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Caratterizzazione funzionale della biosintesi degli aromi delle uve duran-te lo sviluppo dell’acino e controllo della qualità aromatica delle uveD’Onofrio Claudio*

Laboratorio di Ricerche Viticole ed Enologiche, Dipartimento di Coltivazione e Difesa delle SpecieLegnose “G. Scaramuzzi”, Università di Pisa

Ricezione: 1 giugno 2011; Accettazione: 25 giugno 2011

Functional characterisation ofaroma biosynthesis during berrydevelopment and management ofgrape aroma quality

Abstract. Grapevine is one of the most importantcrops in the world and many research groups havefocused their attention on it. The technological poten-tial of a grape variety depends on some compoundsderived from secondary metabolism, such as fla-vanoids and flavour compounds, determining theorganolectic parameters used to define wine quality.Grape-derived flavour compounds and some flavourprecursors modified during fermentation are producedduring berry development and the final mixturedepends on variables, which include the grape varietyused, the environmental conditions during the growingseason, the management of the vineyard and of theripening stage at the time of harvest. Grape flavourmanagement in the vineyard requires knowledge ofthe derivation of individual flavour and aroma charac-teristics and the effects that different concentrationsand interactions between these compounds have onflavour potential. Hundreds of secondary metabolitesthat potentially contribute to wine aroma have beenidentified in grape berries. The main groups of grapeberries flavour metabolites include terpenoids(monoterpenes, sesquiterpenes, C13-norisoprenoids),shikimate pathway derivatives (volatile phenols andbenzene derivatives), thiols, methoxypyrazines,aliphatic aldehydes and alcohols. Recent technologyapplications in the field of functional genomics, themassive sequencing of expressed genome sections,the decodification of whole grape genome, togetherthe evolution of techniques for analysis of volatiles,yield many progress in functional characterisation onaroma biosynthesis in berries. The analysis of aromaevolution during the berry development of severalvarieties achieved many aspects on the influence ofcultivation site, light intensity, temperature, leafremoval, abiotic and biotic stresses on the biosynthe-sis of grape aromas. The analysis of correlationamong flavour compounds and gene expression pat-terns during berry development and in elicited cell

suspension is a useful tool for the selection and func-tional characterisation of genes involved in aromabiosynthesis and it achieved the characterisation of alarge number genes involved in terpene, thiols andmethoxypyrazines biosynthesis. The above knowl-edge on grape and wine aroma research, will improvedecision making along the chain of production for themanagement of aroma to improve wine typicity.

KKey words: aroma gene’s, aroma precursors, berrydevelopment, GC-MS, gene expression, grapearoma, SPE, SPME.

Gli aromi del vino e delle uve

Il fascino esercitato dal vino sul consumatore èdovuto alla complessità delle sensazioni che esso è ingrado di dare, alla loro variabilità e non uniformabi-lità. In tale ambito la finezza, la persistenza e la com-plessità aromatica di un vino sono caratteristichemolto ricercate dal consumatore moderno.

L’aroma del vino è costituito da alcune centinaiadi composti di varia origine, con concentrazioni chevariano da diversi mg/L a qualche frazione di ng/L, dipiccola dimensione (< 300 Da) e volatili alle normalicondizioni atmosferiche, che generano una sensazio-ne di odore quando raggiungono l’epitelio olfattivo.Grazie all’enorme variabilità di note espresse, gliaromi rappresentano i componenti che maggiormentedefiniscono i parametri di qualità e di tipicità delvino, inoltre, alcune componenti della frazione aro-matica possono essere assunte come marker tecnolo-gici e di conservazione del vino rivestendo un ruoloimportante nella rintracciabilità di filiera e nella dife-sa delle produzioni locali e regionali.

Gli aromi del vino sono attribuibili ad aldeidi,alcoli, esteri, idrocarburi, chetoni e furani. In relazio-ne alla loro genesi essi possono essere classificati in:• aromi primari o varietali: sostanze presenti nelle

uve che conferiscono al vino l’impronta aromaticadel vitigno;

• aromi secondari o pre-fermentatici e fermentativi:sostanze che si originano dal metabolismo dei lie-* [email protected]

Review n. 14 – Italus Hortus 18 (2), 2011: 39-61

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viti e dei batteri che conducono le fermentazionialcolica e malolattica;

• aromi terziari o post-fermentativi: sostanze deriva-te da reazioni chimiche post-fermentative cheintervengono nel corso dell’evoluzione e dell’affi-namento del vino.Gli aromi del vino sono, pertanto, il risultato della

concomitanza di:• metabolismo dell’uva, dipendente dall’ecosistema

viticolo (vitigno/portinnesto, clima, terreno, tecni-che colturali);

• biochimismi pre-fermentativi (ossidazioni, idrolisi)che si verificano nel corso della pigiatura e dellamacerazione;

• metabolismo dei microrganismi responsabili dellafermentazione alcolica e malolattica, dipendenteanche dai composti delle uve non direttamentecoinvolti nella produzione degli aromi;

• reazioni chimiche che avvengono durante l’evolu-zione e l’affinamento dei vini.Conseguentemente, il profilo aromatico di un vino

è l’espressione di tanti fattori che insieme contribui-scono a definire un carattere aromatico che è tipico edistintivo di ogni tipologia di vino ed è strettamentelegato alla varietà, al territorio e all’andamento stagio-nale.

Aromi varietali e qualità aromatica delle uve

Un vino viene particolarmente apprezzato quandodegustandolo si percepiscono l’originalità del vitignoe il territorio nel quale il vino è stato prodotto. Gliaromi varietali, pertanto, nell’essere importanti neldeterminare le caratteristiche qualitative del vino e nelpermettere il riconoscimento del vitigno nel vino,sono tra i composti che maggiormente determinano lecaratteristiche qualitative delle uve e da cui dipende ilpotenziale tecnologico di un vitigno. Lo studio dellecaratteristiche aromatiche delle uve ha permesso divalorizzare vitigni con buone potenzialità enologiche,ma poco coltivati, contribuendo al mantenimento dellabiodiversità ed alla valorizzazione di prodotti legati alterritorio. Il controllo della qualità aromatica delle uvenel vigneto richiede le conoscenze sulla provenienzadei vari composti che li caratterizzano e su come leconcentrazioni e le interazioni tra questi influenzano ilpotenziale aromatico. Al fine di poter opportunamenteintervenire in modo mirato con le tecniche colturaliper modulare la qualità aromatica nel vigneto, ènecessario individuare i momenti di massima biosinte-si delle singole classi di composti nel corso dello svi-luppo dell’acino e conoscere nel dettaglio l’influenzadei vari fattori colturali sulla loro biosintesi.

Aromi varietali e precursori d’aromaLe principali classi di composti che costituiscono

gli aromi varietali sono terpeni (monoterpeni e sesqui-terpeni), C13-norisoprenoidi, derivati della via biosin-tetica dello scichimato (detti anche derivati del benze-ne o benzenoidi), tioli volatili (detti anche mercapta-ni), metossipirazine, alcoli alifatici e aldeidi a 6 atomidi carbonio (fig. 1).

Gli aromi varietali sono presenti nelle uve e neivini sia in forma libera che coniugata non volatile einodore. Gli aromi varietali coniugati, detti anche“precursori d’aroma”, rilasciano gli agliconi odorosidurante la vinificazione e la conservazione dei viniconferendo al vino le note aromatiche varietali (DiStefano et al., 1998; Maicas e Mateo, 2005; Cabrita etal., 2006; Ugliano e Moio, 2008).

Gli aromi presenti nell’uva già in forma liberavengono anche definiti “aromi varietali primari”,mentre gli agliconi che si liberano nel corso delle fasidi pre-fermentazione, fermentazione e affinamentodagli aromi coniugati presenti nell’uva sono anchedetti “aromi varietali secondari”.

In relazione alla presenza di aromi varietali liberi econiugati le uve vengono classificate in:• “uve aromatiche”, quelle in cui gli aromi liberi

sono presenti in concentrazioni superiori alla lorosoglia olfattiva e, quindi, immediatamente percetti-bili con la degustazione dell’uva;

• “uve neutre” o “a sapore semplice” o “non aro-matiche”, quelle in cui le forme libere degli aromisono presenti in concentrazioni inferiori alla lorosoglia olfattiva e, di conseguenza, non percettibilicon la degustazione delle uve.I precursori d’aroma dei monotepeni, C13-noriso-

prenoidi, derivati del benzene e alcoli alifatici C6sono coniugati degli zuccheri (eterosidi), e nello spe-cifico si tratta di glucosidi semplici in cui l’agliconeè legato al glucosio, o glicosidi disaccaridici in cui

Fig. 1 - Principali classi di aromi varietali dell’uva.Fig. 1 - Main classes of grape aroma.

Biosintesi e qualità degli aromi delle uve

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α-L-arabinofuranosio o α-L-ramnopiranosio o il β-D-apiofuranosio sono legati al glucosio e quindi all’agli-cone (fig. 2) (Francis e Newton, 2005). I tioli, invece,non sono presenti nell’uva come S-coniugati dellacisteina (Tominaga et al, 1998) o del glutatione(Fedrizzi et al., 2009).

Gli eterosidi rilasciano gli agliconi odorosi, duran-te la vinificazione e la conservazione dei vini, peridrolisi enzimatica attraverso azione degli enzimi del-l’uva, dei lieviti o esogeni, o per idrolisi acida pro-mossa dagli acidi del mosto e del vino. La composi-zione e le proprietà sensoriali del pool di compostirilasciati attraverso questi due meccanismi sono fon-damentalmente differenti: l’idrolisi enzimatica impli-ca la rottura del legame glicosidico e, quindi, noninduce ulteriori trasformazioni nella struttura chimicadell’aglicone rilasciato, mentre l’idrolisi acido-cataliz-zata comporta la rottura del legame etere tra il gluco-sio e l’aglicone con formazione di un carbocationereattivo, che può subire ulteriori trasformazioni dandoun vasto assortimento di composti. L’idrolisi enzima-tica degli eterosidi implica l’intervento di glicosidasiche agiscono in modo sequenziale: prima un enzimaspecifico che rompe il legame disaccaridico (α-L-ramnosidasi, α-L- arabinosidasi, β-D-apiosidasi) e poiuna β-D-glucosidasi che libera l’aglicone odoroso dalglucosio (Gunata et al., 1988). Sia l’uva che i lievitipossiedono delle glicosidasi capaci di idrolizzare que-sti eterosidi dell’uva, ma nelle condizioni di vinifica-zione, questa idrolisi è relativamente limitata, siaperché le β-glicosidasi hanno un pH ottimale di atti-vità intorno a 5-6, sia perché esse sono fortemente ini-

bite dal glucosio. Poiché l’attività enzimatica presentenaturalmente nell’uva e nei lieviti non è sufficiente aliberare tutto il potenziale aromatico, si può fare ricor-so a preparati enzimatici esogeni a forte attività β-gli-cosidasica.

Gli agliconi S-coniugati dei tioli vengono idroliz-zati principalmente nel corso della fermentazionealcolica per azione della β-liasi dei lieviti che rompe illegame carbonio-zolfo (Peyrot de Gachons et al.,2002). I tioli coniugati sono responsabili della partico-lare sensazione descritta come “ritorno aromatico diSauvignon”, che si percepisce bruscamente per viaretro-nasale dopo vari secondi dal momento delladegustazione delle uve per azione di una reazionedovuta agli enzimi della nostra mucosa orale che libe-ra gli agliconi di questi composti.

Fattori che regolano la biosintesi degli aromivarietali

La produzione e la composizione finale degliaromi delle uve, prodotti nel corso dello sviluppodegli acini, dipende da vari fattori, tra cui il vitigno, lecondizioni pedo-climatiche e le tecniche colturali, checongiuntamente alle tecniche di vinificazione, sonoresponsabili delle differenze che caratterizzano i viniottenuti da uno stesso vitigno.

Il genotipo rappresenta indubbiamente il fattore piùimportante. Sulla base dei vari profili aromatici sonostati realizzati raggruppamenti di vitigni aventi tenden-ze biosintetiche simili a seconda della natura e del con-tenuto dei composti terpenici in esse presenti (DiStefano, 1996a). I monoterpeni prevalgono nelle uvearomatiche, tra cui il Moscato bianco (D’Onofrio etal., 2010a), mentre nel Sangiovese (Di Stefano et al.,1996c; Lanati et al., 2000; D’Onofrio et al., 2008) eCiliegiolo (D’Onofrio et al., 2010b) i monoterpeni e iC13-norisoprenoidi sono tra loro in concentrazioni piùsimili. Nelle uve di Aleatico prevalgono i monoterpenicome nel Moscato bianco, ma con una netta prevalen-za del geraniolo anziché del linalolo (D’Onofrio et al.,2010a). Nelle uve di Vermentino, un vitigno conside-rato ad uva neutra, vi è una leggera prevalenza deimonoterpeni sui derivati del benzene e C13-norisopre-noidi e una significativa presenza di aromi liberi anchese in concentrazioni molto inferiori a quelle riscontratenelle uve tipicamente aromatiche del Moscato bianco eAleatico, ma completamente assenti nelle uve diSangiovese (caratteristica tipica delle uve non aromati-che). Pertanto, dal punto di vista aromatico, ilVermentino si colloca in una posizione intermedia tra ivitigni tipicamente a uve non aromatiche e i vitigni auve aromatiche (D’Onofrio et al., 2010c). Mentre alcu-ne classi di aromi sono ubiquitarie, tra cui appunto

Fig. 2 - Struttura degli aromi glicoconiugati.Fig. 2 - Structure of glycoconjugates aroma.

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monoterpeni e C13-norisoprenoidi, alcuni vitigni sonodotati di aromi specifici che non sono rilevabili in altrecultivar, come ad esempio le metossipirazine ed i tioliche caratterizzano i Cabernet, il Sauvignon blanc epochi altri vitigni (Kalua e Boss, 2009; Rodríguez-Bencomo et al., 2009), e i sesquiterpeni che sono tra iprincipali responsabili dell’aroma dei vini di Syrah(Wood et al., 2008).

Tra i diversi fattori colturali che influenzano ilcontenuto in aromi delle uve vi sono l’ambiente dicoltivazione (Borsa et al., 2007), il microclima deigrappoli (Reynolds et al., 1996; Lee et al., 2007), larimozione delle foglie basali (Zoecklein et al., 1998;D’Onofrio et al., 2010c), l’esposizione diretta delgrappolo alla radiazione solare e l’escursione termicagiornaliera (Belancic et al., 1997), i livelli produttivied il diradamento dei grappoli (Reynolds et al., 1996;Prajitna et al., 2007), lo stadio di maturazione delleuve (Palomo et al., 2007). Un elevato contenuto incalcare dei terreni favorisce la persistenza e la finezzaaromatica e l’accumulo di C13-norisoprenoidi, mentrela concimazione aumenta la concentrazione di carote-noidi la cui sintesi può, però, essere ridotta se i grap-poli sono in ombra.

Profili aromatici e dinamiche di espressione genica

Al fine di poter controllare in modo adeguato laqualità aromatica del vigneto, oltre a conoscere l’in-fluenza dei vari fattori colturali sulla biosintesi di que-sti composti, è necessario individuare i momenti dimassima biosintesi delle singole classi di composti nelcorso dello sviluppo dell’acino al fine di poter inter-venire in modo mirato con le tecniche colturali.Quindi è necessario determinare sia i picchi di accu-mulo dei singoli composti nel corso dello sviluppodell’acino sia conoscere nel dettaglio le dinamiche diespressione dei geni responsabili della loro biosintesi.In passato gli studi in merito alle dinamiche di accu-mulo degli aromi e di espressione genica nel corsodello sviluppo dell’acino sono state spesso disincenti-vate dalla mancanza di metodologie affidabili, sempli-ci ed economiche, capaci di identificare e quantificareuna così grande quantità di composti, spesso comples-si, e per l’agevole determinazione dell’espressione delgran numero di geni coinvolti, oltre che dai molteplicieffetti esercitati dall’ambiente sulla componente aro-matica delle uve.

Tecniche di analisi degli aromi ed evoluzione dei pro-fili aromatici durante lo sviluppo dell’acino

La determinazione e la quantizzazione degli aromidelle uve, sia liberi che coniugati, viene fatta princi-

palmente attraverso estrazione in fase solida (SPE:solid phase extraction) o con micro-estrazione in fasesolida dello spazio di testa (HS-SPME: head spacesolid phase micro extraction) e determinazionemediante gas-cromatografia accoppiata a spettrome-tria di massa (GC-MS). Inoltre i precursori non volati-li e gli aromi coniugati possono essere analizzatidirettamente con apparato per cromatografia liquidaaccoppiata a spettrometria di massa (LC-MS).

Sostanzialmente i più diffusi protocolli per l’anali-si degli aromi delle uve prevedono l’analisi separatadella componente libera degli aromi e di quella coniu-gata, generalmente eterosidica. La metodologia SPE,così come riportato da Di Stefano (1991), consistenell’estrazione della componente solubile degli acinifreschi in un tampone tartarico a pH 3,2 e successivaseparazione delle componenti di interesse con passag-gio su cartucce contenenti resine C18 che legano siagli aromi liberi che glicosilati. Dalle cartucce vengonoeluiti prima gli aromi liberi, che sono concentrati apiccolo volume e analizzati con l’apparato GC-MS, epoi vengono eluiti gli aromi glicosilati che sono suc-cessivamente trattati con delle glicosidasi in modo daliberare gli agliconi che vengono recuperati con ulte-riore passaggio sulle resine C18 e quindi analizzatialla GC-MS. Con l’estrazione di tipo HS-SPME,generalmente gli acini vengono macinati e posti in unpiccolo recipiente chiuso dove viene inserita una fibraricoperta di materiale sorbente in modo da adsorbirele sostanze volatili che vengono poi desorbite diretta-mente nell’iniettore dell’apparato GC-MS. Il proto-collo SPE sopra descritto presenta una buona ripetibi-lità e consente una facile separazione degli aromi libe-ri da quelli glicosilati, mentre l’SPME descritta rilevameglio alcuni composti, ma non consente una faciledeterminazione degli aromi glicosilati dato che l’ag-giunta delle glicosidasi direttamente nel campione diuve macinate difficilmente riesce a liberare gli aglico-ni degli eterosidi a causa della presenza del glucosioche inibisce questi enzimi. Lo spettrometro di massaaccoppiato al gascromatografo consente una facileidentificazione qualitativa dei vari composti volatiliattraverso il confronto degli spettri di massa con quel-li degli standard o di specifici database. La determina-zione quantitativa viene invece fatta confrontando learee dei picchi del cromatogramma con quelle dei sin-goli standard oppure confrontando l’area dei picchi ditutti i composti di interesse con quella di uno standardinterno appositamente aggiunto al campione, ottenen-do così una determinazione di tipo semiquantitativa.

In generale, il contenuto totale di aromi, e partico-larmente di terpeni e derivati del benzene è molto ele-vato nei fiori, e insieme ai C13-norisoprenoidi e com-


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posti alifatici C6, sono già presenti nell’uva acerba,anche se a concentrazioni basse, per poi aumentareprogressivamente nel corso della maturazione in con-comitanza con l’accumulo degli zuccheri. Mentre,altre classi di aromi, come le metossipirazine, si accu-mulano molto prima dell’invaiatura ed il loro conte-nuto si riduce notevolmente durante la maturazione(Ryona et al., 2008; Kalua e Boss, 2009), e altre anco-ra, come i benzenoidi, compaiono solo durante lamaturazione (Kalua e Boss, 2009).

A tale proposito è necessario porre l’attenzionesu alcune considerazioni che riguardano le modalitàdi espressione della concentrazione degli aromi nelleuve. Dal punto di vista produttivo ed enologico risul-ta conveniente esprimere le concentrazioni per unitàdi peso di tessuto, e quindi nel caso specifico perpeso dell’acino, ma ai fini dello studio delle dinami-che di biosintesi e di accumulo appare più conve-niente esprimere tale contenuto per singolo acino, inmodo da evitare gli eventuali effetti di diluizione chesi possono verificare in seguito al rapido accumulodi acqua e altri componenti all’interno dell’acino, eavere, pertanto, una indicazione più precisa sull’ef-fettiva attività di biosintesi e di accumulo.Prendendo in considerazione il contenuto in terpeni,C13-norisoprenoidi, derivati del benzene e compostialifatici a C6, rilevati in fiori chiusi e aperti, e aciniad intervalli regolari di 10-11 giorni dall’allegagionealla surmaturazione in Moscato bianco, un vitignoaromatico, ed esprimendo le concentrazioni pergrammo di tessuto, gli aromi appaiono particolar-mente abbondanti nei fiori e presenti sin dalle primefasi di sviluppo degli acini per poi aumentare note-volmente di concentrazione nel corso della matura-zione fino a raggiungere un picco di concentrazioneche precede la vendemmia (fig. 3) (D’Onofrio et al.,2010a). Esprimendo le medesime concentrazioni persingolo fiore o acino (fig. 4), sparisce il picco diconcentrazione nei fiori e appare ben evidente chel’accumulo comincia ad aumentare significativamen-te sin dalla fine della fase erbacea, e non è più visibi-le l’apparente stasi nell’accumulo che invece risultaevidente esprimendo le medesime concentrazioni pergrammo di tessuto a causa dell’effetto di diluizioneconseguente al rapido accrescimento dell’acino. Ilpicco di aromi liberi, rappresentato principalmenteda terpeni, indicherebbe il momento di massima atti-vità biosintetica per questi composti. In riferimentoalle varie classi di aromi, i terpeni e i derivati delbenzene sono apparsi particolarmente abbondanti neifiori, e tutte le classi di aromi considerate sono risul-tate presenti già dalle prime fasi di sviluppo dell’aci-no (fig. 5). Inoltre, appare chiaro che vi è una forte

prevalenza dei monoterpeni sulle altre componentiaromatiche, mentre nel Sangiovese, un vitigno nonaromatico, il contenuto totale in aromi nelle variefasi fenologiche di sviluppo dell’acino è apparsoinferiore fino a 4 volte, e a differenza del Moscato,in questo vitigno non vi è la netta prevalenza dei ter-peni che vanno a coprire le note aromatiche dellealtre classi di aromi, ma terpeni, C13-norisoprenoidi ederivati del benzene hanno tra loro concentrazionisimili implicando una maggiore complessità aromati-ca dei vini (D’Onofrio et al., 2008). Maggiori detta-gli sulle dinamiche di accumulo degli aromi nel

Fig. 3 - Curva di crescita dell’acino e concentrazioni dellecomponenti libere e glicosilate degli aromi, in fiori (chiusi e

aperti) e acini di “Moscato bianco” espresse in μg per grammo ditessuto. (D’Onofrio et al., dati non pubblicati).

Fig. 3 - Trend of berry development and total, free andglycolconjugates aroma compounds in flowers (bud flowers andopen flowers) and during berry development of Moscato bianco.Concentration expressed as μg per g of tissue. (D’Onofrio et al.,

unpublished data).

Fig. 4 - Curva di crescita dell’acino e concentrazioni dellecomponenti libere e glicosilate degli aromi in fiori (aperti e

chiusi) e acini di “Moscato bianco” espresse in μg per fiore oacino. (D’Onofrio et al., dati non pubblicati).

Fig. 4 - Trend of berry development and of single class of aromacompounds in flowers (bud flowers and open flowers and during

berry development of Moscato bianco. Concentration expressed asμg per flower or berry. (D’Onofrio et al., unpublished data).

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corso dello sviluppo dell’acino sono forniti nellespecifiche sezioni delle varie classi di aromi.

La genomica funzionale e l’espressione genica nellacaratterizzazione della biosintesi degli aromi

Le recenti innovazioni tecnologiche nel campodella genomica funzionale hanno reso possibileimportanti progressi anche per la vite. In tal senso,l’ampio sequenziamento delle sequenze espresse,dette ESTs (Expressed Sequence Tags), ha rappresen-tato un’acquisizione di grande importanza per lagenomica funzionale: la vite è una delle specie megliocaratterizzate in termini di ESTs, tanto che attualmen-te in Genbank le ESTs di Vitis vinifera oltrepassano le360.000 accessioni, la maggior parte delle quali relati-ve alle varie fasi di sviluppo dell’acino. Nuovi scenarisi sono poi aperti in seguito al sequenziamento com-pleto del genoma della vite (Jaillon et al., 2007;Velasco et al., 2007), evento che ha agevolato la pos-sibilità di identificazione delle sequenze geniche. Èproprio grazie all’analisi dell’omologia delle sequenzegenomiche e delle ESTs con sequenze già annotate inaltri organismi che recentemente sono stati individuatie caratterizzati tutta una serie di geni coinvolti nellabiosintesi degli aromi della vite. In tale ambito, l’ana-lisi della correlazione tra l’accumulo dei compostiaromatici e l’espressione genica nei fiori e durante losviluppo dell’acino si è rilevato un ottimo strumentoper la selezione dei più promettenti geni candidaticoinvolti nella biosintesi dei terpeni (D’Onofrio et al.,2010a), tioli (Kobayashi et al., 2011) e metossipira-zione (Dunlevy et al., 2010). Inoltre, come prima giàevidenziato, la conoscenza delle dinamiche di espres-sione genica nel corso dello sviluppo dell’acino sono

di fondamentale importanza per identificare le fasifenologiche nelle quali questi geni sono maggiormen-te espressi al fine di poter intervenire in modo miratoe puntuale per modulare adeguatamente la qualità aro-matica delle uve.

Allo stato attuale l’espressione genica può essereagevolmente determinata con costi contenuti attraver-so la RT-PCR real-time, i microarrays a DNA e tecni-che di sequenziamento veloce di ultima generazionetipo pirosequenziamento. La PCR real-time, denomi-nata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa intempo reale (rtq-PCR), è un metodo di amplificazionee quantificazione simultanea del DNA. La PCR real-time rileva la fluorescenza emessa durante la reazionecome un indicatore della quantità di ampliconi pro-dotti in ogni singolo ciclo. Il segnale fluorescenteaumenta proporzionalmente all’aumento della quan-tità di prodotto di PCR, per cui, rilevando la quantitàdi fluorescenza emessa in ogni singolo ciclo di PCR èpossibile monitorare la reazione di PCR durante lafase esponenziale, nel corso del quale il primo incre-mento significativo dei prodotti di PCR è correlatoalla quantità di stampo presente all’inizio della reazio-ne: tanto più è elevato il numero di copie di stampoall’inizio della reazione tanto più è precoce un signifi-cativo incremento della fluorescenza emessa. La PCRreal-time, combinata con la PCR Retro Trascrizionale(RT-PCR), permette di quantificare l’espressione rela-tiva di un gene ad un tempo specifico, in particolaretessuto o una particolare cellula. I DNA microarrayssono divenuti uno strumento di fondamentale impor-tanza per la diagnostica medica, la farmacogenomicae la biologia dello sviluppo animale e vegetale. Ilprincipio concettuale di questa metodologia è la capa-cità di analisi dell’espressione contemporanea di moltigeni attraverso la disposizione in “arrays” su chip dioligomeri di DNA sintetico designati sulla base disequenze di genoma espresse. Il pirosequenziamentoè una delle nuove tecniche di sequenziamento ad ele-vato parallelismo, basata sul principio del sequencingby synthesis che si basa sull’utilizzo di una serie dienzimi che producono luce in presenza di ATP quan-do un nucleotide viene incorporato nel filamento adopera della DNA polimerasi. Per ogni ciclo vieneintrodotto un unico nucleotide e l’incorporazione nelfilamento dei nucleotidi genera una quantità di luceche è proporzionale al numero di basi incorporate inun’unica aggiunta di nucleotidi. La luce emessa vienerilevata da un sensore CCD che ne registra l’intensità,sulla base della quale si ricostruisce la sequenza.Questo tipo di tecnica risulta particolarmente utile perla valutazione dell’espressione genica nelle specie incui è stato sequenziato il genoma, tra cui appunto la

Fig. 5 - Curva di crescita dell’acino e concentrazioni delle varieclassi di aromi in fiori (aperti e chiusi) e acini di “Moscatobianco” espresse in μg per fiore o acino. (D’Onofrio et al.,

dati non pubblicati).Fig. 5 - Trend of berry development and of single class of aromacompounds in flowers (bud flowers and open flowers and duringberry development of Moscato bianco. Concentration expressedas μg per flower or berry. (D’Onofrio et al., unpublished data).


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vite, che tra l’altro, grazie al grosso lavoro di annota-zione genica che è stato svolto, il suo genoma è diven-tato quello di riferimento per gli studi nelle speciearboree da frutto.

In molti studi di genomica funzionale sono stateutilizzate con successo anche le sospensioni cellulari,le quali, oltre ad essere economiche, offrono la possi-bilità di controllare facilmente e accuratamente lecondizioni ambientali permettendo di effettuare espe-rimenti durante tutto il corso dell’anno e di attribuirespecifici effetti ad un determinato fattore. Inoltre, lapossibilità di utilizzare le sospensioni cellulari perattivare la sintesi di determinati composti per mezzodi appropriati elicitori, congiuntamente all’analisi del-l’espressione genica, rappresenta un ottimo mezzo perindividuare i presunti geni coinvolti in specifiche viebiosintetiche. In tale ambito le sospensioni cellulari divite sono state utilizzate con successo per avere infor-mazioni sui fattori che stimolano la biosintesi degliaromi nelle uve (D’Onofrio et al., 2009a; Thibon etal., 2011) e per individuare una serie di geni coinvoltinella biosintesi dei sesquitepeni (D’Onofrio et al.,2009a).

Le classi degli aromi varietali

Tra le varie classi di aromi varietali, i terpeni(monoterpeni, sesquiterpeni), C13-norisoprenoidi,derivati del benzene, alcoli e aldeidi C6 sono compo-sti che sono stati generalmente identificati nelle uve ditutti i vitigni fin ora analizzati, mentre le metossipira-zine e i tioli sono più specifici per alcune varietà.

TerpeniI terpeni appartengono alla più ampia classe di

metaboliti secondari delle piante e quelli che maggior-mente contribuiscono a determinare gli aromi delleuve e dei vini sono i monoterpeni, ai quali si aggiun-gono i sesquiterpeni particolarmente importanti inalcuni vini. I monoterpeni sono composti a 10 atomidi carbonio e i sesquiterpeni a 15 atomi di carbonio. Iterpeni comprendono anche i carotenodi (tetraterpenia 40 atomi di carbonio) dai quali derivano i C13-nori-soprenoidi.

I monoterpeni sono tipicamente aromi varietali ealti livelli di monoterpeni si ritrovano generalmentenelle uve aromatiche. Approssimativamente nelle uvesono stati identificati 70 monoterpeni, presenti comeidrocarburi semplici, aldeidi, alcoli (anche conosciuticome monoterpenoli), acidi e esteri. I più frequentisono i monoterpenoli, tra cui il linalolo e i suoi epos-sidi piranici e furanici, nerolo, geraniolo, citronellolo,α-terpineolo, ossido di nerolo e ossido di rosa che

conferiscono gradevoli note floreali di rosa (geranio-lo, nerolo, ossido di rose), di coriandolo (linalolo), dicanfora (linalol ossido), ma anche note verdi (ossidodi nerolo) ed erbacee non sempre piacevoli. Nel vinola loro soglia di percezione varia da frazioni a centi-naia di microgrammi per litro.

Nell’acino i monoterpeni possono trovarsi nell’uvasia in forma libera che glicosilata e sono stati indivi-duati principalmente nella buccia (Gholami et al.,1995) anche se è ancora poco chiara la situazioneriguardo alla compartimentalizzazione tra i differentitessuti del frutto. I monoterpeni sono molto abbon-danti nei fiori (Wilson et al., 1984, D’Onofrio et al.,2010a) e sono presenti in tutte le fasi di sviluppo del-l’acino dove l’accumulo riprende significativamentealla fine della fase erbacea in correlazione con l’accu-mulo degli zuccheri, per poi diminuire nell’ultimafase della maturazione (Asporundi et al., 2007) prece-dendo spesso la data di vendemmia, come evidenziatoin Moscato bianco e Sangiovese (D’Onofrio et al.,2010a), Moscato d’Amburgo (Fenoll et al., 2009),Airén, Chardonnay e Macabeo (Garcia et al., 2003) ein uve da tavola (Yang et al., 2011). I più abbondantieterosidi monotepeni sono apiosilglicosidi e arabino-silglicosidi, seguiti dai rutinosidi e poi dai monoglu-cosidi, e sono contenuti in quantità pressoché similinelle diverse parti dell’acino, mentre la proporzionerelativa fra composti liberi e legati varia in funzionedella cultivar. Generalmente nell’acino la frazioneeterosidica dei monoterpeni è da 3 a 10 volte piùabbondante di quella libera, persino nelle uve aroma-tiche (Gunata et al., 1988; D’Onofrio et al., 2010a),rimane inoltre sempre più elevata di quella libera eaumenta in concentrazione nel corso della maturazio-ne (D’Onofrio et al., 2010a; Fenoll et al., 2009;Hellin et al., 2010) suggerendo che lo stoccaggiodegli alcoli terpenici avviene per la maggior parte informa legata, ad eccezione del linalolo la cui frazionelibera è talvolta superiore a quella legata nelle uvemature (Fenoll et al., 2009) o addirittura per tutta ladurata della maturazione.

I sesquiterpeni sono presenti nelle uve esclusiva-mente in forma libera e ne sono stati identificati alcu-ni come idrocarburi a odore resinoso e alcuni comealcoli. Il farnesolo rappresenta uno dei principali com-ponenti volatili dei mosti di alcune varietà quali ilBoal e il Verdello (Câmara et al., 2004), Baga(Coelho et al., 2006), Syrah (Parker et al., 2007), ed èrisultato molto abbondante nei fiori di Moscato bian-co (fig. 6) e di Sangiovese, con lievi picchi talvoltarilevati nel corso della fase erbacea (D’Onofrio et al.,2010a). Alcuni sesquiterpeni, tra cui il β-cariofillene,sono stati identificati nelle uve di Cabernet sauvignon

D’Onofrio

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e Riesling (Kalua e Boss, 2009; 2010). Il ruolo senso-riale dei sesquiterpeni nei vini è però ancora pocochiaro; solo recentemente è stata identificata una rela-zione tra la concentrazione del sesquiterpene “rotun-done” e la tipica nota di pepe nero dell’uva e nel vinodi Syrah (Wood et al., 2008). Il rotundone è statoindividuato anche nella Vespolina, un’uva trentina,dove aumenta progressivamente in concentrazione nelcorso della maturazione (Caputi et al., 2011).

I processi di biosintesi e accumulo dei terpeni nel-l’acino sono fortemente influenzati dalle condizioniclimatiche, ambientali e colturali. Tra i diversi para-metri che caratterizzano il clima, la temperatura rico-pre sicuramente un ruolo determinante. Temperaturetroppo elevate durante la maturazione dell’uva riduco-no la sintesi dei composti aromatici e accelerano ladegradazione di quelli maggiormente termolabili:nelle annate e nelle zone più fresche la quantità totaledi terpeni aumenta più lentamente nel corso dellamaturazione rispetto alle zone calde, ma raggiunge amaturità un valore più elevato. Per il vitignoTraminette, però, è stato evidenziato che i siti piùcaldi favoriscono l’accumulo dei terpeni (Ji e Dami,2008), inoltre, la defogliazione precoce, che quindidovrebbe comportare una maggiore temperatura del-l’acino nel corso del giorno, ha indotto un maggioreaccumulo di monoterpeni rispetto al controllo (fig.13) (D’Onofrio et al., 2010b).

Caratterizzazione funzionale delle vie biosinteticheI terpeni sono sintetizzati attraverso due distinte

vie biosintetiche (fig. 7): la via dell’acido mevalonico(MVA), attiva nel citosol, e la via del 2-C-metil-D-eritritolo-4-fosfato (MEP), attiva nei plastidi (Aharoni

et al., 2005). Entrambe le vie biosintetiche conduconoalla formazione dell’isopentenil-pirofosfato (IPP) edel suo isomero, il dimetilallil-pirofosfato (DMAPP),che costituiscono le unità di base a 5 atomi di carbo-nio (C5), dette anche unità isoprene, dalla cui conden-sazione sequenziale si ottengono gli scheletri di basedei vari terpeni. Monoterpeni e carotenoidi vengonosintetizzati soprattutto nei plastidi attraverso la via delMEP, mentre i sesquiterpeni sono sintetizzati princi-palmente nel citosol attraverso la via dell’MVA(Tholl, 2006). Tuttavia, non esiste un’assoluta separa-zione compartimentale in quanto tra i due percorsibiosintetici avviene uno scambio di intermediari dalcitosol al plastidio (figg. 7 e 8) confermato dall’evi-denza che mentre la via biosintetica dell’MVA noncontribuisce alla formazione dei monoterpeni, la viadel MEP contribuisce alla formazione di sesquiterpeni(Dudareva et al., 2006).

Il processo biosintetico dei terpeni può essere sud-diviso in tre fasi: nella prima fase vengono prodotte leunità di base a 5 atomi di carbonio (IPP e DMAPP),nella seconda queste vengono condensate per formarei prenil-pirofosfati che nella terza fase sono convertitinei prodotti finali. Nella via biosintetica del MEP (fig.8), il primo enzima è la 1-deossi-D-xilulosio-5-fosfatosintasi (DXS) che condensa il piruvato con la gliceral-deide-3-fosfato producendo il deossi-D-xilulosio-5-fosfato (DXP), sul quale per azione della DXP-redut-toisomerasi (DXR) viene sintetizzato il 2-C-metil-D-eritritolo-4-fosfato (MEP). La CDP-ME sintetasi(CMS) catalizza la trasformazione del MEP in 2-C-metil-eritritolo (CDP-ME), dal quale per azione dellaCDP-ME chinasi (CMK) si orina il 2-C-metil-eritrito-lo-2-fosfato (CDPME-2P). Il CDPME-2P, per catalisi

Fig. 6 - Curva di crescita dell’acino e concentrazione deisesquiterpeni in fiori e acini di “Moscato bianco” espressa in μgper grammo di tessuto. (D’Onofrio et al., dati non pubblicati).Fig. 6 - Trend of berry development and total sesquiterpenes

aroma in flowers (bud flowers and open flowers) and during berrydevelopment of Moscato bianco. Concentration expressed as μg

per g of tissue. (D’Onofrio et al., unpublished data).

Fig. 7 - Via biosintetiche dei terpenoidi. MVA: via biosinteticacitosolica dell’acido mevalonico; MEP: via biosintetica plastidiale

del 2-metil-D-eritritol-4-fosfato. (modificata daAharoni et al., 2005).

Fig. 7 - Terpenoids biosynthetic pathways. MVA: cytosolmevalonic acid pathway; MEP: plastidial 2-methyl-D-erythritol-4-

phosphate pathway. (modified from Aharoni et al., 2005).


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della ME-2,4-cPP sintasi (MCS) si trasforma in 2,4-ciclodifosfato (ME-2,4-cPP) che è convertito in 1-idrossi-2-metil-2-butenil-difosfato (HMBPP oHMBDP) dall’enzima HMBPP sintasi (HDS). IlHMBPP da origine a isopentenil-pirofosfato (IPP) edimetilallil-pirofosfato (DMAPP) per azione dell’en-zima HMBPP reduttasi (HDR). L’isomerizzazione traIPP e DMAPP avviene ad opera dell’enzima IPP iso-merasi (IDI). L’IPP e DAMPP sono quindi condensatiin prenil-pirofosfati per azione delle isoprenil-trasfe-rasi. Al momento attuale di questa prima parte dellesuddetta via biosintetica plastidiale l’unico gene che èstato individuato e funzionalmente caratterizzato nellavite è il DXS, che ha permesso di sviluppare un meto-do per stabilire se una vite produce uve aromaticheoppure neutre (Emanuelli et al., 2010). In riferimentoalla via biosintetica dell’MVA (fig. 8), il primo enzi-ma è la aceto-acetil tiolasi (AACT) che catalizza lacondensazione di due molecole di acetil-CoA per laformazione dell’acetoacetil-CoA che è poi convertito

in 3-idrossi-3-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) dallaHMG-CoA sintasi (HMGS), il quale è ridotto a acidomevalonico (MVA) per catalisi della HMG-CoAriduttasi (HMGR). Il MVA è convertito in mevalona-to-5-fosfato (MVP o MVA-5-P) dalla mevalonato chi-nasi (MVK o MK) e questo a mevalonato-5-disfosfato(MVPP o MVA-5-PP) per azione della fosfo-mevalo-nato-chinasi (PMK). Per catalisi della fosfo-mevalo-nato-carbossilasi (PMD o DPMDC) l’MVPP è tra-sformato in isopentenil-pirofosfato (IPP) e dimetilal-lil-pirofosfato (DMAPP), tra loro isomerizzati dallaIPP isomerasi (IDI), che sono poi condensati per azio-ne delle prenil-transferasi formando tutta una serie dimolecole precursori di alcune classi di composti, tracui anche il farnesil-pirofosfato (FPP) che è il precur-sore dei sesquiterpeni. Nella vite i geni di questaprima parte della via biosintetica dell’MVA sono statitutti individuati attraverso l’analisi dell’omologia disequenza ed esperimenti di espressione genica con-dotti su sospensioni cellulari di acino di vite indotte a

Fig. 8 - Enzimi coinvolti nelle vie biosintetiche dell’acido mevalonico (MVA) e del 2-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP).(Rodríguez-Concepción 2006, modificata)

Fig. 8 - Enzymes involved in the mevalonic acid pathway (MVA) and 2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway (MEP)(Rodríguez-Concepción 2006, modified)

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produrre aromi per mezzo di elicitazione con jasmo-nati (D’Onofrio et al., 2006; 2009a). Questi esperi-menti hanno dimostrato che trattando le sospensionicellulari di acini di Cabernet Sauvignon con metil-jasmonato (MeJA) e acido jasmonico (JA) si ottienela produzione di oltre 25 sesquiterpeni, dei quali il piùabbondante è il β-cariofillene. Attraverso l’analisi del-l’espressione genica per mezzo dell’analisi deimicroarrays e la RT-PCR real-time è stato possibileevidenziare un’ampia serie di geni differenzialmenteespressi e che i geni HMGS, HMGR e DPMDC dellavia biosintetica del’MVA che conduce alla produzio-ne dei sesquiterpeni sono indotti dal trattamento conjasmonati e soppressi dall’acido salicilico (fig. 9).Inoltre, un altro aspetto molto importante per le possi-bili implicazioni pratiche che questa ricerca ha messoin risalto è che i jasmonati oltre ad attivare la via bio-sintetica dei terpenoidi attivano anche quella dei feno-li, compreso antociani, tannini e stilbeni (D’Onofrioet al., 2009a).

La condensazione dell’IPP e DMAPP, di tipotesta-coda, avviene per azione di enzimi detti isopre-nil-trasferasi, formando i prenil-pirofosfati tra cui il

Fig. 9 - Espressione dei geni della via biosintetica del mevalonatoin sospensioni cellulari indotte con metil-jasmonato (MeJA) o

acido jasmonico (JA). SA: acido salicilico. Gli istogrammiindicano l’espressione, determinata attraverso la PCR real-time,dei relativi geni rispetto alle sospensioni cellulari non trattate. I

valori rappresentano le medie e le barre l’errore standard delle trerepliche. (modificata da D’Onofrio et al., 2009a).

Fig. 9 - Expression of genes of the mevalonate pathway in berrycell suspension induced by methyl jasmonate (MeJA) and

jasmonic acid (JA) treatments. Graphs show the expression ofeach gene relative to the control cell culture as determined by

real-time PCR. Values represent means + s.e. of three replicates.(modified from D’Onofrio et al., 2009a).

Fig. 10 - Distribuzione delle terpene sintasi individuate conl’analisi dell’omologia di sequenze delle sequenze genomiche edelle EST. Tra parentesi, il primo numero indica i geni candidati

individuati e il secondo quelli selezionati sulla base dellecorrelazioni tra espressione genica e accumulo dei singoli aromi

nei fiori e nel corso dello sviluppo dell’acino di “Aleatico”,“Moscato bianco”, “Sangiovese” e “Vermentino”, e in sospensioni

cellulari di “Cabernet Sauvignon” indotte con elicitori(D’Onofrio et al., dati non pubblicati).

Fig. 10 - Distribution of terpene synthases identified by analysis ofVitis genomic and ESTs homology of sequence. In bracket the first

number indicates the number of identified genes and the secondindicate the number of genes selected by analysis of the

correlations among gene expressions and aroma trends in flowersand during berry development in ‘Aleatico, ‘Moscato bianco’,

‘Sangiovese’ and ‘Vermentino’ and cell suspension of CabernetSauvignon grapevine varieties (D’Onofrio et al., unpublished).


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geranil-pirofosfato (GPP), precursore dei monoterpe-ni, farnesil-pirofosfato (FPP), precursore dei sesqui-terpeni, e geranilgeranil-pirofosfato (GGPP) dalla cuiulteriore condensazione si forma il tetraterpene lico-pene, precursore dei carotenoidi da cui poi derivano iC13-norisoprenoidi. Al momento nessuna isoprenil-trasferasi è stata individuata e caratterizzata nella vite.

La conversione dei prenil-pirofosfati nei prodottifinali avviene per azione di una grande famiglia dienzimi conosciuti come terpene sintasi, e successivereazioni di ossidazione, deidrogenazione, metilazione,acilazione e glicosilazione (Duradeva et al., 2004).Grazie all’ampio sequenziamento delle sequenzeespresse e al sequenziamento completo del genoma,nella vite sono state individuate 71 terpene sintasi, ilpiù ampio gruppo di terpene sintasi fin ora individua-to in una singola specie (D’Onofrio et al., 2010a;Martin et al., 2010), distribuite nelle sottofamiglie a,b, c, e, f, g di terpene sintasi delle piante (fig. 10). Traqueste, il gruppo di ricerca in biologia molecolare delLaboratorio di Ricerche Viticole ed Enologico delDipartimento di Coltivazione e Difesa delle SpecieLegnose dell’Università di Pisa, analizzando le corre-lazioni tra l’accumulo degli aromi e l’analisi dell’e-spressione genica nei fiori e nel corso dello sviluppodell’acino di Aleatico e Moscato bianco (vitigni aduve aromatiche), Sangiovese e Vermentino (vitigni aduve neutre) (D’Onofrio et al., 2008; 2010a) e insospensioni cellulari di Cabernet Sauvignon indottecon elicitori (D’Onofrio et al., 2006; 2009a), ne sonostate selezionate 26 su cui è stata concentrata la suc-cessiva fase di caratterizzazione funzionale. Tra leputative sesquiterpene sintasi individuate la maggiorparte ha presentato un picco di espressione nei boc-cioli fiorali mentre una sola ha mostrato un picco d’e-spressione nei fiori aperti con un pattern d’espressioneche ben correla con la produzione di α-farnesene (fig.11A). La regione codificante è stata clonata in celluledi E. coli BL21 ed il saggio enzimatico della proteinaricombinante utilizzando come substrato il farnesil-pirofosfato, precursore generale dei sesquiterpeni,confermando che questo gene è effettivamente una α-farnesene sintasi di Vitis vinifera (D’Onofrio et al.,2010a; Martin et al., 2010). In riferimento alla biosin-tesi dei monoterpeni, l’attività è stata focalizzata sualcune putative linalolo e geraniolo sintasi. InAleatico e Moscato bianco è stato osservato un piccodi linalolo libero durante la maturazione dell’acino,oltre a quello presente nei fiori, e tra le putative lina-lolo sintasi analizzate la maggioranza hanno presenta-to un picco d’espressione solo nei boccioli fiorali,mentre solo una ha mostrato un pattern d’espressionecon un picco anche nel corso della maturazione che

Fig. 11 - Correlazioni tra espressione genica e accumulo deisingoli aromi nei fiori e nel corso dello sviluppo dell’acino. A)

Correlazione tra α-farnesene e la sesquiterpene sintasi VvTSseq_2in fiori (aperti e chiusi) e acini di “Moscato bianco”; B)

Correlazione tra linalolo libero e la linalolo sintasi VvTSm_2 inacini di “Aleatico”; C) Correlazione tra trans-piran-linalol-ossidolibero e espressione genica della putativa piran-linalol-epossidasi

VvCytP450_1 in acini di “Moscato bianco”. Lettere differentiindicano valori di espressione genica statisticamente differenti per

P ≤ 0,05 (da D’Onofrio et al., 2010a, modificato).Fig. 11 - Correlations among gene expressions and aroma trendsin flowers and during berry development. A) Correlation betweenα-farnesene levels and the expression of the putative Vitis viniferasesquiterpene synthase gene (VvTSseq_2) in flowers (bud flowers

and open flowers) and berries of ‘Moscato bianco’; B)Correlation between free linalool levels and the expression of theputative linalool synthase gene VvTSm_2 in berries of ‘Aleatico’;

B) Correlation between free trans-pyran-linalool oxideconcentration and the expression of a putative Vitis vinifera trans-

pyran-linalool-epoxidase gene (VvCytP450_1) in berries of‘Moscato bianco’. Different letters indicate statistically differentvalues (P ≤ 0.05) according to Tukey’s test for gene expression

level (from D’Onofrio et al., 2010a, modified).

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correla con l’accumulo di linalolo libero (fig. 11B).Nelle uve molto importanti sono anche gli ossidi fura-nici e piranici del linalolo (Di Stefano et al., 1996b)derivanti dal linalolo per azione di specifiche epossi-dasi che potrebbero essere dei citocromi P450.Attraverso l’analisi della correlazione tra l’accumulodegli aromi nei fiori e nel corso dello sviluppo dell’a-cino e l’espressione genica, sono state selezionate dueputative linalolo epossidasi di cui una presenta unpicco di espressione nei fiori chiusi e l’altra un piccodi espressione nel corso della maturazione in corri-spondenza con la massima concentrazione degli ossididel linalolo in Moscato bianco (fig. 11C), Aleatico eSangiovese (D’Onofrio et al., 2010a).

C13-norisoprenoidiI norisoprenoidi, conosciuti anche come apocaro-

tenoidi, derivano dalla degradazione ossidativa deicarotenoidi e nelle uve predominano quelli a 13atomi di carbonio (C13-norisoprenoidi) che conferi-scono note aromatiche floreali e fruttate ai vini siarossi che bianchi.

Chimicamente i C13-norisoprenoidi vengono suddi-visi in due gruppi principali: i megastigmani e i nonmegastigmani. I megastigmani sono C13-norisoprenoi-di ossigenati sul carbonio 7 (serie damascone) o sulcarbonio 9 (serie ionone). Questo gruppo è costituitoda un numero considerevole di composti volatili, tracui quelli più importanti per gli aromi dei vini sono ilβ-damascenone e il β-ionone. Il β-damascenone èdotato di soglia olfattiva particolarmente bassa (2ng/L) e possiede un complesso odore di fiori, frutti

esotici, composta di mele e miele; il β-ionone possie-de un odore caratteristico di violetta e al pari del β-damascenone ha una soglia olfattiva bassa (7 ng/L)(Loscos et al., 2007). Altri composti appartenenti aquesto gruppo sono: 3-idrossi-β-damascone (a notaaromatica di tè e tabacco), β-damascone (fruttato etabacco), 3-oxo-α-ionolo (tabacco). Tra i norisopre-noidi non megastigmani i più importanti sono il TDN(1,1,6-trimetil-1,2-diidronaftalene) che svolge unruolo essenziale nella formazione della nota aromaticadi cherosene dei vini riesling invecchiati, e gli acti-nidoli, che possiedono un odore di canfora. I C13-norisoprenoidi si trovano nelle uve essenzialmentecome arabinosilglucosidi e ramnosilglucosidi(Cabrita et al., 2006).

Nell’acino i carotenoidi, precursori dei norisopre-noidi, sono presenti principalmente nella buccia aconcentrazioni 2-3 volte superiori a quelle dellapolpa, e generalmente sono assenti nel mosto e neivini anche se sono stati ritrovati in alcuni passiti Porto(Guedes de Pinho et al., 2004). I carotenoidi sono sin-tetizzati a partire dall’allegagione, aumentando diconcentrazione fino alla fine della fase erbacea perpoi essere degradati a C13-norisoprenoidi glicosilatinel corso della maturazione (fig. 12) (Baumes et al.,2002; D’Onofrio et al., 2010b), ed è stato dimostratoche vi è una correlazione diretta tra la differenza inconcentrazione dei carotenoidi nelle uve all’invaiaturae alla maturazione e il contenuto in C13-norisoprenoididei vini (Crupi et al., 2010). La possibilità di incre-mentare la presenza di C13-norisoprenoidi nell’acinod’uva è dunque legata, almeno in via teorica, da unaparte all’incremento del substrato nei tessuti dellabacca, ovvero dei carotenoidi, e dall’altra all’aumentodella specifica attività di trasformazione dei carote-noidi in norisoprenoidi.

La biosintesi dei carotenoidi e dei rispettivi C13-norisoprenoidi dipende molto dai fattori climatici ecolturali (Bureau et al., 1998). L’illuminazione favo-risce la biosintesi dei carotenoidi dall’allegagione allafine della fase erbacea (Bureau et al., 1998) e poi,dalla scomparsa della clorofilla, ne favorisce la lorodegradazione e trasformazione in C13-norisoprenoidinel corso della maturazione (Hardie et al., 1996;D’Onofrio et al., 2010b). Nello specifico, una serie diprove effettuate su Sangiovese coltivato in diversi siti,Ciliegiolo e Moscato bianco, hanno evidenziato chel’asportazione precoce delle foglie dalla zona deigrappoli effettuata in pre-fioritura o all’allegagionestimola la biosintesi dei carotenoidi nel corso dellafase erbacea dell’acino e ne favorisce poi la successi-va degradazione (fig. 13) (D’Onofrio et al., 2010b)

Fig. 12 - Cambiamento delle concentrazioni di carotenoidi e C13-norisoprenoidi nel corso dello sviluppo dell’acino di Moscato

(modificata da Baumes et al., 2002).Fig. 12 - Change in the levels of carotenoids and C13-

norisoprenoid glycoconjugates during the maturation of Muscatberries (from Baumes et al., 2002, modified).


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traducendosi in una maggiore produzione di C13-nori-soprenoidi fino a farla più che raddoppiare (fig. 14)(D’Onofrio et al., 2010b). Anche la defogliazioneeffettuata in Riesling nel corso della fase erbacea hastimolato la biosintesi dei carotenoidi nell’acino e ilconseguente accumulo di C13-norisoprenoidi(Kwasniewski et al., 2010).

Caratterizzazione funzionale delle vie biosinteticheI carotenoidi precursori dei norisoprenoidi sono: β-

carotene e luteina, presenti nelle uve a concentrazionidi mg/kg (rappresentando l’85% dei carotenoidi totali),e le xantofille neoxantina, violaxantina, luteo-xantina,flavoxantina, zeaxantina, lutein-5,6-epossido presentinelle uve in concentrazioni di μg/kg (Bureau et al.,1998; Mendes-Pinto, 2009). I carotenoidi sono sintetiz-zati nel plastidio a partire dal licopene, un tretraterpeneprodotto nella via biosintetica del MEP (fig. 8), perazione di ciclasi che formano l’α-carotene e il β-carote-ne, dai quali per successive reazioni di idrossilazione edi epossidazione si formano le xantofille.

La biosintesi dei C13-norisoprenoidi per degrada-zione ossidativa dei carotenoidi avviene attraverso trefasi consecutive: nella prima i carotenoidi vengonotrasformati dalle ossidasi in carbonili di C13-noriso-prenoidi, che hanno lo scheletro ossidato dei corri-spettivi carotenoidi; nella seconda fase il grado diossidazione dei composti ottenuti in quella precedenteviene modificato dall’intervento di ossidasi e ridutta-si; nella terza fase avviene la glicosilazione, tramiteglicosiltransferasi, di quei composti norisoprenoidiaventi un gruppo ossidrilico (fig. 15) (Baumes et al.,2002). Sebbene la formazione dei norisoprenoidi puòavvenire per via chimica e fotochimica (Mendes-Pinto, 2009), la prevalenza dei C13-norisoprenoidinelle uve suggerisce soprattutto una degradazione di

Fig. 14 - Contenuto in monoterpeni, C13-norisoprenoidi e totale(monoterpeni+C13-norisoprenoidi) delle 6 prove di defogliazione

precoce (pre e post-fioritura) delle uve di Sangiovese, Ciliegiolo eMoscato bianco. CTRL: controllo non defogliato; DEF.Pre or

PostBL.: defogliato in pre o post-fioritura; DEF.INV.: defogliatoall’invaiatura. In A i valori sopra gli istogrammi indicano le

variazioni percentuali medie dei monoterpeni e C13-norisoprenoidirispetto al CTRL, mentre in B indicano le variazioni percentuali

del peso dell’acino rispetto al controllo.(da D’Onofrio et al., 2010b, modificata).

Fig. 14 - Monoterpenes, C13-norisoprenoids and total(monoterpenes+C13-norisoprenoids) of grapes of early defoliation(pre and post-bloom) treatments. CTRL: non-defoliated; DEF.Preor PostBL.: defoliated at pre or post-bloom; DEF.INV: defoliatedat veraison. In A the values on bars indicate the mean variation in

percentage of aroma compared to CTRL while in B indicate thevariation in percentage of berry weight compared to CTRL

(from D’Onofrio et al., 2010b, modified).

Fig. 15 - Origine dei norisoprenoidi per degradazione deicarotenoidi.

Fig. 15 - C13-norisopernoids origin from cleavage of carotenoids.

Fig. 13 - Contenuto in xantofille, luteina e β-carotene, delle uve diMoscato bianco nel vigneto di Benazzo Casa nel 2008.

CTRL_PreINV: acini del controllo non defogliato prelevati inpre-invaiatura; CTRL_VEN: acini del controllo non defogliato

prelevati alla vendemmia; DEF.PostBL._PreINV: acini deldefogliato in post-fioritura prelevati in pre-invaiatura;

DEF.PostBL._VEN: acini del defogliato in post-fioritura prelevatialla vendemmia. I valori sopra gli istogrammi indicano le

variazioni percentuali rispetto al CTRL_PreINV per CTRL_VENe DEF.PostBL._PreINV e rispetto al DEF.PostBL._PreINV per

DEF.PostBL._VEN (da D’Onofrio et al., 2010b).Fig. 13 - Xanthophylles, lutein and β-carotene in Moscato bianco

2008 berries of Benazzo Casa vineyard. CTRL_PreINV: pre-verason berries of non defoliated vines; CTRL_PreINV: vintageberries of non defoliated vines; CTRL_VEN: pre-verason berries

of non defoliated vines; DEF.PostBL._PreINV: pre-verasonberries of vines defoliated at post-bloom; DEF.PostBL._VEN:

vintage berries of vines defoliated at post-bloom. The values onbars indicate the variation in percentage compared to

CTRL_PreINV for CTRL_VEN and DEF.PostBL._PreINV andcompared to DEF.PostBL._PreINV for DEF.PostBL._VEN

(from D’Onofrio et al., 2010b).

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tipo enzimatico. A tale proposito, nella bacca di vite èstato individuato un enzima specifico, detto carotenoi-de diossigenasi 1 (VvCCD1: Vitis vinifera carotenoidcleavage dioxygenase 1), responsabile della degrada-zione ossidativa dei carotenoidi e quindi della forma-zione dei C13-norisoprenoidi (Mathieu et al., 2005).D’altra parte, mentre lo β-ionone deriva direttamentedalla degradazione del β-carotene e α-carotene, la for-mazione di β-damascenone, TDN, TPB e vitispiranicomprende successive reazioni chimiche spontaneecon intermediari chetonici.

Derivati della via biosintetica dello scichimatoI derivati della via biosintetica dello scichimato

che concorrono a definire l’aroma varietale sonoanche detti derivati del benzene o benzenoidi. Alcunidi essi conferiscono gradevoli note speziate, agrumatee floreali, mentre altri se presenti in concentrazionielevate apportano sgradevoli odori di farmaceutico,fenolico e sintetico (Tomasi et al., 2007). Su questaclasse di composti aromatici sono stati effettuati pochistudi e di conseguenza non si hanno molte informa-zioni a disposizione.

Nell’uva i benzenoidi più frequenti e in quantitàmaggiori sono: alcol benzilico, 2-fenil etanolo, alcolomovanillico, diidroconiferil alcol e 4-vinil guaiacolo(Di Stefano et al., 1998; Lanati et al., 2000; Cabrita etal., 2006; Pinna et al., 2009), mentre quelli più impor-tanti per il loro impatto aromatico sono alcol benzili-co, vanillina, metil-vanillato, acetovanillone, alcolomovanillico, diidroconiferil alcol e zingerone.Alcuni benzenoidi, quali alcol benzilico, vanillina e 4-vinil guaiacolo, esistono nell’uva sia in forma liberache legata, solitamente con prevalenza di quest’ulti-ma, altri, quali metil-benzoato, zingerone e alcol dii-droconiferilico, esistono solo in forma legata (DiStefano et al., 1998; Cabrita et al., 2006; Pinna et al.,2009). Il profilo di questa classe di molecole aromati-che varia molto in funzione del vitigno.

In riferimento all’evoluzione dei benzenoididurante le fasi di sviluppo dell’acino sono ancorapochissime le informazioni disponibili in letteratura.Da un recente studio condotto sul Cabernet Sauvignonè emerso che i benzenoidi compaiono solo dopo l’in-vaiatura e subiscono un significativo incremento nel-l’ultima fase della maturazione (Kaula e Boss, 2009).Al contrario, in un altro studio, condotto sullaMalvasia di Cagliari, considerando solo la fase dimaturazione dell’uva è stato osservato che questicomposti sono presenti quasi esclusivamente comeglicosidi e tendono a diminuire (Pinna et al., 2009).Negli acini di Moscato bianco, Sangiovese,Ciliegiolo, Vermentino e Aleatico tali composti

aumentano nel corso della maturazione (D’Onofrio etal., 2010a, b, c).

Caratterizzazione funzionale delle vie biosinteticheLa fenilalanina è l’intermediario comune per la

biosintesi dei benzenoidi (Dudareva et al., 2006) ederiva dal corismato proveniente dallo scichimato for-matosi dall’eritroso-4-fosfato e fosfoenolpiruvato (dalcorismato si formano direttamente anche l’acido p-idrossibenzoico, l’acido p-aminobenzoico, metil-sali-cilato). La fenilalanina è convertita in acido cinnami-co da cui derivano l’acido p-cumarico, l’acido caffei-co, ferulico e sinapico, che possono poi essere trasfor-mati in esteri metilici. È stato dimostrato che l’euge-nolo e l’isoeugenolo derivano dal coniferil-acetatoproveniente dall’acido ferulico (Koeduka et al.,2006). Gli altri benzenoidi derivano dagli esteri deisuddetti acidi attivati con il CoA, che vengono ridottiper formare le aldeidi e gli alcoli. I benzenoidi si pos-sono anche generare per degradazione dall’acido cin-namico attraverso la perdita di 2 atomi di carboniodalla catena laterale. Sebbene le vie biosintetiche deibenzenoidi sopra menzionate non sono state diretta-mente studiate nella vite, si può presupporre che sianoattive come nelle altre piante.

TioliI composti solforati di tipo tiolico (mercapatani)

contribuiscono alla definizione degli aromi di variprodotti alimentari, tra cui il vino, nel quale sonoresponsabili di una grande varietà di note e sfumaturearomatiche (es. gemma di cassis, bosso, pompelmo,frutto della passione) ma, in funzione della concentra-zione che può variare dall’ordine di ng/L a mg/L,anche di alcuni odori indesiderati.

I tioli che si ritrovano nel vino derivano principal-mente dalle uve, anche se alcuni sono prodotti dalmetabolismo dei lieviti. I principali tioli volatili sono:• 4-sulfanil-4-metilpentan-2-one o 4-mercapto-4-

metil-pentan-2-one (4-MMP); è la prima molecolascoperta come composto caratteristico dell’aromadi Sauvignon blanc e possiede uno spiccato odoredi bosso e di ginestra ed è estremamente odoroso,la sua soglia di percezione nei vini è di 3 ng/L e,poiché il suo tenore va da diverse decine ad uncentinaio di ng/L, il suo impatto sensoriale nei viniSauvignon è rilevante;

• 3-sulfanilesan-1-ol o 3-mercaptoesan-1-olo (3-MH); il cui aroma ricorda quello del pompelmo edel frutto della passione, ha una soglia olfattiva di60 ng/L e nel Sauvignon risulta essere molto odo-roso dato che è presente a concentrazioni di diver-se centinaia di ng/L;


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• 4-sulfanil-4-metilpentan-2-ol o 4-mercapto-4-metilpentan-2-olo (4-MMPOH); ha un odore dibuccia di agrumi e il suo ruolo sensoriale è piùlimitato poiché il tenore nei vini raramente superala sua soglia di percezione (55 ng/L);

• 3-sulfanilesil-O-acetato o 3-mercaptoesan-1-oloacetato (3-MHA); ha un aroma complesso cheevoca il bosso, la scorza di pompelmo e il fruttodella passione, la sua soglia di percezione è di 4ng/L e in certi vini di Sauvignon se ne trovanoanche alcune centinaia di ng/L, questo compostoviene sintetizzato soprattutto per azione di un’este-rasi dei lieviti attraverso l’acetilazione del 3-MH.Altri tioli sono: 3-sulfanil-3-metilbutan-1-ol

(3MMB; porro cotto), 3-metilltiopropan-1-ol (3MMP;patate, cavolfiore), dimetilsolfuro (ribes nero, cavolo,zolfo, benzina, asparago cotto, mais, pomodoro), 2-furan-metanotiolo (caffè tostato, carne, pane, pop-corn), 2-metil-3-furantiolo (carne), benziltiolo(gomma). È stato evidenziato che spesso gli enantio-meri di questi composti possono presentare differentisoglie olfattive e possono essere differentemente pre-senti nei vari vitigni (Tominaga e Dubordieu, 2006)

I tioli non sono presenti nell’uva esclusivamentecome precursori inodori S-coniugati della cisteina odel glutatione (Tomiaga et al, 1998; Fedrizzi et al.,

2009) e sono distribuiti in maniera non uniforme nel-l’acino: nel Sauvignon i precursori cisteinil del 4-MMP e del suo alcol 4-MMPOH sono presenti per il20% nella buccia e per l’80% nella polpa, mentrequello del 3-MH è equamente distribuito tra buccia epolpa (Peyrot de Gachons et al., 2000).

Nel corso della maturazione dell’uva, la comparsadel precursore del 4-MMP precede quella del 3-MH,dinamica dalla quale dipendono le sfumature di bossopiù marcate del Sauvignon se la vendemmia è effettua-ta precocemente, e sentori più fruttati se la vendemmiaè tardiva. Recentemente è stato evidenziato che alcunitioli coniugati alla cisteina e al glutatione aumentanodi concentrazione soprattutto nel corso dell’ultima fasedella maturazione (fig. 16) (Capone et al., 2011).Analizzando l’accumulo dei tioli coniugati in diversitessuti della varietà aromatica Koshu è stato rilevatoche questi composti sono scarsamente presenti neivinaccioli e nel fusto, mentre nelle foglie sono piùabbondanti che nell’acino; in questi ultimi comincianoad accumularsi a partire da 11 settimane dalla fiorituraraggiungendo un picco a 16-18 settimane per poi dimi-nuire di concentrazione (Kobayashi et al., 2010). Nellavarietà aromatica Koshu, l’accumulo dei tioli coniugatinel corso dello sviluppo dell’acino è risultato esserepiù rapido in vigneti di bassa altitudine rispetto a quelli

Fig. 16 - Concentrazione del precursore del 3-MH (μg/kg) nel corso della maturazione di cloni di Sauvignon blanc coltivati nell’AdelaideHills. Le barre impilate rappresentano la media di tre repliche. La deviazione standard delle tre repliche era minore del 15%. Inserto:

espansione delle prime tre fasi fenologiche di campionamento (modificata da Capone et al., 2011).Fig. 16 - Concentrations of 3-MH precursor diastereomers (μg/kg) during ripening for five Sauvignon blanc clones colocated in an

Adelaide Hills vineyard. The stacked bars represent the mean of each precursor diastereomer derived from three replicates. The relativestandard deviations for the averages were < 15% (Inset) Expansion of the first three time points.(from Capone et al., 2011, modified).

D’Onofrio

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collocati ad altitudini maggiori (Kobayashi et al.,2010), inoltre nelle varietà Koshu, Chardonnay eMerlot, le infezioni di botrite, gli stress idrici e in par-ticolare le radiazioni ultraviolette hanno stimolano labiosintesi del glutatione e di 3-MH coniugato al gluta-tione o alla cisteina (Kobayashi et al., 2011). È anchestato riportato che le infezioni di botrite stimolato labiosintesi dei tioli in sospensioni cellulari trattate ino-culate con botrite (Thibon et al., 2011).

Inoltre, alcune indagini hanno evidenziato che ildeficit idrico moderato, soprattutto se si verifica appenadopo l’invaiatura, induce un aumento della concentra-zione dei tioli, particolarmente marcato se accompa-gnati da temperature non troppo elevate (Choné, 2001).Una adeguata concimazione azotata del vigneto favori-sce la biosintesi dei tioli e quindi l’espressione aromati-ca delle uve Sauvignon (Choné, 2001). L’applicazionedi formulati a base di rame sulle viti di Sauvignon e diCabernet Sauvignon induce una netta diminuzione del-l’aroma dei vini a causa della reattività di questo ele-mento con i tioli (Darriet et al., 2001).

Caratterizzazione funzionale delle vie biosinteticheLa produzione dei tioli che si ritrovano nel vino

può avvenire attraverso diversi meccanismi, alcuni deiquali dipendono dal metabolismo dei lieviti nel corsodella fermentazione. I tioli coniugati alla L-cisteina oal glutatione (un tripeptide formato da acido glutam-mico cisteina e glicina) si formano nell’uva per via

enzimatica e vengono poi degradati, liberando l’agli-cone odoroso, nel corso della fermentazione graziealla β-liasi dei lieviti. Nelle uve la via biosintetica checonduce alla formazione dei tioli coniugati non èancora nota. Vi sono alcune evidenze che indichereb-bero una probabile origine di alcuni precursori di tiolida aldeidi insaturi a 6 atomi di carbonio o da alcoliprodotti per azione di lipossigenasi da acidi grassi, aiquali l’addizione del glutatione avverrebbe per azionedi glutatione trasferasi. Questi composti coniugativerrebbero poi trasportati nel vacuolo dove avverreb-be la rimozione dei gruppi glutammici e di glicina,rispettivamente per azione di γ-glutamil-transpeptida-si e di peptidasi, per formare i composti coniugati allacisteina (Ohkama-Ohtsu et al., 2007). Recentemente,analizzando la correlazione tra accumulo dei tioliconiugati e l’espressione genica in differenti vitigni(Chardonnay, Koshu e Merlot) sottoposti a vari tipi distress (raggi ultravioletti, stress idrico, shock ad alte ebasse temperature, inoculo con botrite) è stata propo-sta una specifica via biosintetica e di questa sono stateindividuate e funzionalmente caratterizzate 2 glutatio-ne-S-transferasi (VvGST3 e VvGST4) (fig. 17), ipo-tizzando, inoltre, che la produzione enzimatica degliaromi tiolici possa essere il risultato dell’azione didetossificazione delle cellule danneggiate da condi-zioni di stress (Kobayashi et al., 2011).

MetossipirazineLe metossipirazine sono composti eterociclici azo-

tati, provenienti dal metabolismo degli amminoacidi.Esse sono state identificate in vari vegetali, tra cuipeperone, asparago e pisello, e nelle uve sono soprat-tutto tipiche dei vitigni bordolesi, tra cui in particolar-mente Semillon, Sauvignon blanc, Merlot, CabernetSauvignon e Cabernet Franc. L’aroma delle metossi-pirazine richiama note vegetali o verdi (peperoneverde, pisello, asparago) associate al frutto immaturoe spesso poco gradite dal consumatore. In alcuneregioni viticole la nota di peperone verde, associataalla presenza di metossipirazine, è considerata un fat-tore di tipicità dei vini di Cabernet Sauvignon, mentrein altre denota una mancanza di maturità quandoeccessiva.

Le principali metossipirazine identificate nelle uvesono:• 2-metossi-3-isobutilpirazina (IBMP), con tipiche

note di peperone verde;• 2-metossi-3-isopropilpirazina (IPMP), che conferi-

sce note di asparago e pisello dolce;• 2-metossi-3-sec-butilpirazine (SBMP), responsabi-

le della nota di olio di galbano.La soglia olfattiva di questi composti è di pochi

Fig. 17 - Ipotetica via biosintetica di 3-MH-S-glut e 3-MH-S-cytin viti esposte a condizioni di stress (da Kobayashi et al., 2011).

Fig. 17 - Hypothetical pathway for the biosynthesis of 3MH-S-glutand 3MH-S-cys in grapevine exposed to environmental stress

conditions (from Kobayashi et al., 2011).


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ng/L, per cui sono sufficienti minime quantità a ren-derle percettibili. L’IBMP è generalmente la piùabbondante nelle uve e nei vini, dove ha una soglia dipercezione di 10-15 ng/L e spesso raggiunge concen-trazioni di circa 50 ng/L che la rendono sgradevole(Belancic e Agosin, 2007). L’IBMP ha una soglia dipercezione di circa 2 ng/L, ma spesso nei vini nonraggiunge questi livelli di concentrazione, e lo stessovale per SBMP. Altre pirazine sono state identificatenelle uve e nei vini, quali la 2-metossi-3-metilpirazinae 2-metossi-3-etilpirazina, ma sono entrambe pocoodorose.

Nell’acino le metossipirazine sono localizzateessenzialmente nella buccia (Roujou De Boubée etal., 2000) e la concentrazione aumenta progressiva-mente nel corso della fase erbacea fino a raggiungereil massimo intorno o poco prima dell’invaiatura perpoi decrescere progressivamente (Ryona et al., 2008;Kalua e Boss, 2008). In genere, la degradazionedelle metossipirazine nel corso della maturazionedell’uva è inizialmente rapida per poi rallentare inprossimità della raccolta, ed è fortemente influenzatadall’andamento climatico. Alcuni lavori hanno evi-denziato un forte effetto del terroir e dell’andamentoclimatico sia sulla degradazione delle pirazine, masoprattutto sulla loro sintesi nel corso della faseerbacea. Tra i fattori climatici che possono contri-buire all’accumulo e degradazione delle metossipira-zine, la radiazione luminosa è uno dei più importan-ti. Secondo alcuni autori, la radiazione solare stimo-lerebbe l’accumulo nel corso della fase erbacea(Hashizume e Samuta, 1999), mentre secondo altrine ridurrebbe la concentrazione (Ryona et al., 2008;Robinson et al., 2011). Altri autori sostengono chedurante la maturazione la radiazione solare favori-rebbe la degradazione delle metossipirazine (Kalua eBoss, 2008) e secondo altri invece la diminuzionedella loro concentrazione in maturazione è da impu-tare esclusivamente all’effetto diluizione (fig. 18)(Ryona et al., 2008). In Cabernet Sauvignon eMerlot è stato rilevato un decremento della concerta-zione di IBMP nelle uve conseguente alla rimozioneprecoce delle foglie nella zona dei grappoli(Scheiner et al., 2010) ed è stato ipotizzato che nelcorso della maturazione l’IBMP diminuisce perchéviene demetilata e ritrasformata nel suo immediatoprecursore, il 3-isobutil-2-idrossipirazina (Ryona etal., 2010). Le basse temperature favoriscono l’accu-mulo delle metossipirazine nelle uve (Belancic eAgosin, 2007) e la concentrazione di questi compostinelle uve è anche influenzata dal vigore, carico pro-duttivo e disponibilità idrica (Roujou de Boubee etal., 2000; Chapman et al., 2004).

Caratterizzazione funzionale delle vie biosintetichePer la biosintesi delle metossipirazine sono state

proposte diverse vie biosintetiche che coinvolgonoamminoacidi e gruppi 1,2-dicarbonilici. Gli amminoa-cidi valina, leucina e isoleucina sono rispettivamente iprecursori di IPMP, IBMP e SBMP. Questi amminoa-cidi, attraverso un meccanismo non ancora noto, ori-ginano gli intermediari 3-alchil-2-idrossipirazine (HP)che vengono poi metilati a metossipirazine attraversol’azione di metiltransferasi. Analizzando la correlazio-ne tra accumulo di metossipirazine ed espressionegenica nel corso dello sviluppo dell’acino di CabernetSauvignon sono stati proposti gli schemi per la biosin-tesi della IBMP e IPMP (fig. 19) e funzionalmentecaratterizzate le due O-metil-transferasi (rispettiva-

Fig. 19 - Ipotetico schema biosintetico dell’IPMP (2-metossi-3-isopropilpirazina) e IBMP (2-metossi-3-isobutilpirazina)

rispettivamente dagli amminoacidi valina e leucina. La reazionefinale di metilazione delle idrossipirazine in metossipirazine è

catalizzata da una OMT (O-metil-transferasi).(modificata da Dunlevy et al., 2010).

Fig. 19 - Proposed pathway for the biosynthesis of 3-isopropyl-2-methoxypyrazine (IPMP) and 3-isobutyl-2-methoxypyrazine

(IBMP) from the amino acids valine and leucine, respectively. Thefinal step involving methylation of hydroxypyrazine to

methoxypyrazine is catalysed by an OMT. (modified from Dunlevy et al., 2010).

Fig. 18 - Concentrazione dell’IBMP in uve in ombra (●) o espostealla luce (○) nel corso della stagione vegetativa. Le barre indicanol’errore standard delle tre repliche (tre piante per trattamento). Ledifferenze statistiche tra i trattamenti sono state valutate con il t

test (** p ≤ 0,05; * p ≤ 0,08; ns, non significativo). (modificata daRyona et al., 2008).

Fig. 18 - IBMP concentrations of shaded (●) and exposed berries(○) during the growing season. The error bars reflect standard

error for the three replicates (three vines per treatment).Significant differences between treatments were evaluated by a

paired t test (**, p ≤ 0.05; *, p ≤ 0.08; ns, not significant).(modified from Ryona et al., 2008).

D’Onofrio

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mente VvOMT1 e VvOMT2) che ne catalizzano lametilazione finale (fig. 20; Dunlevy et al., 2010).

Alcoli e aldeidi alifatici a 6 atomi di carbonio Le aldeidi e gli alcoli a sei atomi di carbonio (C6),

insieme alle metossipirazine, sono i composti respon-sabili dell’aroma erbaceo. A bassa concentrazione(indicativamente inferiore a 0,5 mg/L) queste moleco-le concorrono positivamente all’aroma complessivodel vino, ma a dosi più elevate forniscono note orga-nolettiche poco gradite di tipo erbaceo, di frutta acer-ba, di foglia stropicciata e talvolta di amaro.

Gli alcoli C6 più frequentemente trovati nell’uvasono l’esanolo ed alcuni suoi isomeri, quali il cis-3-esenolo ed il trans-2-esenolo. Essi possono essere pre-senti sia in forma libera che in forma legata glicosidi-ca (Cabrita et al., 2006; Di Stefano et al., 1998;Lanati et al., 2000; Pinna et al., 2009): nella Malvasiadi Casorzo e Malvasia di Schierano gli alcoli C6 sonostati identificati solo come aromi liberi, mentre nellaMalvasia aromatica di Candia sono presenti sia comearomi liberi che glicosilati, con prevalenza dei primi(Borsa et al., 2008). Per quanto riguarda le aldeidi C6,quelle individuate nell’uva sono esanale, trans-2-ese-nale, eptanale e trans-2-eptenale (Kalua e Boss,2009). Aldeidi e esteri rappresentano i maggiori com-ponenti volatili nelle uve mature di Riesling, mentrenel Cabernet Sauvignon prevalgono gli alcoli (Kalua eBoss, 2010). Analizzando l’evoluzione dei compostivolatili C6 durante lo sviluppo dell’acino in Cabernet

Sauvignon è emerso che gli esteri raggiungono laloro massima concentrazione nel corso della faseerbacea per poi diminuire nel corso della maturazio-ne fino a raggiungere quantità irrilevanti. Mentre, lealdeidi subiscono un significativo incremento durantela maturazione seguito da un decremento verso lafine di questa fase. Gli alcoli sono anch’essi semprepresenti per tutto l’accrescimento dell’acino, ma rag-giungono quantità significative solo verso la finedella maturazione (Kalua e Boss, 2009). Nel corsodella maturazione il maggiore aumento della concen-trazione degli alcoli a scapito di quella degli aldeidirappresenta un aspetto positivo poiché, avendo glialcoli una soglia di percezione molto maggiorerispetto a quella delle aldeidi, risulta meno evidentela nota erbacea. Inoltre, gli alcoli C6 durante la vini-ficazione, in presenza di acidi carbossilici, sono mag-giormente suscettibili di essere trasformati in esteri,che possiedono gradevoli note fruttate. Recentementeè stato evidenziato che nel vitigno Marechal Foch,coltivato in prossimità del lago di Seneca nel PennYan (NY), la vendemmia tardiva e la cimatura ridu-cono la concentrazione degli alcoli C6 dal 3% e 33%(Sun et al., 2011).

Caratterizzazione funzionale delle vie biosinteticheLe aldeidi e gli alcoli alifatici della vite derivano

dalla via biosintetica delle lipossigenasi, attraverso laquale gli acidi linoleico e linolenico sono trasformatiin aldeidi a 6 e 9 carboni e ossiacidi a 9 e 12 carboni

Fig. 20 - Concentrazione delle metossipirazine e livelli di espressione delle VvOMT nel corso dello sviluppo dell’acino. A) concentrazionedi IBMP e IPMP espresse in ng/kg di peso fresco degli acini, tr: presenza di tracce; nd: non rilevato. B) Espressione relativa di VvOMT1 e

VvOMT2 in acini determinata per mezzo di PCR real-time ed espressa come numero di copie (modificata da Dunlevy et al., 2010).Fig. 20 - MP levels and VvOMT gene expression in whole berries throughout development. A) IBMP and IPMP concentrations, expressed

as ng/kg of fresh weight, in developing grape berries, tr signifies that only trace levels were detected and nd signifies not detectable. B)Relative expression of VvOMT1 and VvOMT2, expressed as copy number, in the berry samples as quantified by Real-Time PCR

(modified from Dunlevy et al., 2010).


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(fig. 21) (Kalua e Boss, 2009). Gli acidi grassi liberatidalle acil-idrolasi (che includono lipasi, fosfolipasi egalactolipasi) sono ossidati per azione delle lipossige-nasi formando idroperossidi che sono poi trasformatiin aldeidi e ossiacidi per azione delle idroperossidiliasi. Infine le aldeidi sono isomerizzate dalle enol-isomerasi e ridotte ad alcoli dalle alcol deidrogenasi.Nella vite sono state individuate varie alcol deidroge-nasi (Torregrosa et al., 2008) la cui espressione ed atti-vità aumenta in condizioni di stress. Analizzando l’ac-cumulo di 2-esenal, 3-esenal e esanal, dei rispettivialcoli e esteri acetati nel corso dello sviluppo dell’aci-no di Cabernet Sauvignon e Riesling, è stato ipotizzatoche: l’attività della alcol-deidrogenasi dopo l’invaiatu-ra è maggiore nelle uve di Cabernet Sauvignon; l’atti-vità dell’idroperossi-liasi è maggiore nelle uve diRiesling; la enal-isomarasi, responsabile dell’isomeriz-zazione del Z-3-hesenal in E-2-esenal, sarebbe attivaprincipalmente nel corso della maturazione. L’attivitàdella alcol acil-transferasi è maggiore nelle uve diRiesling (per cui la maggiore presenza di esteri rende ivini di Riesling più fruttati rispetto a quelli di Cabernet

Sauvignon) e in entrambi i vitigni si riduce nel corsodella maturazione, e quindi i vini di entrambi questivitigni prodotti con uve vendemmiate precocementerisultano più fruttati (Kalua e Boss, 2010).

Aroma delle specie americane: aroma foxyI principali vitigni del nord dell’America, Vitis

lambrusca e Vitis rotundifolia e i loro ibridi, sonomolto conosciuti per il loro caratteristico aroma che èstato definito “volpino” (foxy). Questo termine deriva,probabilmente, dal tipico odore muschiato di questeuve, odore che ricorda quello di un animale (forse unavolpe). Il più noto composto responsabile dell’aromafoxy è l’antranilato di metile, che possiede una parti-colare fragranza di fruttato. Da studi condotti sullacultivar Washington Concord è emerso che la biosin-tesi dell’antranilato di metile coinvolge una alcol acil-trasferasi che catalizza la formazione di tale compostoda antraniloil-CoA e metanolo. Altri composti checoncorrono nel determinare il caratteristico aromafoxy sono: 2-ammino acetofenone e il 2 e 3-mercapto-propionato di etile che hanno odore solforato e di frut-

Fig. 21 - Via biosintetica delle lipossigenasi che evidenzia i percorsi comuni della biosintesi nelle uve dei composti volatili a 6 atomi dicarbono (da Kalua e Boss, 2009).

Fig. 21 - Lipoxygenase (LOX) pathway in grape showing the common routes of C6 compound biosynthesis (from Kalua and Boss, 2009).

D’Onofrio

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tato se presenti a basse concentrazioni; 4-idrossi-2,5-dimetil-3-furanone, comunemente denominato fura-neolo; 4-metossi-2,5-dimetil-3-furanone detto anchemetossifuraneolo, con caratteristico odore di fragolatipico della cultivar Isabella o Uva fragola. La mag-gior parte dei suddetti composti è stata identificata abasse concentrazioni in alcuni vini di Vitis vinifera(Moio e Etievant, 1994; Guedes De Pinho, 1994) ed èstato evidenziato che l’antranilato di metile e quello dietile sono coinvolti nel determinare il particolarearoma del Pinot noir della Borgogna. Questi compostivolatili si accumulano nell’acino principalmente nelcorso della fase di maturazione (Shure e Acree, 1994).

Conclusioni

Data l’importanza degli aromi varietali nel deter-minare le caratteristiche di qualità e tipicità dei vini, equindi il potenziale tecnologico dei vitigni, la ricercasulla caratterizzazione funzionale della biosintesidegli aromi nelle uve al fine di poter modulare ade-guatamente la qualità aromatica delle stesse sta atti-rando l’attenzione di molti ricercatori. I recenti pro-gressi nell’ambito della genomica funzionale, con-giuntamente al sequenziamento del genoma della vitee lo sviluppo di nuove tecnologie per l’analisi dell’e-norme quantità di composti che concorrono a determi-nare gli aromi delle uve e dei vini, hanno consentito diacquisire importanti conoscenze su: a) dinamiche diaccumulo degli aromi nel corso dello sviluppo dell’a-cino in diversi vitigni; b) dinamiche di espressione deigeni responsabili della biosintesi di questi composti eloro conseguente caratterizzazione funzionale; c)influenza che i vari fattori colturali hanno su questiimportanti processi biosintetici. Particolarmente utilesi è rilevata l’analisi delle correlazioni tra dinamichedi accumulo degli aromi ed espressione genica neifiori e nel corso dello sviluppo dell’acino di Aleatico,Cabernet Sauvignon, Chardonnay, Koshu, Moscatobianco, Merlot e Sangiovese, e in sospensioni cellularidi acino di Cabernet Sauvignon, che ha consentito diindividuare e caratterizzare vari geni coinvolti nellevie biosintetiche delle principali classi di aromi delleuve. Lo studio delle dinamiche biosintetiche degliaromi nel corso dello sviluppo dell’acino ha permes-so, inoltre, di meglio evidenziare gli effetti del sito dicoltivazione, della forma di allevamento, dell’illumi-nazione, delle temperature, della defogliazione e dialcuni stress abiotici e biotici, sulla qualità aromaticadelle uve. Tutte queste conoscenze, e quelle che certa-mente seguiranno nell’immediato futuro, sarannosicuramente di notevole supporto alla viticoltura peruna adeguata modulazione della qualità aromatica

delle uve al fine di poter esaltare ulteriormente e concostanza le caratteristiche di tipicità dei vini, che, con-giuntamente all’approfondita caratterizzazione genoti-pica dei vitigni, saranno utili per la valorizzazionedelle produzioni viti-vinicole, in generale, e di quelledi nicchia, in particolare.

Riassunto

Gli aromi delle uve svolgono un ruolo fondamen-tale nella definizione dei parametri qualitativi e ditipicità del vino, nel quale sono i composti che mag-giormente permettono il riconoscimento del vitigno,caratteristica molto apprezzata dal consumatore. Nelvigneto, il controllo della qualità aromatica delle uverichiede una approfondita conoscenza sulle dinamichebiosintetiche dei singoli composti che la caratterizza-no nonché sui fattori colturali che ne determinano l’e-spressione. Lo sviluppo delle tecnologie per l’analisidell’enorme quantità di composti che concorrono adeterminare gli aromi delle uve e dei vini e i recentiprogressi nell’ambito della genomica funzionale,hanno consentito di acquisire ampie conoscenze sulledinamiche di accumulo degli aromi nel corso dellosviluppo dell’acino e sulla caratterizzazione funzionaledei relativi geni, permettendo di individuare le specifi-che fasi fenologiche in cui questi composti sono mag-giormente sintetizzati. In particolare, l’analisi dellecorrelazioni tra dinamiche di accumulo degli aromi edespressione genica nel corso dello accrescimento del-l’acino ed in sospensioni cellulari trattate con elicitoriha reso possibile la caratterizzazione funzionale digeni coinvolti nella biosintesi dei monoterpeni, sesqui-terpeni, tioli e metossipirazine, tutti composti di note-vole importanza per la determinazione degli aromidelle uve e dei vini. Questi studi hanno permesso diapprofondire le conoscenze sull’influenza del sito dicoltivazione, del sistema di allevamento, dell’illumina-zione, delle temperature, della defogliazione e di stressabiotici e biotici sulla biosintesi degli aromi nelle uve,consentendo di acquisire specifiche conoscenze chesaranno di supporto per l’adeguata modulazione dellaqualità aromatica al fine di poter ulteriormente esaltarele caratteristiche di tipicità dei vini.

Parole chiave: accrescimento dell’acino, aromi varie-tali, GC-MS, geni degli aromi, espressione genica,precursori d’aroma, SPE, SPME

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