C2+REACCION+DE+AGLUTINACION+Y+SENSIBILIZACION+José+Paredes.pdf

7/26/2019 C2+REACCION+DE+AGLUTINACION+Y+SENSIBILIZACION+Jos+Paredes.pdf

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Jos Antonio Paredes Arrascue

Dr. (c), Mg., Lic. en Tecnologa Mdica

Profesor Asociado de la Facultad de Medicina

U.N.M.S.M.Tecnlogo Mdico del Servicio de Medicina Transfusional

H.N.E.R.M. - EsSalud


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Reaccin de Aglutinacin y sensibilizacin.

Uso de potenciadores.

Efecto de las enzimas sobre la membrana

de los hemates.


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Se trabajaron pruebas inmunolgicas antes que se

estableciese la inmunologa

Aglutingeno Aglutininas


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El protocolo completo de la prueba de compatibilidad es

una revisin de la evolucin de la prueba en s.

CI TA

ALB

370

C Coombs


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Fases de la Aglutinacin

1ra fase: Sensibilizacin

Temperatura

Tiempo 2da fase: Acercamiento entre clulas (Aglutinacin

propiamente dicha)


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Teora de los puentes


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Anticuerpos aglutinantes y no aglutinantes

Por lo general IgM : aglutinantes,

IgG: no aglutinantes.

Ej. Aglutinantes IgM anti A

NO aglutinantes IgG anti D

NO es una regla: IgG anti A,B: aglutinantes

IgM anti Jka: no aglutinante


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Tamao comparativo

IgG 14 nm

Potencial Z 25 nm

IgM 35 nm

Glbulo Rojo 7,2 um 7 200 nm


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Potencial Zeta


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Considerando la carga elctrica del glbulo rojo , la

fuerza inica del medio de la suspensin () y la

constante dielctrica del medio (D), Pollack desarroll lasiguiente expresin del potencial zeta (Z):

Z = f[, 1/D, 1/]

o sea, la diferencia del potencial zeta es una funcin quevaria directamente con la electronegatividad de lamembrana eritrocitaria () e inversamente con la

constante dielctrica del medio de suspensin (D) y conla raz cuadrada de su fuerza inica ().


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COOH-


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COOH-COOH-

COOH-COOH-

COOH-COOH-COOH-

COOH-COOH-COOH-COOH-

COOH-COOH-

COOH-COOH-

Na+Cl-


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COOH-COOH-

COOH-COOH-

COOH-COOH-COOH-

COOH-COOH-COOH-COOH-

COOH-COOH-

COOH-COOH-

Na+Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Na+

Na+

Na+

Na+Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

D

+ ++ + + + +

++ _++

++ + +_ _ ++

+ + +_ _


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-

COOH

- COOH

- COOH

-

COOH-

COOH

-

COOH

-

COOH

-

COOH

-COOH

-

COOH

-

COOH

-

COOH

++ +

+ + + +++ + +

+

++

++

++

++

+

+++

+

++

++

+++

+

+ +

+++ + +

+

++

++

+

+++

++

++

+

++

++

+++

+

+

+

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+

++ _+

+

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+

_

++

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++

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+ +

+ +

+_ _

_++

+

+

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+

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_

_

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+

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+

+

+

+

+

+

++

++

+++

+

+ +

++

+

+

+

+ +

++

+ +

+

++

+

+

+ +

+

+

_

__

_

_ _ _

__

_

_

_

__

__

_ _

_

__

_

_


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La nube de iones positivos que involucra cada glbulo, se

vuelve menos densa mientras se aleja del glbulo. Ladiferencia de potencial elctrico creada entre la doble

capa de iones positivos (Na+) cerca del glbulo y elmedio con iones de sodio y cloruro en equilibrio(neutro), se llama Potencial Zeta.


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Potencial Zeta crtico y clases de


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Potencial Zeta crtico y clases de

Anticuerpos

POTENCIAL Z

(mV)

-23 Aglutinacin imposible a partir de este punto

- 18 a 23 Potencial Z critico para IgM

-15 Potencial Z de una suspensin de GR en (SSF)

-8 a -10 Potencial Z crtico para IgG

-7 Aglutinacin inespecfica por debajo de este punto

Fuente: Rouger P., Salmon C.; La pratique de lagglutination des Erytrocites et du test

de Coombs


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Procedimientos ms importantes bajo la ecuacin de

Pollack para reducir el potencial zeta:

Tratamiento de los glbulos rojos por enzimas

proteolticas:

Adicin de substancias macro-moleculares Cambio de la fuerza inica del medio

Prueba de la antiglobulina humana o prueba de Coombs:


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+++++ +++

++

+ ++ ++++ + + +++ +

+++ ++++ + + ++ ++++

+ + +++ +

+++ ++++ + + ++ ++++ + ++ ++


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+++++ +++

++

+ ++ ++++ + + +++ +

+++ ++++ + + ++ ++++

+ + +++ +

+++ ++++ + + ++ ++++ + ++ ++


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++++ ++++ +

+ ++ ++++ + ++ +

++ ++++ + + ++ ++++

++ +

++ ++++ + + ++ ++++ ++


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NH2 NH2

++

+++ ++++ + +++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++


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++

+++ ++++ + +++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++


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++

+++ ++++ + +++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++ ++++ +++ + + ++ ++++ + +

+ ++


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++

++ + + +

++ ++++ + ++ + +

++ + + + ++ ++++ + ++ + +

+++ ++ + ++ ++++ + ++ ++


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POTENCIADORES


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Adicin de sustancias macromoleculares

Pollack: primero en ofrecer un modelo plausible deaglutinacin en medio macromolecular: papel de laconstante dielctrica del medio (D).

Albmina, dextran, ficol, PEG y otras (macromolculashidrosolubles), poseen un extremo positivo (amnico) yotro negativo (carboxlico), cuando son aadidas al mediode suspensin de los glbulos rojos se polarizan en elcampo elctrico (aumenta su constante dielctrica: D) son

atradas para cerca de los glbulos neutralizando suscargas negativas y promoviendo la dispersin de ionespositivos (Na+) cerca de ellos. La disminucin de este

escudo de cargas positivas, baja el valor del potencial zetay disminuye la fuerza de repulsin interglobular.


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Albmina Srica Bovina

Las soluciones de albmina bovina ejercen un efecto

potenciador gracias a que aumentan la constantedielctrica del medio en el que se hallan los hemates y

los anticuerpos; esto tiene como resultado la disminucindel potencial Z y, en consecuencia disminuye, tambin larepulsin electrosttica existente entre los hemates

cuando se hallan en suspensin en un medio salino.


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Albmina Srica Bovina

Concentraciones ms empleadas: 30%, 22%, 6%, 3% (ms

usada en microplaca).

La temperatura ms adecuada para la conservacin de lassoluciones de albmina es de 4C. Adems, para evitar la

contaminacin bacteriana se utiliza la azida sdica (N3Na)al 1: 1 000.


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--

-

--

-

-

-

- -++ +

+

+ ++++

+

++

+++ ++++ + +++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++


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+

+ +

+

+

---

-

-

-

--

- -++ + +

+ +++

+

+

++

++

+

+


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LISS (Low ionic Strength Saline)

Solucin de baja fuerza ionica (sbfi)

Li


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Liss

La carga de iones positivos y negativos que poseen esinferior a la que contiene la solucin salina fisiolgicanormal, por ello, la interaccin de los iones del medio

dificulta menos las uniones antgeno/anticuerpo(sensibilizacin de los hemates) permitiendo tiempos deincubacin ms cortos


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++

+++ ++++ + +++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++ ++++ ++++ + + ++ ++++ + +

+ ++

SSF

0.85% LISS0.2%


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++

+++ + + +

+ ++ + ++ ++

+++ + + + ++ + ++ ++ +

+++ ++ + + ++ + ++ ++

SSF

0.85% LISS0.2%


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++

+++ + + +

+ ++ + ++ ++

+++ + + + ++ + ++ ++ +

+++ ++ + + ++ + ++ ++

SSF

0.85% LISS0.2%

LISS


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LISS

Low Ionic Strength Saline 0.2 % ClNa, glucosa al 7%

Aumentan la cintica de la reaccin antgeno anticuerpo con loque reducen el periodo de incubacin:

Incrementa la captacin de Anticuerpos por Ag Incrementa la velocidad de asociacin Ag-Ac.

Disminuye el tiempo de incubacin.

Posibilita detectar anticuerpos dbiles que no puedendetectarse por otros medios.

Formacin de aglutinados ms fuertes que los producidos con

otras tcnicas Puede potenciar anticuerpos fros.


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POLYBRENE

Polybrene


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Polybrene

Es un policatin (polmero positivamente cargado)de amonio cuaternario (bromuro deexadimetrina) en cuya presencia, en baja fuerzainica y a pH bajo, los hemates normales agreganespontneamente, la cual puede ser disgregada

mediante citrato de sodio, Si los hemates estnsensibilizados esta aglutinacin persiste

Esto puede deberse a la neutralizacin de la carga negativa

aportada por los residuos de Acido silico, que sefundament en la observacin que el Polybrene no afecta alas clulas que les falta el cido silico (por causas genticaso por tratamiento con Enzimas).

Polybrene


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Polybrene

Otra explicacin para la agregacin inducida por estepolicatin es que la asociacin de las macromolculas conmolculas cargadas en la membrana celular expulsa a las

molculas de agua que forman la capa de hidratacin.

Problemas con deteccin de Anti Kell


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++

+++ + + +

+ ++ + ++ ++

+++ + + + ++ + ++ ++ +

+++ ++ + + ++ + ++ ++

SSF

0.85% LISS0.2%


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++

+ + +

+ +

+ + + +++ + + +

LISS0.2%

PEG


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Polmero linear que desplaza al diluyente, por lo que aumenta laconcentracin de Anticuerpo.

PEG especialmente en un medio de baja fuerza inica, agregalos hemates y aumenta la sensibilidad de las tcnicas dedeteccin de anticuerpos, consiguiendo la disminucin deltiempo de incubacin. Tiene una sensibilidad y especificidadsuperior a la Albmina.

Lectura solo en fase de Antiglobulina, no se debe efectuarlectura despus de la incubacin a 37C.

Reacciones inespecficas con Antiglobulina humanapoliespecfica

PEG


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Aumenta la sensibilidad de la prueba para la deteccin deAc clnicamente significativos mediante la Prueba

Antiglobulina indirecta

Empleada como aditivo, mejora de manera espectacular lasensibilidad de las pruebas de deteccin. La mayora de las

anticuerpos IgG se pueden detectar a niveles de potencia

ms bajos que por mtodos convencionales.

Puede requerir mayor nmero de lavados antes de aadir

la Antiglobluina.


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Tratamiento por Enzimas

proteoliticas

Tratamiento por enzimas proteolticas


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p p

Descritas en 1946 por Pickles: son capaces de retirarde la superficie del hemate fragmentos polipeptdicos

de las glicoprotenas de membrana, tales como elcido silico (disminuyen ) y por consiguiente

disminuyendo el Potencial Zeta permitir un mayor

acercamiento de los hemates facilitando suaglutinacin por los anticuerpos de tipo IgG.

De esa manera los hemates pueden ser aglutinados

por anticuerpos de clase IgG (no aglutinantes), comoIgG anti-Rho(D), en medio salino.

Tecnicas enzimticas


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Las enzimas mas utilizadas: bromelina, papana y ficina

Aumentan la sensibilidad de deteccin de algunos

antgenos ( Rh, Kidd)

Destruyen antgenos de la membrana eritrocitaria ( M, N,

S, Fy)

Incrementan la deteccin de anticuerpos fros Las pruebas para la investigacin de anticuerpos mediante

enzimas proteolticas son muy sensibles para

determinados anticuerpos pero tienden a dar resultadosfalsos positivos, por ello los anticuerpos reactivos solocon enzimas no suelen tener significacin clnica.


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Tripsina Primera enzima descrita, da

muchos falsos positivos. Las clulastratadas con tripsina son especialmente

sensibles a la hemlisis, sobre todo enpacientes con enfermedad de aglutininas

fras.

Ficina


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Se obtiene desecando el ltex de la higuera.La ficinaen polvo produce, en muchas personas erupciones

cutneas, y si accidentalmente penetra en un ojo,puede producir lesiones graves. Las clulas tratadas

con ficina dan con frecuencia resultados positivos

falsos, por lo que se recomienda trabajar concontroles positivos y negativos. Debe usarse slo

para pretratar las clulas, ya que an no se han

descrito mtodos de un solo paso para esta enzima.

Papaina


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Obtenida de la papaya, se utiliza mucho porque renelas propiedades de una adecuada sensibilidad juntocon una buena selectividad. Como sucede con todaslas Enzimas, si las clulas se tratan por exceso conpapaina se produce falsas reacciones positivas, perono tan frecuentemente como con la tripsina o laficina. Puede usarse para pretratar clulas o, cuandose activa con la l-cistena, para tcnicas de una sola

fase. Es especialmente til para detectar anticuerposdel sistema Rh.

Bromelina


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Se obtiene del tronco de la pia, se emplea en tcnica deuna sola fase. Las clulas tratadas con esta enzima

detectan la mayora de anticuerpos del sistema Rh sinmostrar sensibilidad a la cantidad de aglutina fra que

normalmente hay en el suero.

Eficacia en la eliminacin del Acido silico: Ficina >

papaina > bromelina > tripsina

Modificaciones del Potencial Zeta (Z) y de la carga

elctrica del hemate () por el tratamientoi ti


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enzimtico

HematesPotencial

(Z)(mV)

Carga Elctricadel hemate

(x 103ues/cm2)

% dereduccin de

(z) y ()

No tratados - 19,6 - 3,27 0.0Tripsina - 15,6 - 2,59 24.4Bromelina - 14,1 - 2,35 28.1Papana - 10,1 - 1,68 48.0Ficina - 9,00 - 1,51 53.9Adaptacin de: P. Rouger, y C. Salmon; La Pratique delAgglutination des rythrocytes et du Test de Coombs

Tratamiento por enzimas proteolticas


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Es importante sealar que ciertos gruposantgenos de grupo sanguneo son destruidos o

inactivados por el tratamiento enzimtico: M, N, S,s, Fya, Fyb, Xga.

Esta inactivacin exacerba la presencia de los

determinantes antignicos residuales, pudiendo provocarefectos no deseados de aumento de reactividad de

anticuerpos sin importancia clnica


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