Biosintesi proteica in vitro

Passato, presente e futuro

Produzione di proteine eterologhe

• Resa relativa bassa rispetto al potenziale– complicate procedure di downstream

• Misfolding e aggregazioni

• Degradazione

• Prodotti tossici

• Modificazioni delle proteine

ESISTONO ALTERNATIVE??

Sistemi in vitro

• Sono noti da decenni (studi biochimici sulla sintesi proteica…..)

• Le proteine prodotte (in piccolissima quantità) erano correttamente foldate e attive.

Possibili vantaggi• Non richiede sintesi DNA• Non richiede clonaggio &

trasformazione• Aggira legislazione restrittiva• Poche esigenze strumentali

– procedure semplici– poco personale– poca energia

• Bassi investimenti• Purificazione semplice• Rese per unità volume• Rapidità• Smaltimento residui• Proteine tossiche• Inserimento aminoacidi non naturali

Potenzialità

• E. coli duplica in 30’ e ha un contenuto proteico del 15%.

• 1 litro contenente 1.6 g di cellule produce 500 mg h-1 (3-5000 proteine diverse)

• Lo stesso apparato biosintetico potrebbe in principio essere forzato a produrre in vitro 1 solo tipo proteico.

La sintesi proteica

• Uno dei maggiori processi biologici delle cellule

• 15% della massa cellulare, 80% dell’energia

• più di 200 molecole diverse coinvolte

estratti E. coli

commerciale

sintesi

Dove troviamo tutto?

• Frazione S30• Frazione S100• mRNA

– DNA + RNA polimerasi fagica– RNA sintetico– trascrizione/traduzione accoppiata

E. coli, germe grano, lisato reticolociti, preparazioni commerciali

Possibili applicazioni

• Proteine di valore (ricerca medica o industria)• studiare il folding ( e disegnare proteine migliori)

– marcatura selettiva di singole posizioni

• Studi dei trasportatori• Sintesi di proteine tossiche• Proteine migliori o nuove (modifiche non naturali)• Combinazione con PCR per screening di mutanti

ed evolvere nuove caratteristiche• Chip proteici

E. coli: il più popolare, no capping, ma sistema procariote, problemi di folding, problemi con proteine multidominio (folding cotraslazionale)Reticolociti di coniglio: eucariote, bassa efficienza (codon usage ottimizato per la globina, ribonucleasi molto attiva, elevata concentrazione emoglobina)Embrioni di germe di grano: hanno presente tutto l’apparato di traduzione in uno stato liofilizzato. Bassa durata di reazione

Simultaneous Expression and Maturation of the Iron-Sulfur Protein Ferredoxin in a Cell-

Free System

• 450 mg/L in 6 ore

Folding

• Folding cotraslazionale, sia in procarioti che in eucarioti

• Chaperoni (DnaJ/DnaK/GtpE; GroEL/GroES; hsp60; hsp70)

• Formazione ponti disolfuro corretti– ambiente redox adeguato e catalizzatori

(disulfide isomerasi eucariotica)

Proteine tossiche

Modifiche non naturali

• Facilità di alterazione di singoli componenti del sistema traduzionale

• Estensione del codice genetico– studi di stabilità proteica, trasduzione del

segnale e meccanismi enzimatici

Evoluzione

• Espressione diretta di prodotti PCR random

• Recupero delle varianti migliori

• Nuovi cicli di mutagenesi

• Scanning saturation mutagenesis– Analisi di tutte le possibili combinazioni della

binding region di un anticorpo– Possibilità di automazione del processo

Selezione in vitro da grandi librerie

• Tecniche di display fagico o su cellule: limitazione dall’efficienza di trasformazione

• Strategia evoluzionista: le molecole selezionate sono mutagenizzate a ogni round

• size library > 1012 • ribosome display : la proteina folda correttamente

ma non lascia il ribosoma• “RNA-peptide fusion”: un linker di DNA e

puromicina lega il prodotto al suo messaggero.

Da migliorare• Scale up da ml a litri• Durata

– Rigenerazione energia– PURE: prodotti purificati– Rimozione prodotti (membrane “intelligenti”)– Eterogeneità efficacia messaggeri (ottimizzazione

sequenze)– Stabilità messaggero

• mutanti• inibitori RNAsi• stabilizzazione chimica (nucleotidi acetilati in pos. 2)

sistema “PURE”

Present composition of the PURE system

• Translation factors• 2.7 M IF1• 0.40 M IF2• 1.5 M IF3• 0.26 M EF-G• 0.92 M EF-Tu• 0.66 M EF-Ts• 0.25 M RF1• 0.24 M RF2• 0.17 M RF3• 0.50 M RRF• Aminoacyl-tRNA synthetases

Other enzymes4500U/ml MTF1.2 M ribosomes4.0 g/ml creatine kinase3.0 g/ml myokinase1.1 g/ml nucleoside-diphosphate kinase2.0 units/ml pyrophosphatase10 g/ml T7 RNA polymeraseEnergy sources2mM ATP, GTP1mM CTP, UTP20 mM creatine phosphateBuVers50 mM Hepes–KOH, pH 7.6100mM potassium glutamate13 mM magnesium acetate2mM spermidine1mM DTTOther components0.3mM 20 amino acids10mg/ml 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid56 A260/ml tRNAmix (Roche)

Durata

• I componenti non devono degradarsi né esaurirsi: Protein Bioreactor

• In dipendenza dall’mRNA, 3-30 g/ml in 1 h (max durata 50 ore, fino a 90 mol proteina/mol RNA)

Proteine piccole(< 20.000 Da)Estremamente attive

amino acids, energy components, NTPs, co-factors.

ribosome, translation factors, tRNA, aminoacyl tRNA synthetases, template (RNA or DNA),and RNA polymerase

product, AMP, GDP, Pi, aminoacida..

Altri tipi possibili

SFCF:il prodotto resta dentro e va separato dalla miscela

Hollow filter:grande superficie filtrante

Incremento tempi

• Aumentare la concentrazioni dei componenti– ultrafiltrazione, PEG

Cloramfenicol acetil transferasi

Rigenerazione energia

• Creatina fosfato + creatina fosfokinasi (eucarioti)

• PEP + piruvato kinasi (procarioti)

• AcetilP + acetato kinasi (già presente)

Struttura messaggero

• Capping aumenta stabilità, ma anche incremento concentrazione non-capped mRNA

• Ottimizzazione interazione col ribosoma e rapporto mRNA/ribosoma– agire sulla quantità di templato o di RNA polimerasi

• Accoppiare trascrizione e traduzione incrementa emivita messaggero (steady state)

• Aggiunta strutture secondarie in 5’ e 3’

Single Protein Production (SPP)

• MazF è una tossina di E. coli che degrada il messaggero a livello delle tripletta ACA

• Induzione MazF la cellula è una fabbrica cellulare pronta a eseguire qualunque istruzione.

• Le cellule sono quiescienti, ma con l’apparato metablico pienamente funzionante

• Induzione di un gene eterologo (pCold) privo di triplette ACA

• La sintesi prosegue per almeno 4 giorni

SSP

• Sintesi generale bloccata entro 2 ore dall’induzione MazF• Eotaxina umana fino al 30% proteine totali, >96 ore• NMR in vivo

Fully automated transcription and translation. Capable of producing approx. 4mg* of protein (e.g. GFP) in each of the 8 tubes (or 30mg* in total) in an overnight campaign.

*as crude protein

Applications: structural analysis, antibodies production

Fully automated transcription and translation. Capable of producing approx. 10mg* of protein (e.g. GFP) in each of the 384 wells in an overnight campaign.

*as crude protein

Applications: high throughput screening, functional analysis

ROCHE RTS500

• DNA templates (expression vectors with a T7-RNA

• polymerase promoter and a ribosomal binding site (RBS))

• T7-RNA polymerase for transcription (mRNA synthesis)

• Special E. coli lysate for translation

Anche Promega, Quiagen hanno il loro sistema

“Cell-free protein synthesis: Applications come of age”

Biotechnology Advances 30 (2012) 1185–1194

Cell-free protein synthesis has emerged as a powerful technology platform to help satisfy the growing demand for simple and efficient protein production. While used for decades as a foundational research tool for understanding transcription and translation, recent advances have made possible cost-effective microscale to manufacturing scale synthesis of complex proteins. Protein yields exceed grams protein produced per liter reaction volume, batch reactions last for multiple hours, costs have been reduced orders of magnitude, and reaction scale has reached the 100-liter milestone. These advances have inspired new applications in the synthesis of protein libraries for functional genomics and structural biology, the production of personalized medicines, and the expression of virus-like particles, among others. In the coming years, cell-free protein synthesis promises new industrial processes where short protein production timelines are crucial as well as innovative approaches to a wide range of applications.

Sutro Biopharma's Scalable Biochemical Protein Synthesis PlatformDesigning and Manufacturing a New Generation of Biotherapeutics

Sutro Biopharma's technology platform is made possible by the separation, into an extract, of the cellular components required to produce proteins from the process of protein generation itself. The extract includes all the necessary biochemical components for energy production, transcription and translation and can be used to support cell-free biochemical protein synthesis by the addition of the specific DNA sequence for the desired protein. The process produces single proteins at g/L yields in 8-10 hours at any scale. Difficult-to-fold proteinsCytotoxic molecules Non-natural amino-acid containing proteins