BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓWztibsl.ch.pw.edu.pl/3wm/upl/1361989118.pdf · 3 Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW W środowisku silnie kwasowym aminokwasy wyst ępuj

1

Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW

ĆWICZENIE 1

BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓW

1.1. AMINOKWASY BIAŁKOWE

Aminokwasy są związkami organicznymi zawierającymi co najmniej jedną grupę

karboksylową -COOH oraz co najmniej jedną grupę aminową -NH2. W zależności od położenia

grupy aminowej względem karboksylowej wyróżniamy α-, β- i γ-aminokwasy. W przyrodzie

występuje ponad 300 różnych aminokwasów, ale tylko 20 z nich wchodzi w skład białek (tzn. są

kodowane w kodzie genetycznym). Wszystkie aminokwasy białkowe są α-aminokwasami,

w których grupa aminowa znajduje się przy atomie węgla bezpośrednio sąsiadującym z grupą

karboksylową (tzw. atomie węgla α). Wyjątek stanowi prolina, która posiada grupę aminową

wbudowaną w pierścień. Aminokwasy niebiałkowe także często pełnią istotne funkcje biologiczne

np. β-alanina wchodzi w skład koenzymu A, a kwas γ-aminomasłowy jest neuroprzekaźnikiem.

Ciekawym aminokwasem niebiałkowym, który powstaje w wyniku modyfikacji istniejącego

łańcucha polipeptydowego jest hydroksyprolina występująca w niektórych białkach

(np. w kolagenie). Ogólna struktura α-aminokwasów oraz przykładowe β- i γ-aminokwasy zostały

przedstawione na rys 1.1.

Rys. 1.1 Aminokwasy

Wśród białkowych aminokwasów tylko glicyna (R = H) jest achiralna. Wszystkie pozostałe

aminokwasy mają cztery różne podstawniki przy węglu α (asymetrycznym), są zatem cząsteczkami

chiralnymi, mogącymi występować jako enancjomery określane umownie jako L i D (projekcja

Fischera). Wszystkie chiralne aminokwasy białkowe należą do szeregu L (wyjątek stanowi prolina).

Z punktu widzenia konfiguracji absolutnej (projekcja Newmana wg zasady Cahna, Ingolda i Preloga)

wszystkie aminokwasy mają konfigurację (S) (z wyjątkiem (R)-cysteiny) (rys. 1.2). Chiralne

aminokwasy wykazują czynność optyczną, czyli skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego o pewien

2


kąt, charakterystyczny dla danego aminokwasu. Znak skręcalności ((+) lub (-)) jest jedyną wielkością,

która pozwala rozróżnić enancjomery danego aminokwasu, ponieważ wszystkie pozostałe właściwości

fizyczne i chemiczne są identyczne.

Rys. 1.2. Konfiguracja aminokwasów na przykładzie alaniny

L-aminokwasy, zależnie od zdolności organizmu do syntezy, dzieli się na endogenne oraz

egzogenne. Człowiek może syntezować jedynie część podstawowego zestawu aminokwasów, które są

nazywane aminokwasami endogennymi. Pozostałe (egzogenne) muszą być dostarczane

z pożywieniem. Są to walina, leucyna, izoleucyna (o rozgałęzionych łańcuchach bocznych),

fenyloalanina, tryptofan (zawierające pierścień aromatyczny), lizyna, treonina i metionina, a u dzieci

także histydyna i arginina. D-aminokwasy występują w stanie wolnym, ścianie komórkowej bakterii oraz

w antybiotykach peptydowych i są nieprzyswajalne przez zwierzęta i człowieka.

Właściwości chemiczne aminokwasów wynikają z jednoczesnej obecności dwóch grup

funkcyjnych – aminowej i karboksylowej. Powoduje to, że aminokwasy są związkami

amfoterycznymi, czyli mogą reagować zarówno jak kwasy i jak zasady. W roztworach wodnych

cząsteczki aminokwasów występują w formie niezjonizowanej tylko w ilości 0,1%, natomiast reszta

cząsteczek to jony. Sumaryczny ładunek cząsteczki aminokwasu zależy od pH środowiska.

W roztworach wodnych występuje równowaga kwasowo–zasadowa pomiędzy kationem i anionem

oraz jonem obojnaczym (zwitterionem) powstałym w wyniku oddziaływania grup funkcyjnych

w obrębie tej samej cząsteczki (rys. 1.3).

Rys. 1.3. Równowaga kwasowo-zasadowa

3


W środowisku silnie kwasowym aminokwasy występują jako kationy, w środowisku silnie

zasadowym – jako aniony. Stałe równowagi (pKa) tych przemian są charakterystyczne dla

poszczególnych aminokwasów. Dodatkowo aminokwasy zasadowe i kwasowe określa się także pKa

grup bocznych. Istnieje także takie pH roztworu w którym ładunek sumaryczny cząsteczki jest równy

zeru, a aminokwas występuje w formie jonu obojnaczego. Takie pH nosi nazwę punktu

izoelektrycznego (pI). Wartości pI dla większości aminokwasów białkowych są bliskie 6.

W przypadku aminokwasów posiadających dodatkowe grupy aminowe lub karboksylowe punkt

izoelektryczny ulega przesunięciu z uwagi na dodatkową jonizację tych grup (tabela 1.1). Stałe

dysocjacji i wartość punktu izoelektrycznego wyznacza się przez miareczkowanie roztworami

silnych kwasów i zasad.

Tabela 1.1. Przykładowe wartości pI i pKa aminokwasów

aminokwas pI pKa1 pKa2 pKa gr. bocz.

Ala 6,02 2,35 9,87

Leu 5,98 2,33 9,74

Ser 5,68 2,19 9,21

His 7,74 1,80 9,33 6,04

Arg 10,76 1,82 8,99 12,48

Lys 9,74 2,16 9,06 10,54

Asp 2,87 1,99 9,90 3,90

Glu 3,22 2,10 9,47 4,07

Stosuje się różne kryteria klasyfikacji aminokwasów. Biorąc pod uwagę budowę łańcuchów

bocznych aminokwasy możemy podzielić na: alifatyczne obojętne, alifatyczne

hydroksyaminokwasy, siarkowe, zasadowe, kwasowe i ich monoamidy oraz aminokwasy

z pierścieniem aromatycznym. Poza wymienionymi grupami podziału znajduje się pozbawiona

łańcucha bocznego glicyna.

1.1.1. Aminokwasy alifatyczne obojętne

Do tej grupy należą: alanina, walina, leucyna, izoleucyna oraz prolina, których wzory

strukturalne przedstawione są na rys. 1.4. Aminokwasy te zawierają alifatyczny, niepolarny, a zatem

hydrofobowy łańcuch boczny (R).

4


Rys. 1.4. Aminokwasy alifatyczne obojętne

1.1.2. Alifatyczne hydroksyaminokwasy

Alifatyczne hydroksyaminokwasy to seryna i treonina (rys. 1.5.). Ich łańcuchy boczne są neutralne

(pozbawione ładunku) i polarne dzięki obecności grupy hydroksylowej.

Rys. 1.5. Alifatyczne hydroksyaminokwasy

1.1.3. Aminokwasy siarkowe

Do aminokwasów siarkowych (rys. 1.6.) należą: cysteina (zawierająca grupę tiolową SH)

i metionina (zawierająca grupę tiometylową SCH3). Cysteina pod wpływem łagodnych czynników

utleniających dimeryzuje do cystyny (Cys)2 z utworzeniem wiązania disiarczkowego.

5


Rys.

1.6. Aminokwasy siarkowe

1.1.4. Aminokwasy zasadowe

Aminokwasami zasadowymi (rys. 1.7) są: lizyna (zawierająca na końcu łańcucha bocznego

grupę aminową), arginina (zawierająca grupę guanidynową) oraz histydyna (posiadająca silnie

zasadowy pierścień imidazolowy).

Rys. 1.7. Aminokwasy zasadowe

1.1.5. Aminokwasy kwasowe i ich amidy

Do aminokwasów kwasowych (rys 1.8.) zalicza się kwas asparaginowy i kwas glutaminowy.

W łańcuchach bocznych tych aminokwasów znajduje się dodatkowa grupa karboksylowa. Amidami

kwasów asparaginowego i glutaminowego są asparagina i glutamina.

6


Rys. 1.8. Aminokwasy kwasowe i ich amidy

1.1.6. Aminokwasy z pierścieniem aromatycznym

Do tej grupy należą aminokwasy zawierające podstawnik aromatyczny (rys. 1.9) czyli:

fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan. Obecność pierścienia aromatycznego warunkuje zdolność do

pochłaniania promieniowania UV w zakresie 260 – 290 nm (właściwość ta jest wykorzystywana

w metodach ilościowego oznaczania białka). Tyrozyna zawiera dodatkowo grupę hydroksylową

w pierścieniu. Tryptofan jest aminokwasem heteroaromatycznym.

Rys. 1.9. Aminokwasy aromatyczne

7


1.2. WYKONANIE ĆWICZENIA

Najbardziej charakterystyczną reakcją barwną α-aminokwasów jest reakcja z ninhydryną.

Jest ona uwarunkowana równoczesną obecnością wolnej grupy aminowej i karboksylowej przy tym

samym atomie węgla. W reakcjach barwnych uwarunkowanych budową łańcucha bocznego

aminokwasu, pozytywne wyniki dają również związki nie będące aminokwasami, których cząsteczki

zawierają takie same lub podobne grupy funkcyjne.

Białka, zawierające z reguły wszystkie rodzaje aminokwasów, dają również pozytywne

odczyny w reakcjach na łańcuchy boczne poszczególnych aminokwasów. Istnieje ponadto szereg

reakcji związanych z charakterystycznymi cechami budowy białek. Do reakcji wykorzystujących

obecność wiązań peptydowych lub specyficzną budowę przestrzenna cząsteczki należą: reakcja

biuretowa i reakcje oparte na wytracaniu białka z roztworu za pomocą różnych czynników

denaturujących.

Schemat postępowania w celu identyfikacji aminokwasów przy wykorzystaniu barwnych

reakcji wskaźnikowych przedstawia rysunek 1.10.

Odczynniki: 1. 1% roztwory aminokwasów: glicyny (Gly), cystyny ([Cys]2), fenyloalaniny (Phe), tyrozyny

(Tyr), tryptofanu (Trp), histydyny (His), argininy (Arg)

2. 1% roztwór białka (albuminy lub kazeiny)

3. 0,2M bufor fosforanowy pH 6,0

4. 6M NaOH

5. 10% NaOH

6. 1% α-naftol w etanolu

7. 1% NaBrO

8. HNO3 stężony

9. H2SO4 stężony

10. 0,5% roztwór CuSO4

11. 20% kwas trichlorooctowy (TCA)

12. 2% roztwór octanu ołowiu(II) (Uwaga! Silna trucizna!) 13. odczynnik Millona: 10 g rtęci metalicznej rozpuścić w 14 ml stężonego HNO3 i rozcieńczyć

dwukrotną objętością wody (Uwaga! Silna trucizna!) 14. roztwór kwasu glioksalowego: roztwór a – 1 g pyłu magnezowego zalać 20 ml wody; roztwór b

– 2,5 g kwasu szczawiowego rozpuścić w 25 ml wody; w celu sporządzenia roztworu kwasu

glioksalowego należy do roztworu b wlać roztwór a, po czym ochłodzić, przesączyć, dodać

2,5 ml lodowatego kwasu octowego i dopełnić wodą do 100 ml

15. 36% aldehyd mrówkowy

16. 10% roztwór NaNO2

17. 1% roztwór kwasu sulfanilowego w 1M HCl

18. 10% roztwór Na2CO3

19. 1% roztwór ninhydryny w etanolu (96%)

8


Rys. 1.10. Schemat identyfikacji aminokwasów za pomocą reakcji barwnych

9


1.2.1. REAKCJE OGÓLNE AMINOKWASÓW I BIAŁEK

A. Reakcja z ninhydryną

Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do amoniaku, dwutlenku węgla i

aldehydu uboższego o jeden atom węgla. W przypadku reakcji z α-aminokwasami istotną rolę

odgrywa grupa karboksylowa. Kondensacja dwóch cząsteczek ninhydryny (zredukowanej i

utlenionej) z amoniakiem w środowisku o pH wyższym niż 4 daje związki o barwie fioletowo-

niebieskiej (purpura Rühemana), której natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu

aminowego aminokwasu (rysunek 1.11).

Rys. 1.11. Reakcja aminokwasu z ninhydryną

Reakcja ta znalazła liczne zastosowania zarówno w próbach jakościowych jak i w metodach

ilościowego oznaczania aminokwasów. Dodatni wynik reakcji z ninhydryną (oprócz aminokwasów,

peptydów i białek) dają także sole amonowe, aminocukry i amoniak. Z tego względu oznaczana

próba musi być wolna od tych związków.

Wykonanie

Do czterech ponumerowanych próbówek odpipetować po 1 ml buforu fosforanowego o pH 6

i dodać po 5 kropli roztworów: 1 – badany; 2 – dowolny aminokwas; 3 – białko; 4 – woda. Następnie

dodać po 2 krople roztworu ninhydryny i ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej.

Zanotować wyniki.

B. Reakcja z kwasem azotowym(III)

Aminokwasy wydzielają azot cząsteczkowy w reakcji z kwasem azotowym(III) w wyniku

deaminacji (rysunek 1.12). Reakcję tę wykorzystuje się w gazometrycznej metodzie ilościowego

oznaczania α-aminokwasów metodą Van Slyke’a.

10


Rys. 1.12. Schemat reakcji aminokwasów z kwasem azotowym(III)

Wykonanie

Do trzech ponumerowanych próbówek odpipetować po 2 ml 10% NaNO2 i 1 ml 2M

CH3COOH. Następnie dodać po 0,5 ml roztworów: 1 – badanego, 2 – glicyny, 3 – wody. Dokładnie

zamieszać. Wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o powstawaniu azotu cząsteczkowego.

C. Reakcja biuretowa (reakcja Piotrowskiego)

Białka i peptydy zawierające co najmniej 2 wiązania peptydowe tworzą z jonami miedzi(II)

w środowisku zasadowym połączenia kompleksowe o barwie fioletowej (Rys.1.13.), natomiast

produkty kompleksowego powiązania jonów miedzi(II) z aminokwasami są niebieskie. Wyjątkiem

jest histydyna, która ze względu na budowę swego łańcucha bocznego, daje produkt o barwie

fioletowo-niebieskiej. Reakcja biuretowa znalazła zastosowanie w wielu metodach ilościowego

oznaczania białek. Nazwa reakcji pochodzi od biuretu – najmniejszego związku dającego pozytywny

wynik w tej próbie (rys. 1.14.).

Rys 1.13. Kompleks jonów miedzi z białkami Rys.1.14. Biuret

Wykonanie

Do 0,5 ml badanego roztworu dodać 10 kropli 6 M NaOH i 2 krople 0,5% roztworu CuSO4.

Przeprowadzić próby z wodą oraz roztworami histydyny, glicyny i albuminy. Zanotować wyniki.

D. Wytrącanie białka za pomocą kwasu trichlorooctowego

Jednym z powszechniej stosowanych odczynników odbiałczających jest kwas trichlorooctowy

(TCA), który w stężeniu 2-10% powoduje wytrącenie większości białek z roztworu.

Wykonanie

Do 0,5 ml badanego roztworu dodać 3 krople 20% roztworu TCA. Przeprowadzić próby

z roztworem albuminy i dowolnego aminokwasu. Zanotować wyniki.

11


1.2.2. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE NIEKTÓRYCH AMINOKWASÓW

A. Reakcja na obecność aminokwasów siarkowych

Związki posiadające grupy sulfhydrylowe (utlenione lub zredukowane), jak cysteina i

cystyna, ogrzewane w środowisku zasadowym ulegają rozkładowi, a powstały anion siarczkowy daje

z solami ołowiu(II) czarny lub szary osad siarczku ołowiu(II). Metionina, której atom siarki

uczestniczy w utworzeniu wiązania tioeterowego, nie daje tej reakcji. Schematyczny przebieg reakcji

cysteiny z jonami ołowiu(II) przedstawia rysunek 1.15.

Rys. 1.15. Schemat przebiegu reakcji cysteiny z jonami ołowiu(II)

Wykonanie

Do czterech ponumerowanych próbówek odmierzyć po 5 kropli roztworów: 1 – badanego,

2 – cystyny, 3 – dowolnego aminokwasu, 4 – białka. Następnie dodać po 10 kropli 6M NaOH i 5

kropli roztworu (CH3COO)2Pb. Próbkę ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej.

Zanotować wyniki.

B. Reakcja ksantoproteinowa na obecność pierścienia benzenowego

Pierścienie benzenowe różnych związków ulegają nitrowaniu (rysunek 1.16) pod wpływem

tzw. mieszaniny nitrującej (stężony kwas azotowy i stężony kwas siarkowy w stosunku 1:3).

Produkty nitrowania mają barwę od jasnożółtej do brązowej, znacznie intensywniejszą po

zalkalizowaniu próby. Reakcja zachodzi z różną szybkością i wydajnością w zależności od budowy

związku i warunków reakcji. Tyrozyna, tryptofan i białka zawierające te aminokwasy nitrują się

łatwo, natomiast do nitrowania fenyloalaniny niezbędne jest intensywne ogrzewanie próbki.

Rys. 1.16. Schemat reakcji ksantoproteinowej z udziałem tyrozyny

12


Wykonanie

Ponumerować 6 próbówek i odpipetować po 0,5 ml roztworów: 1 – badanego, 2 – tyrozyny,

3 – tryptofanu, 4 – fenyloalaniny, 5 – białka, 6 – glicyny. Dodać 2 krople stężonego kwasu

azotowego i 6 kropli stężonego kwasu siarkowego. Mieszaninę ogrzewać przez kilka minut we

wrzącej łaźni wodnej, a następnie ostudzić i ostrożnie dodać 2 ml 6M roztworu NaOH (wlot

probówki skierować pod wyciąg). Gdyby zabarwienie nie wystąpiło, reakcję powtórzyć, ogrzewając

próbę w płomieniu mikropalnika do momentu pojawienia się brązowych par tlenków azotu (kilka

minut). Zanotować wyniki.

C. Reakcja Millona na obecność fenoli

Związki zawierające grupy fenolowe tworzą w środowisku kwasu azotowego w temperaturze

40°C czerwone kompleksy nitrofenoli z jonami rtęci(II) i rtęci(I). Jest to reakcja charakterystyczna

dla monofenoli, a więc spośród aminokwasów tylko dla tyrozyny. Służy do ilościowego oznaczania

tyrozyny metodą fotometryczną.

Wykonanie

Ponumerować cztery próbówki i dodać po 10 kropli roztworów: 1 – badanego, 2 –tyrozyny, 3

– dowolnego aminokwasu, 4 – białka. Następnie dodać po 5 kropli odczynnika Millona i ogrzać

kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Zanotować wyniki.

D. Wykrywanie układu indolowego w tryptofanie

W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami, między innymi z kwasem

glioksalowym HOOC-CHO (rekcja Adamkiewicza-Hopkinsa (inna nazwa reakcja Hopkinsa-Colé))

lub aldehydem mrówkowym (reakcja Voisseneta), dając barwne produkty kondensacji (Rys.1.17).

Wykonanie

Ponumerować cztery próbówki i dodać po 10 kropli roztworów: 1 – badanego, 2 – tryptofanu, 3 –

dowolnego aminokwasu, 4 – białka oraz po 4 krople roztworu kwasu glioksalowego lub aldehydu

mrówkowego. Następnie wprowadzić ostrożnie po wewnętrznej ściance probówki około 0,5 ml

stężonego kwasu siarkowego tak, aby nie wymieszać kwasu z roztworem wodnym. W obecności

pochodnych indolu na granicy faz powstanie fioletowe zabarwienie. Zanotować wyniki.

13


Rys. 1.17. Schemat kondensacji tryptofanu z kwasem glioksalowym i aldehydem mrówkowym

E. Reakcja Pauly’ego na obecność histydyny

Pochodne imidazolu, jak również fenole i aminy aromatyczne, dają z solami diazoniowymi

w środowisku zasadowym barwne produkty sprzęgania. Pauly zastosował w tym celu kwas

diazobenzenosulfonowy, który przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem przez diazowanie

kwasu sulfanilowego kwasem azotowym(III) na zimno. Histydyna, tyrozyna i białka dają w reakcji

Pauly’ego jednakowe, krwistoczerwone zabarwienie.

Wykonanie

Zmieszać w probówce po 2 ml roztworów kwasu sulfanilowego i azotanu(III) sodu

i zawartość probówki wytrząsać przez kilka minut chłodząc ją jednocześnie pod bieżącą wodą.

Następnie ponumerować pięć próbówek i odmierzyć do każdej po 5 kropli odczynnika diazowanego

i kolejno po 5 kropli roztworów: 1 – badanego, 2 – histydyny, 3 – tyrozyny, 4 – dowolnego

aminokwasu, 5 – białka oraz po 10 kropli roztworu Na2CO3. Zanotować wyniki.

F. Reakcja na obecność argininy (Sakaguchi)

Grupa guanidynowa argininy z α-naftolem w obecności utleniacza bromianu(I) sodu w

środowisku zasadowym tworzy czerwono-pomarańczowy kompleks (Rys. 1.18). W razie dłuższego

działania bromianu(I) sodu następuje odbarwienie roztworu, ponieważ barwny produkt ulega

dalszym przemianom. Dodatek mocznika może stabilizować utworzony barwnik.

14


Rys. 1.18. Schemat reakcji argininy z α-naftolem

Wykonanie

Ponumerować 4 próbówki i odpipetować po 1 ml roztworów: 1 – badanego, 2 – argininy, 3-

dowolnego aminokwasu, 4 – białka. Następnie dodać kolejno po 0,5 ml 10% NaOH, 2 krople 1%

etanolowego roztworu α-naftolu oraz 2 krople roztworu NaBrO. Wymieszać zawartość i zanotować

wyniki.

1.3. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

Uzyskane podczas wykonanych doświadczeń wyniki należy przedstawić w formie

zestawienia (tabela 1.2). Uwaga! Wszystkie reakcje należy wykonywać dla roztworu badanego

(otrzymanego od prowadzących zajęcia) oraz dla odpowiednich roztworów wzorcowych.

Tabela 1.2

Reakcja Gly (Cys)2 Phe … … Badana próbka

Z ninhydryną

…

…

1.4. PYTANIA I ZADANIA

2. Dokonaj klasyfikacji aminokwasów w oparciu o różne kryteria ich podziału: (np.

białkowe/niebiałkowe, egzogenne/endogenne, budowa łańcucha bocznego).

3. Narysuj formę L i D wskazanego aminokwasu.

4. Wyjaśnij co to jest punkt izoelektryczny. Podaj przykłady aminokwasów znacznie różniących się

od siebie wartościami pI.

5. Narysuj wzory aminokwasów: chiralnego i achiralnego. Podaj ich nazwy i skróty trzyliterowe.

6. Opisz reakcję wykorzystywaną w ilościowym oznaczaniu aminokwasów metodą Van Slyke’a.

7. Wyjaśnij na czym polega reakcja Pauly’ego i jakie aminokwasy można przy jej użyciu

wykrywać.

8. Zaproponuj schemat postępowania służący do wykrycia tryptofanu w próbie badanej.

Documents

BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓWztibsl.ch.pw.edu.pl/3wm/upl/1361989118.pdf · 3 Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW W środowisku silnie kwasowym aminokwasy wyst ępuj