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32
MARIANA FERREIRA DOS ANJOS
CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA INDUZIDA PELO VENENO MLU_080047
ISOLADO DA CARAVELA Physalia physalis
Itajaí (SC)
2017
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3
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS
SINTÉTICAS BIOATIVAS
MARIANA FERREIRA DOS ANJOS
CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA INDUZIDA PELO VENENO MLU_080047
ISOLADO DA CARAVELA Physalia physalis
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como
parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profª. Drª. Nara Lins Meira Quintão
Itajaí (SC)
Maio de 2017
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4
A58c
Anjos, Mariana Ferreira dos, 1989-
Caracterização da resposta induzida pelo veneno MLU_080047
isolado da
caravela Physalia physalis. [manuscrito] / Mariana Ferreira dos
Anjos. –
Itajaí, 2017.
109 f. : il., color.
Inclui lista de figuras, gráficos, abreviaturas e siglas.
Referências: p. 51-57.
Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí,
Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em
produtos
naturais e substâncias sintéticas bioativas, 2017.
“Orientadora: Profª Drª. Nara Lins Meira Quintão”.
1. Physalis physalis - Veneno. 2. Toxina – Efeitos fisiológicos.
3. Venenos de
Cnidários. I. Quintão, Nara Lins Meira. II. Título.
CDU: 593.73
Irene Albino – CRB 14ª/1114
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5
CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA INDUZIDA PELO VENENO MLU_080047
ISOLADO DA CARAVELA Physalia physalis
Mariana Ferreira dos Anjos
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título
de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de
Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e
aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do
Itajaí.’
_______________________________________________
Clóvis Antônio Rodrigues , Profº Drº
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos
Professores:
______________________________________
Profª Drª Nara Lins Meira Quintão (UNIVALI)
Presidente orientador
______________________________________
Profª Drª Ruth Meri Lucinda da Silva (UNIVALI)
Membro
______________________________________
Profª Drª Priscila de Souza (UNIVALI)
Membro
____________________________________
Profº Drº Rafael Cypriano Dutra (UFSC)
Membro
Itajaí (SC), 19 de maio de 2017
-
6
Dedicatória
À minha mãe Mariza e ao meu avô José Henrique dedico todo
o meu conhecimento.
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7
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por ter guiado meus caminhos até esta conquista
e ter sido o grande suporte nos momentos
difíceis.
Agradeço aos meus Pais por me permitirem existir nesse plano
terrestre e poder elevar minha evolução
como ser.
Em especial sempre agradecerei a minha mãe Mariza por
incansavelmente nos dar o melhor carinho, o
maior amor e o maior exemplo.
À minha irmã Natália, agradeço o companheirismo, a parceria, o
suporte e o amor, em todos esses anos.
À toda minha família, meus avós, tias e tios por me amarem
tanto, por sempre sentirem tanto orgulho e por
vibrarem a cada conquista.
Agradeço e dedico este trabalho aos meus primos para lembrar que
vale a pena seguir nossos sonhos e o
que manda nosso coração.
Agradeço a minha orientadora Profª Nara, por todos esses anos de
orientação e amizade. Obrigada por ter
orientado meus caminhos, me incentivado e por ter me ajudado a
crescer e amadurecer na pesquisa, por
ter me tornado mais crítica, mais seletiva, mais aberta às
possibilidades. Espero tê-la sempre por perto.
Agradeço aos membros da pré banca e banca por contribuírem na
construção deste trabalho, os
professores: Dr. Rafael Cypriano Dutra (UFSC), Drª Ruth Meri
Lucinda da Silva (UNIVALI), Drª Priscila
de Souza (UNIVALI) e Drª Luisa Mota (UNIVALI).
Agradeço aos meus colegas e amigos do grupo de pesquisa em
processos dolorosos do Programa de Pós
graduação em Ciências farmacêuticas da UNIVALI, em especial à
amiga Dra. Gislaine Francieli da Silva,
que me acompanhou na maioria dos experimentos, ajudando nas
minhas limitações e tornando este trabalho
possível. Da mesma forma agradeço aos colegas Jessica Melato e
Dr. Luis Carlos Stoeberl, aprendi muito
com vocês nesse período de convivência. Desejo muito sucesso a
todos.
Aos demais colegas do Programa de Pós graduação em Ciências
farmacêuticas da UNIVALI agradeço por
estes anos. Obrigada pelo carinho e respeito de todos. Em
especial agradeço a minha amiga Me. Thaise
Boeing por ter colaborado no trabalho e auxiliado nas duvidas
que surgiram. Obrigada pela amizade e
desejo a você muito sucesso.
À CAPES e ao CNPq agradeço o apoio e incentivo à pesquisa.
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8
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9
EPÍGRAFE
“A mente que se abre a novas ideias, nunca volta a seu tamanho
original”
Albert Einstein
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CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA INDUZIDA PELO VENENO MLU_080047
ISOLADO DA CARAVELA Physalia physalis
Mariana Ferreira dos Anjos
Maio/2017
Orientador: Nara Lins Meira Quintão, PhD
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas
Bioativas
Número de Páginas: 61
O envenenamento por animais marinhos como os cnidários são cada
vez mais relatados no litoral brasileiro. Esse grupo de
animais possui poderosas células de defesa denominadas
nematocistos, estrutura responsável pela injeção do veneno. A
partir
do contato do veneno com humanos, ocorrem diferentes reações que
variam de moderadas até potencialmente fatais. Dentre as
reações mais comuns estão a dor e ardência local, náusea e mal
estar, mas as dificuldades no tratamento dessas ocorrências
acabam tornando-as, em muitos casos, emergência médica. Este
trabalho teve como objetivo investigar a capacidade do veneno
da caravela Physalia physalis (MLU_080047) em induzir
hipersensibilidade e as possíveis vias de sinalização envolvidas,
bem
como os efeitos gástricos produzidos após o contato com o mesmo.
Inicialmente, verificou-se que a injeção intraplantar (i.pl.)
do veneno (0,1 ng/pata) causou hipersensibilidade mecânica, com
aumento da resposta em 144,0 ± 31,0% entre 30 min e 2h
após a sua injeção. Os animais apresentaram redução do limiar
térmico com redução de 23,9 ± 6,2% em relação ao grupo
injetado com PBS. Entretanto, o veneno não produziu resposta
edematogênica significativa nas mesmas doses utilizadas para
avaliação da hipersensibilidade. A hipersensibilidade mecânica
induzida pelo veneno foi significativamente atenuada pela
pirilamina (antagonista do receptor H1) em 31,0 ± 3,9 %, com
maior ênfase para os 30 min seguintes à injeção do veneno. O
SB36679 (antagonista do receptor TRPV1) também inibiu a resposta
dos animais em 74,4 ± 12,5 % entre 1 h e 2 h após a
injeção do veneno. O antagonista do receptor B1 para cininas
(Des-Arg9-Leu8-BK) e HOE 140 (antagonista do receptor B2)
também apresentou inibição de 43,7 ± 15,7 % em relação ao grupo
controle no intervalo de tempo de 1 à 3 h após a injeção do
veneno. O papel do sistema inflamatório, principalmente a via
dos prostanoides foi evidenciada através da administração tanto
do meloxican (inibidor seletivo da enzima COX-2), o qual
apresentou inibição de 36,0 ± 8,7 % nos 30 min de avaliação,
quanto
da dexametasona (glicocorticóide) que apresentou inibição na
fase mais tardia da hipersensibilização (2 h de avaliação), com
inibição de 21,4 ± 7,2 %. Cabe ressaltar que a
hipersensibilidade mecânica não foi alterada quando antagonista do
receptor
TRPA1(HC030031) e COX-1 (Indometacina). Diante dos resultados
acima descritos, foram utilizados animais tratados com
capsaicina 24-48h após o nascimento como protocolo de depleção
de fibras C. Estes animais, quando injetados com o veneno,
apresentaram redução significativa da hipersensibilidade
mecânica quando comparados aos animais sem depleção. O veneno
MLU_080074 foi capaz de aumentar os níveis de IL-1β e a
atividade da enzima mieloperoxidade (migração de leucócitos) na
pata e no nervo ciático, respectivamente. Entretanto nenhuma
alteração foi evidenciada quanto aos níveis de TNF. Na
avaliação
dos efeitos gástricos do veneno MLU_080074, foi observada
redução da acidez e volume de secreção gástrica, bem como
aumento na quantidade de muco aderido em animais submetidos ao
modelo de ligadura de Piloro. Os resultados em conjunto
apontam forte influência do sistema histaminérgico, vaniloide e
de eicosanoides na hipersensibilidade mecânica induzida pelo
veneno da P. physalis, com primordial importância das fibras
sensoriais do tipo C. estas vias também podem estar
relacionadas
com os efeitos gástricos encontrados, uma vez que o sistema
histaminérgico e prostanoides estão diretamente relacionados
com
a secreção gástrica e alterações de pH. Apesar do forte
envolvimento das vias neurogênicas da dor, o sistema
inflamatório
parece contribuir significativamente para este processo. Novos
alvos ainda estão sendo investigados para melhor delinear o
mecanismo pelo qual o veneno da P. physalis desencadeia
hipersensibilidade mecânica nos animais, a fim de contribuir
para
um tratamento mais adequado de pessoas expostas a este
veneno.
Palavras-chave: Physalis physalis. Veneno.
Hipersensibilidade.
-
11
CHARACTERIZATION OF THE RESPONSE INDUCED BY THE VENOM
MLU_080047 CARAVELA ISOLATE Physalia physalis
Mariana Ferreira dos Anjos
May, 2017
Supervisor: Nara Lins Meira Quintão, PhD
Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive
Substances
Number of pages: 61
Poisoning by marine animals, such as jellyfish, is increasingly
reported on the Brazilian coast. This group of animals has
powerful defence cells called nematocysts, the structure
responsible for the injection of venom. Once this venom comes
into
contact with humans, different reactions occur, ranging from
moderate to potentially fatal. The most common reactions
include
local pain and burning, nausea and malaise, but due to the
difficulties in treating these occurrences, they often end up
becoming
medical emergencies. This work investigates the ability of the
caravel venom Physalia physalis (MLU_080047) to induce
hypersensitivity, and the possible signalling pathways involved,
as well as the gastric effects produced after contact with it.
Initially, intraplantar (i.pl.) injection of the venom (0.1
ng/paw) caused mechanical hypersensitivity, with a response
increase
of 144.0 ± 31.0% between 30 min and 2 h after injection. The
animals presented a reduction in thermal threshold of 23.9 ±
6.2% in relation to the group injected with PBS. However, the
venom did not produce a significant edematogenic response at
the same doses used to assess hypersensitivity. The mechanical
hypersensitivity induced by the venom was significantly
attenuated by pyrilamine (H1 receptor antagonist) by 31.0 ±
3.9%, with a more pronounced effect in the 30 min following
injection of the poison. SB36679 (a TRPV1 receptor antagonist)
also inhibited the animals' response by 74.4 ± 12.5% between
1 h and 2 h after venom injection. The B1 receptor antagonist
for kinins (Des-Arg9-Leu8-BK) and HOE 140 (B2 receptor
antagonist) also showed inhibition of 43.7 ± 15.7% over the
control group in the time interval from 1 to 3 h after injection
of
the venom. The role of the inflammatory system, particularly the
prostanoid pathway, was evidenced by administration of both
meloxicam (selective COX-2 inhibitor), which showed inhibition
of 36.0 ± 8.7% in the 30 min evaluation, and dexamethasone
(glucocorticoid), which showed inhibition in the later phase of
hypersensitization (2 h evaluation), with inhibition of 21.4 ±
7.2%. It should be noted that mechanical hypersensitivity was
not altered when antagonizing the receptor TRPA1 (HC030031)
and COX-1 (Indomethacin). Based on these results, we used
animals treated with capsaicin 24-48h after birth as a C fiber
depletion protocol. These animals, when injected with the venom,
showed a significant reduction in mechanical hypersensitivity
when compared to animals without depletion. The MLU_080074 venom
was able to increase IL-1β levels and myeloperoxidase
activity (leukocyte migration) in the paw and sciatic nerve,
respectively. However, no change was seen in TNF levels. In the
evaluation of the gastric effects of the venom MLU_080074, a
reduction in the acidity and volume of gastric secretion was
observed, as well as an increase in the amount of adhered mucus
in animals submitted to the Pylorus ligature model. Taken
together, the results show a strong influence of the
histaminergic, vanilloid and eicosanoid systems on mechanical
hypersensitivity induced by the venom P. physalis, with
primordial importance of type C sensory fibres. These pathways
may
also be related to the gastric effects found, as the
histaminergic system and prostanoids are directly related to
gastric secretion
and pH changes. Despite the strong involvement of neurogenic
pain pathways, the inflammatory system seems to contribute
significantly to this process. New targets are still being
investigated to better delineate the mechanism by which P.
physalis
venom triggers mechanical hypersensitivity in animals, in order
to contribute to a more appropriate treatment of people exposed to
this venom.
Keywords: Physalis physalis. Venom. Hypersensitivity.
-
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Incidência dos acidentes com águas vivas e caravelas no
estado de Santa Catarina........ 13
Figura 2 Espécie de cnidários de maior importância
médica..........................................................
16
Figura 3 Partes anatômicas que compõe a caravela P.
physalis.....................................................
17
Figura 4 Transmissão nervosa da
dor.............................................................................................
19
Figura 5 Terminações cutâneas das fibras
nervosas.......................................................................
20
Figura 6 Mediadores envolvidos na sensibilização
periférica........................................................
21
Figura 7 Canais TRP, seus diferentes subtipos e
ativadores...........................................................
22
Figura 8 Número de publicações indexadas no Pubmed utilizando os
descritores “toxin/venom
and pain”
.........................................................................................................................
23
Figura 9 Hipersensibilidade mecânica induzida pelo veneno
MLU_080047................................. 30
Figura 10 Limiar mecânico de retirada da
pata.................................................................................
31
Figura 11 Limiar térmico de retirada da
pata....................................................................................
32
Figura 12 Resposta edematogênica do veneno
MLU_080047.........................................................
33
Figura 13 Envolvimento do receptor de histamina do tipo
H1.........................................................................................
34
Figura 14 Envolvimento do receptor
TRPV1...................................................................................
34
Figura 15 Envolvimento do receptor
TRPA1...................................................................................
35
Figura 16 Envolvimento da
COX-1..................................................................................................
35
Figura 17 Envolvimento da
COX-2..................................................................................................
36
Figura 18 Envolvimento da via dos
glicocorticoides........................................................................
36
Figura 19 Envolvimento do receptor B1 para
cininas........................................................................
37
Figura 20 Envolvimento do receptor B2 para
cininas.......................................................................
37
Figura 21 Participação das fibras aferentes do tipo
C.......................................................................
38
Figura 22 Efeito sobre a migração de
leucócitos..............................................................................
39
Figura 23 Efeito sobre os níveis de IL-1β na pata de
camundongos................................................ 39
Figura 24 Efeito sobre os níveis de
TNF..........................................................................................
40
Figura 25 Sinalização intracelular dos receptores de histamina
do tipo 1........................................ 44
Figura 26 Envolvimento de TRPV1 e TRPA1 na sensibilização
periférica..................................... 45
Figura 27 Fármacos inibidores das cicloxigenases e sua
participação em processos biológicos..... 46
Figura 28 Sistema
calicreína/cininas.................................................................................................
47
Figura 29 Vias de sinalização participantes da sensibilização
induzida pela P. physalis.................
50
-
13
LISTA DE ABREVIATURAS
AC - Adenilato Ciclase
AMPc - Monofosfato Cíclico de Adenosina
ANOVA - Análise de Variância
ATP - Trifosfato de Adenosina
ASICs - Canais iônicos sensíveis a ácido
AUC - area under curve (área sob a curva)
BjV – Veneno da Bothrops jararaca
BK – Bradicinina
CEUA – Comite de ética para o uso de animais
CGRP - Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina
COX1 - Ciclooxigenase 1
COX2 - Ciclooxigenase 2
DAG - Diacilglicerol
DRG - Gânglio da Raiz Dorsal
EPM - Erro Padrão da Média
VFH - Filamento de Von Frey
GABA - Ácido -aminobutírico
i.p. - Intraperitoneal
i.pl. - Intraplantar
IASP - Associação Internacional Para o Estudo da Dor
IL-1β - Interleucina-1β
IL-8 - Interleucina-8
iNOS - Óxido Nítrico Sintase Induzida
IP3 – Trifosfato de inositol
MPO - Mieloperoxidade
NF-b - Fator Nuclear κB
NGF - Fator de Crescimento Neural
NMDA - N-metil de Aspartato
PAF – Fator de Ativação Plaquetária
PBS - Salina Tamponada com Fosfato
PG - Prostaglandina
PGE2 - Prostaglandina E2
PIP2 - Fosfatidilinositol
PKA - Proteína Quinase A
PKC - Proteína Quinase C
RNAm – RNA mensageiro
Rpm – Rotações por minuto
SNC - Sistema Nervoso Central
SNP - Sistema Nervoso Periférico
SP - Substância P
TNF - Fator de Necrose Tumoral
TRK - Receptor de Tirosina Quinase
TRK-A - Receptor de Tirosina Quinase A
TRP - Receptor de Potencial Transitório
TRPV1 - Receptor de Potencial Transitório Vanilóide Tipo 1
TRPA1 - Receptor de Potencial Transitório Anquirina Tipo 1
TRPM8 - Receptor de Potencial Transitório Melastatina Tipo 8
TsTX - Tityustoxina
TTX - Tetrodotoxina
-
14
TTxr - Tetrodotoxina Toxina Resistente
v.o - Via Oral
-
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
.......................................................................................................................
12
2 OBJETIVOS
............................................................................................................................
14
2.1 Objetivo Geral.
........................................................................................................................
14
2.2 Objetivos Específicos.
.............................................................................................................
14
3 REVISÃO DA LITERATURA
..............................................................................................
15
3.1 Veneno e toxina
.......................................................................................................................
15
3.2 Envenenamento
.......................................................................................................................
15
3.3 Physalia physalis
......................................................................................................................
17
3.4 Dor
............................................................................................................................................
18
3.4.1 Dor por envenenamento………………..…………………………………………………….22
3.5 Ação do veneno sob outros
sistemas…………..…………………………………………….23
4 MATERIAL E
MÉTODOS....................................................................................................
25
4.1 Animais
....................................................................................................................................
25
4.2 Reagente
...................................................................................................................................
25
4.3 Avaliação da nocicepção espontânea
.....................................................................................
25
4.4 Avaliação do limiar mecânico
................................................................................................
25
4.5 Avaliação do limiar térmico
...................................................................................................
26
4.6 Avaliação da resposta edematogênica
...................................................................................
26
4.7 Análise dos mecanismos envolvidos na resposta nociceptiva
.............................................. 26
4.8 Envolvimento das fibras aferentes do tipo C
.......................................................................
26
4.9 Ensaios bioquimicos
................................................................................................................
27
4.9.1 Medida da atividade da
MPO……………………………………………………………......27
4.9.2 Análise dos níveis de
citocinas……………………………………………………………….27
4.10 Avaliação da secreção gástrica
...............................................................................................
27
4.11 Avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica
............................................................ 28
4.12 Análise estatística
.....................................................................................................................
28
5 Resultados
................................................................................................................................
29
6 Discussão
..................................................................................................................................
42
7 CONCLUSÃO
.........................................................................................................................
50
REFERÊNCIAS
......................................................................................................................
51
-
32
-
32
1 INTRODUÇÃO
O reino animal conta com um variado e complexo mecanismo de
sobrevivência da espécie que é a
existência dos venenos e toxinas presentes no seu corpo e que
são liberados na presa ou predador. Esse mecanismo
se transforma em uma fonte de substâncias e moléculas inéditas,
haja vista o rápido estabelecimento de sintomas
durante um envenenamento. Na última década, inúmeros
pesquisadores têm estudado venenos e toxinas
provenientes de espécies do reino animal, incluindo moluscos,
insetos, aracnídeos, cnidário, répteis, etc., tanto no
intuito de investigar os eventos que participam do processo de
intoxicação quanto para buscar novas ferramentas
farmacológicas, tais como inibidores, moduladores seletivos de
canais iônicos e receptores (BRIGATTE et al.,
2010; DE SOUZA et al., 2011; 2012; LEWIS et al., 2012; TEIXEIRA
et al., 2009; WANG et al., 2011). Em ambos
os casos, a alta seletividade da toxina faz destas moléculas
ferramentas extraordinárias para o estudo das reações
celulares desencadeadas pelas mesmas, contribuindo também para
decifrar as vias de sinalização mediadas por
determinados alvos celulares (IBANEZ-TALLON; NITABACH,
2012).
Acidentes com envenenamento de animais marinhos, como os
cnidários, podem levar a prejuízos à saúde
e também ao turismo local. Uma das espécies mais comumente
encontrada no Brasil é a Physalia physalis (Classe
Hidrozoa). A partir do contato com o animal, os sintomas mais
comuns são dor imediata, não raras vezes de forte
intensidade, com sensação de ardência, manchas avermelhadas na
pele, e em alguns casos, náuseas, vômitos,
hipotensão, cefaleia e angústia respiratória (HADDAD JUNIOR;
SILVEIRA; MIGOTTO, 2010).
De acordo com Centro de Informações Toxicológicas de Santa
Catarina (CIT – UFSC) o número de
acidentes com águas-vivas e caravelas ocorridos no Sul e Sudeste
do Brasil vem aumentando significativamente.
Possivelmente, isto tenha como causa as alterações climáticas,
onde em águas quentes os animais se agrupam para
reprodução e através de correntes frias são deslocados para as
demais regiões do país, além da diminuição do
número de predadores dessas espécies, como a tartaruga marinha
(http://dc.clicrbs.com.br/sc/estilo-de-
vida/noticia/2017/01/confira-as-cinco-hipoteses-que-explicam-o-aumento-da-incidencia-de-aguas-vivas-em-
santa-catarina-9418212.html; Figura 1).
Todo o litoral de Santa Catarina apresenta ocorrência de
águas-vivas. No verão de 2016, em 3 meses, foram
registrados quase 20 mil casos de acidentes pelos cnidários nas
praias catarinenses. Somente no Sul do Estado, houve
registro de 3,5 mil casos em uma semana. Já no verão de 2017,
antes de terminar a temporada, houve registro de 77 mil
casos de acidentes com animais marinhos
(http://dc.clicrbs.com.br/sc/estilo-de-vida/noticia/2017/02/santa-catarina-
registra-77-mil-lesoes-por-aguas-vivas-desde-outubro-9726746.html).
De acordo com o Centro de biologia marinha da Universidade de
São Paulo (CEBIMar, 2015), outro fator
que faz aumentar a quantidade de acidentes envolvendo
águas-vivas é a composição corporal do invertebrado. A
espécie é formada por mais de 95% de água, o que a torna
praticamente invisível no mar. Nesse cenário, os
cnidários se tornam grande perigo para as crianças, apresentando
maior importância médica e urgência de medidas.
Os primeiros estudos com o veneno da P. physalis mostrou que ele
foi capaz de induzir rápida
degranulação com liberação de histamina seguida da lise celular
(CORMIER, 1984). Também apresentou efeito
vasodilatador do veneno deste cnidário em vasos da musculatura
esquelética de cães (LOREDO; GONZALEZ;
HESSINGER, 1985). A Physaliotoxina, a mais conhecida toxina do
veneno, é uma poderosa hemolisina, esses
efeitos fisiológicos justificam a geração dos sintomas
existentes no envenenamento.
http://dc.clicrbs.com.br/sc/estilo-de-vida/noticia/2017/01/confira-as-cinco-hipoteses-que-explicam-o-aumento-da-incidencia-de-aguas-vivas-em-santa-catarina-9418212.htmlhttp://dc.clicrbs.com.br/sc/estilo-de-vida/noticia/2017/01/confira-as-cinco-hipoteses-que-explicam-o-aumento-da-incidencia-de-aguas-vivas-em-santa-catarina-9418212.htmlhttp://dc.clicrbs.com.br/sc/estilo-de-vida/noticia/2017/01/confira-as-cinco-hipoteses-que-explicam-o-aumento-da-incidencia-de-aguas-vivas-em-santa-catarina-9418212.html
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13
Figura 1: Incidência dos acidentes com águas vivas e caravelas
no estado de Santa Catarina.
Fonte -
http://dc.clicrbs.com.br/sc/estilo-de-vida/noticia/2017/01/confira-as-cinco-hipoteses-que-explicam-o-
aumento-da-incidencia-de-aguas-vivas-em-santa-catarina-9418212.html
Apesar dos relatos com acidentes apresentarem sintomas de curta
duração, a ausência de tratamento
específico, bem como a desinformação sobre as principais medidas
a serem tomadas, culminam no agravamento
dos sintomas do envenenamento.
Existem inúmeros estudos que caracterizam os venenos e toxinas
de muitos animais venenosos como
caramujos, escorpiões, cobras e aranhas, mas, por comparação,
poucos deles evidenciam os venenos e toxinas dos
cnidários. A identificação de peptídeos tóxicos em cnidários é
limitada a um pequeno número de toxinas,
principalmente de anêmonas do mar. A exemplo de outros estudos
já realizados com toxinas animais, tais como,
veneno da Apis mellífera, Phoneutria nigrieventer, Bothrops
asper, Conus sp, etc, a caracterização dos eventos
moleculares desencadeados pelo contato com o veneno MLU_080047
da P. physalis pode contribuir para a
descoberta de uma nova ferramenta farmacológica.
http://dc.clicrbs.com.br/sc/estilo-de-vida/noticia/2017/01/confira-as-cinco-hipoteses-que-explicam-o-aumento-da-incidencia-de-aguas-vivas-em-santa-catarina-9418212.htmlhttp://dc.clicrbs.com.br/sc/estilo-de-vida/noticia/2017/01/confira-as-cinco-hipoteses-que-explicam-o-aumento-da-incidencia-de-aguas-vivas-em-santa-catarina-9418212.html
-
14
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Caracterizar a resposta sensorial, inflamatória e gástrica
induzida pela injeção do
veneno MLU_080047 isolado da caravela Physalia physalis em
roedores.
2.2 Objetivos Específicos:
Traçar o perfil da resposta sensorial e edematogênica induzidas
pela injeção
intraplantar do veneno isolado da P. physalis;
Investigar os mecanismos moleculares e as vias de sinalização
envolvidos na
hipersensibilidade mecânica induzida pelo veneno isolado da P.
Physalis em
camundongos através da utilização de antagonistas e inibidores
de vias específicas;
Verificar a produção de citocinas e migração celular em animais
submetidos a
injeção i.pl. do veneno da P. Physalis;
Avaliar a produção de muco e secreção de ácido gástrico de
animais submetidos
ao contato com o veneno da P. physalis através do modelo de
ligadura de piloro em
camundongos.
-
15
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Veneno e toxina
A produção de veneno, por diversas espécies de animais, ocorre
tanto para garantir a caça da presa quanto
para defesa contra predadores. A sua produção ocorre em
glândulas especializadas, pertencente a um conjunto de
animais venenosos que incluem anelídeos, cnidários,
equinodermos, moluscos, vertebrados e artrópodes
(BOHLEN; JULIUS, 2012). A sua inoculação está associada a uma
estrutura corporal especializada na inoculação,
para facilitar o fornecimento de venenos, incluindo farpas,
bicos, presas ou dentes modificados, arpões,
nematocistos, tenazes, probóscide, espinhos, sprays, esporas e
picadas (CASEWELL et al., 2013).
O veneno é uma complexa mistura de toxinas – compostos
principalmente por proteínas que exibem
atividade enzimática, mas também por aminas, lipídios e outros
componentes – que interrompem os efeitos
fisiológicos normais da presa (FRY et al., 2007). A composição
do veneno reflete sua função. Os venenos
defensivos, como os de peixes ou abelhas, são altamente
conservados e específicos, produzindo como resposta
imediata dor intensa e localizada. Por outro lado, os venenos
predatórios são mais frequentemente variáveis em
composição e efeitos.
Entretanto o componente peptídico dos venenos desperta maior
interesse como ferramentas biológicas e
potenciais terapias. Cada porção especifica do veneno chama-se
toxina - moléculas altamente ativas que agem em
vários receptores celulares. A provável função ancestral dos
venenos é a atividade enzimática envolvida na
digestão de presas; no entanto, em alguns animais, as glândulas
de veneno evoluíram para produzir potentes toxinas
(THAN; KHAN; BRUSIC, 2003). Até hoje, aproximadamente 200
toxinas foram identificadas a partir de cnidários
(A. TRIM; TRIM, 2013).
Os venenos e toxinas exibem uma riqueza de propriedades
farmacológicas através da interação com uma
gama de alvos, tais como receptores celulares, receptores de
membranas e canais iônicos. Possuem diversas
funções, como caracterização de vários canais de íons,
desenvolvimento de vacinas e antídotos, agentes
terapêuticos e até na formulação de inseticidas.
3.2 Envenenamento por cnidários
O envenenamento ou intoxicação por veneno animal é um importante
problema de saúde e principalmente
registrado nos trópicos do planeta. Os animais se aproximam do
litoral, e o aumento da interação com o homem
pode provocar um correspondente aumento no número de acidentes
(KITATANI et al., 2015).
A cada ano, milhares de lesões causadas por caravelas e
águas-vivas são relatadas. Os cnidários estão
entre os organismos mais venenosos e peçonhentos que se
conhecem, e seu arsenal químico vem despertando
interesse farmacológico (BADRÉ, 2014; BALHARA; STOLBACH, 2014).
Os sinais e sintomas de
envenenamento por cnidários estão relacionados à ação tóxica
imediata do veneno e a reação alérgica
individual. Eles variam de dor simples, leve, localizada com
eritema e erupção papulovesicular, a dor intensa, ao
choque grave e morte (HADDAD JUNIOR et al., 2013). Os efeitos
locais (eritema, edema e dor), apresentam
menos de 20 cm de marcas de pele, são de aparência geralmente
oval ou redonda e caracterizam impressões de
pequenos tentáculos. Já as vítimas que apresentam marcas longas,
maiores de 20 cm, com impressões lineares e
cruzadas mais facilmente apresentam fenômenos sistêmicos, como
mal-estar, náuseas, vômito, dispneia,
taquicardia, hipotensão arterial, convulsões, arritmias
cardíacas, insuficiência respiratória e, em alguns casos, a
morte (HADDAD JUNIOR; SILVEIRA; MIGOTTO, 2010; MOLEIRO,
2013).
Ressalta-se que os acidentes com cnidários não são queimaduras,
embora o aspecto exterior lembre
queimaduras solares ou por água quente, as lesões são provocadas
por toxinas do veneno desses animais, que
agridem a epiderme e formam desde linhas avermelhadas e
dolorosas até bolhas ou mesmo feridas na pele. Na
maioria dos casos, imediatamente há o aparecimento de dor, edema
local e prurido concomitantes (MOLEIRO,
-
16
2013). Mas é a manifestação dolorosa a mais comum nos acidentes
mais simples até os que desenvolvem choque
anafilático.
Neves et al (2007) relataram através de um questionário
realizado em hospitais de Pernambuco, com
vítimas de acidente com animais marinhos que a ardência foi o
sintoma mais referido (24%), seguido pela dor
(14%), alergia (9%) e queimaduras (7%). Outros sintomas citados
foram bolhas, edema, manchas na pele,
problemas respiratórios e vermelhidão com 5% cada um; enquanto
asfixia, desmaios, eritema, perda de
consciência, pressão baixa e tontura obtiveram 3% cada um.
A gravidade da reação depende de variáveis da eficácia da toxina
e da proporção do envenenamento,
incluindo o número e tipo de nematocistos ativados, o poder de
penetração da agulha de nematocistos, a toxicidade
da espécie envolvida, tamanho molecular do veneno, resposta
antigênica particular da vítima, área de superfície
da pele, localização de lesões corporais e peso corporal das
vítimas (MONTGOMERY; SEYS; MEES, 2016;
NOMURA et al., 2002).
As ocorrências de águas vivas e caravelas são comuns nas regiões
Norte e Nordeste. Entretanto, a
ocorrência de um número grande de acidentes nos estados do Sul e
Sudeste tem chamado à atenção. Possivelmente
isto tenha como causas as alterações climáticas, onde em águas
quentes eles se agrupam para reprodução, e através
de correntes frias são deslocados para as demais regiões do
país. A sobrepesca, o processo de eutrofização e
alteração do habitat também podem ser pontuados como causas
possíveis (MONTGOMERY; SEYS; MEES,
2016). De acordo com o Corpo de Bombeiro do Município de
Florianópolis, somente no verão de 2015, o número
de relato de acidentes por animais marinhos aumentou 2000% em
Santa Catarina. No verão de 2017 houve
aumento de 100% do número de registros de acidentes em relação
ao ano anterior.
O contato do veneno do cnidário com humanos - composto de
substâncias tóxicas a partir de uma mistura
de vários polipeptídeos como fosfolipases A e B, enzimas
proteolíticas e lipídios neutros - pode produzir efeitos
necrótico, neurotóxico (dor) e cardiotóxicos (NEVES, AMARAL;
STEINER, 2007; RIVITTI, 2014).
O Brasil possui diversas espécies de cnidários. Alguns
apresentam importância médica, como as
caravelas, pertencentes à espécie P. physalis, da classe
Hidrozoa (Figura 2C), que podem causar acidentes graves.
As cubomedusas, da classe Cubozoa, são frequentemente associadas
a acidentes fatais como mostra figura 2 A e
B (OLIVEIRA; PIRES-JUNIOR, 2011).
Figura 2: Espécies de cnidários de maior importância médica. (A)
Chiropsalmus quadrumanus e (B) Tamoya haplonema da
classe cubozoa e (C) P. physalis da classe hidrozoa.
A Fonte: Álvaro Migotto / Banco de imagens de biologia marinha,
CeBiMar. http://cifonauta.cebimar.usp.br/taxon/chiropsalmus-
quadrumanus/.
A B C
http://cifonauta.cebimar.usp.br/taxon/chiropsalmus-quadrumanus/http://cifonauta.cebimar.usp.br/taxon/chiropsalmus-quadrumanus/http://cifonauta.cebimar.usp.br/taxon/chiropsalmus-quadrumanus/
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17
3.3 P. physalis
Bem conhecida por banhistas, a espécie de caravela P. physalis,
pertencente ao filo Cnidario, classe
Hydrozoa, é considerada uma colônia de pólipos. Cada ser desta
colonia desempenha uma função, que pode ser
na flutuação, captura de alimentos, defesa, reprodução e
movimentação do organismo. É normalmente encontrada
nas águas quentes do Oceano Atlântico, e considerada a mais
perigosa devido ao seu tamanho e por ser responsável
por muitas mortes relacionadas aos animais marinhos (FERNANDEZ
et al., 2011).
Chamada também de Caravela Portuguesa ou “Portuguese
Man-of-War”, a P. physalis é composta por
uma bolsa azul de ar, flutuante na superfície da água que mede
2-25 cm de comprimento e possui vários tentáculos
subaquáticos que podem medir até 30 m de comprimento. A espécie
se alimenta de lulas e peixes (adultos e larvas),
e a forte infestação desta espécie pode trazer como consequência
a diminuição da pesca (BARDI; MARQUES,
2007).
As colônias de P. physalis são dioicas, pois possuem
fertilização externa e gametas gerados na água
(PUGH, 1999). A plânula é formada após a gastrulação, como na
maioria dos cnidários (CARRÉ & CARRÉ,
1994). Tentáculos são longos, portando numerosos nematocistos
(CORMIER & HESSINGER, 1981), usados para
a defesa e captura de presas. A espécie possui múltiplos
tentáculos, que são capazes de descarregar milhares de
organelas intracelulares, os cnidoblastos, cheios de veneno que
são usados principalmente para capturar presas ou
para sua defesa (Figura 3). A descarga do cnidoblasto depende de
estímulos mecânicos e químicos e ocorre à alta
pressão através de um dispositivo semelhante a um canivete,
capaz de injetar microgotas de veneno dentro da presa
ou do predador (QUEIROZ; CALDAS, 2011). O veneno é libertado da
cápsula após estimulação dentro de uma
fração de segundo (700 ns), no que se pensa ser um dos
mecanismos mais rápidos presente na natureza
(MONTGOMERY; SEYS; MEES, 2016).
Figura 3: Partes anatômicas que compõe a caravela P.
physalis.
Nota: Em destaque, a estrutura de inoculação do veneno, os
nematocistos, funcionando como microagulhas descarregadas na
penetração da presa ou predador. O pneumatóforo é a estrutura
flutuante para a colônia. Os gastrozoóides são os responsáveis
pela alimentação da colônia, já os dactilozoóides são as
estruturas nas quais os tentáculos se fixam e os gonozoóides que
são
as estruturas reprodutivas. Fonte: Imagem adaptada de Smarter
Every Day
(https://www.youtube.com/watch?v=7WJCnC5ebf4&t=54s).
https://www.youtube.com/watch?v=7WJCnC5ebf4&t=54s
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O principal componente proteináceo do veneno é a physaliotoxina,
uma hemolisina (TAMKUN;
HESSINGER, 1981) com 240 kDa. Glicoforinas, glicoproteínas de
membranas de eritrócitos de ratos, cães,
ovelhas e humanos, parecem ser os alvos nos quais a toxina se
ligaria para causar o efeito hemolítico do veneno
da P. Physalis (MARIOTTINI, 2014).
Os primeiros estudos demonstraram que a exposição de mastócitos
ao veneno da P. physalis foi capaz de
induzir rápida degranulação com liberação de histamina seguida
da lise celular (CORMIER, 1984). Em seguida,
Loredo, Gonzalez e Hessinger (1985) publicaram dados acerca do
efeito vasodilatador do veneno deste cnidário
em vasos da musculatura esquelética de cães. Este efeito pareceu
ser independente da ação de receptores
muscarínicos ou adrenérgicos. Entretanto, os autores sugeriram
que a ação do veneno estaria sendo mediada
principalmente pela estimulação da síntese de prostaglandinas,
uma vez que o inibidor da enzima ciclo-oxigenase
foi capaz de inibir completamente o efeito vasorelaxante
(LOREDO; GONZALEZ; HESSINGER, 1985).
Mas et al. (1989) avaliaram o efeito da toxina P3 de alto peso
molecular, extraída da P. physalis, sobre o
potencial de ação evocado pelo glutamato em neurônios de lesmas
e junções neuromusculares de lagostim. A
toxina foi capaz de bloquear reversivelmente o potencial de ação
induzido pelo glutamato de modo dependente da
dose. Edwards e colaboradores (2000) evidenciaram ainda que o
veneno da P. physalis foi capaz de aumentar o
influxo de Ca2+ intracelular em cultura de células cardíacas de
embrião de galinha. Esta ação foi dependente da
dose, porém, inalterada frente à exposição aos bloqueadores
clássicos de canal de Ca2+ (diltiazem, verapamil,
nifedipina, nimodipina e mibefradil). Essas alterações foram
evidenciadas também para o influxo de Na2+ e efluxo
de K+.
3.4 Dor
A dor é um sintoma comum na prática clínica e seu manejo ainda é
um desafio para a equipe de saúde.
Entre os principais tratamentos farmacológicos estão os
analgésicos opioides e não opioides, que muitas vezes não
apresentam a eficácia esperada. Além disso, os efeitos adversos
e diferenças na variabilidade interindividual
podem determinar o insucesso terapêutico (SONYA TING; STEPHAN
SCHUG, 2016). Portanto, é preciso que
novos alvos celulares sejam investigados a fim de proporcionar
alívio desse sintoma e melhora na qualidade de
vida dos pacientes. Neste cenário, vários estudos são
desenvolvidos, tanto para aperfeiçoar os medicamentos
analgésicos já existentes, quanto para descobrir novos agentes
terapêuticos.
Classificada como uma experiência sensorial comum a todos os
seres, a dor foi, durante muito tempo,
considerada como uma reação a um estímulo nociceptivo,
funcionando apenas como um mecanismo de proteção
do organismo. Hoje em dia sabe-se que a dor é muito mais
complexa do que um sistema de ação e reação. Ela é
reconhecida mais como uma experiência do que como uma sensação
(BERNACCHIO; CONTIN; MORI, 2005).
Conforme recente definição da Associação Internacional para
Estudos da Dor (IASP), a dor é uma experiência
angustiante associada a uma lesão real ou potencial dos tecidos
com componentes sensoriais, emocionais,
cognitivas e sociais (WILLIAMS e CRAIG, 2016).
O sistema nervoso detecta e interpreta uma gama de estímulos
térmicos e mecânicos, bem como irritantes
químicos ambientais e endógenos (Figura 4). Muitos estímulos
provocam dor e agem como marcadores da
integridade do indivíduo. A dor alerta da existência de lesões
reais ou potenciais ao organismo. Os receptores
responsáveis por perceberem estímulos potencialmente nocivos,
ficam susceptíveis no cenário do envenenamento
(BASBAUM et al., 2009).
-
19
Figura 4: Transmissão nervosa da dor.
Nota: Transmissão dos impulsos originados nos nociceptores e
conduzidos até o corno dorsal da medula espinhal (processo de
transmissão). Os impulsos são projetados para as vias superiores
ou suprimidos (processo de modulação), podendo chegar a
centros superiores do sistema nervoso para a integração,
processamento e reconhecimento dos estímulos sensoriais
(percepção).
Fonte: Adaptada de Oaklander (2011)
http://www.medicinanet.com.br/conteudos/acp
medicine/5249/dor_cronica_%E2%80%93_anne_louise_oaklander.htm.
A dor fisiológica se manifesta como resposta protetora
desencadeada para o conhecimento dos estímulos
lesivos e para a memorização contra os futuros perigos que o
organismo estará exposto (BASBAUM et al., 2009).
Diferentes sensações mecânicas, térmicas e químicas são
transformadas em impulsos elétricos por
terminações nervosas livres chamadas nociceptores. Os
nociceptores são uma subpopulação de fibras nervosas
periféricas (BASBAUM; JESSELL, 2000), que quando excitados por
um estímulo que atinge uma faixa nociva de
intensidade, desencadeiam uma atividade elétrica sequencial.
Algumas fibras aferentes primárias nociceptivas são
especificamente sensíveis a estímulos nocivos,
enquanto outras respondem a estímulos inócuos também. As
aferências nociceptivas são de diâmetro pequeno e
de condução lenta (fibras aferentes do tipo Aδ e C). O fenômeno
da nocicepção envolve os processos de
transdução, onde os estímulos nocivos são transformados em
atividade elétrica. O aumento da sensibilidade à dor
pode ser refletido como uma resposta perceptiva exagerada a
estímulos nocivos (hiperalgesia), como resposta à
dor a um estímulo (por exemplo, tátil) que é habitualmente
inócuo (alodínia) ou ainda como dor referida através
do envolvimento de terminações aferentes adjacentes à área da
lesão inicial (BASBAUM et al., 2009).
As informações provenientes da periferia chegam aos corpos
celulares dos nociceptores, localizados
nos gânglios da raiz dorsal (DRG; processo de transmissão da
dor, onde a informação codificada é levada da
medula espinhal às áreas do cérebro). O processo de modulação
segue a fase de transmissão, e os sinais neurais
são processados, analisados e uma resposta é então elaborada
(BRIDGESTOCK; RAE, 2013). Quando intensos,
esses estímulos geram a dor aguda. Quando se tornam frequentes,
os danos tornam-se persistentes (VON HEHN;
BARON; WOOLF, 2012).
http://www.medicinanet.com.br/conteudos/acp
-
20
Vários mediadores químicos estão envolvidos na sensibilização
periférica através da interação com
canais iônicos ou receptores de membrana nas terminações
aferentes nociceptivas (BASBAUM et al., 2009).
Alguns destes canais iónicos e receptores de membrana são
ativados por estímulos mecânicos e térmicos nocivos.
A ativação do nociceptor por estímulo mecânico é dependente do
sistema somatossensorial e são
categorizados conforme o limiar de ativação gerado por esse
estímulo. Mecanoceptores presentes nas fibras C e
Aδ, terminações nervosas livres da pele, possuem limiar alto de
ativação, sensível a insultos mecânicos nocivos.
Os mecanoceptores de baixo limiar incluem as fibras Aβ e
detectam toque leve. As fibras que inervam células de
Merkel, corpúsculos Pacinni e folículos pilosos detectam
textura, vibração e leve pressão (GUYTON; HALL,
2011; Figura 5)
Figura 5: Terminações cutâneas das fibras nervosas.
Fonte: Adaptado de Michelle Duarte (2011).
https://www.todamateria.com.br/pele-humana/.
A nocicepção química é o processo pelo qual os neurônios
aferentes primários detectam componentes
irritantes e fatores endógenos produzidos pelo estresse
fisiológico, principalmente no contexto da dor aguda. Esses
fatores podem agir sozinhos ou em combinação para sensibilizar
nociceptores sensíveis a estímulos térmicos e/ou
mecânicos, reduzindo assim os limiares da dor. O resultado desta
ação é o reforço da proteção tecidual após as
lesões (GUYTON; HALL,2011).
Tanto componentes periféricos quanto do sistema nervoso central
apresentam plasticidade de
transmissão, reforçando os sinais de dor e produzindo
hipersensibilidade. Se a plasticidade facilita reflexos
protetores, a dor pode ser benéfica, desempenhando função
protetora ou adaptativa mas, quando o processo se
estende, uma condição de dor crônica pode resultar e o sintoma
doloroso passa a ser a própria doença
(SCHESTATSKY, 2008; SCHOLZ; WOOLF, 2007). Após a lesão tecidual,
há uma cascata de eventos envolvendo
aferentes sensoriais primários, eferentes simpáticos, leucócitos
e plaquetas que induz sensibilização periférica. Há
também a liberação de endotelina, prostaglandina E2,
leucotrienos, bradicinina, citocinas, serotonina e adrenalina
que aumentam a excitabilidade. Juntamente com as substancias
liberadas por mastócitos, macrófagos e os
neutrófilos, esse cenário inflamatório resulta no aumento da
eficácia do fenômeno da transdução, na uma redução
do limiar de ativação dos canais iônicos e uma resposta
aumentada após a ativação desse canal (BRIDGESTOCK;
RAE, 2013).
Os Canais de Na+ voltagem-dependentes são expressos em neurônios
somatossensoriais. Classificados
como canais sensíveis a Tetrodotoxina (TTX) (Nav1.1, 1.6 e 1.7)
e canais não-sensíveis a TTX (Nav1.8 e 1.9),
quando alterados levam a uma variedade de distúrbios de dor em
humanos (COX et al., 2006; DIB-HAJJ et al.,
2008). A família de Canais de Ca2+ voltagem dependentes estão
expressos em nociceptores. Os canais de tipo P/Q
são expressos nas lâminas II-IV do corno dorsal e os canais do
tipo N e T são também expressos por fibras C.
Na sensibilização periférica, o acúmulo de fatores endógenos
liberados, incluindo mastócitos,
basófilos, plaquetas, macrófagos, neutrófilos, células
endoteliais, queratinócitos e fibroblastos, compreendem uma
https://www.todamateria.com.br/pele-humana/
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21
matriz de moléculas sinalizadoras, incluindo neurotransmissores,
peptídeos (substância P, CGRP, bradicinina),
eicosinoides e lípidos relacionados (prostaglandinas,
tromboxanos, leucotrienos, endocanabinóides),
neurotrofinas, citocinas e quimiocinas. Todos esses componentes
aumentam a excitabilidade da fibra nervosa,
levando ao aumento na sensibilidade à temperatura ou ao toque. A
liberação das citocinas, entre elas IL-1β e IL-
6, e o fator de necrose tumoral (TNF) contribuem para a
hipersensibilidade e resulta na potencialização da resposta
inflamatória (BASBAUM et al., 2009). Estas vias estão
exemplificadas na figura 6.
Figura 6: Mediadores envolvidos na sensibilização
periférica.
Nota: Liberação de mediadores químicos provenientes de
macrófagos, mastócitos, células imunes e das próprias células
lesionadas que atuam sobre canais iónicos ou receptores de
membrana em terminações nervosas aferentes nociceptivas
periféricas. Alguns mediadores podem aumentar a excitabilidade
das terminações aferentes nociceptivas e outros podem
exercer efeitos inibitórios. ASIC, canal iônico sensível a
ácido; canal de potássio; 5-HT, serotonina; IGluR, receptor de
glutamato ionotrópico; IL-1β, interleucina-1-beta; IL-6,
interleucina-6; Μ, receptor mu-opióide; M2, receptor
muscarínico;
MGluR, receptor metabotropico de glutamato; NGF, fator de
crescimento neural; PAF, fator de ativação plaquetária; PGE2,
prostaglandina E2; PKA, proteína quinase A; PKC, proteína
quinase C; TNF, fator de necrose tumoral; TrkA, receptor A de
tirosina quinase; TRPV1, receptor de potencial transitório
vaniloide 1; TTXr, canal de sódio resistente à TTX. Fonte:
Adaptado
de Meyer et al., 2006.
Nesse cenário os canais TRP possuem papel fundamental. São
receptores conhecidos por serem
seletivamente ativados por substâncias irritantes derivadas de
plantas, incluindo capsaicina (TRPV1), mentol
(TRPM8), óleo de mostarda, alho e wasabi (TRPA1) (Figura 7).
Ademais, estes mesmos receptores podem ser
ativados por estímulos térmicos em determinadas faixas de
temperatura. Os receptores de potencial transitório
(TRPs) são canais de cátions não seletivos, permeáveis ao Ca2+ e
participam nos complexos mecanismos de quase
todas as respostas sensoriais. Compreendem uma superfamília
complexa e multifuncional. Nos mamíferos, são
compostos por seis subfamílias conhecidas como canais iônicos
TRPC (canônica), TRPV (vaniloide), TRPM
(melastatina), TRPML (mucolipina), TRPP (policistina) e TRPA
(ANKTM1). Atualmente, muitos TRPs têm sido
descrito em gânglios da raiz dorsal; TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4,
TRPM8 e TRPA1 (PEREIRA, 2013).
-
22
Figura 7: Canais TRP, seus diferentes subtipos e ativadores.
Canais TRP funcionando como termoceptores, estímulos de calor e
frio ativando seus diferentes subtipos. Estimulantes
naturais são indicados no lado de cada canal com sua fonte
natural mais comum. Fonte: adaptado de Belvisi; Dubuis;
Birrell,
2011.
Os receptores TRPV1, TRPM8 e TRPA1 são detectores moleculares de
estímulos térmicos e químicos
que ativam neurônios sensoriais para produzir dor aguda ou
persistente (JULIUS; BASBAUM, 2001). Tem sido
demonstrado que canais TRPA1 podem ser ativados pela bradicinina
(BK), causando hipersensibilidade mecânica
e térmica (POOLE et al., 1999). Estudos realizados por Bandell
et al. (2004) mostraram que o canal TRPA1 está
acoplado à via de sinalização da BK, e que a fosfolipase C (PLC)
é um importante componente para a ativação
deste canal. Estes autores mostraram que a BK estimula
diretamente os neurônios nociceptivos do gânglio da raiz
dorsal, e assim, causa hiperalgesia. Autores propõem que a
ativação do TRPA1 pela BK ocorre através do aumento
de cálcio intracelular mediado pela PLC e pelo influxo de cálcio
através de TRPV1 (NASCIMENTO, 2014).
3.4.1 Dor por envenenamento
Os venenos podem ser compostos de catecolaminas, aminas
vasoativas (histamina, serotonina), BK,
colagenases, hialuronidases, proteases, fosfolipases,
fibrinolisinas, dermoneurotoxinas, cardiotoxinas, miotoxinas,
nefrotoxinas, neurotoxinas e antígenos (FRY et al., 2007). Estas
substâncias podem interagir diretamente com as
terminações nervosas sensoriais, como já mostrado na figura 5,
desencadear a liberação de agentes pró-álgicos
intracelulares, causar alterações no transporte de íons e ter
ação cardiotóxica, neurotóxica, hepatotóxica e
demonecrosante (HADDAD e BARREIROS,2007).
Da mesma forma, de acordo com o Manual de Toxicologia clínica
(2014), toxinas podem ter o efeito
paralisante e anticoagulantes, e produzir dor por rigidez
muscular ou choque hemorrágico, respectivamente. Com
base nos eventos celulares e moleculares envolvidos, há
liberação de células inflamatórias que agem na
sensibilização dos nociceptores (QUEIRO; CALDAS, 2011).
file:///C:/Users/mariza/Downloads/(adaptadofile:///C:/Users/mariza/Downloads/(adaptado
-
23
Por outro lado, efeitos vasculares também podem explicar muitos
dos eventos envolvidos na resposta
inflamatória e, por consequência, na nocicepção. A liberação de
mediadores inflamatórios, além de estimular vias
nociceptivas possuem efeitos diretos sobre vasos, causando
aumento da permeabilidade vascular e vasodilatação.
Por exemplo, substâncias presentes no veneno da aranha-marrom
(Loxosceles intermedia) causam vasodilatação
e aumento da permeabilidade vascular (RATTMANN et al., 2008), o
que contribui para a resposta inflamatória
existente no local da picada.
A dor serve como um sistema de alerta primário fisiológico,
permitindo que um organismo responda e
reaja a estímulos potencialmente perigosos. Alguns venenos podem
produzir uma hipersensibilidade sem provocar
danos teciduais significativos, uma vez que estimulam
diretamente os neurônios somatosensoriais (MEBS, 2002).
Aos predadores, essas toxinas produtoras de dor desencadeiam uma
desagradável e memorável experiência
sensorial.
Nos últimos anos, como mostra a figura 8, venenos e toxinas se
revelaram como novas estratégias
farmacológicas e de mecanismos bioquímicos para manipular
receptores específicos e controlar a função celular.
De 1990 a 2015, houve um aumento exponencial no número de
publicação científicas abrangendo tanto o veneno
e/ou toxina, e dor (A., TRIM; TRIM, 2013).
Figura 8: Número de publicações indexadas no Pubmed utilizando
os descritores “toxin/venom and pain”.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
1947
1950
1960
1970
1980
1990
2000
2010
2016
Nú
mero
de p
ub
licaçõ
es
Fonte: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
As toxinas derivadas de veneno podem produzir dor a partir da
ativação de vias nociceptivas, especificamente através da ativação
do receptor TRPV1 ou canais de íons sensíveis a ácido (ASICs) ou
ativar
diretamente as terminações nervosas sensoriais no local de
envenenamento, gerando potenciais de ação que
propagam os sinais iniciados por elas para áreas de
processamento da dor na medula espinhal e no cérebro
(BASBAUM et al, 2009).
As principais indicações dos entrevistados contra os sintomas
dos acidentes (água do mar, 17% e vinagre,
14%), estão de acordo com vários autores, que recomendam a
utilização de água do mar gelada para lavar o local
e a aplicação de ácido acético 5% (vinagre) para impedir a
descarga dos nematocistos a maioria dos acidentes é
controlada por analgesia obtida pelo uso de uma ampola de
dipirona por via intramuscular e compressa de água
do mar gelada ou cubos de gelo recobertos aplicados na pele
(HADDAD JR., 2000).
3.5 Ação do veneno sobre outros sistemas
Apesar das atenções acerca dos efeitos atribuídos às toxinas
liberadas pela P. physalis estarem voltadas
para o processo doloroso e inflamação, substâncias isoladas de
organismos vivos têm se mostrado capazes de atuar
sobre o funcionamento de outros sistemas. Os eventos gástricos
também fazem parte dos sintomas desencadeados
após contato com animais venenosos, a exemplo de relatos de
náusea, mal-estar e vomito; no teor de componentes
da secreção gástrica foram identificadas após contato com veneno
de escorpião amarelo Tityus serrulatus.
Este exerce o seu efeito através da despolarização de
terminações do sistema nervoso autônomo pela
abertura dos canais de Na+, liberando mediadores químicos
(acetilcolina, catecolaminas, peptídeos) os quais são
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhttp://www.controlarambiental.com.br/Escorpiao%20Amarelo%20Tityus%20serrulatus.html
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24
responsáveis por aumentar substancialmente a secreção de
glândulas exócrinas do trato gastrointestinal,
principalmente glândulas salivares, estômago e pâncreas (NOVAES
et al., 2002). Melo Jr et al., (1983), ao injetarem a Tityustoxina
(TsTX), outra toxina conhecida do escorpião amarelo
Tityus serrulatus em ratos observaram aumento no volume de
secreção gástrica, produção de ácido e pepsina do
suco gástrico e uma diminuição significativa no pH. Os autores
atribuíram os efetos da TsTX à libertação de
mediadores químicos das fibras nervosas autonômicas
pós-ganglionares estimuladas por vias muscarínica e
receptores histaminérgicos H2.
Estudos experimentais mostraram que a injeção do veneno total de
escorpião amarelo e toxinas
purificadas também causar salivação profusa, aumento da secreção
gástrica e pancreática, lesões de mucosa
gástrica e pancreáticas agudas, bem como distúrbios da
motilidade intestinal (BUCARETCHI et al., 1999).
Os eventos motores, secretores e absortivos do trato
gastrointestinal (TGI) possibilitam controlar a
motilidade e a velocidade de trânsito da digestão humana, assim
como as várias secreções do TGI. Com isso
permite com que as enzimas digestivas sejam secretadas e
ativadas, realizando ação sobre os nutrientes, no
momento certo, nas quantidades adequadas e em um meio com pH
ideal (GUYTON; HALL, 2011).
O estômago possui mecanismos de proteção contra agentes
agressores. Entre os principais estão os
secretados no lúmen, como ácido, muco, bicarbonato e
antibacterianos. A defesa da camada mucosa do estomago
é constituída de muco e bicarbonato, que tem como função evitar
o contato do ácido clorídrico com as células do
epitélio. A camada de muco aderida à mucosa gástrica protege o
epitélio contra o ácido, a pepsina e outros fatores
necrotizantes. O muco forma um revestimento sob as células
superficiais da mucosa gástrica. O suco gástrico
normal é uma mistura das secreções parietais (ácido e fatores
intrnsecos) e não parietais (muco, bicarbonato, Na+,
K+ e pepsinogênio) (GUYTON; HALL, 2011).
Os mediadores acetilcolina, gastrina e histamina são conhecidos
por estimularem a secreção de ácido
clorídrico no estômago (RODRIGUES et al, 2005). A presença de
ácido clorídrico mantém o pH entre 0,9 e 2,0 e
garante a ação do pepsinogênio em sua atividade proteolítica. Em
conjunto, quando os mecanismos homeostáticos
estão prejudicados, o volume e a acidez gástrica podem aumentar
desproporcionalmente, superando assim as
defesas da mucosa gástrica, levando a formação de úlcera
duodenal, úlcera gástrica e doença do refluxo gastro-
esofágico (TWARDOWSCHY, 2007).
http://www.controlarambiental.com.br/Escorpiao%20Amarelo%20Tityus%20serrulatus.htmlhttp://www.controlarambiental.com.br/Escorpiao%20Amarelo%20Tityus%20serrulatus.html
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25
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 (pesando entre
20 e 28 g, com idades de 2 a 5
meses de idade) machos e camundongos Swiss fêmeos (estes últimos
utilizados exclusivamente para os testes de
ligadura de Piloro) criados no Biotério Central da Universidade
do Vale do Itajaí. Os animais foram mantidos em
ambiente com temperatura e umidade controladas (22 ± 1 °C, 60 a
80% de umidade), em ciclo 12 h claro/12 h
escuro, com água e ração fornecidos ad libitum. Os experimentos
foram conduzidos de acordo com as diretrizes
atuais de cuidados com os animais de laboratório e com as
diretrizes éticas para investigações de dor experimental
em animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983). Todos os experimentos
foram aprovados pelo Comitê de ética
de uso de animais (CEUA) da Universidade do Vale do Itajaí, sob
o protocolo 011/14.
4.2 Reagentes
O veneno MLU_080047 foi adquirido da Bachem AG (Geneva, Suiça).
Os seguintes fármacos foram
usados: [Des-Arg9]-Bradicinina (DALBK) (Tocris - Inglaterra);
Meloxicam (Eurofarma, Brasil); Dexametasona
(Achê, Brasil); Indometacina (Farmacia UNIVALI, Brasil);
Omeprazol (Medley, Brasil); D-Arg-L-Arg-L-Pro-
LHyp-Gly-L-(2-tienil)Ala-L-Ser-D-1,2,3,4
tetrahidro3isoquinolinocarbonil-L-(2α,3p,7ap)-octa-hidro-1H-indole-
2-carbonil-L-Arg (HOE 140); Sal de maleato de
N-(4-metoxifenil)metil-N',N'-dimetil-N-(2-piridinil)-1,2-
etanodiamina (Maleato de pirilamina);
N-(3-Methoxifenil)-4-clorocinnamida (SB-366791);
1,2,3,6-Tetrahidro-
1,3-dimetil-N-
[4-(1-metiletil)fenil]-2,6-dioxo-7H-purina-7-acetamida,
2-(1,3-Dimetil-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetra-
hidro-7H-purin-7-il)-N-(4-isopropilfenil)acetamida (HC030031) e
Capsaicina obtidos da Sigma-Aldrich, EUA.
Kit de citocinas, EUA,mrIL-1β, mrTNF (R&D Systens,
Minneapolis, MN).
4.3 Avaliação da nocicepção espontânea
Os animais passaram por um período de ambientação de 1 h por 7
dias consecutivos nas câmaras de
observação. No momento do experimento os animais foram injetados
com o veneno e o tempo dispendido pelo
animal lambendo ou mordendo a pata foi considerado como índice
de nocicepção. Os camundongos receberam
uma injeção intraplantar (i.pl.) de 10 µL de PBS contendo
MLU_080047 em diferentes concentrações (0,01 a 10
ng/pata), e a nocicepção espontânea foi avaliada por 1 h,
extraindo os dados de 5 em 5 min.
4.4 Avaliação do limiar mecânico
Os animais foram colocados individualmente em compartimentos de
acrílico transparente individuais (9
X 7 X 11cm) localizados em uma plataforma de arame elevada.
Inicialmente, a frequência de resposta de retirada
da pata posterior direita foi obtida através de 10 aplicações
sequenciais do filamento de von Frey 0,6 g (VFH,
Stoelting, Chicago, USA). Anotadas as frequências, os animais
que obtiveram frequência de resposta menor que
50% foram estimulados com filamentos com gramaturas maiores, em
escala logarítmica (1, 1,4, 2 e 4 g), de forma
crescente até obter-se 50% ou oi mais de resposta de retirada.
Caso a frequência de retirada com o filamento de
0,6 g tenha sido maior que 50%, o mesmo passa a ser estimulado
com filamentos de menor gramatura (0,07, 0,16
e 0,4 g) até obter 50% de resposta). O filamento com o qual o
animal respondeu no mínimo 50%, seguindo o
método descrito acima, representou o limiar mecânico. (Ex: 50%
resposta com filamento 0,6 g = limiar 0,6 g)
(COBOS et al., 2012).
-
26
4.5 Análise do limiar térmico
A técnica utilizada foi primeiramente descrita por Hargreaves et
al. (1988), sendo que a intensidade do
feixe luminoso foi adequada para não causar a retirada da pata
dos animais controle num intervalo mínimo de
tempo de 15 segundos. Os animais foram colocados em uma câmara
de acrílico com fundo e lados transparentes
(Plantar Test, Ugo Basile, modelo 7371), onde permaneceram
durante 30 minutos antes do teste. Decorrido o
tempo de adaptação dos animais ao ambiente, um feixe de luz
previamente estabelecido foi incidido abaixo do
fundo transparente e posicionado sob a pata direita traseira dos
animais. A sensibilidade térmica foi caracterizada
pelo tempo que o animal levou para retirar a pata em um tempo
máximo de 20 segundos. Todos os grupos de
animais foram submetidos à habituação prévia no equipamento por
no mínimo uma semana em ambiente
iluminado com luz vermelha. Os mesmos foram avaliados para o
estabelecimento do limiar térmico basal de
retirada da pata e novamente reavaliados em diferentes tempos
após a injeção do veneno.
4.6 Avaliação da resposta edematogênica
Os camundongos receberam por via i.pl. na pata posterior direita
uma injeção de 10 µL de PBS contendo
MLU_080047 em diferentes concentrações (0,1 ng/pata, 1,0 ng/pata
ou 10 ng/pata). A pata posterior contralateral
recebeu o mesmo volume de PBS e foi utilizada como controle. O
edema de pata foi avaliado utilizando o
pletismômetro (Ugo Basile, Italy) e expresso em microlitros como
a diferença entre as patas posteriores direitas e
esquerdas (TRATSK et al., 1997).
4.7 Análise dos mecanismos envolvidos na resposta
nociceptiva
Para avaliar o possível envolvimento de cininas na resposta
nociceptiva causada pelo veneno
MLU_080047, grupos separados de camundongos foram tratados com
antagonista não peptídicos seletivo para os
receptores B1 DALBK (20 nmol/pata) e B2 de cininas, HOE 140
(0,01 nmol/pata e 10 nmol/pata) ou, co-
administrados com o veneno por via i.pl. (BÉLICHARD et al.,
2000).
O possível envolvimento da ciclooxigenase-1 ou -2 (COX-1 ou
COX-2) foi avaliado pelo tratamento de
animais com indometacina (100 µg/pata; inibidor seletivo para
COX-1) (VILLARREAL et al., 2013) e o
meloxicam (2 mg/kg, inibidor seletivo da COX-2) 30 min antes do
teste (PASZCUK et al., 2008). O tratamento
com dexametasona (0,5 mg/kg) foi realizado para evidenciar a
importância da síntese de proteínas, onde os animais
foram pré-tratados por via s.c. 4 h antes do teste.
Para avaliar o possível envolvimento dos TRPs nas respostas do
veneno, os animais foram pré-tratados
por via s.c., 30 min antes da injeção do veneno, com o SB366791
(500 μg/kg) (antagonista seletivo dos receptores
TRPV1) (PASZCUK al., 2007) ou co-administrados com HC-030031
(35mg/ml) (antagonista seletivo dos
receptores TRPA1) e o veneno por via i.pl (PASZCUK, et al.,
2008). Foi testado também o antagonista seletivo
do receptor de histamina H1, pirilamina (10 mg/kg), através do
pré-tratamento por via s.c., 30 minutos antes do
veneno (PASZCUK, 2007).
4.8 Envolvimento das fibras C na nocicepção induzida pelo
veneno
Avaliou-se o efeito do tratamento neonatal de camundongos com
capsaicina na hipersensibilidade induzida
peloveneno MLU_080074. O tratamento de animais com capsaicina no
período neonatal ou mesmo na fase adulta
causa uma destruição de grande parte das fibras C sensíveis a
capsaicina, sendo este efeito o responsável pela
insensibilidade dos animais a substâncias irritantes e também a
outros estímulos nocivos. (GAMSE, 1982). Com
a finalidade de explorar a participação das fibras C na condução
do estimulo nociceptivo, camundongos recém
nascidos, foram tratados com uma injeção subcutânea de
capsaicina (163,7 mol/kg, s.c.;5 mg/ml) no segundo dia
de vida, como descrito anteriormente por Massuyama e Shimizu
(1997). O efeito do veneno MLU_080074 (1,0
ng/pata) foi avaliado utilizando o modelo de hipersensibilidade
mecânica quando os animais completaram oitava
semana de vida. Para a comprovação da depleção das fibras C os
animais neonatais injetados com capsaicina foram
desafiados no teste de limpeza ocular (JI et al., 2013), onde
receberam 20 µL de capsaicina (0,01%) nos olhos e o
número de vezes que os mesmos coçaram os olhos foi quantificado
num intervalo de 1 min. Os animais que
alcançavam valores inferiores a 5 vezes por min foram
considerados aptos para o teste.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0162310999001654http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091305712003176
-
27
4.9 Ensaios bioquímicos
4.9.1 Medida da atividade da MPO
O recrutamento de leucócitos na pata do camundongo foi avaliado
indiretamente por meio da atividade
de MPO nos tecidos (FERNANDES et al., 2005). Para este fim, os
animais receberam uma injeção i.pl. de 10 μL
do veneno MLU_080047 (1,0 ng/pata) na pata direita. Os animais
foram eutanasiados e as amostras de tecido das
patas, medula e nervo ciático foram coletadas 1 e 3 h após a
injeção da toxina. As mesmas foram homogeneizadas
a 5% (p/v) em tampão EDTA / NaCl (pH 4,7) e centrifugadas a
10.000 rpm durante 15 min a 4 °C. O sedimento
foi resuspenso em tampão HTAB a 0,5% (pH 5,4) e as amostras
foram congeladas e descongeladas três vezes em
nitrogênio líquido. As amostras foram centrifugadas (10.000 rpm,
15 min, 4 °C) e 25 μL do sobrenadante foram
utilizados para o ensaio de MPO. A reação enzimática foi
avaliada com 1,6 mM de TMB, 80 mM de PBS (pH 7,2)
e 0,3 mM de H2O2. A absorbância foi medida a 650 nm. Os
resultados foram expressos como a densidade óptica
O.D. por miligrama de tecido.
4.9.2 Análise dos níveis de citocinas
Os níveis de IL-1β e TNF teciduais foram avaliados utilizando o
método previamente descrito por Cunha
et al. (2005). Os animais foram eutanasiados 1 h e 3 h após a
injeção do ven. MLU_080074 e o tecido plantar da
pata posterior direita, nervo ciático e porção lombar da medula
espinhal foram coletados. As amostras foram
imediatamente estocadas a -80 °C. Os tecidos foram
homogeneizados em PBS (pH= 7,4; NaCL 137 mM, KCL 2,7
mM, Na2HPO4 1,5 mM, filtrado a 0,2 mm) contendo NaCL 0,4 M, PMSF
0,1 M, EDTA 10 mM, 0,05 % de tween
20, 0,5 % de BSA e 2 mg/ml de aprotinina. Os homogenatos foram
centrifugados a 3000 g por 10 minutos a 4 °C.
Os níveis de IL-1β e TNF foram medidos através de Kit ELISA, de
acordo com as recomendações do fabricante.
Os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos 2
vezes.
4.10 Avaliação da secreção gástrica
Os animais foram submetidos a jejum (8 h) com livre acesso a
água, e divididos em diferentes grupos
(n=7). Foram anestesiados com uma mistura de xilazina (5 mg/ml)
e cetamina (2 mg/ml) (0,1 ml/10g de peso de
animal) e submetidos a amarração do piloro, como descrito por
Shay et al. (1945). Realizou-se uma incisão
longitudinal abaixo ao processo xifoide, onde o estômago foi
exposto e o piloro amarrado com fio de sutura. A
administração das diferentes doses foi realizada por via
intraduodenal e intraplantal. Os grupos foram: veículo
contendo água destilada, 1 (controle negativo) e veneno
MLU_080047 nas doses de 1,0 ng/sítio e 30 ng/sítio. O
grupo omeprazol (20 mg/kg) (controle positivo) recebeu o
tratamento via oral, 30 minutos antes da ligadura do
piloro. Após os tratamentos, as incisões foram suturadas e
quatro horas após a cirurgia os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical. As incisões foram
reabertas e após pinçamento da válvula cárdia (para
evitar a perda do conteúdo gástrico) o estômago foi retirado. Os
estômagos foram abertos ao longo da curvatura
maior, lavados com 2 ml de água destilada e todo conteúdo
gástrico foi coletado em tubo cônico, centrifugado por
15 min a 5.000 rpm. Após o processamento do suco gástrico,
avaliou-se o pH, volume e acidez total por titulação
com hidróxido de sódio 0,1 N e fenolftaleína como indicador
ácido base. Os resultados foram expressos em ml
(volume), pH e mEq[H+]/ml/4h (acidez total). Estes testes foram
supervisionados pela Profª. Luisa Mota da Silva.
-
28
4.11 Avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica
Os animais foram submetidos ao protocolo de amarração do piloro
anteriormente descrito. O estômago
foi retirado, lavado em salina, pesado, e acondicionado em 2 ml
de solução de Alcian Blue (Alcian Blue 0,02%,
sacarose 0,16 M, acetato de sódio 0,05 M; pH 5,8 a 20 ºC) por 24
horas. A solução de Alcian Blue foi removida,
procedendo a lavagem dos estômagos em 5 mL de solução de
sacarose 0,25 mol/l por 15 min e por 45 min. Após
a remoção da solução de sacarose, solução de cloreto de magnésio
0,5 mol/l foi adicionada a fim de extrair o
corante aderido ao muco do tecido; esta última solução
permaneceu por 2 horas, tendo sido realizado a raspagem
dos estômagos com auxílio de pinças a cada 30 min neste período.
Todo procedimento foi realizado a temperatura
ambiente. Após leve homogeneização do líquido extrator,
transferiu-se 1 ml deste para um tubo cônico, onde igual
quantia de éter etílico também foi adicionado. A mistura foi
agitada em vórtex e centrifugada por 15 min a 3.000
rpm. Posteriormente, 200 µl da fase aquosa foram transferidos
para uma placa de 96 poços em duplicata, a
absorbância foi determinada em comprimento de onda de 598 nm. O
conteúdo de muco foi calculado usando uma
curva padrão de Alcian Blue (6,25–100 μg/ml), e os resultados
foram expressos em μg Alcian Blue/g tecido
(CORNE; MORRISSEY; WOODS, 1974).
4.12 Análise estatística
Todos os resultados são relatados como média ± S.E.M.. As
inibições totais são dadas como a diferença
(em porcentagem) entre as áreas sob a curva tempo-resposta (AUC)
do grupo tratado com fármaco em relação ao
grupo de controle. A comparação estatística dos dados foi
realizada por análise de variância (ANOVA) seguido
de Teste de Bonferroni, ou pelo uso do Teste t de Student
não-pareado, Teste de Dunnett´s e Turkey. Valores de
P inferiores a 0,05 foram considerados significativos. Todas as
análises citadas acima foram realizadas utilizando
o programa GraphPad Instat® ou GraphPad PRISM®.
-
29
5 RESULTADOS
5.1 Avaliação da resposta nociceptiva espontânea e
hipersensibilidade mecânica
Os animais injetados com as doses de 0,1 ng/pata, 1,0 ng/pata e
10 ng/pata não apresentaram
comportamento distinto dos animais injetados com PBS,
evidenciando ausência do comportamento nociceptivo
espontâneo (dados não mostrados), tanto injetando o veneno por
via i.pl., quanto através da instilação do mesmo
sobre a pata. O próximo passo foi avaliar a hipersensibilidade
mecânica induzida pela injeção i.pl. do veneno. A
Figura 9 demonstra que os animais injetados com o veneno da P.
physalis apresentaram hipersensibilidade
mecânica provocando aumento na frequência de resposta de
retirada da pata frente à estimulação com o
monofilamento de Von Frey, com incremento de 144,0 ± 31,0% na
dose de 0,1 ng/pata em relação ao grupo que
recebeu somente PBS.
As doses de 0,3 e 1,0 ng/pata também causaram alteração do
limiar mecânico de retirada da pata, com
respectivamente 93,5 ± 9,9% e 107,1 ± 23,7% de aumento da
sensibilidade em relação ao controle (figura 9A e
B). Esta sensibilização mecânica é mais evidente no intervalo 30
minutos à 1 hora após a injeção do veneno.
-
30
Figura 9: Hipersensibilidade mecânica induzida pelo veneno
MLU_080047.
0
10
20
30
40
50
60
70
PBS (10 L/pata)
P. physalis (0,01 ng/pata)
P. physalis (0,03 ng/pata)
P. physalis (0,1 ng/pata)
P. physalis (0,3 ng/pata)
P. physalis (1,0 ng/pata)
P. physalis (3,0 ng/pata)
P. physalis (10 ng/pata)
P. physalis (30 ng/pata)
tempo (min) tempo (h)
Fre
qu
ên
cia
de
re
sp
osta
(%
)
***
****** ***
***
**
***
*
B 10 20 30 60 1 2 3 4
A
B PBS 0,01 0,03 0,1 0,3 1,0 3,0 10 300
50
100
150
200
250
P. physalis (ng/pata)
***
******
***
AU
C
B
Hipersensibilidade mecânica obtida na pata traseira direita
através da aplicação de VFH 0,6 g de animais injetados com
veneno
MLU_080047 em diferentes doses. Os resultados mostram a média ±
erro padrão da média, n = 10. Com * p
-
31
A partir destes dados foi escolhida a dose de 0,1 ng/pata para
os demais experimentos. O próximo passo
foi determinar, de maneira quantitativa, alteração no limiar
mecânico de retirada da pata. Como demonstrado na
figura 10 (A e B), os animais injetados com veneno P. physalis
na dose de 0,1 ng/pata apresentaram uma redução
significativa do limiar mecânico de retirada da pata, com
redução de 54,39 ± 4,15% em relação ao grupo injetado
com PBS. Essa alteração foi evidenciada já nos primeiros 20 min
com duração máxima de 4 h.
Figura 10: Limiar mecânico de retirada da pata.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
PBS (10 L/pata)
P. physalis (0,1 ng/pata)
Tempo (min) Tempo (min)
*****
****** ***
30 6010 20 2 3 4 6 24
Fre
quência
de resposta
(%
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
PBS (10 L/pata)
P. physalis (0,1 ng/pata)
Tempo (min) Tempo (h)
*** ** ***
*** **
10 20 30 60 2 3 4 6 24
Lim
iar
(g)
0
100
200
300
400
500
***
Basal PBS P. physalis
(0,1 ng/pata)
AU
C
A
B C
Hipersensibilidade mecânica verificada na pata traseira direita,
(A) utilizando o filamento 0,6 g de von Frey, (B) e através do
método up and down, em momentos diferentes. Os resultados
mostram a média ± erro padrão da média, n = 10. Com ** p
-
32
Na continuação da triagem do potencial nociceptivo do veneno
MLU_080047, a hipersensibilidade
térmica ao calor foi verificada, conforme mostra a figura 11.
Atualmente é bem estabelecido que a
percepção térmica esteja relacionada com receptores que
funcionam como sensores de temperatura. O grupo de animais com
injeção do veneno da P. physalis apresentou período de latência (s)
para
retirada da pata de 23,89 ± 6,19%, maior em relação ao controle.
Conforme a figura abaixo, o veneno foi
capaz de diminuir o limiar térmico, diminuindo o período de
latência ou tolerância do animal em sinalizar
o estimulo térmico como nocivo, possivelmente por sensibilização
previa desses receptores participantes
do processo.
Figura 11: Limiar térmico de retirada da pata.
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17 PBS (10 L/pata)
P. physalis (0,1 ng/pata)
Tempo (h)
*****
B 0,5 1 2 3 4 6 24
Latê
ncia
(s)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
**
PBS P. physalis
(0,1 ng/pata)
AU
C
A B
Hipersensibilidade térmica registrada na pata traseira direita
pelo Plantar Teste (Hargreaves) em animais injetados com
MLU_080047 (0,1 ng/pata). Os resultados mostram a média ± erro
padrão da média, n= 10. Significativamente
diferente do grupo de veículos (PBS, 10 uL/pata) * p
-
33
Figura 12: Resposta edematogênica do veneno MLU_080047.
0
10
20
30
40
50PBS (10 L/pata)
P. physalis (1 ng/pata)
P. physalis (0,1 ng/pata)
P. physalis (0,01 ng/pata)
*
0,5 1 2 3 4 6
Tempo (h)
v
olu
me d
a p
ata
(
L)
Resposta edematogênica pela diferença entre as patas posteriores
direitas e esquerda em animais injetados com
MLU_080047 (1,0, 0,1 e 0,01 ng/pata). Os resultados mostram a
média ± erro padrão da média, n= 10.
Significativamente diferente do grupo tratado com veículo (PBS;
10 uL/pata) * p
-
34
Figura 13: Envolvimento do receptor de histamina do tipo H1.
0
1
2
3
4
P. physalis (0,1 ng/pata)
Pirilamina (10 mg/kg s.c.) + P. physalis (0,1 ng/pata)
PBS (10 L/pata)
Tempo (h)
B 0,5 1 2 3 4 6
Lim
iar
(g)
0.0
0.5
1.0
1.5
PBS P. physalis Pirilamina
**
#
Lim
iar
(0-3
0 m
in)
A B
Hipersensibilidade mecânica obtida na pata traseira direita
através da aplicação de VFH 0,6 g de animais tratados com
Pirilamina (A) (10mg/kg s.c.) e animais controle, tratados
somente com o MLU_080047. Os resultados mostram a
média ± erro padrão da média, n = 10. Significativamente
diferente do grupo de veículos (PBS, 10 uL/pata) * p
-
35
No resultado com os animais tratados com HC 030081, um
antagonista do receptor TRPA1, na dose
de 35 µg/pata não se observou diferença significativa em relação
ao grupo controle (figura 15).
Figura 15: Envolvimento do receptor TRPA1.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
P. physalis (0,1 ng/pata)
HC-030031 (35 g/ml s.c.), P. physalis (0,1 ng/pata)
PBS (10 L/pata)
Tempo (min) Tempo (h)
B 10 30 60 1 2 3 4 6
Lim
iar
(g)
Hipersensibilidade mecânica obtida na pata traseira direita
através da aplicação de VFH 0,6 g de animais tratados com
HC-030021 (35 µg/ml) coadministrado com ve
