Acute LD50 values for a variety of chemical agents

AgentSpeciesLD50 mg/kg b.w.

EthanolMouse 10,000Sodium chlorideMouse4,000Ferrous sulphateRat1,500Morphine sulphateRat 900Phenobarbital SodRat 150DDTRat 100PicrotoxinRat 5Strychnine sulphateRat 2NicotinRat 1D-TubocurarineRat 0.5Hemicholinium-3Rat 0.2TetrodoxinRat 0.1Dioxin (TCDD)Guinea-pig 0.001Botulinum toxinRat 0.00001

Dasar-dasar Uji Laboratorium dalam ToksikologiPrinsip umumBahan kimia dapat menimbulkan efek toksik hanya jika bahan kimia tersebut berhubungan langsung dengan sel atau organ sasaran

Jumlah bahan kimia yg memejani sel sasaran dapat menentukan apakah bahan tersebut dapat atau tidak dpt menimbulkan efek toksik

Sel dr berbagai spesies yg mempunyai kesamaaan fungsi dan lintasan metabolisme mempunyai akibat yang sama jika terkena bahan kimia yang sama

Perubahan bahan struktur (kimia) suatu senyawa dapat berakibat perubahan besar pada aksi biologiknya

Nilai ambang ToksisitasMerupakan dosis atau tingkat pemejanan minimal yang dapat menyebabkan perubahan biologik melebihi batas kemampuan adaptasi homeostasis. Dibawah nilai tersebut dianggap aman, sedang di atasnya dapat menimbulkan efek toksik.Sulit tentukan nilai ambang efek karsinogenik dan mutagenik

Uji ToksisitasKarena pertimbangan moral etik dan hukum penelitian toksikologik eksperimental tidak dilakukan pd manusiaPada hewan uji in vivo / in vitroRancangan yang baik dan penelitian yang seksama (properly qualified ) dpt memberikan gambaran efek toksik pd manusia

Faktor faktor yang berpengaruh pd hasil uji toksisitas

1. Faktor bahan ujiSifat fisikokimiaKemurnianBentuk sediaan dosis

2. Faktor Hewan Uji

Jenis dan galurUmurJenis kelaminBerat badanStatus kesehatan

Faktor cara pelaksanaan uji

Pemeliharaan hewan ujiPetugas yang berpengalamanPemilihan metode statistikJumlah hewan ujiKecermatan pengamatan dan pengukuranKetelitian alat ukurKetepatan prosedur Keadaan peneliti

Keterbatasan Uji Toksisitas pada hewan uji

Bbrp manifestasi toksik tidak nampak pd

hewan ujiPerbedaan respon antar spesiesLD 50 yg sama belum tentu profil toksisitasnya sama

UJI TOKSISITASUji Toksisitas Akut

Mendapatkan informasi tentang dosis yg dpt mematikan 50% hewan uji (LD50) suatu bahan serta gejala keracunan, penyebab kematian dan urutan proses kematianUji Toksisitas Jangka Panjang

Meliputi toksisitas subkronik dan kronik Uji toksistas khusus : uji toksisitas jangka panjang utk mendptkan data efek toksik yg bersifat khusus spt efek teratogenik, karsinogenik dan ketergantungan

Lama Uji toksisitas

Lama masuknya dalam kadaan sehari-hariLama Pemberian dlm uji toksisitasakutsubakutkronikSatu kali atau beberapa dosis

Kurang dari 1 minggu

Lebih dari 4 mingguSatu kali

Satu kali

Satu kaliPaling tidak 2 minggu

13-26 minggu

Paling tidak 26 mingguTidak perlu

Paling tidak 6 bulan

Paling tidak 1 tahun

Uji Toksistas AkutKetoksikan akut:

Derajad efek toksik suatu senyawa (bahan) yang terjadi dalam waktu singkat setelah pemberian dalam dosis tunggal.

Uji toksisitas akutUntuk menetapkan potensi ketoksikan akut (LD50). (tolok ukur kuantitatif) Selain itu diamati gejala keracunan, sistem biologik yg paling peka, mekanisme keracunan yg berakibat kematian, serta ada tidaknya perbedaan toksisitas antar spesies (tolok ukur kualitatif)

Uji Toksisitas AkutSebaiknya menggunakan mamalia dr

2 mcm spesies (rodensia dan non-rodensia)Hewan uji sehat berasal dr satu galur yg jelasMenggunakan paling tidak 4 peringkat dosis yg terdiri dr 8-10 ekor

(pendapat lain min 4 ekor)Dosis dibuat berdasar kelipatan logaritmik tetap

Dosis terendah :

Dosis tertinggi yang tidak menyebabkan kematian hewan ujiDosis tertinggi :

Dosis terendah yang menyebabkan seluruh atau hampir seluruh hewan uji matiDpt dicari dengan dosis yang secara tehnis dapat diberikan pada hewan ujiKisaran dosis diperkirakan menyebabkan 10-90% kematian hewan uji pd masa akhir uji

Cara pemberian sesuai dgn cara masuknya pd manusia mempermudah ekstrapolasiLD 50 dihitung setelah pengamatan 24 jam

Namun gejala keracunan (kematian) dpt berjalan lambat (delayed toxicity) sehingga gejala keracunan dapat diamati selama 7-14 hari.

Cara menghitung LD 50

1. Perhitungan dengan grafik Miller dan Tainter (1944)Menggunakan kertas grafik logaritmik-probit(skala logaritmik pd absis, skala probit pd ordinat)Probit : transformasi dr hasil pengukuran yg digambarkan dlm kurva sigmoid (hubungan antara respon kuantal dgn logaritme dosis) menjadi kurva yg lurus

2. Cara aritmatik Reed dan Muench (1938)3. cara Aritmatik dr Karber (1931)4. Cara CS. Weill (1952)

Lihat copy-an

Kategori potensi ketoksikan :Sangat toksis (extremely toxic), LD5015 g/kgBB

LD 50 beberapa bahan kimia yang diberikan melalui cara yang berbeda pada mencitDFP= diisoprophyfluorophosphat

Cara pemberianLD50 (mg/kg BB) pada mencit dariProkainDFPfenobarbitalIV450,3480IP2301,00130IM6300,85124SC8001,00130Oral5000,90280

Uji toksisitas subkronisMerupakan longterm toxicityUntuk mendapatkan data tentang keracunan bahan kimia yg digunakan secara sengaja atau tidak sengaja masuk ke dalam tubuh berulangkali atau dlm wkt lama.Perlu dilakukan didasarkan asumsi jika tidak ada efek yg timbul pd dosis tunggal tetapi dpt timbul jika dosis berulang dan jangka waktu lama

Efek toksik dpt timbul krn perkembangan tubuh krn umur (aging process) spt sensitifitas jaringan, perubahan kapasitas kemampuan fisiologik, abnormalitas / penyakit yg muncul spontan

Diamati lesi pd organ tubuh, organ apa yg rentan, bgmn sifat lesi (reversible/ireversible), mulai dosis berapa efek toksik mulai timbul

UJi Toksisitas SubkronisHewan uji

Satu spesies rodent dan satu spesies nonrodent

Peringkat dosis

dosis terendah: yang tidak menimbulkan gejala toksik akutDosis tertinggi : yang menimbulkan gejala keracunan akut tapi tidak menyebabkan kematian

Lama pemberian

Umumnya dilakukan 90 hari berturut-turut

Lama masuknya bahan uji dalam keadaan sehari-hari Lama pemberian pada uji toksisitas akut-satu kali atau beberapa dosis-kurang dari satu minggu-lebih dari 4 minggu-paling tidak 2 minggu-13-26 minggu-paling tidak 26 minggu

Cara pemberian obat/bahan uji

Disesuaikan dgn cara masuknya ke dlm tubuh dlm keadaan sehari-hari (termasuk cara inhalasi)Dosis sesuai berat badan/luas permukaan tubuh- dpt berubah scr periodikPemberian bersama pakan/air minum diperhatikan : dosis dan kemungkinan adanya interaksi

Pengamatan gejala klinik

Berat badan diukur tiap mingguAsupan pakan dan minum tiap hariPemeriksaan fisik spt :Aktifitas lokomotor, reaksi aneh,suara, konvulsi, responsi somatik, agresivitas, , mata, defekasi, ekor, tremor, kesadaran, sensitifitas thd suara, salivasi, piloereksi, jantung dll

Uji fungsi biokhemis organ tertentu

Analisis darah spt kadar gula, protein, kolesterol, asam lemak, bilirubin, enzim sesuai arah uji toksisitasDilakukan pd hari ke 0 dan tiap 30 hari selama penelitian berlangsung (paling sedikit 3x)

Pemeriksaan hasil metabolisme

Analisis darah, urin atau homogenat utk memberikan inform. Kinetika bahan uji atau efeknya pd metabolisme

Pemeriksaan hematologik

Kuantitatif (jumlah sel) dan kualitatif (morfologik)

Pemeriksaan postmortal

Pengamatan makros-mikros pd organPengamatan abnormalitas bentuk, ukuran, berat organ dan homogenitas jaringanPerlu diperhatikan bahwa hasil pemeriksaan mikros dpt dipengaruhi oleh cara pemrosesan pembuatan preparatnya.

1.psd

Uji Toksisitas KronisUtk mengetahui efek toksik dari suatu bahan uji dengan dosis yang setara dgn pemakaian sehari-hari yg diberikan dlm waktu lama dan utk menunjukkan ada tidaknya efek toksik yg bersifat khusus

Hewan uji

Satu jenis hewan rodensia dan satu jenis hewan non rodensia, umur dewasa, 2 jenis kelaminTiap kelompok rodensia min. 20 ekor, nonrodensia min 4 ekorCara pemberian bahan uji

Sesuai dgn cara sehari-hari

Peringkat dosisPaling tidak 3 peringkat dosis Dosis terkecil : dosis yg pd uji toksisitas akut tidak menimbulkan gejala keracunanDosis terbesar : dosis yg pada uji toksisitas akut menimbulkan beberapa kematian hwn uji.Dosis antara termasuk dosis yg digunakan dalam keadaan sehari-hari

Lama pemberian bahan uji dan pengamatan

Lama masuknya bahan uji dalam keadaan sehari-hariLama pemberian pada uji toksisitas kronik-satu kali atau beberapa dosis-Kurang dari satu minggu-Lebih dari 4 minggu-tidak diperlukan-paling tidak 6 bulan-paling tidak satu tahun

Pemeriksaan fisik dan klinik

(spt uji toks. Subkronis)Berat badan diperiksa paling tidak seminggu sekaliTiga bulan pertama asupan pakan minum dan urin yg dikeluarkan 24 jam, diamati tiap tiap minggu. Selanjutnya tiap bulanPemeriksaan biokhemis min. 3xAnalisis darah dan urin tiap 6-12 minggu

Reproductive ToxicologyUtk mengetahui efek toksik dr suatu bahan (agen eksogen) pada sistem reproduksiEfek terhadap libido, sterilitas, mutagenesis, kematian fetus, kematian perinatal dll

Pada hewan uji dapat diamati efek terhadap:

JantanSpermatogenesisTesticuler pathogenesisEpididymal spermCeluller biochemistryFertilityIn vitro fertilizationHormon profileMotilityetc

BetinaEmbriogenesisOvarian pathogenesisEstrus cycleFertilityHormon profileIn vitro fertilizationetc

Abnormalitas morfologi sperma

Reproductive toxicology on female rodent (mice, rat)

euthanasia42days19-20220matingparturitiongestationlactationweaningtreatment15 dayseuthanasia

Uji Toksisitas KhususUji teratogenesis

Perkembangan dan pertumbuhan embrio (mudigah) terutama fase organogenesis rentan terhadap gangguan proliferasi dan deferensiasiBerakibat malformasi (struktural, fungsional, biokimia) dan kematian embrio atau fetus

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 280organogenesishistogenesismaturasiMasa embrioMasa fetus(hari)Tahap tahap embriogenesis pd manusia

Masa organogenesis pd bbrp spesies

Hewan ujiMasa organogenesisHari ke-Lahir hari ke-Rat6-1522Mencit6-1519kelinci6-1833

Marmot10-1866Hamster8-1215manusia21-56267

Zat yg bersifat embriotoksik atau fetotoksik sebabkan kematian janinkeguguranZat teratogenik dapat tidak toksik pada induknya tapi pengaruhi perkembangan dan pertumbuhan janin

Kematian janin tanpa malformasi dapat diakibatkan krn pemejanan zat teratogen sebelum masa deferensiasiMalformasi terjadi jika pajanan zat pada masa organogenesisJika pajanan terjadi pd masa pertumbuhan berakibat kelambatan masa pertumbuhan

Periode kritis embriogenesis pd rat

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21implanNervous sistemeyeheartface

kidneylimbspalateExternal genitaliaday

Contoh zat yg bersifat teratogen pd hewan dan manusia

No.Nama zatNo.Nama Zat1.2..3.4.5.6.7.8.9.TalidomidTiourasilKlorpropamidKortisonEtinil testoteronKlorambusilNitrogen mustardUretankolsikin10.11.12.13.14.15.16.17.18.Hipervitaminosis AKelebihan a. nikotinatBiru tripanBiru evanAktinomisin DTetrasiklinFenilmerkuri asetatTimah hitamtalium

UJI TERATOGENESISHewan uji yg sering digunakan adalah mice, rat dan kelinci (didasarkan kedekatan ciri dan sifat tertentu pd manusia)Penelitian dgn mudigah ayam ternyata terlalu sensitif, hasil berbeda pada manusiaHewan uji babi digunakan krn sifat biologik banyak anak dan peka terhadap teratogenPenggunaan hewan uji kera kedekatan filogenetik dgn manusia

Uji teratogenesisHewan uji

Jumlah Harus memenuhi sarat statistikJika angka kejadian malformasi 0,5%, berarti 1 malformasi hanya ditemukan pada 200 ekor hewan ujiHewan uji yg digunakan yang positif dibuahi (pada mice/rat adanya vaginal plug)Bahan uji diberikan mulai hari tersebutHewan uji dikorbankan sebelum perkiraan lahir (anak yg cacat biasanya dimakan induknya)

Pengamatan :Jumlah implantasi (ada nodul yg kaya vaskularisasi)Jika ada selisih antara implantasi total dengan jumlah korpora luteaterjadi preimplantation loss (resorpsi awal)Jumlah resorpsi : selisih jumlah persarangan dengan jumlah janin yg tetap hidup sampai cukup umur

Semua janin (hidup/mati) ditimbang, dihitung, diperiksa ada tidaknya malformasi (kelainan struktur, fungsi dan biokemis)Cairan amnion dicatat volume, warna dan kelainan lainnyaPemeriksaan histopatologik plasenta

Uji karsinogenesis

Uji Efek Toksik Lokal pada Kulit(ketoksikan akut)Efek toksik yang timbul dimana bahan tersebut kontak langsung dengan tubuhEfek iritatif,korosi, alergi

Efek Iritatif

Hewan uji yg sering digunakan kelinci, marmut, tikus putihJika bahan uji merupakan bahan yg sengaja/tidak sengaja terjadi kontak pada kulit berkali-kaliperlu uji toksisitas utk melihat efek sistemik

Hewan uji dicukur punggungnya, Bahan uji dioleskan , ditutup dengan selotipSetelah 24, selotip dibuka diperiksa efek iritasinya

Evaluasi berupa skor terhadap kemerahan dan edema yg terjadi

0 = tidak ada kemerahan1 = merah muda2 = eritema3 = merah sekali4 = merah menyala dengan perluasan daerah

0 = tidak ada edem1 = edema sangat ringan2 = edema ringan3 = edema sedang (1 mm)4 = edema berat (>1 mm)

Uji Fototoksik dan fotoalergikReaksi fototoksik disebabkan karena energi sinar ultraviolet dapat mengaktifkan bahan dan mampu menimbulkan perubahan biologik pada sel/jaringan tubuhReaksi fotoalergik disebabkan karena energi sinar ultraviolet memacu pembentukan hapten sehingga timbul sensitisasi alergi pada kulit.

Seperti uji efek iritatif, tetapi kemudian daerah yg diolesi bahan uji disinari sinar ultraviolet

Referensi :

Donald J.Ecobichon The Basis of Toxicity TestingNgatijan, Metodologi Penelitian dalam Toksikologi