.
Considerando o método de avaliação, a
recuperação funcional pode ter ocorrido de
forma bastante sutil e, talvez não tenha sido
detectada pelo BBB. Embora esse teste seja
altamente utilizado e aceito para análise de
lesões medulares (Basso et al., 1996b; Ma
et al., 2001), alguns autores sugerem que
ele deve ser associado a outros para
interpretação mais precisa (Muir e Webb,
2000; Giglio et al., 2006; Sedy et al., 2008),
principalmente no caso de traumas dorsais à
medula espinhal, onde as vias sensoriais são
bastante atingidas (Agrawal et al., 2008),
lembrando que a porção ventral possui
principalmente função motora, enquanto a
dorsal é mais sensorial (Hoerlein et al.,
1983). As lesões dorsais e dorsolaterais na
medula espinhal atingem ainda as vias
corticoespinhal e rubroespinhal, que
desempenham papel importante para os
aspectos volitivos e alvo-dirigidos da
locomoção, assim como o controle fino da
musculatura distal. Elas também parecem
desempenhar papel crítico em tarefas
locomotoras mais difíceis como desviar de
obstáculos e andar em escadas. As vias
corticoespinhais estão envolvidas em
movimentos que exigem habilidade e
precisão, assim como em movimentos
antecipatórios (Rossignol e Frigon, 2011), e
no posicionamento exato do pé durante
cada passada (Boulenguez e Vinay, 2009).
Dessa maneira, avaliações sensoriais e
testes que demandem maior aptidão para
execução dos movimentos podem ser
bastante úteis como complementares ao
BBB.
Muir e Webb (2000) indicaram quando há
escores do BBB entre zero e nove, a
inclusão de testes como a natação
(swimming) e uso espontâneo da pata
(spontaneous paw use), no qual é
mensurada a utilização individual de cada
membro. Nesse caso, eles ressaltaram que
61
avaliações sensoriais devem ser realizadas,
como por exemplo, teste do papel colante,
teste de retirada da cauda e teste de
lambedura da pata, e se necessário, os
resultados podem ser medidos mais
precisamente utilizando técnicas
eletrofisiológicas. Agrawal et al. (2008)
sugeriram a utilização da mensuração
eletrofisiológica usando o potencial
somatossensitivo evocado como avaliação
suplementar, por ser mais objetivo, sensível
e detalhado do que o BBB, entretanto, essa
análise exige instrumentação específica,
requer preparação de eletrodos e
processamento de biossinais. Em
concordância com esses autores, Moore
(1992) ressaltou que apesar da deambulação
fornecer informações importantes sobre a
existência de alterações neurológicas,
algumas vezes as anormalidades
visualizadas podem ser bem sutis e
subjetivas e, que a aplicação de outros
testes neurológicos pode ajudar a percebê-
las.
O período de avaliação de 28 dias após o
trauma, pode não ter sido suficiente para a
visualização dos efeitos dos tratamentos na
capacidade motora. Hu el al. (2010)
demonstraram que a recuperação anatômica
e funcional atinge seu platô quatro semanas
após a lesão. Esses autores avaliaram
animais sem tratamento durante 16 semanas
por meio do teste BBB, testes
eletrofisiológicos, ressonância magnética e
histologia, e demonstraram que o escore do
BBB diminuiu drasticamente no primeiro
dia após a lesão, seguido de recuperação
gradual com ápice na quarta semana. Esse
fato foi verificado no grupo placebo do
presente estudo, pois os animais foram
avaliados justamente no período de maior
recuperação espontânea. Com base nesses
resultados, poderíamos esperar que após
essa fase, o grupo placebo apresentaria
resultados inerciais, devido à estagnação da
recuperação espontânea, enquanto os outros
grupos continuariam a evoluir, usufruindo
dos efeitos dos tratamentos. Reforçando
essa teoria, Hofstetter et al. (2002), Lee et
al. (2007) e Kamada et al. (2011) só
conseguiram obter escores do BBB mais
altos nos grupos tratados com células
tronco nas avaliações após cinco ou mais
semanas do trauma. Estudos que relataram
recuperação funcional com o transplante de
CTM da medula óssea e a observaram
precocemente, duas ou três semanas após a
lesão, sugeriram a ocorrência de
neuroproteção mais relevante do que ação
regenerativa. Tem sido postulado que a
neuroproteção pode ocorrer como resultado
da produção de fatores de crescimento pelas
células transplantadas (Parr et al., 2008).
Contudo, assim como ocorreu com Parr et
al. (2008), é possível que a lesão causada à
medula espinhal nesse experimento tenha
sido tão acentuada que impediu a
ocorrência de qualquer neuroproteção e,
que o tempo avaliado tenha sido
insuficiente para perceber os possíveis
efeitos benéficos na plasticidade,
remielinização e regeneração neuronais.
Considerando a avaliação da expressão
gênica dos fatores tróficos BDNF, NT-3,
VEGF e seu receptor KDR, um fato
interessante é que todos os gráficos são
parecidos, sendo que em todos a menor
coluna é a do grupo PLA e, a maior, a do
CTM. O grupo CTM teve expressão
significativamente maior dos fatores BDNF
e VEGF, apresentando resultado mais
favorável que a sua combinação com a
condroitinase. O grupo CDT apresentou
maior expressão de BDNF do que o
placebo, embora menor do que o CTM.
Os astrócitos reativos, por meio da captação
de glutamato, limpeza dos radicais livres, e
síntese de neurotrofinas e hormônios,
protegem os tecidos e preservam as funções
62
nos períodos iniciais após lesões do sistema
nervoso central (Sofroniew, 2005 citado por
Hu et al., 2010). A astrogliose também
pode propiciar a regulação extracelular de
íons, controlar a liberação de
neurotransmissores e permitir reparação da
matriz (García-Alías et al., 2009). No
presente estudo, a condroitinase foi
administrada em uma fase inicial após o
trauma, com menos de quatro semanas, o
que segundo Hu et al. (2010) agiria
inibindo essa ação benéfica dos astrócitos e,
consequentemente sua síntese de
neurotrofinas. Apesar disso, o grupo tratado
teve expressão maior dos fatores benéficos
oriundos da ação dos astrócitos em relação
ao grupo placebo, em desacordo com o
autor citado.
As neurotrofinas desempenham papel
crucial em vários aspectos da função neural,
incluindo sobrevivência, desenvolvimento,
funcionamento e plasticidade (Chen et al.,
2005; Balaratnasingam e Janca, 2012). O
BDNF, o fator de crescimento do nervo
(NGF), a NT-3 e a neurotrofina-4 (NT-4)
são neurotrofinas essenciais conhecidas por
promover sobrevivência neuronal (Webb et
al., 2010). O BDNF e a NT-3 ainda
induzem o crescimento de neuritos, e
aumentam a expressão de enzimas que
sintetizam neurotransmissores (Mocchetti e
Wrathall, 1995 citado por Chen et al.,
2005). Além disso, o BDNF, neurotrofina
mais abundante e abrangente no sistema
nervoso central de mamíferos, tem a
capacidade de inibir a apoptose neuronal
sendo essencial para o seu bom
funcionamento (Balaratnasingam e Janca,
2012; Han et al., 2012). Nesse contexto,
talvez fosse esperado que o grupo CTM que
apresentou maior expressão do BDNF
tivesse maior imunomarcação de neuN,
menor de caspase 3 e melhor recuperação
locomotora. Entretanto, a expressão gênica
é um evento precoce e, após sua ocorrência,
o BDNF precisa ser constituído e ter tempo
para agir, principalmente no caso da função
motora que seria consequência mais tardia
do aumento da expressão dessa
neurotrofina.
Observa-se que a expressão gênica das
neurotrofinas possui inserção bastante
controversa. Diversos estudos
demonstraram aumento local na expressão
de BDNF (Lu et al., 2005; Rodrigues Hell
et al., 2009; Osaka et al., 2010) após
aplicação de células em ratos com lesão
medular, enquanto, Caldeira (2011) ao
avaliar medulas espinhais duas, três ou
cinco semanas após a aplicação de CTM da
medula óssea não detectou expressões
aumentadas de BDNF ou NT-3. A
recuperação correlacionada com o aumento
dessas neurotrofinas também não é
consenso na literatura. Osaka et al. (2010)
correlacionaram os níveis maiores
encontrados com melhor desempenho na
capacidade motora e, Sasaki et al. (2009)
demonstraram que células geneticamente
modificadas para secretar mais BDNF
proporcionavam maior crescimento dos
axônios acompanhado de recuperação
funcional. Por outro lado, corroborando os
achados do presente estudo, Lu et al. (2005)
encontraram aumento dos níveis de BDNF
no grupo que recebeu células, mas não
observaram recuperação funcional e,
atribuíram esse achado ao fato que o
crescimento axonal se limitou ao sítio da
lesão e não se estendeu além dele, o que
também pode ter ocorrido nesse
experimento.
Não está bem estabelecido se as células
transplantadas contribuem para aumentar os
níveis das neurotrofinas por meio de
secreção direta ou por efeito parácrino,
induzindo a secreção no tecido hospedeiro
(Osaka et al., 2010), mas o efeito
neuroprotetor dessas substâncias está
63
claramente associado ao benefício
terapêutico da administração das células
(Chen et al., 2005; Honma et al., 2006; Parr
et al., 2008; Osaka et al., 2010). Entretanto,
Wright et al. (2011) relataram que essas
mesmas neurotrofinas podem ter efeito
limitado na medula espinhal lesada frente as
moléculas inibitórias presentes na cicatriz
glial, ou seja, PGSC, glicoproteína
associada a mielina (MAG) e Nogo-A.
Nesse contexto, era esperado que a CDT,
por inibir os PGSC, contribuísse para
melhor ação das neurotrofinas, aumentadas
pela ação das células tronco, contudo esse
fato não foi comprovado. Apesar do grupo
CDT+CTM ter sido o único que se diferiu
do PLA e apresentou resultados
semelhantes ao controle negativo em
relação à sobrevivência neuronal, seu
resultado foi semelhante ao do grupo que
recebeu apenas as CTM.
O grupo CTM também obteve a maior
expressão de VEGF. Embora esse fator
trófico tenha efeito controverso na lesão
medular (Wang el al., 2011) por alterar a
permeabilidade da barreira hemato-espinal
e, possivelmente causar edema, na maioria
das vezes ele parece ser benéfico (Patel et
al., 2009). Além da sua conhecida função
de estímulo aos vasos sanguíneos, ele tem
ação neuroprotetora (Xin-min et al., 2005),
promove crescimento axonal, melhora na
recuperação funcional e aumento da
sobrevida de células tronco implantadas
(Jin et al., 2011). A angiogênese por si só,
já justificaria maior neuroproteção nesse
grupo, pois pode ser efetiva em reduzir o
dano secundário (Patel et al., 2009; Jin et
al., 2011; Han et al., 2012; Kundi et al.,
2013). O grupo CTM, apesar de ter
expressado mais BDNF e VEGF, não
apresentou melhor recuperação motora.
Contrariando os achados desse estudo,
Wang et al. (2011) encontraram aumento
precoce na capacidade locomotora no grupo
tratado com VEGF sugerindo efeito
benéfico na aceleração da recuperação
neurológica. Patel et al., (2009) também
constataram melhora no teste do BBB, 28
dias após o trauma, no grupo que recebeu
VEGF em relação ao placebo. No trabalho
de Han et al. (2012), a associação de CTM
com sinvastatina aumentou a expressão de
BDNF e VEGF e, foi capaz de promover
redução nas cavitações da lesão e, assim
como em Wang el al. (2011), com
recuperação precoce da função do membro.
Em lesões da medula espinhal, a
interrupção da barreira hemato-espinal e o
rompimento das redes locais de vasos
sanguíneos contribuem para a inflamação e
isquemia. Sendo o grau da isquemia
correlacionado com a gravidade da lesão,
pois a falta de vascularização impede a
ocorrência de processos de reparação
tecidual, terapias que contribuem para
reduzir a perda de vasos e/ou restabelecer a
sua integridade podem auxiliar a
recuperação após uma lesão medular
(McCreedy e Sakiyama-Elbert, 2012;
Kundi et al., 2013). Para avaliar o efeito das
terapias instituídas na angiogênese utilizou-
se, além do VEGF, a molécula de adesão
endotélio plaquetária (PECAM-1),
conhecido marcador de células do endotélio
vascular (Whetstone et al., 2003; Mahoney
et al., 2009). Não houve diferença
estatística entre os grupos quanto à
expressão dessa molécula de adesão,
embora o grupo CDT tenha apresentado os
valores mais altos e, tenha sido observada
maior vascularização nesse grupo e no
CDT+CTM no exame histológico (não
quantificado). Contudo, avaliou-se a
expressão gênica, processo bastante precoce
na angiogênese e, que pode ter ocorrido em
fase anterior à avaliada nesses grupos, não
sendo por isso identificada nesse estudo.
Quanto a expressão gênica da caspase 3,
não houve diferença entre os grupos. Esse
64
resultado era esperado considerando que os
principais picos de apoptose ocorrem com
oito e 24 horas pós trauma medular agudo
experimental em ratos (Lu et al.; 2000) e, a
avaliação nesse estudo foi realizada 30 dias
após o trauma. Corroborando esse
resultado, Lin et al. (2012) constataram
níveis das caspases 3, 6, 8 e 9
significativamente maiores nos grupos que
sofreram trauma medular somente até o
sétimo dia pós lesão e não encontraram
diferença após 14 e 28 dias, quando os
níveis já estavam muito baixos em todos os
grupos. Contrariando esses achados, Mallei
et al. (2005) afirmaram que a apoptose pode
persistir por vários meses e, Dasari et al.
(2007) encontraram menor expressão de
caspase-3, 21 dias após a lesão no grupo
tratado com CTM.
As alterações histológicas encontradas estão
de acordo com a literatura. O trauma grave
geralmente causa cavitação central na
medula em que apenas a borda periférica da
substância branca é preservada (Tator e
Fehlings, 1991). A fagocitose que se inicia
poucos dias após a lesão resulta nessas
cavitações (Janssens, 1991). Dependendo
da gravidade da lesão, a necrose pode se
estender cranial e caudalmente, tipicamente
na base do funículo dorsal (Summers et al.,
1995). Outro achado interessante nessa
avaliação foi a distensão do canal central
medular nas regiões craniais ao trauma,
bem como a diminuição do seu lúmen nas
regiões imediatamente caudais, fato que
pode ser atribuído à obstrução do fluxo do
líquido cefalorraquidiano causada pelo
trauma, levando ao acúmulo desse líquido
no segmento anterior a lesão e diminuição
no posterior. Constatou-se ainda que o
intervalo de 440µM entre as lâminas
permitiu boa caracterização da progressão
da lesão ao longo da medula espinhal, com
visualização de diferentes intensidades de
alterações histológicas, desde vacuolização
discreta até mielomalácia difusa intensa, no
local onde foi realizado o trauma mecânico.
Quanto à avaliação imunoistoquímica pelo
neuN, o grupo que recebeu a combinação
de tratamentos (CDT+CTM) obteve maior
número de neurônios viáveis em relação ao
placebo. Os grupos que receberam células
(CTM e CDT+CTM) apresentaram
imunomarcação neuronal semelhante ao
grupo sem trauma (CN), contudo o
CDT+CTM foi o único que se diferiu do
placebo. O neuN é considerado marcador
específico e confiável e, tem sido
extensivamente utilizado para caracterizar
os neurónios (Mullen et al., 1992; Gill et
al., 2005; Han et al., 2012). A maior
preservação neuronal encontrada no
CDT+CTM pode ter sido mediada pela
neuroproteção causada pelo BDNF, NT-3
ou VEGF, embora esse grupo tenha
apresentado valores desses fatores
inferiores ao CTM, a avaliação foi pontual
e, não mostra o comportamento dos fatores
nos momentos que a precedem. Era
esperado que no grupo CDT+CTM a
condroitinase apresentasse efeito sinérgico
com as CTM, favorecendo a cinética dessas
células na lesão medular, tornando o
ambiente mais propício à ação das
neurotrofinas e à regeneração axonal, e,
favorecendo a vascularização e seus efeitos
benéficos, contudo esse fato não foi
verificado, pois esse grupo teve número de
neurônios viáveis semelhante ao grupo que
recebeu somente as CTM. Lim et al. (2011)
encontraram maior imunomarcação de
neuN no grupo de ratos com isquemia
cerebral que recebeu CTM e, atribuíram
esse achado à migração e diferenciação das
células injetadas, o que também pode ter
contribuído para o resultado encontrado no
grupo CDT+CTM, pois a
transdiferenciação de células da medula
óssea em células neuronais, embora
controversa, é outro mecanismo proposto
65
para explicar o efeito terapêutico das CTM
(Honma et al., 2006; Osaka el al., 2010;
Uccelli et al., 2011).
Na análise imunoistoquímica da GFAP os
grupos CDT e CTM apresentaram
resultados semelhantes ao CN sem,
entretanto, se diferir do placebo. Quanto à
avaliação da vimentina, todos os grupos
com trauma apresentaram imunomarcaçào
maior do que o controle negativo, como era
esperado. Entre os grupos com trauma, o
CDT apresentou o menor valor, sendo o
único que se diferiu do placebo. A
vimentina e o GFAP pertencem a um grupo
de proteínas designadas de filamento
intermediário. O papel exato dessas duas
proteínas, além de suas funções no
citoesqueleto, ainda não está estabelecido,
embora ambas sejam utilizadas como
marcadores gliais (Oudega e Marani, 1991).
A vimentina é considerada o maior
componente do citoesqueleto de astrócitos
imaturos, contudo Oudega e Marani (1991)
demonstraram que, durante a segunda e
terceira semana pós natal em ratos, ocorre
transição de vimentina para GFAP,
possivelmente refletindo a diferenciação de
glioblastos em astrócitos. Contudo, frente a
agressões ao sistema nervoso, ocorre
recuperação na capacidade de expressar
vimentina e, independente da causa da
agressão, o reparo tecidual acaba contando
com reação astrocitária em menor ou maior
grau (Bondan et al., 2003), fato que foi
constatado nesse estudo. Nesses dois
filamentos intermediários verificou-se que a
imunomarcação é aumentada frente à
injúria, em concordância, Luna et al. (2010)
constataram que as células de Müller da
retina de roedores, assim como os
astrócitos, têm incremento de vimentina e
GFAP na ocorrência de lesão, indicando
estado de reatividade. Bondan et al. (2003)
também verificaram maior imunomarcação
desses filamentos no tronco encefálico de
ratos submetidos ao agente gliotóxico
brometo de etídio.
Embora a diminuição do GFAP nos grupos
CDT e CTM não tenha sido significativa,
Rodrigues Hell et al. (2009) relataram que
por meio da imunomodulação, as CTM
conseguem diminuir a astrogliose e a
ativação microglial, com consequente
redução de GFAP, contribuindo para
melhorar a sobrevivência neuronal e
estabilidade sináptica. A CDT pode
conseguir esse efeito de maneira
semelhante, pois a degradação dos PGSC
pela condroitinase ABC resulta na
formação do 6-sulfato dissacarídeo que
também é capaz de modular a micróglia
acarretando neuroproteção (Rolls et al.,
2008).
A cicatriz glial envolve principalmente
astrócitos que são ativados na tentativa de
limitar a extensão da lesão (Crespo et al.,
2007; Rolls et al., 2008) e restaurar a
barreira hematoencefálica (Wright et al.,
2011). Essas células são os principais
componentes da cicatriz glial e, expressam
GFAP e vimentina, dessa forma, menor
imunomarcação da vimentina no grupo
CDT é indicativo da ação dessa enzima
diminuindo a cicatriz glial. Embora não
tenha sido observada aumento da
capacidade motora em nenhum grupo no
presente trabalho, Menet et al. (2003) e Hsu
et al. (2006) demonstraram que
camundongos deficientes de ambos, GFAP
e vimentina, ou com ablação seletiva de
astrócitos reativos, mostram maior
crescimento dos axônios e melhor
recuperação funcional após a lesão, como
resultado da redução da astrogliose reativa.
66
8. CONCLUSÕES
- A CDT e as CTM em terapia única ou
associada não promoveram melhora motora
dos animais estudados após trauma medular
experimental.
- A utilização de CDT e de CTM em terapia
única ou associada não modificou o padrão
da lesão histológica observada nos animais
em relação aos não tratados.
- A associação das CTM com a CDT
promoveu neuroproteção ao apresentar
viabilidade neuronal semelhante ao grupo
CN, mas não demonstrou redução na
cicatriz glial expressa pela imunomarcação
de GFAP e vimentina.
- As CTM, como terapia única,
demonstraram ser o tratamento mais
eficiente para promover aumento na
expressão dos fatores tróficos BDNF e
VEGF, ambos com funções reconhecidas na
neuroproteção.
- O tratamento com a enzima CDT, como
terapia única, aumentou a expressão da
neurotrofina BDNF e promoveu queda na
vimentina em relação ao placebo gerando
neuroproteção e redução na cicatriz glial.
- No presente estudo os valores da
expressão gênica de NT3, KDR, PECAM 1
e caspase 3 não sofreram interferência com
os diferentes tratamentos.
67
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGRAWAL, G.; THAKOR, N. V.; ALL,
A. H. Evoked potential versus behavior to
detect minor insult to the spinal cord in a rat
model. J. Clin. Neurosc., v. 16, p. 1052-
1055, 2009.
AKIYAMA, Y.; RADTKE, C.; HONMOU,
O. et al. Remyelination of the spinal cord
following intravenous delivery of bone
marrow cells. Glia, v. 39, p. 229-236, 2002.
BALARATNASINGAM, S.; JANCA, A.
Brain Derived Neurotrophic Factor: a novel
neurotrophin involved in psychiatric and
neurological disorders. Pharmacol. Ther.,
v. 134, p. 116-124, 2012.
BASSO, M.; BEATTIE, M. S.;
BRESNAHAN, J. C. A sensitive and
reliable locomotor rating scale for open
field testing in rats. J. Neurotrauma, v. 12,
p. 1-21, 1995.
BASSO, M.; BEATTIE, M. S.;
BRESNAHAN, J. C. et al. MASCIS
evaluation of open field locomotor scores:
effects of experience and teamwork on
reliability. J. Neurotrauma, v. 13, p. 343-
359, 1996a.
BASSO, M.; BEATTIE, M. S.;
BRESNAHAN, J. C. Graded histological
and locomotor outcomes after spinal cord
contusion using the NYU weight-drop
device versus transection. Exp. Neurol., v.
139, p. 244-256, 1996b.
BEATTIE, M.S. Inflammation and
apoptosis: linked therapeutic targets in
spinal cord injury. Trends Mol Med., v.10,
p.580-583, 2004.
BERGMAN, R.; LANZ, O.; SHELL, L.
Acute spinal cord trauma: mechanisms and
clinical syndromes. Vet. Med., v. 95, p.
846-849, 2000.
BOELONI, J. N.; OCARINO, N. M.;
MELO, J. F. et al. Dose-dependent effects
of triiodothyronine on the osteogenic
differentiation of rat bone marrow
mesenchymal stem cells. Horm. Res., v. 72,
p. 88-97, 2009.
BONDAN, E.F.; LALLO, M.A.; DAGLI,
M.L.Z. Estudo da imunorreatividade
astrocitária para GFAP e vimentina no
tronco encefálico de ratos wistar
submetidos ao modelo gliotóxico do
brometo de etídio. Arq Neuropsiquiatr., v.
61, p. 642-649, 2003.
BOULENGUEZ, P.; VINAY, L. Strategies
to restore motor functions after spinal cord
injury. Curr. Opin. Neurobiol., v. 19, p.
587-600, 2009.
BRADBURY, E. J.; MOON, L. D. F.;
POPAT, R. J. et al. Chondroitinase ABC
promotes functional recovery after spinal
cord injury. Nature, v. 416, p. 636-640,
2002.
BRAUND, K.G.; SHORES, A.;
BRAWNER, W.R. The etiology, pathology,
and pathophysiology of acute spinal cord
trauma. Vet.Med. v.85, p. 684-691, 1990.
BROWN, S. A.; HALL, E. D. Role of
oxygen-derived free radicals in the
pathogenesis of shock and trauma, with
focus on central nervous system injuries. J.
Am. Vet. Med. Assoc., v. 200, p. 1849-1858,
1992.
BUFFO, A.; ROLANDO, C.; CERUTI, S.
Astrocytes in the damaged brain: Molecular
and cellular insights into their reactive
response and healing potential. Biochem.
Pharmacol., v.79, p. 77-89, 2010.
68
CALDEIRA, F. M. C. Células tronco
mesenquimais indiferenciadas no
tratamento do trauma medular espinal de
ratos Lewis. 2011. 100f. Tese (Doutorado
em Ciência Animal) – Escola de
Veterinária-UFMG, Belo Horizonte.
CAMPOS, M. F.; RIBEIRO, A. T.;
LISTIK, S. et al. Epidemiologia do
traumatismo da coluna vertebral. Rev. Col.
Bras. Cir., v. 35, p. 88-93, 2008.
CARVALHO, J.L.; BRAGA, V.B.A.;
MELO, M.B. et al. Priming mesenchymal
stem cells boosts stem cell therapy to treat
myocardial infarction. J. Cell. Mol. Med., v.
17, p. 617-625, 2013.
CARVALHO, P. H. Avaliação neurológica
e histológica de lesão compressiva da
medula espinhal de ratos Wistar tratados
com células tronco mesenquimais. 2011.
79f. Dissertação (Magister scientiae em
Medicina Veterinária) – Universidade
Federal de Viçosa, Viçosa.
CASTANHEIRA, P.; TORQUETTI, L. T.;
MAGALHÃES, D. R. S. et al. DAPI
diffusion after intravitreal injection of
mesenchymal stem cells in the injured
retina of rats. Cell Transplant., v. 18, p. 1-
100, 2009.
CHEN, J.; LI, Y.; WANG, L. et al.
Therapeutic benefit of intravenous
administration of bone marrow stromal
cells after cerebral ischemia in rats. Stroke,
v. 32, p. 1005-1011, 2001.
CHEN, Q.; LONG, Y.; YUAN, X. et al.
Protective effects of bone marrow stromal
cell transplantation in injured rodent brain:
synthesis of neurotrophic factors. J.
Neurosci. Res., v. 80, p. 611-619, 2005.
CHO, K. J.; TRZASKA, K. A.; GRECO, S.
J. et al. Neurons derived from human
mesenchymal stem cells show synaptic
transmission and can be induced to produce
the neurotransmitter substance P by
interleukin-1a. Stem Cells, v. 23, p. 383-
391, 2005.
COLTER, S.; RUCKER, N. C. Acute injury
to the central nervous system. Vet. Clin.
North Am. Small Anim. Pract., v. 18, p.
545-563, 1988.
COSTA, P. M. Avaliação anátomo-clínica
do dantroleno sódico no trauma medular
agudo experimental em ratos por período
prolongado. 2010. 55 f. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal) – Escola de
Veterinária-UFMG, Belo Horizonte.
COUGHLAN, A. R. Secondary injury
mechanisms in acute spinal cord trauma. J.
Small Anim. Pract., v.34, p. 117-122, 1993.
CRESPO, D.; ASHER, R.A.; LIN, R. et al.
How does chondroitinase promote
functional recovery in the damaged CNS?
Exp. Neurol., v. 206, p. 159-171, 2007.
DASARI, V. R.; SPOMAR, D. G.; CADY,
C. et al. Mesenchymal stem cells from rat
bone marrow down regulate Caspase-3
mediated apoptotic pathway after spinal
cord injury in rats. Neurochem. Res., v. 32,
p. 2080-2093, 2007.
DAVIES, S. J.; FITCH, M. T.;
MEMBERG, S. P. et al. Regeneration of
adult axons in white matter tracts of the
central nervous system. Nature, v. 390, p.
680-683, 1997.
DOMINICI, M.; LE BLANC, K.;
MUELLER, I. et al. Minimal criteria for
defining multipotent mesenchymal stromal
cells. The international society for cellular
69
therapy position statement. Cytotherapy, v.
8, p. 315-317, 2006.
DRUMMOND, B. L. Subfração PnTx 3-6
do veneno da aranha armadeira (Phoneutria
nigrivebter) no tratamento de ratos wistar
submetidos ao trauma agudo compressivo à
medula espinhal. 2010. 52p. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal) – Escola de
Veterinária-UFMG, Belo Horizonte.
FERRARI, G.; CUSELLA-DE ANGELIS,
G.; COLETTA, M. et al. Muscle
regeneration by bone marrow-derived
myogenic progenitors. Science, v. 279, p.
1528-1530, 1998.
FUKUSHIMA, F.B. Avaliação do efeito
neuroprotetor do propofol e do etomidato
em ratos submetidos ao trauma medular
espinal. 2012. 85f. Tese (Doutorado em
Ciência Animal) – Escola de Veterinária-
UFMG, Belo Horizonte.
GALTREY, C. M.; KWOK, J. C. F.;
CARULLI, D. et al. Distribution and
synthesis of extracellular matrix
proteoglycans, hyaluronan, link proteins
and tenascin-R in the rat spinal cord. Eur. J.
Neurosci., v. 27, p. 1373-1390, 2008.
GARCIA-ALÍAS, G.; BARKHUYSEN, S.;
BUCKLE, M. et al. Chondroitinase
treatment opens a window of opportunity
for task-specific rehabilitation. Nat.
Neurosci., v. 12, p. 1145-1151, 2009.
GARCIA-ALÍAS, G.; LIN, R.; AKRIMI, S.
F. et al. Therapeutic time window for the
application of chondroitinase ABC after
spinal cord injury. Exp. Neurol., v. 210, p.
331-338, 2008.
GARCIA-ALÍAS, G.; PETROSYAN,
H.A.; SCHNELL, L. et al. Chondroitinase
abc combined with neurotrophin nt-3
secretion and nr2d expression promotes
axonal plasticity and functional recovery in
rats with lateral hemisection of the spinal
cord. . J. Neurosci., v. 31, p. 17788-17799,
2011.
GIGLIO, C. A.; DEFINO, H. L. A.; DA
SILVA, C. A. et al. Behavioral and
physiological methods for early quantitative
assessment of spinal cord injury and
prognosis in rats. Braz. J. Med. Biol. Res.,
v. 39, p. 1613-1623, 2006.
GILL, S.K.; ISHAK, M.; RYLETT, R.J.
Exposure of nuclear antigens in formalin-
fixed, paraffin-embedded necropsy human
spinal cord tissue: Detection of NeuN. J.
Neurosci. Methods, v. 148, p. 26-35, 2005.
GRILL, R. J. User-defined variables that
affect outcome in spinal cord
contusion/compression models. Exp.
Neurol., v. 196, p. 1-5, 2005.
GUEST, J.; BENAVIDES, F.; PADGETT,
K. et al. Technical aspects of spinal cord
injections for cell transplantation. clinical
and translational considerations. Brain Res.
Bull, v. 84, p. 267-279, 2011.
HAMBLY, P. R.; MARTIN, B.
Anaesthesia for patients with chronic spinal
cord injury. Anaesthesia, v. 53, p. 273-289,
1998.
HAN, X.; YANG, N.; CUI, Y. et al.
Simvastatin mobilizes bone marrow stromal
cells migrating to injured areas and
promotes functional recovery after spinal
cord injury in the rat. Neurosci Lett., v. 521,
p. 136-141, 2012.
HAUSMANN, O. N. Post-traumatic
inflammation following spinal cord injury.
Spinal Cord, v. 41, p. 369-378, 2003.
70
HEDEMAN, L.S.; SIL, R. Studies in
experimental spinal cord trauma. Part 2:
comparison of treatment with steroids, low
molecular weight dextran, and
catecholamine blockade. J. Neurosurg.,
v.40, p.44-51, 1974.
HOERLEIN, B.F.; REDDING, R.W.;
HOFF, E.J.; McGUIRE, J.A. Evaluation of
dexamethasone, DMSO, mannitol and
solcoseryl in acute spinal cord trauma. J.
Am. Anim. Hosp. Assoc., v.19, p.216-226,
1983.
HOFSTETTER, C. P.; SCHWARZ, E. J.;
HESS, D. et al. Marrow stromal cells form
guiding strands in the injured spinal cord
and promote recovery. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A., v. 99, p. 2199-2204, 2002.
HONMA, T.; HONMOU, O.; IIHOSHI, S.
et al. Intravenous infusion of immortalized
human mesenchymal stem cells protects
against injury in a cerebral ischemia model
in adult rat. Exp. Neurol., v. 199, p. 56-66,
2006.
HSU, J.Y.C.; MCKEON, R.; GOUSSEV,
S. et al. Matrix metalloproteinase-2
facilitates wound healing events that
promote functional recovery after spinal
cord injury. J. Neurosci., v. 26, p. 9841-
9850, 2006.
HUANG. W. C.; KUO, W. C.; CHERNG,
J. H. et al. Chondroitinase ABC promotes
axonal re-growth and behavior recovery in
spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res.
Commun., v. 349, p. 963-968, 2006.
HUANG, W. C.; KUO, W. C.; HSU, S. H.
et al. Gait analysis of spinal cord injured
rats after delivery of chondroitinase ABC
and adult olfactory mucosa progenitor cell
transplantation. Neurosci. Lett., v. 472, p.
79-84, 2010.
HU, R.; ZHOU, J.; LOU, C. et al. Glial scar
and neuroregeneration: histological,
functional, and magnetic resonance imaging
analysis in chronic spinal cord injury. J.
Neurosurg.Spine, v. 13, p. 169-180, 2010.
HWANG, D. H.; KIM, H. M.; KANG, Y.
M. Combination of multifaceted strategies
to maximize the therapeutic benefits of
neural stem cell transplantation for spinal
cord repair. Cell Transplant., v. 20, p.
1361-1379, 2011.
HYATT, A. J. T.; WANG, D.; KWOK, J.
C. Controlled release of chondroitinase
ABC from fibrin gel reduces the level of
inhibitory glycosaminoglycan chains in
lesioned spinal cord. J Control Release, v.
147, p. 24-29, 2010.
IACI, J. F.; VECCHIONE, A. M.;
ZIMBER, M. P. et al. Chondroitin sulfate
proteoglycans in spinal cord contusion
injury and the effects of chondroitinase
treatment. J. Neurotrauma, v. 24, p. 1743-
1759, 2007.
IKEGAMI, T.; NAKAMURA, M.;
YAMANE, J. et al. Chondroitinase ABC
combined with neural stem/progenitor cell
transplantation enhances graft cell
migration and outgrowth of growth-
associated protein-43-positive fibers after
rat spinal cord injury. Eur. J. Neurosci., v.
22, p. 3036-3046, 2005.
ISEDA, T.; OKUDA, T.; KANE-
GOLDSMITH, N. et al. Single, high-dose
intraspinal injection of chondroitinase
reduces glycosaminoglycans in injured
spinal cord and promotes corticospinal
axonal regrowth after hemisection but not
contusion. J. Neurotrauma, v. 25, p. 334-
349, 2008.
71
JANSSENS, L.A.A. Mechanical and
pathophysiological aspects of acute spinal
cord trauma. J Small Anim Pract, v.32,
p.572-578, 1991.
JIANG, Y.; JAHAGIRDAR, B. N.; LEE
REINHARDT, R. et al. Pluripotency of
mesenchymal stem cells derived from adult
marrow. Nature, v. 418, p.41-49, 2002.
JIN, H.L.; PENNANT, W.A.; LEE, M.H. et
al. Neural stem cells modifi ed by a
hypoxia-inducible VEGF gene expression
system improve cell viability under hypoxic
conditions and spinal cord injury. SPINE, v.
36, p. 857–864, 2011.
JEFFERSON, S. C.; TESTER, N. J.;
HOWLAND, D. R. Chondroitinase ABC
promotes recovery of adaptive limb
movements and enhances axonal growth
caudal to a spinal hemisection. J. Neurosci.,
v. 31, p. 5710-5720, 2011.
JEFFERY, N.D.; BLAKEMORE, W.F.
Spinal cord injury in small animals 1.
Mechanisms of spontaneous recovery. Vet.
Rec., v.144, p.407-413, 1999.
KAMADA, T.; KODA, M.; DEZAWA, M.
et al. Transplantation of human bone
marrow stromal cell-derived Schwann cells
reduces cystic cavity and promotes
functional recovery after contusion injury
of adult rat spinal cord. Neuropathol., v. 31,
p.48-58, 2011.
KARIMI-ABDOLREZAEE, S.;
EFTEKHARPOUR, E.; WANG, J. et al.
Synergistic effects of transplanted adult
neural stem/progenitor cells,
chondroitinase, and growth factors promote
functional repair and plasticity of the
chronically injured spinal cord. J.
Neurosci., v. 30, p. 1657-1676, 2010.
KITADA, M. Mesenchymal cell
populations: development of the induction
systems for Schwann cells and neuronal
cells and finding the unique stem cell
population. Anat Sci Int, v. 87, p. 24-44,
2012.
KORNEGAY, J. N. Patogênese das
afecções do sistema nervosa central. In:
SLATTER, D. Manual de Cirurgia de
Pequenos Animais. 2.ed. São Paulo:
Manole, 1998. v.1, cap.71, p.1231-1249.
KUNDI, S.; BICKNELL, R.; AHMED, Z.
The role of angiogenic and wound-healing
factors after spinal cord injury in mammals.
Neurosci. Res., v.76, p. 1-9, 2013.
KWON, B. K.; FISHER, C. G.; DVORAK,
M. F.et al. Strategies to promote neural
repair and regeneration after spinal cord
injury. Spine, v. 30, p. S3-S13, 2005.
LEE, B. H.; LEE, K. H.; YOON, D. H. et
al. Effects of methylprednisolone on the
neural conduction of the motor evoked
potentials in spinal cord rats. J. Korean
Med. Sci., v. 20, p. 132-138, 2005.
LEE, H., MCKEON, R. J.,
BELLAMKONDA, R. V. Sustained
delivery of thermostabilized chABC
enhances axonal sprouting and functional
recovery after spinal cord injury. Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 107, p. 3340–
3345, 2010.
LEE, K. H.; SUH-KIM, H.; CHOI, J. S. et
al. Human mesenchymal stem cell
transplantation promotes functional
recovery following acute spinal cord injury
in rats. Acta Neurobiol. Exp., v. 67, p. 13-
22, 2007.
LIM, J.Y.; JEONG, C.H.; JUN, J.A. et al.
Therapeutic effects of human umbilical
72
cordblood-derived mesenchymal stem cells
after intrathecal administration by lumbar
puncture in a rat model of cerebral
ischemia. Stem Cell Res. Ther., v. 2, p. 1-
13, 2011.
LIN, H.S.; JI, Z.S.; ZHENG, L.H. et al.
Effect of methylprednisolone on the
activities of caspase 3, 6, 8 and 9 in rabbits
with acute spinal cord injury. Exp. Ther.
Med., v.4, p. 49-54, 2012.
LIN, R.; ROSAHL, T.W.; WHITING, P.J.
et al. 6-sulphated chondroitins have a
positive influence on axonal regeneration.
Plos One, v. 6, p.1-10, July 2011.
LIVAK, K. J.; SCHMITTGEN, T. D.
Analysis of relative gene expression. Data
using real time quantitative PCR and the 2(-
Delta Delta CT) method. Methods, v. 25, p.
402-408, 2001.
LU, J.; ASHWELL, K.W.S.; WAITE, P.
Advances in secondary spinal cord injury:
Role of apoptosis. Spine, v.25, p.1859-
1866, 2000.
LU, P.; JONES, L. L.; TUSZYNSKI, M. H.
BDNF-expressing marrow stromal cells
support extensive axonal growth at sites of
spinal cord injury. Exp. Neurol., v. 191, p.
344-360, 2005.
LUNA, G.; LEWIS, G.P.; BANNA, C.D. et
al. Expression profiles of nestin and
synemin in reactive astrocytes and Müller
cells following retinal injury: a comparison
with glial
fibrillar acidic protein and vimentin. Mol.
Vis., v. 16, p.2511-2523, 2010.
MAHMOOD, A.; LU, D.; QU, C. et al.
Human marrow stromal cell treatment
provides long-lasting benefit after traumatic
brain injury in rats. Neurosurg., v. 57, p.
1026-1031, 2005.
MAHMOOD, A.; LU, D.; LU, M. et al.
Treatment of traumatic brain injury in adult
rat with intravenous administration of
human bone marrow stromal cells.
Neurosurg., v. 53, p. 697-703, 2003.
MAHONEY, E.T.; BENTON, R.L.;
MADDIE, M.A. et al. ADAM8 is
selectively upregulated in endothelial cells
and is associated with angiogenesis after
spinal cord injury in adult mice. J. Comp.
Neurol., v.512, p. 243-255, 2009.
MALLEI, A.; ADEN, S.A.; BACHIS, A.;
BRANDOLI, C.; ONGINI, E.;
MOCCHETTI, I. The nitrosteroid NCX
1015, a prednisolone derivative, improves
recovery of function in rats after spinal cord
injury. Brain. Res., v.1062, p.16-25, 2005.
MALTMAN, D. J.; HARDY, S. A.;
PRZYBORSKI, S. A. Role of
mesenchymal stem cells in neurogenesis
and nervous system repair. Neurochem. Int.,
v. 59, p. 347-356, 2011.
MA, M.; BASSO, M.; WALTERS, P. et al.
Behavioral and histological outcomes
following graded spinal cord contusion
Injury in the C57Bl/6 Mouse. Exp. Neurol.,
v. 169, p. 239–254, 2001.
MASSEY, J.M.; AMPS, J.; VIAPIANO,
M.S. et al.Increased chondroitin sulfate
proteoglycan expression in denervated
brainstem targets following spinal cord
injury creates a barrier to axonal
regeneration overcome by chondroitinase
ABC and neurotrophin-3. Exp. Neurol., v.
209, p. 426–445, 2008.
MCCREEDYA, D.A.; SAKIYAMA-
ELBERTA, S.E. Combination therapies in
73
the CNS: engineering the environment.
Neurosci. Lett., v. 519, p. 115-121, 2012.
MENET, V.; PRIETO, M.; PRIVAT, A. et
al. Axonal plasticity and functional
recovery after spinal cord injury in mice
deficient in both glial fibrillary acidic
protein and vimentin genes. PNAS, v. 100,
p. 8999-9004, 2003.
MEYER, F.; VIALLE, L. R.; VIALLE, E.
N. et al. Alterações vesicais na lesão
medular
experimental em ratos. Acta Cirurg. Brasil.,
v. 18, p. 203-208, 2003.
MITSUI, T.; FISCHER, I.; SHUMSKY, J.
S. et al. Transplants of fibroblasts
expressing BDNF and NT-3 promote
recovery of bladder and hindlimb function
following spinal contusion injury in rats.
Exp. Neurol., v. 194, p. 410-431, 2005.
MOCCHETTI, I.; WRATHALL, J. R.
Neurotrophic factors in central nervous
system trauma. J. Neurotrauma, v. 5, p.
853-870, 1995.
MOORE, M.P. Approach to the patient
with spinal disease. Vet. Clin. North Am.
Small Anim. Pract., v. 22, n. 4, p. 751-781,
1992.
MUIR, G. D.; WEBB, A. A. Assessment of
behavioural recovery following spinal cord
injury in rats. Eur. J. Neurosci., v. 12, p.
3079–3086, 2000.
MULLEN R.J., BUCK C.R., SMITH A.M.
NeuN, a neuronal specific nuclear protein in
vertebrates. Development, v. 116, p. 201-
211, 1992.
NAKAJIMA, H.; UCHIDA, K.;
GUERRERO, A.R. et al. Transplantation of
mesenchymal stem cells promotes an
alternative pathway of macrophage
activation and functional recovery after
spinal cord injury. J Neurotrauma, v. 29, p.
1614–1625, 2012.
NG, M.T. L.; STAMMERS , A.T.; KWON,
B.K. Vascular disruption and the role of
angiogenic proteins after spinal cord injury.
Transl. Stroke Res., v. 2, p.474-491, 2011.
OLIVEIRA, K.M. Efeitos de diferentes
doses de ω-conotoxina MVIIC no
tratamento de ratos submetidos ao trauma
medular agudo compressivo. 2012. 61 f.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal)
– Escola de Veterinária-UFMG, Belo
Horizonte.
OLIVEIRA, M.S.; MELO, M.B.;
CARVALHO, J.L. Doxorubicin
cardiotoxicity and cardiac function
improvement after stem cell therapy
diagnosed by strain echocardiography. J.
Cancer Sci. Ther., v. 5, p. 52-57, 2013.
OSAKA, M.; HONMOU, O.;
MURAKAMI, T. et al. Intravenous
administration of mesenchymal stem cells
derived from bone marrow after contusive
spinal cord injury
improves functional outcome. Brain Res., v.
1343, p. 226-235, 2010.
OHTA, M.; SUZUKI, Y.; NODA, T. et al.
Bone marrow stromal cells infused into the
cerebrospinal fluid promote functional
recovery of the injured rat spinal cord with
reduced cavity formation. Exp. Neurol., v.
187, p. 266-278, 2004.
OUDEGA, M. e MARANI, E. Expression
of vimentin and glial fibrillary acidic
protein in the developing rat spinal cord: an
immunocytochemical study of the spinal
cord glial system. J. Anat., v. 179, p. 97-
114, 1991.
74
PARR, A. M.; KULBATSKI, I.; WANG,
X. H. et al. Fate of transplanted adult neural
stem/progenitor cells and bone marrow–
derived mesenchymal stromal cells in the
injured adult rat spinal cord and impact on
functional recovery. Surg. Neurol., v. 70, p.
600-607, 2008.
PATEL,C.B.; COHEN, D.M.; AHOBILA-
VAJJULA, P. et al. Effect of VEGF
treatment on the blood-spinal cord barrier
permeability in experimental spinal cord
injury:dynamic contrast-enhanced magnetic
resonance imaging. J. Neurotrauma, v. 26,
p. 1005-1016, 2009.
PAUL, C.; SAMDANI, A. F.; BETZ, R. R.
et al. Grafting of human bone marrow
stromal cells into spinal cord injury: a
comparison of delivery methods. Spine, v.
34, p. 328-334, 2009.
PITTENGER, M. F.; MACKAY, A. M.;
BECK, S. C. et al. Multilineage potential of
adult human mesenquimal stem cells.
Science, v. 284, p. 143-147, 1999.
QUERTAINMONT, R.; CANTINIEAUX,
D.; BOTMAN, O. et al. Mesenchymal stem
cell graft improves recovery after spinal
cord injury in adult rats through
neurotrophic and pro-angiogenic actions.
Plos One, v. 7, p. 1-15, 2012.
QUESENBERRY, P. J.; BECKER, P. S.
Stem cell homing: rolling, crawling, and
nesting. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v.
95, p. 15155–15157, 1998.
RODRIGUES HELL, R. C.; COSTA, M.
M. S.; GOES, A. M. et al. Local injection
of BDNF producing mesenchymal stem
cells increases neuronal survival and
synaptic stability following ventral root
avulsion. Neurobiol. Disease, v. 33, p. 290-
300, 2009.
ROLLS, A.; SHECHTER, R.; LONDON,
A. et al. Two faces of chondroitin sulfate
proteoglycan in spinal cord repair: A role in
microglia/macrophage activation. Plos
Med., v. 5, p. 1262-1277, 2008.
ROSSIGNOL, S.; FRIGON A. Recovery of
locomotion after spinal cord injury: some
facts and mechanisms. Annu. Rev.
Neurosci., v. 34, p. 413-440, 2011.
ROWLAND, J. W.; GREGORY, W. J.;
HAWRYLUK, M. D. et al. Current status
of acute spinal cord injury pathophysiology
and emerging therapies: promise on the
horizon. Neurosurg. Focus, v. 25, p. 1-17,
2008.
RYU, H. H.; LIM, J. H.; BYEON, Y. E. et
al. Functional recovery and neural
differentiation after transplantation of
allogenic adipose-derived stem cells in a
canine model of acute spinal cord injury. J.
Vet. Sci., v. 10, p. 273-284, 2009.
SASAKI, M.; RADTKE, C.; TAN, A.M. et
al. BDNF-hypersecreting human
mesenchymal stem cells promote functional
recovery, axonal sprouting, and protection
of corticospinal neurons after spinal cord
injury. J. Neurosci., v. 29, p. 14932-14941,
2009.
SEDY, J.; URDZIKOVA, L.;
JENDELOVA, P. et al. Methods for
behavioral testing of spinal cord injured
rats. Neurosci. Biobehav. Rev., v. 32, p.
550-580, 2008.
SEVERO, M. S.; TUDURY, E. A.; ARIAS,
M. V. B. Fisiopatologia do trauma e da
compressão à medula espinal de cães e
gatos. Med. Vet., v. 1, p. 78-85, 2007.
75
SHIELDS, L. B. E.; ZHANG, Y. P.;
BURKE, M. A. Benefit of chondroitinase
ABC on sensory axon regeneration in a
laceration model of spinal cord injury in the
rat. Surg. Neurol., v. 69, p. 568-577, 2008.
SILVA, C. M. O. Efeito da prednisona em
lesão medular aguda experimental em ratos
(Rattus novergicus). 2006. 46f. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal) – Escola de
Veterinária-UFMG, Belo Horizonte.
SILVER, J.; MILLER, J. Regeneration
beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci.,
v. 5, p. 146-156, 2004.
SOFRONIEW, M. V. Reactive astrocytes
in neural repair and protection.
Neuroscientist, v. 11, p. 400-407, 2005.
SPAETH, E.; KLOPP, A.; DEMBINSKI, J.
et al. Inflammation and tumour
microenvironments: Defining the migratory
itinerary of mesenchymal stem cells. Gene
Ther., v. 15, p. 730-738, 2008.
SPRINGER, J.E. Apoptotic cell death
following traumatic injury to the central
nervous system. J. Biochem.Mol. Biol., v.
35, p. 94-105, 2002.
SUMMERS, B. A.; CUMMINGS, J. F.;
DeLAHUNTA, A. Injuries to the central
nervous system. In:___. Veterinary
Neuropathology. St. Louis: Ed. Mosby,
1995. cap.4, p.189-207.
SUN, F.; HE, Z. Neuronal intrinsic barriers
for axon regeneration in the adult CNS.
Curr. Opin. Neurobiol., v. 20, p. 510-518,
2010.
SYKOVÁ, E; JENDELOVÁ, P. Migration,
fate and in vivo imaging of adult stem cells
in the CNS. Cell Death Differ., v. 14, p.
1336-1342, 2007.
TAKEUCHI,H.; NATSUME, A.;
WAKABAYASHI, T. et al. Intravenously
transplanted human neural stem cells
migrate to the injured spinal cord in adult
mice in an SDF-1- and HGF-dependent
manner. Neurosci. Lett., v. 426, p. 69-74,
2007.
TALAC, R.; FRIEDMAN, J. A.; MOORE,
M. J. et al. Animal models of spinal cord
injury for evaluation of tissue engineering
treatment strategies. Biomaterials, v. 25, p.
1505-1510, 2004.
TAOKA, Y.; OKAJIMA, K. Spinal cord
injury in the rat. Prog. Neurobiol., v. 56, p.
341-358, 1998.
TATOR, C. H.; FEHLINGS, M. G. Review
of the secondary injury theory of acute
spinal cord trauma with emphasis on
vascular mechanisms. J. Neurosurg., v. 75,
p. 15-26, 1991.
TESTER, N. J., HOWLAND, D. R.
Chondroitinase ABC improves basic and
skilled locomotion in spinal cord injured
cats. Exp. Neurol., v. 209, p. 483-496,
2008.
THURET, S.; MOON, L. D. F.; GAGE, F.
H. Therapeutic interventions after spinal
Cord injury. Nature, v. 7, p. 628-643, 2006.
TOM, V. J.; HOULÉ, J. D. Intraspinal
microinjection of chondroitinase ABC
following injury promotes axonal
regeneration out of a peripheral nerve graft
bridge. Exp. Neurol., v. 211, p. 315-319,
2008.
TOM, V. J.; KADAKIA, R.; SANTI, L. et
al. Administration of chondroitinase ABC
rostral or caudal to spinal cord injury site
promotes anatomical but not functional
76
plasticity. J. Neurotrauma, v. 26, p. 2323-
2333, 2009.
TORRES, B. B. J. Efeitos do dantrolene
sódico em ratos adultos com trauma
medular agudo experimental. 2008. 84f.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal)
– Escola de Veterinária-UFMG, Belo
Horizonte.
TORRES, B. B. J.; SILVA, C. M. O.;
ALMEIDA, F. M. C. et al. Modelo
experimental de trauma medular agudo
produzido por aparelho estereotáxico
modificado. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec.,
v. 62, p. 92-99, 2010.
TROPEL, P.; NOËL, D.; PLATEL, N. et al.
Isolation and characterisation of
mesenchymal stem cells from adult mouse
bone marrow. Exp. Cell Res., v. 295, p.
395- 406, 2004.
UCCELLI, A.; BENVENUTO, F.;
LARONI, A. et al. Neuroprotective features
of mesenchymal stem cells. Best. Pract.
Res. Clin. Haematol., v. 24, p. 59-64, 2011.
VAQUERO, J.; ZURITA, M. Functional
recovery after severe CNS trauma: Current
perspectives for cell therapy with bone
marrow stromal cells. Prog. Neurobiol., v.
93, p. 341-349, 2011.
VAQUERO, J.; ZURITA, M.; OYA, S. et
al. Cell therapy using bone marrow stromal
cells in chronic paraplegic rats: Systemic or
local administration? Neurosci. Lett., v.
398, p. 129-134, 2006.
VERMEULEN, M.; LE PESTEUR, F.;
GAGNERAULT, M. C. et al. Role of
adhesion molecules in the homing and
mobilization of murine hematopoietic stem
and progenitor cells. Blood, v. 92, p. 894-
900, 1998.
WALKER, A.P.; SHAH, S.K.; JIMENEZ,
F. Intravenous multipotent adult progenitor
cell therapy for traumatic brain injury:
preserving the blood brain barrier via an
interaction with splenocytes. Exp. Neurol.,
v. 225, p. 341-352, 2010.
WANGA,Y.F.; FAN, Z.K.; CAO, Y. et al.
2-Methoxyestradiol inhibits the up-
regulation of AQP4 and AQP1 expression
after spinal cord injury. Brain Res., v. 1370,
p. 220-226, 2011.
WEBB, A. A.; NGAN, S.; FOWLER, J. D.
Spinal cord injury I: A synopsis of the basic
science. Can. Vet. J., v. 51, p. 485-492,
2010.
WHETSTONE, W.D.; HSU, J.Y.C.;
EISENBERG, M. et al. Blood-spinal cord
barrier after spinal cord injury: relation to
revascularization and wound healing. J
Neurosci Res., v.74, p. 227-239, 2003.
WRIGHT, K. T.; MASRI, W. E.; OSMAN,
A. et al. Concise Review: Bone marrow for
the treatment of spinal cord injury:
Mechanisms and clinical applications. Stem
Cells, v. 29, p. 169-178, 2011.
XIA, Y.; ZHAO, T.; LI, J. Antisense
vimentin cDNA combined with
chondroitinase ABC reduces glial scar and
cystic cavity formation following spinal
cord injury in rats.
Bioch. Bioph. Res. Commun., v. 377, p.
562-566, 2008.
XIN-MIN, D.; BO-YONG, M.; SHU, J. et
al. Neuroprotective effect of exogenous
vascular endothelial growth factor on rat
spinal cord neurons in vitro hypoxia. Chin.
Med. J., v. 118, p. 1644-1650, 2005.
77
YIU, G.; HE, Z. Glial inhibition of CNS
axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci., v.
7, p. 617-626, 2006.
YUAN, J. S.; REED, A.; CHEN, F. et al.
Statistical analysis of real-time PCR data.
B. M. C. Bioinformatics, v. 7, 2006. <
http://www.biomedcentral.com/1471-
2105/7/85>. Acesso em: 16 fev. 2012.
ZHAO, R.R. e FAWCETT, J. Combination
treatment with chondroitinase ABC in
spinal cord injury—breaking the barrier.
Neurosci. Bull., v. 29, p. 477-483, 2013.
78
10. ANEXOS
10.1. Anexo 1. Certificado do Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA/UFMG)
79
10.2. Anexo 2. Resultados individuais da capacidade motora pela escala de escores BBB
em cada dia de avaliação
CONTROLE NEGATIVO
Avaliação Animal
1 2 3 4 5 6 7 8
A1G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A2G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A3G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A4G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A5G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A6G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A7G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A9G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A10G1 21 21 21 21 21 21 21 21
A2G3 21 21 21 21 21 21 21 21
PLACEBO
Avaliação
Animal 1 2 3 4 5 6 7 8
A2G2 0 0 0 1 1 4 5 5
A4G2 0 0 1 5 5 0 2 6
A5G2 1 5 8 10 13 13 14 14
A6G2 0 0 0 0 1 1 1 1
A7G2 0 0 0 0 0 0 0 1
A8G2 1 1 8 8 9 9 10 10
A9G2 0 0 4 7 7 7 7 8
A10G2 0 0 1 1 1 4 4 7
A4G3 0 1 7 8 9 9 9 10
A5G3 0 0 4 4 8 8 8 9
CONDROITINASE
Avaliação
Animal 1 2 3 4 5 6 7 8
A1G4 0 0 0 1 6 6 8 8
A2G4 0 0 1 1 1 1 1 1
A3G4 0 0 0 1 2 2 2 6
A4G4 1 4 8 11 13 17 19 20
A5G4 0 0 0 2 7 7 7 9
A6G4 1 1 4 8 10 12 14 14
A7G4 0 1 8 9 9 9 11 11
A8G4 0 1 8 9 9 10 10 11
A9G4 0 6 8 10 10 11 12 13
A10G4 0 0 0 0 0 1 1 1
80
CTM
Avaliação
Animal 1 2 3 4 5 6 7 8
A1G5 0 0 1 1 7 8 8 8
A2G5 0 4 8 8 9 9 9 9
A4G5 0 0 1 1 1 3 3 3
A5G5 0 0 0 0 1 4 4 5
A7G5 0 0 0 0 1 3 3 4
A8G5 0 0 0 0 0 0 1 1
A9G5 0 0 0 0 0 1 1 1
A1G7 1 1 7 8 8 9 9 10
A5G7 0 0 0 1 6 7 7 7
A11G6 0 0 0 1 4 4 4 4
CONDROITINASE + CTM
Avaliação
Animal 1 2 3 4 5 6 7 8
A1G6 1 1 6 8 9 10 12 12
A3G6 0 0 1 4 6 7 7 7
A4G6 0 0 1 1 2 7 7 7
A5G6 0 0 0 1 1 1 4 5
A6G6 0 0 0 0 0 1 3 3
A7G6 0 0 0 0 0 0 0 0
A8G6 0 0 1 1 3 6 6 6
A9G6 0 0 0 0 1 6 7 7
A10G6 0 0 0 0 1 1 1 1
A3G7 1 1 1 2 2 2 3 8