02/05/2010

1

Biotransformaciones y Química

verde

Dr . J. V. Sinisterra

Grupo de Biotransformaciones.

Facultad de Farmacia Universidad Complutense

Email: jvsgago@farm.ucm.es

www.ucm.es/info/btg

Relación de las Biotransformaciones con la Química sostenibleObjetivos de la QUIMICA SOSTENIBLE

1) Reducir el numero de pasos de la síntesis2) Evitar la producción de subproductos.-Compuestos homoquirales3) Condiciones suaves de proceso -T ambiente, P atmosférica, Medio acuoso

o disolventes poco contaminantes4) Utilización de catalizadores muy activos y que sean lo mas selectivos posible.-

Biocatalizadores5) Desarrollo de metodologías analíticas que permitan el seguimiento en tiempo real del proceso y el control previo de la posible formación de substancias peligrosas.-

Hacer de manera selectiva procesos que no puede realizar la Química convencional

Biosensores---------------------------------------------------------------------------------------a) Minimización de residuos y lograr el control de efluentesb) Simplificar los procesos de purificación de producto finalc) Obtener buenos rendimientosd) Reducir al mínimo la formación de productos concomitantese) Evitar ó reducir al mínimo el riego de producción de fuegos, explosiones o emisiones

contaminantes.

O O

O

O

O

O

OO O

O

OCH3

O N

O

O

O

OO O

N

N

O

OCH3

O N

HO OH

N

N

HO

O

NH2

1O

IMMOBILISED

Chemical and Biocatalyzed synthesis of Ribavirin, 1

N

NN

O

H

HO

NH

O

ON

O

OHOH

HHHH

N

NN

O

NH2

H

NH

NH

O

IMMOBILISEDWHOLE CELLS

45% Yield E. gergoviae CECT 857. Imm. agar 2%T=60ºC, t=3hrs. Phosphate buffer pH=6.8

Trelles y col. Tetrahedron Letters 2003, 44, 2605-2609

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2

Enzimas aisladasLiasas, transferasas

e isomerasas

Enzimas aisladas

Enzimas aisladasCélulas enteras

K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 5th ed, 2004

Células enteras

BIOTRANSFORMACIONES-Empleo de células o enzimas como catalizadorespara obtener productos de valor añadido o servicios de interés.

Industria Farmacéutica

Industria Química Fina

I d t i li t i

Aplicaciones industriales de las Biotransformaciones

Industria agroalimentaria

Tratamiento de efluentes, residuos urbanos o industriales

Producción de bio-gas a partir de residuos urbanos orgánicos

Recuperación de minerales –Biomining

Producción de Biocombustibles

Bioremediación utilizando microorganismos

Aplicaciones de los Biotransformaciones a la Industria Farmacéutica y de Química Fina.

1) generar templatos para librerías químicas

2) funcionalizar nuevas moléculas para estudios S.A.R.

3) preparación de sustancias específicas para la ) p p p pinvestigación de modelos microbianos y de metabolismo de mamíferos

4) generar gramos o kilos de compuestos enantiomericamente puros, claves para la síntesis y desarrollo de nuevos compuestos.

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3

POLAR

APROTICS

6%

ALCOHOLS

30%

ESTERS

9%

ETHERS

13%

The most used solvents in Pharmaceutical Industry

ALKANES

9%

AROMATICS

20%

A.D. Curzons

,

Green Chemistry

,

2001, 3, 1-6,

HALIDES

8%

Category Example Waste Impact Health SafetyWater Water GOOD GOOD GOOD GOOD

Impact of Some representative solvents on the environment and human health

Water Water GOOD GOOD GOOD GOOD

Alcohols Ethanol BAD REGULAR GOOD REGULAR

Esters Ethyl Acetate REGULAR GOOD REGULAR REGULAR

Aromatics Toluene REGULAR BAD REGULAR REGULAR

Polar Aprotic Acetonitrile BAD REGULAR BAD GOOD

Alkanes Hexane REGULAR BAD BAD BAD

Halides Dichloromethane BAD BAD BAD GOOD

Ethers Tetrahydrofuran BAD REGULAR REGULAR BAD

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4

Technical steps in a Biocatalysed process

1) Screening for the most interesting biocatalyst

2) Optimization of the reaction conditions

3) Immobilization – stabilization of the biocatalyst

4) Scale up of the process.

Biotransformaciones empleadas para la preparación de compuestos quirales

A.- Resolución de racematos

A.1- Resolución de estéres, ácidos, alcoholes racémicos

A.2-Resolución de lactamas y lactonas racémicos

B.-Introducción de uno o varios centros estereogénicos en lé l i luna molécula aquiral

B.1- Reducción de enlaces C=O

B.2- Reacción de Baeyer-Villiger

B.3- Hidroxilación de alcanos

B.4-Hidroxilación de anillos aromáticos

C- Modificación de moléculas quirales

ClO

N

O

Cl

O

O ArO Cl

O

ADH whole cells

ADH whole cells4

3

Alternative synthesis of S- adrenergic -blocker

(R)ArO Cl

HO H

NCl

O

O H OH

NOAr

O

O H OH

(S)ArOHO H

(S)HN

H OHOAr

R

SS

SSR

ADH - whole cells

NHR

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5

O

H OH

HO H

S L

SL

S L

Prelog's rule

A ti P l ' l

NADH/H+

NAD+

Alcohol dehydrogenase

Alcoholdehydrogenases (ADH)

Anti Prelog's rule

ClOR

O O

ClO

OH OHCl

OEt

OHO H

R= Octyl R=Et

Octyl

Table 5. Reduction of 2 using resting cells.(29).

Yeast Medium CultureTime (h)aa

Yieldbb

(%)Product.cc Absolute

Configurationddee (%)ee

Yarrowia lipolytica 1240 BYPO 48 88 0.50 S>R 99

Pichia mexicana 11015 YM 48 86 0.51 R>S 95

S a c c h a r o m y c e sb 1969 YED 72 42 0 24 R>S 88

OO

Cl O(S)

Cl O(R)

ClHO HH OH

SR

2

bayanus 1969 YED 72 42 0.24 R>S 88S a c c h a r o m y c e scerevisiae (Tipe II) YM 32 33 0.23 S>R 83S a c c h a r o m y c e scerevisiae 1317 YM 48 25 0.21 R>S 75

a number of cells similar Table 2.bMolar conversion determined after 48h. by HPLC on thecrude mixture. c Productivity x 106 (mmol/(mLxh.x106cell).d Absolute configuration wasassigned on the basis of its specific rotation [2]. S(+)-2 (99%)[]25

D=+9.3 (c=1.9 EtOH), R(-)-2 (95%)[]25D=-8.8 (c=1.9 EtOH). ee.e. determined by chiral phase HPLC

-Martínez -Lagos F., Del Campo C., Llama E.F. and Sinisterra J.V. New yeast strains for enantioselective production of halohydrin precursor of (S)-Propranolol Tetraahedron Asymmetry 2000, 11, 4651-4660

INMOBILIZACIÓN DE LAS LEVADURAS EN ALGINATO INMOBILIZACIÓN DE LAS LEVADURAS EN ALGINATO VIDA MEDIA DEL CATALIZADOR

Martinez-Lagos F. et al. Tetrahedron Asymmetry 2004, 15,pp 763-770

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6

OHO

+ O2 +

Fe(III)-complex + H2S

CH3CN + Py

OHOH

++ O2

CH3CN + Py

Fe(III)-complex + H2S

Chemical hydroxilation of alkanes

CH3CN Py

O

AcO

OBzCH2OTBS

O

AcO

OBzCH2OTBS

CrO3Bu4N+ IO4-

CH3CN/CH2CL2

-40ºC

OH

progesterona

11

O

O

-FRIED J.; THOMA R.W; GERKE J.R.; HERZ J.E.; DONIN M.N.; PERLMAN D. (1952)J.Am.Chem.Soc. 74, 3692

Hydroxylation of steroids

acido litiocolico

7

COOH

HHO

-SAWADA S.; KULPRECHA S.; NILUBOL N.; YOSHIDA T.; KINOSHITA S.; TAGUCHI H(1982)-Appl. Envirom .Microbiol.44,4109

O

O

OOCCH3

O

O

OOCCH3

OH

Curvularia lunata NRRL 2380

NH

O

ONHR

NH

O

ONHR

Curvninghamella elegans atcc 9244

HO

Key intermediate in testosterone 5-reductase

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7

Tabla 1: Regioselelctividad en la hidroxilación de esteroides por diferentes microorganismos

Posición de hidroxilación del esteroide Microorganismo

7α Fusarium monilifirme, Phycomyces blakesleeanus

11α Aspergillus ochraceus, A. fumigatus

1 i illi i i kii15α Penicillium raistrickii

16α Streptomyces roseochromogenes

6β Bacillus thermoglucosidasius

11β Cochliobolus lunatus

11 β/ 14 α Curvularia lunata

6 β/ 11α Rhizopus arrhizus

15β Bacillus megaterium

14α Mucor piriformis

9α Rhodococcus spp.

Biotransformaciones empleadas para la preparación de compuestos quirales

A.- Resolución de racematos

A.1- Resolución de estéres, ácidos, alcoholes racémicos

A.2-Resolución de lactamas y lactonas racémicos

B.-Introducción de uno o varios centros estereoqgénicos lé l i len una molécula aquiral

B.1- Reducción de enlaces C=O

B.2- Reacción de Baeyer-Villiger

B.3- Hidroxilación de alcanos

B.4-Hidroxilación de anillos aromáticos

C- Modificación de moléculas quirales

O O

O

O

O

O

OO O

O

OCH3

O N

O

O

O

OO O

N

N

O

OCH3

O N

HO OH

N

N

HO

O

NH2

1O

IMMOBILISED

Chemical and Biocatalyzed synthesis of Ribavirin, 1

N

NN

O

H

HO

NH

O

ON

O

OHOH

HHHH

N

NN

O

NH2

H

NH

NH

O

IMMOBILISEDWHOLE CELLS

45% Yield E. gergoviae CECT 857. Imm. agar 2%T=60ºC, t=3hrs. Phosphate buffer pH=6.8

Trelles y col. Tetrahedron Letters 2003, 44, 2605-2609

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HO

N

NN

N

NH2

O

OHOH

HHHH

HO

N

NN

N

NH2

O

OHOH

HHHH

HO

N

NN

N

NH2

O

OHOH

HHHH

NH

NN

N

O

OHOH

HHHH

HO

R

R=ClR= NHCH2CH2(C6H5)

O-

+

O

CH3O

CH3

N

NN

N

NH2

OHOH

HHHH

HO

N

NN

N

NH2

OHOH

HHH

HO

N

NN

N

NH

OHOH

CH3HHH

HO

N

NN

N

NH

OHOH

HHHH

HOCl

Ph Ph Ph Ph

Cl

N

NN

N

NHCH2CH2Ph

(R)

O(R)

OHOH

HH

HH

HO

Cl

Monoxigenases .- Oxidises the CH2OH of the suggar to COOH

NHCH2CH2Ph

20 g/l

N

NN

N

(R)

O

(S)

OHOH

HH

HH

Cl

HOOC

Stenotrophomonas maltophila

20 g/l

100% yield at 24hrs

Enzimas implicadas en la síntesis de nucleósidos.1) Nucleósido Fosforilasas

B1O

OH

XOH

OOH

XOH

B2O

OH

XOH OPO3

-2

PO4-3

B1

B2PO4

-3

2) 2’-Deoxiribosiltransferasas.

B1O

OH

XOH

OOH

XOH

B2O

OH

XOH Glu-R

R-Glu

B1

B2

R-Glu

Donde: B1 y B2 son bases púricas o pirimidímicas X = OH ó H

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Nucleosido FosforilasasEstas enzimas catalizan la fosforólisis reversible de

ribo o desoxiribonucleósidos con la formación de ribosa o desoxiribosa-1-fosfato, y la base correspondiente. Se conocen purín (EC 2.4.2.1) y pirimidín (EC 2.4.2.2, EC2.4.2.3 y EC 2.4.2.4) nucleósidofosforilasas

O E1 O OHOB1

HO HOB2

E

Donde B1: pirimidina E1: pirimidín nucleósido fosforilasa

B2: purina E2: purín nucleósido fosforilasao bien B1: purina E1: purín nucleósido fosforilasa

B2: pirimidina E2: pirimidín nucleósido fosforilasa

O

XOH

E1

PO43-

OH X

O

OH X

O

OP

HO HOE2

B2

Binary complex of trimmeric calf spleen PNP and Hypoxantine (in black ), Helical regions in yellow, -strands in green and loops in blue.-Bzowska et al. Pharmacology & therapeutics 88, 349-425 (2000)

Ternary complex of hexameric E. coli PNP with formocyn B. (analog of inosine) and phosphate (in red). There are three independent monomers A,B & C. Helical regions in yellow, -strands in green and loops in Blue.- Bzowska et al. Pharmacology & Therapeutics 88,(2000) 349-425

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Purin-Nucleosido fosforilasas (PNP)

TIPO I.- Ino-Guanosin Fosforilasas. HomotrímerosTIPO II.-Menos específicas que las anteriores – aceptan 6-

oxo y/o 6-aminopurinas y Uridina.Homohexámeros

Aceptan Adenosina como mejor substrato que GuanosinaTIPO III

IIIa- La misma especificidad que las Tipo I con la salvedad de que no son Homotrímerassalvedad de que no son Homotrímeras.

IIIb - La misma especificidad que las Tipo II con la salvedad de que no son homohexámeras

Pirimidin nucleosido fosforilasas (PyNP)

TIPO I.- Específicas de Timidina y deoxinucleósidosTIPO II.- Específicas de UridinaTIPO III.- Antranilato fosforil transferasas.

Intervienen en la síntesis de triptofano

2’-DeoxiribosiltransferasasHay dos subclases de enzimas según sea su mecanismo de acción.

B1O

OH

XOH

OOH

XOH

B2O

OH

XOH Glu-R

R-Glu

B1

B2

R-Glu

X H B1 B2 B ú i i i idí i

TIPO I.- catalizan la transferencia entre purinas

dRib-Pur(1) + Pur (2) d Rib-Pur (2) + Pur (1)

TIPO II catalizan la transferencia entre purinas y/o pirimidinasdRib – Pur (1) + Pur (2) d Rib-Pur (2) + Pur (1)dRib-Pur + Pyr d Rib-Pyr + PurdRib – Pyr (1) + Pyr (2) d Rib – Pyr + Pyr (2)

X = H B1y B2 Base púrica o pirimidímica

Estructura secundaria de la 2’-deoxiribosiltransferasa

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Identify the synthetic step

Biological diversity

Screen

In-house expertise - Outside data base -Historical microbial library

Screening steps

Data evaluation- 1st positive

Microbial library

Lead identification and selection

Process development activities

Laboratory and large scale fermentation

Screen- 2nd, 3rd positive etc.

Analysis

ExperimentalCrecemos las células en medio líquido en un erlenmeyer de

100 ml durante 24 h. Acto seguido centrifugamos a 4000 r.pm. y separamos las células del medio líquido.

Añadimos los reactivos [5 mM] en tampón fosfato sobre las células. pH=7 Sometemos a una agitación de 200 r.p.m. 1 hora y Tª de 57º ºC. Después centrifugamos y separamos por decantación las células del sobrenadante, el cual se analizará por HPLC.

Condiciones HPLC

INERTSIL ODS2 5 m 15 * 0,46(TEKNOKROMA).Fase móvil : 97% AcNa/AcH pH = 5.8 20 mM, 3% MeOH

Flujo : 0,8 ml/min Presión : 1800 psis = 260 nm

R e a c c ió n d e L a c to b a c il lu s a lim e n ta r is 5 7 0 e n ta m p ó n F o s fa to

1 1 51 Ac Urico55

-5

1 5

3 5

5 5

7 5

9 5

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

1-Ac. Urico.

2-Uracilo

3-Hipoxantina

4-Deoxiuridina

5-Adenina

6-Deoxiadenosina1

4

5

3 6

52

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Yield & Productivity in the synthesis of adenosine from uridine. Uridine/Adenine (30:10) mM., Resting free cells conditions. T = 70 ºC. Reaction volume =15ml. Reaction time = 30 min.

Microorganisms AdenosineYield (%)

Cell concentration(106 cel/ml)

Productivity(mM/(hrx106 cells)) x 10

5

Enterobacter aerogenes CECT 684 100 1110 120

Enterobacter amnigenus CECT 4078 98,5 1.947 67

Enterobacter gergoviae CECT 857

100 1.389 96

E b k kii 91 2 087 58Enterobacter sakazakiiCECT 858

91 2.087 58

Erwinia amylovoraCECT 222

30 970 41

Pantoea agglomeransCECT 850

<1% 2.854 0

Photabacterium damselae CECT 626 99,5 2.366 56

Serratia rubideaCECT 868

90 1.249 96

Serratia marcenses CECT 977

92 3.214 38

Optimización de las Biotransformaciones (DU +A).

Productividad = Rendimiento (%) sustrato (mM)

Tiempo (horas) células (106 cel/ml) 20 mL

Cepa (Nombre y número CECT)

% conversión

Población (106cells)

Productividad(mM/(hrx106 cells)) x 10 5

Bacillus coagulans 12 24 1204 2.9

Bacillus psychrosaccharolyticus 4074

71 56

554 590

32

27

Lactobacillus pampilonensis 4219

42 2068 5.0

Psycrhobacter immobilis 4492

66 53

690 713

23

18

Adenosine production from free and immobilised E. gergoviae whole cells. [uridine]=30mM; [adenine]= 10mM; T=70ºC; Vr=50ml. Catalyst weight in

Experimental Part. [whole cell] = 15,000 cells added.

Microorganism Temperature(ºC) Support Adenosine yield (%)

X. traslucens 60 None 23(4hrs)

S.marcenses 60 None 71(4hrs)

60 Agar a 94(14hrs)

60 Agar b 95(95hrs)

E. gergoviae 70 None 89(1hr) S. Marcenses CECT 977

immobilised in agar from Gracilaria(2%)70 Alginate 80 (3hrs)

70 Agara 87(3hrs)

70 Agarosea 86(3hrs)

70 Polyacrylamidea 99(3hrs)

a Small cubes 0.2 x 0.2 x 0.2 cm.bin small beads (106 m) S. marcenses CECT 977

immobilised in agarose (2%)

immobilised in agar from Gracilaria(2%)

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Remaining activity of immobilised biocatalysts, stored at 4ºC for several days. Synthesis of adenosine from uridine. [uridine]=30mM; [adenine]=10mm;

T=70ºC; t=3hrs. 50mL 30mM phosphate buffer pH=7.

Storage time (Days) E. gergoviae (agar 2%)

0 78

15 72

Enterobacter gergoviae CECT 857 immobilized in agar A28/03

60

80

100

no

sin

e (%

)

Synthesis of adenosine from uridine/adenine (30/10 mM)using immobilized whole cells of Enterobacter gergoviae CECT 857 in A28/03.(%) adenosine in each cycle.Temperature 70ºC, Reaction volume = 15ml. Reaction time = 1 hr.Wet biocatalyst weight = 20g

30 76

60 72

75 73

0

20

40

0 2 4 6 8 10 12

Recycles

Yie

ld A

den

o b

ase

nit

rog

en

ada/

mil

lon

es d

e cé

lula

s.h

1,0

1,5

2,0AdenosinaHipoxantinaInosina

895

45224071

4078

857

868

Aeromonassalmonicidassp achromogenesBacillus subtilisBacillusatrophaeus*EnterobacteramnigenusEnterobactergergoviaeSerratia rubidaea

Bacteria (número CECT)

895 4071 4643 4078 4522 857 868nm

ole

s d

e n

ucl

eósi

do

0,0

0,5

Productividad de adenosina mediante transglicosilación catalizada por bacterias productoras denucleósido fosforilasas.Donador y aceptor de ribosa: uridina 5 mM y adenina= 5 mM, respectivamente.Medio de reacción: tampón fosfato de sodio de 25 mM y pH=7. Temperatura de transglicosilación=60ºC(Bacterias CECT 895, 4071 y 4643) y 70ºC (Bacterias CECT 4078, 4522, 857, 686),velocidad de agitación=200 r.p.m y tiempo de reacción=1 hora. Los valores representan el promedio±SD (n=3).

8684643

Serratia rubidaeaXantomonastranslucens

Condezo L.A.- Tesis Doctoral. 2006

de

aden

osi

na

ó i

no

sin

a/m

illo

nes

de

célu

las.

h

0,5

1,0

1,5

2,0Tampón fosfato de potasioTampón fosfato de sodio

45224071

4078

4643

Bacillus subtilisBacillusatrophaeus*Enterobacteramnigenus

Xantomonastranslucens

Bacteria (número CECT)

4071 4643 4078 4522

nm

ole

s

0,0

Efecto de iones potasio en la biosíntesis de adenosina e inosina mediante transglicosilacióncatalizada por bacterias productoras de nucleósidos fosforilasas. Se emplearon las siguientescondiciones de reacción: (1) Bacterias CECT 4071 y 4643 donador ribosa (uridina= 5 mM) y aceptor (adenina= 5 mM), temperatura 60ºC y (2) Bacterias CECT 4078 y 4522: donador de ribosa (uridina= 5 mM),ceptor (hipoxantina= 5 mM), temperatura 70ºC. Todas las reacciones se mantuvieron a 200 r.p.m durante 1 hora y la presenciadel ión potasio se logró empleando tampón fosfato de potasio en el medio de reacción. Los valores representan el promedio±SD (n=3).

Condezo L.A.- Tesis Doctoral. 2006

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14

Efecto de la temperatura sobre la reacción de transglicosilación catalizadapor bacterias productoras de nucleósidos fosforilasas. (A) Bacillus atrophaeus(CECT 4071) y (B) Xanthomona translucens (CECT 4643). Condiciones de reacción: relación molar de sustratos=3:1(15 mM de uridina como donador de ribosa y 5 mM de adenina como aceptor, ambos disueltos en tampón fosfato de potasio de 25 mM y pH=7), velocidad deagitación 200 r.p.m y 1 hora de reacciónLos valores representan el promedioSD (n=3).

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

1 ,2

1 ,4

1 ,6U rac iloH ipo xa n tin aU rid inaA d en in aIn os inaA d en os ina

se n

itro

ge

na

da

/mil

lon

es d

e c

élu

las.

h

1 ,6

A

B

T em p era tu ra (ºC )

4 5 5 0 5 5

nm

ole

s d

e n

ucl

eó

sid

o o

bas

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

1 ,2

1 ,4

B

Condezo L.A.- Tesis Doctoral. 2006

Comparative catalytic activity of E. Coli immmobilized on dif ferent supports

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

100.00

0 5 10 15 20 25 30 35nº of cycles

Yie

ld (%

)

Agar Poliacrilamida Agarosa

Figure 1.- Yield in Adenosine synthesis from Uridine using E.coli BL21 ATCC 47092 whole cells immobilized of severalmatrix.. Cycle = 3hrs

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Escherichia coli (proceso 9)agarosefree cells

Ade

nosi

ne p

roduct

ion (%

)

nº of cycles

Figure 5. Comparative thermal stability and reuse of whole cells of Escherichia coli BL21, ATCC47092, reactiontemperature T=60ºC Free and immobilized whole cells in agarose from Gracilaria. Reaction test synthesis of Adenosine fromUridine. Cycle = 3hrs

HO

NH

O

ON

O

YX

ZHHH

BHO

B

O

YX

ZHHH

NH

NH

O

O+

+

W

W

N N

H2N

U= Uridine X=Y= OH; Z= H ; W=HDU= 2'deoxyuridine X=OH; Y=Z=H; W= HDDU = 2',3'-dideoxyuridine X=Y=Z =H; W=HMU= 5-Methyluriidne X=Y=OH , Z=H, W = CH3

AU = ara-uridine ; X=Z= OH; Y=W=H

B=N

NNH

Adenine

N N

NNH

HS

N N

NNH

H3CO

N N

NNH

N N

NH2NOC

H6-Mercaptopurine

6-methoxypurine

purine

3-carboxyamido-1,2-4-triazol

02/05/2010

15

Table 4.- Synthesis of different adenosine nucleosides using immobilizedwhole cells .- Synthesis of some nucleosides using E. gergoviaeimmobilised in agar (2%). T=60ºC; Pyrimidine nucleoside = 0.15mM;adenine =0.05mM

Microorganism Matrix Pyrimidinenucleoside

Reaction time(hrs)

Yield inadenosinenucleoside

(%)E.gergoviae Agar U 3 87

DU 1 42DDU -a 0Td 3 35

AraU a 0AraU - 0E. coli Agarose U 3 89

DU 1 35DDU 24 40Td 1 42

AraU -a 0C.

amalonaticusPolyacryla

mideU 3 91

DU 1 23DDU 24 10Td 1 17

AraU 24 15a Contact time greater than 24hrs

Trelles J.A.; Fernández M.; Lewkowicz E.S.; Iribarren A.M., Sinisterra J.V. Tetrahedron lett. 44(2003)2065-9,

TABLE 5.- Synthesis of some nucleosides using E. gergoviae immobilised in agar(2%). T=60ºC; t=3hrs; Pyrimidine nucleoside = 0.15mM; Base =0.05mM

i i i i (%)

N

NN

N

SH

H

N

NN

N

H

NN

N

NH2

O

H

N

NN

N

OCH3

H

Py nucleoside Base Yield in nucleoside (%)U 6-mercaptopurine 56DU 6-mercaptopurine 18U 3-carboxyamido1,2,5-

triazol45 a

DU 6-methoxypurine 27 ( 24hrs)U Purine 80DU Purine 40 (5hrs)DDU Purine 18 (21hrs)

a yield in virazol

Trelles J.A.; Fernández M.; Lewkowicz E.S.; Iribarren A.M., Sinisterra J.V. Tetrahedron lett. 44(2003)2065-9,

Estado fisiológico de las células de la reacción.El hecho de que el proceso de síntesis de nucleósidos se lleve a cabo a 57º

C o a 70ºC con las células centrifugadas y húmedas ha llevado a pensar a los investigadores que las células deberían morir después de 1 hora de reacción. Para comprobar la viabilidad celular:

El líquido sobrenadante se separa y se cuantifica por

Centrifugam os

a 4000 r.p.m

Añadim os agua destilada que es el blanco que utilizam os para todas las m edidas de absorbancia

HPLC

Tom am os 0,1 m l y o llevam os a 10 de H 2O (habiendo m edido previam ente su concentración)

1 m l1 m l1 m l 1 m l1 m l

10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2

10 m l 9 m l 9 m l9 m l9 m l9 m l

02/05/2010

16

En el siguiente esquema se indican las Placas Petri que mostraron crecimiento (+) a partir de las disoluciones.

660 nm 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Bacillus psychrosaccharolyticus 4074

(+) (+) (-) (-) (-) (-)

Lactobacillus pampilonensis 4219

(+) (+) (+) (-) (-) (-)

Psycrhobacter (+) (+) (-) (-) (-) (-)Psycrhobacter immobilis 4492

(+) (+) ( ) ( ) ( ) ( )

Bacillus coagulans 12

(+) (+) (-) (-) (-) (-)

De ello se deduce que las células que realizan la reacción no mueren durante la misma sino que una parte se mantiene viable. Así pues estamos trabajando con células en estado de no-crecimiento y no células muertas como pensábamos hasta ahora.

CONCLUSIONS

1) Screening for the most interesting biocatalyst

2) Optimization of the reaction conditions

3) Immobilization – stabilization of the

biocatalyst

4) Scale up of the process.

BIOTRANSFORMACIONES-Empleo de células o enzimas como catalizadorespara obtener productos de valor añadido o servicios de interés.

Industria Farmacéutica

Industria Química Fina

Aplicaciones industriales de las Biotransformaciones

Industria Química Fina

Industria agroalimentaria

Tratamiento de efluentes, residuos urbanos o industriales

Producción de bio-gas a partir de residuos urbanos orgánicos

Recuperación de minerales –Biomining

Producción de Biocombustibles

02/05/2010

17

Componente Composición media

Materia orgánica 49%

Papel-cartón 19%

Plástico 12%

Vidrio 8%

Metales férricos 3%

Composición media de losResiduos Sólidos Urbanos (RSU)Ministerio de Medio Ambiente (2000)

Producción de biogas a partir de residuos urbanos

Metales férricos 3%

Metales no férricos 2%

Maderas 1%

Textiles 4%

Complejo. Celulosa 2%

Varios 3%

RSU

Recogida selectiva

Fracción restos Fracción envases

Papel-cartónPlásticosVidrio Metales

Reciclaje

ClasificaciónRechazo

Combustiblederivado de residuoCDR

Vertedero

Rechazo

COMPOSTAJE

BIOMETANIZACION

Fracción orgánica

Separación mecánica

02/05/2010

18

FASE DE HIDRÓLISIS

FASE DE ACIDIFICACIÓN

C6H12O6 + H2O 2 CH3COOH + 2 CO2 + 4H2

C6H12O6 CH3CH2CH2COOH + 2CO2+ 2H2

C6H12O6 + 2 H2O 2 CH3CH2COOH + 2H2O

FASE ACETOGÉNICA

CH3CH2COOH + 2 H2O CH3COOH + CO2 + 3H2

CH3CH2CH2COOH +2H2O 2CH3COOH +2H2

FASE METANOGÉNICA

Bacterias matanogénicas acetoclásticas

CH3COOH + H2O CH4 +H2CO3 G0= -7,44 kcal/mol

Bacterias metanogénicas utilizadoras de hidrógeno

CO2 +4H2 CH4+2H2O G= -32,5 kcal/mol

Peptococucua AnaerobusLactobacillusClostridium spp.ActynomicesBifidobacterium spp.StaphylococcusDesulphovibrio spp.Escherichia coliCorynebacterium spp.

Bacterias acetogénicas

ORDEN FAMILIA GÉNERO ESPECIE

Metanobacteriales Methanobacteriaceae Methanobacterium M. formicicumM. bryantiM. thermoautotrophicumM. ruminantium

Methanobrevibacter M. arboriphilusM. smithiiM. vannielli

Metanococcales Methanococcaceae Methanococcus M. voltae

Methanomicrobium M. mobile

Methanomicrobiales Methanomicrobiaceae Methanogenium M. cariaciM. marisnigri

Methanospirillum M. hungateiM. barkeri

Methanosarcinaceae Methanosarcina M. mazei

Bacterias

Metanogénicas

La gasificación de residuos es una tecnología que se presenta como alternativa a la incineración y respecto a la que presenta claras ventajas técnicas, medioambientales y económicas:

1)menores costes de inversión2)mayor rendimiento eléctrico, lo que incrementa los

ingresos 3)ocasiona un nivel de dioxinas mucho menor que la

incineración4)el caudal de gases a limpiar es el 30-40% del que se

genera en incineración5)el biogas puede ser usado en motores y turbinas, y en

calderas existentes como complemento a otros combustibles; mayor flexibilidad

6) También pude usarse como fuente de H2 e integrado con pilas de combustible

02/05/2010

19

:

Tipo gasificador

Lecho fluido circulante (LFC)

Lecho fluido burbujeante (LFB)

LFC-twin

“Shaft slagging”

“Updraft”

Horno rotativo + gasif. arrastre (“slagging”)

Horno rotativo

Otros

Consideraciones generales a la hora de elegir entre un proceso aeróbico y otro anaerobio

1)el tratamiento anaerobio no conduce a los bajos valores de COD,BOD o TOC, que nos piden las leyes anti - contaminación.2)aguas residuales muy concentradas deberían ser tratadas anaeróbicamente debido a la posibilidad de recuperación de la energía contenida en la materia orgánicaenergía contenida en la materia orgánica.3) La eficiencia de reducción de los valores COD por ambos procesos es muy similar.4)Aguas residuales con bajas concentraciones de compuestos orgánicos polucionantes deberían ser tratadas.5)Los tratamientos anaerobios son más costosos que los aeróbicos a nivel de inversión pero más fáciles de manejar.

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I d t i li t i

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Recuperación de minerales –Biomining

Producción de Biocombustibles

Bioremediación utilizando microorganismos

02/05/2010

20

La tecnología microbiana presenta ventajas sobre los métodos no biológicos de recuperación de minerales, entre los que podemos encontrar: 1)Requieren poca inversión de capital (las bacterias pueden ser aisladas a partir de aguas ácidas de minas). 2)B j t d ió i l

Recuperación de minerales de minas pobres

2)Bajos costes de operación necesarios para las operaciones hidrometalúrgicas en comparación con los procesos convencionales. 3)Relativa ausencia de polución o contaminación ambiental durante el proceso. 4)El tratamiento del creciente cúmulo de minerales de baja ley en las minas que no pueden ser económicamente procesados por los métodos tradicionales.

Lixiviación indirecta de metales T. ferroxidans

proceso aerobio

FeS2 + 7/2 O2 + H2O Fe SO4 + H2SO4

2 FeSO4 + 1/2 O2 + H2 SO4 Fe2(SO4)3 + H2O

proceso anaerobioCuFeS2 + 2 Fe2(SO4)3 CuSO4 + 5 FeSO4 + 2S2 2( 4)3 4 4

Cu2S + 2Fe2(SO4)3 2 CuSO4+ 4FeSO4 + 2 S

produccion de ácido sulfúrico

2S + 3O2 + 2H2O 2H2SO4

Lixiviación directa - aerobia

2FeS2 +H2O+15/2 O2 Fe2(SO4)3 + H2SO4

2 CuFeS2 + 17/2 O2 + H2SO4 2CuSO4 + FE2(SO4)3 + H2O

ECUACIÓN GENERAL

MS + 2 O2 MSO4

02/05/2010

21

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Producción de Biocombustibles

Bioremediación utilizando microorganismos

Biocatálisis en la producción de emergías limpias y renovables

1. Biogas

2. Biodiesel

3. Bioetanol

15% del consumo energético mundial

4. Hidrogeno

Biodiesel

El biodiesel ( esteres metílicos de los acidos grasos) Ventajas.- se obtiene de Fuentes renovables. Biomasa

no aumenta la producción global de CO2puede producirse con baja tecnologíaes biodegradable a diferencia del dieselse reduce la producción de CO, compuestos de azufre y de óxidos de nitrógeno

Se produce por 1.- transesterificacion de trigliceridos (aceites vegetales ) con metanol usando lipasas o

microorganismos (Candida, Pseudomonas, Rhizopus).Bajos niveles de contaminación ambiental y bajo consumo de energiaBajos niveles de contaminación ambiental y bajo consumo de energiaElevados costos de produccion, moderados rendimientos

2.- saponificación- esterficación de trigliceridos con KOH y MeOH.Proceso con buenos rendimientosAlto consumo de energía, difícil recuperar el glicerol, tratamiento del agua residual para eliminar el catalizador básico, los ácidos grasos libres y el agua interfieren en el proceso

Alcalde e al. TRENDS in Biotechnol. 24, 281-287 (2006)

02/05/2010

22

Bioetanol

Se puede obtener de fuentes renovables incluyendo cosechas agricolas: maiz, azucar de caña; residuos de industrias alimentarias como suero de industrai quesera etc.

Sustituye en un 100% a la gasolina y no hay que añadir el Me-O-tBu (para subir I.O) que es tóxico

Se produce: por hidrólisis ácida de polisacaridos: celulosa, almidón etc.Alto rendimiento y consumo energético

por fermentación alcoholica usando bacterias levaduras u hongospor fermentación alcoholica usando bacterias, levaduras u hongosBajo consumo energético, producción de biomasa

por hidrólis enzimática con α-amilasas, glucosidadsas etcBajo consumo energetico, proceso caro

Alcalde e al. TRENDS in Biotechnol. 24, 281-287 (2006)

Biohidrógeno y células de biofuel

El hidrógeno es un combustible incoloro, inodoro y que genera un producto de combustiónno tóxico (H2 O).

La generación de hidrógeno de biomasa esta en sus inicios

Rhodobacter spheroides se ha utilizado para producir hidrógeno a partir de residuosvegetales. La producción es baja 0.37 y 3.3 mol de hidrógeno por mol de glucosa

Las enzimas que usan son lacasas e hidrogenasasLas enzimas que usan son lacasas e hidrogenasas

Martens & Liese Curr. Opinion Biotechnol. 15,343-348 (2004)Kruse et al. Photochem. Pjhotobiol.Science 4, 957-970 (2005)

BIOTRANSFORMACIONES-Empleo de células o enzimas como catalizadorespara obtener productos de valor añadido o servicios de interés.

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Recuperación de minerales –Biomining

Producción de Bio-combustibles

Bio-remediación utilizando microorganismos

02/05/2010

23

Bio-remediación de contaminantes persistentes

Los microorganismos salvajes o GMO son excelentes candidatos a la eliminación de materiales altamente contaminantes. V.g.; eliminación de residuos de hidrocarburos: hundimiento del Prestige. Pseudomonas fluorecens HK44

Problemas: los GMO crecen mas lentamente que las cepas salvajes .los OGM pueden alterara el ecosistema

Utilizan mono-o dioxigenasas,reductasas, dehalogenasas,Citocromo P450 monoxigenasas etc.

Alcalde e al. TRENDS in Biotechnol. 24, 281-287 (2006)

Producen compuestos oxigenados menos tóxicos que los productos departida y mas fácilmente biodegradables

1.-Visión del Sector Empresarial Español en IndustriaBiotecnológica

- Visión general- Volumen de las empresas- Perfil del sector de la Industria Biotecnológica

2.-Entorno de la Industria Biotecnológica- Institucional- Legal- Sociológico- Científico

Distribución de empresas Biotecnológicas por áreas de actividad

3313

17

Salud humana Salud animal AlimentaciónAgricultura Medio Ambiente Bioprocesosotros

19

31

54

23

02/05/2010

24

-Empresa de tamaño medio (< 500 trabajadores)-Con experiencia reciente en el campo de la Biotecnología ( eo 81% ha

iniciado su actividad hace menos de 25 años)-Empresas localizadas preferentemente en Madrid o Cataluña-Capital mayoritariamente nacional (63%)- Con vocación exportadora ( >50%)-Empresas altamente innovadoras.- 40% de las empresas han

desarrolladonuevosproductosbiotecnológicoscongastoenI+D

Perfil medio de la empresa de Biotecnología Española

desarrollado nuevos productos biotecnológicos con gasto en I Ddel 4% de las ventas

-Alto porcentaje en titulados superiores (52% son Licenciados odoctores) y el 9% del personal se dedica a I+D

- Muy dinámica en el campo de alianzas y/o procesos de fusión /adquisición (26% de las empresas se han fusionado en losultimo dos años.)

-Los beneficios de la industria Biotecnológica Española en el bienio1998-99 han sido mayores que el promedio de la industriaespañola

Alianza

Investigación y Descubrimiento Desarrollo P d ió

Joint-VentureAbsorción,Fusión

Evolución de una compañía Biotecnológica en el sector de Sanidad

Descubrimiento Desarrollo Preclínico/Clínico

Salida a bolsa

Producción

Ventas-Marketing

15

20

25

de empresas

Distribución de empresas Biotecnológicas según el número de empleados

0

5

10

<20 20‐49 50‐99 100‐199 200‐499 500‐999 1000‐1500 1500‐2000 2800‐10000

Porcentaje d

Número de empleados

1998

20002003

02/05/2010

25

40

50

60

70

Tipo de empresa Biotecnologica

2000

0

10

20

30

Privado Nacional Privado Internacional Público

1999

2000

20002003

1.-Visión del Sector Empresarial Español en IndustriaBiotecnológica

- Visión general- Volumen de las empresas- Perfil del sector de la Industria Biotecnológica

2.-Entorno de la Industria Biotecnológica- Institucional- Legal- Sociológico- Científico

E ntorno de la F inanciac ión de la industria B iotecnológica1 .-La escasa o rientac ión de l e ntorno financie ro e spaño l ha cia la

B iotecnología es un punto débil fre nte a o tros pa íses2 .-La B iotecnología despierta c ada vez ma s interés e ntre los

inve rsores e spañoles . Un 25 -30 % de la s e mpresas capital-riesgo han invertido e n

B iotecnología3 .-Las princ ipales e scollos a ducidos pa ra inve rtir en

B iotecnología sonl i l d i ió i d d d l-alto nive l de inversión y periodos de ma durez alto s

-dificultad de evalua r e l proye cto-escasez de pe rsona l c ualifica do-escaso nume ro de pro yectos e valuables.

4 .-Las princ ipales o portunidades que de tecta e l c apital-riesgo son

-mercado c on a lto c recimiento -alto po tencia l económico-secto r muy innova dor y con g ra n c apacida d de crea rvalo r para e l inverso r

02/05/2010

26

Entorno Legal1.-La Biotecnología es uno de los sectores mas regulados

que existen - tanto a nivel español como europeo - en contra dela percepción opuesta de la sociedad en general

2.-La regulación se encuentra - sobre todo - en los subsectoresde salud humana, salud animal, agricultura, alimentación y medioambiente que tiene una mayor transcendencia a nivel ético,político, social y socioeconómico.

3.-El ámbito europeo es el que ofrece un mayor número deregulaciones y normativas sobre Biotecnología y sus aplicaciones,seguido del ámbito nacional y regional

Grado de aceptación de las aplicaciones Biotecnológicas

Uso España Europa

Uso para producción de alimentos 2.94 2.19

Transferencia Genética entre plantas para hacerlasresistentes a las plagas

3.28 2.33

Inducir genes humanos en bacterias para producirmedicamentos o vacunas

3.26 2.53

Clonación de células humanas o tejidos para reemplazarlos 3.45 2.83

Entorno sociológico

j p pen pacientes

Clonación de animales para producir medicamentos(insulina)

3.10 3.01

Uso para detección de enfermedades hereditarias 3.38 3.01

Desarrollo de bacterias modificadas genéticamente paralimpiar vertidos de petróleo o productos químicospeligrosos

3.20 3.17

Entorno I+D+I

1.- España dispone de una oferta científico-tecnológica de calidad comparable a la mediaeuropea. No tiene masa critica

2.-La mayor concentración de recursos humanos y técnicos se dan en la universidades y en al CSIC, peor no en las empresas

Universidades CSIC

1.- UCM 1.-Centro de Biotecnología

2.-Autónoma de Barcelona 2.- Centro Investigaciones

3.-Central de Barcelona Biológicas

4.- Navarra

5.-Autónoma de Madrid

Informe ASEBIO 2000

02/05/2010

27

Empresas13%

Distribución de Proyectos Europeos(VI Programa Marco)

Entorna I+D+I

Universiades33%

CSIC34%

Opis no CSIC9%

Hospitales11%

13%

Biotecnología

Ciencia del S-XXI

Salud humana

Salud animal

Bioprocesos

Medio-ambiental

A li t iAgrolimentaria