Breviář forenzní genetiky Forenzní DNA analýza v otázkách a odpovědích

Halina Šimková

Tribun EU

2012

Breviář forenzní genetiky Forenzní DNA analýza v otázkách a odpovědích

Halina Šimková

recenzovali:

doc. Jiří Drábek, Ph.D.

Ing. Aleš Hořínek

Mgr. Vlastimil Stenzl

Tato publikace je spolufinancována Evropským sociálním

fondem a státním rozpočtem České republiky z projektu

CZ.1.07/2.3.00/09.0080 – „4n6gen – vzdělávání v oblasti

forenzní genetiky“.

Řešitelem uvedeného projektu je Československá

společnost pro forenzní genetiku – www.cssfg.org.

Publikace obsahuje řadu ilustrativních příkladů užití forenzně

genetické expertízy v reálných situacích. Tyto příklady vycházejí ze

skutečných případů, na nichž autorka v průběhu své praxe pracovala,

či s nimiž se seznámila, jsou však oproti realitě zjednodušeny či

pozměněny tak, aby co nejlépe sloužily jako modelové; jsou vynechána

či zcela změněna všechna identifikační data týkající se jak osob, tak

míst.

© Halina Šimková, 2012

Illustrations © Halina Šimková, 2012

Cover illustrations © Halina Šimková, 2012

This edition © Tribun EU, 2012

ISBN

5

Obsah Seznam ilustrací ........................................................................................... 7

Předmluva .................................................................................................. 11

Forenzní genetika jako obor ................................................................ 13

Biologické stopy a biologický materiál ............................................ 18

Obecné pojmy .................................................................................................... 18

Tkáňový původ, druhový původ a původce biologického

materiálu ............................................................................................................. 19

Využitelnost biologického materiálu pro forenzně genetickou

analýzu ................................................................................................................. 25

Nakládání s biologickými stopami ............................................................ 29

Vlastnosti a chování biologického materiálu ve stopách................. 37

Důkazní potenciál stopy ................................................................................ 46

Seznámení s genetikou ........................................................................... 50

Základní fakta o DNA ...................................................................................... 50

Základní principy fungování dědičné informace ................................ 58

Forenzní potenciál genetické analýzy .............................................. 69

Individualita a identifikace .......................................................................... 69

Určení příbuznosti ........................................................................................... 80

Predikce biogeografického původu a fenotypových znaků osoby

................................................................................................................................. 95

Obecné principy forenzně genetické analýzy ................................ 99

Principy identifikace ....................................................................................... 99

Principy určení příbuznosti ...................................................................... 117

Principy predikce biogeografického původu a fenotypových

znaků osoby..................................................................................................... 122

Technologie forenzně genetické analýzy ..................................... 127

Základní kroky forenzně genetické analýzy ...................................... 127

Izolace (extrakce) DNA ............................................................................... 129

Kvantifikace (a případná charakterizace) DNA ................................ 140

Amplifikace DNA ........................................................................................... 146

Elektroforéza DNA ........................................................................................ 153

6

Analýza STR lokusů ...................................................................................... 158

Analýza HVR mt DNA ................................................................................... 161

Analýza SNP lokusů ...................................................................................... 164

Nakládání se stopami obsahujícími degradovanou DNA

a/nebo malá množství DNA ...................................................................... 166

Interpretace forenzně genetických dat ......................................... 175

Obecné kroky a pravidla interpretace dat .......................................... 175

Spolehlivost dat – technická kvalita dat ............................................... 176

Kvalita v laboratoři ....................................................................................... 179

Vypovídací hodnota dat .............................................................................. 182

Zdroje chyb ve forenzně genetické expertíze .................................... 185

Uchovávání zdrojů genetických informací ................................... 190

Banky (archivy, depozity) biologického materiálu ......................... 190

Banky izolátů DNA ........................................................................................ 191

DNA databáze .................................................................................................. 192

„Non–human“ forenzní analýza živočišné, rostlinné a

mikrobiální DNA .................................................................................... 196

Forenzní analýza živočišné DNA ............................................................. 196

Forenzní analýza rostlinné DNA ............................................................. 198

Forenzní analýza mikrobiální DNA ........................................................ 199

Doslov ........................................................................................................ 201

O autorce ................................................................................................... 202

Doporučená literatura a informační zdroje ................................. 203

Rejstřík ...................................................................................................... 204

7

Seznam ilustrací

Obrázek 1 – Charakteristiky biologické stopy .........................................................20

Obrázek 2 – Degradace DNA – příčiny .........................................................................32

Obrázek 3 – Odběr biologického materiálu ...............................................................34

Obrázek 4 – Kontaminace stopy .....................................................................................36

Obrázek 5 – Primární a sekundární přenos biologického materiálu .............44

Obrázek 6 – Struktura jednořetězcové DNA ............................................................51

Obrázek 7 – Struktura dvouřetězcové DNA .............................................................52

Obrázek 8 – Karyotyp ..........................................................................................................53

Obrázek 9 – Genetický kód ...............................................................................................55

Obrázek 10 – DNA v lidské buňce ..................................................................................57

Obrázek 11 – Variabilita lokusů v DNA ......................................................................60

Obrázek 12 – Meióza (redukční dělení) .....................................................................62

Obrázek 13 – Oplození .......................................................................................................63

Obrázek 14 – Dědičnost autozomálních lokusů .....................................................64

Obrázek 15 – Dědičnost Y–chromozomálních lokusů .........................................66

Obrázek 16 – Dědičnost X–chromozomálních lokusů . ........................................67

Obrázek 17 – Dědičnost mitochondriální DNA .......................................................68

Obrázek 18 – Genetický profil osoby ..........................................................................71

Obrázek 19 – Genetická informace jednovaječných dvojčat ............................74

Obrázek 20 – Genetická informace dvouvaječných dvojčat .............................76

Obrázek 21 – Genetická informace chimérického jedince .................................78

Obrázek 22 – Rodokmen – stupeň příbuznosti ......................................................87

Obrázek 23 – Rodokmen – dědičnost autozomálních lokusů ..........................88

Obrázek 24 – Rodokmen – dědičnost X–chromozomálních lokusů ...............89

Obrázek 25 – Rodokmen – dědičnost Y–chromozomálních lokusů ...............90

Obrázek 26 – Rodokmen – dědičnost mitochondriální DNA ............................91

Obrázek 27 – Rodokmen – konsangvinita a incest ...............................................93

Obrázek 28 – Rodokmen – mnohotný incest ...........................................................94

Obrázek 29 – Struktura krátké tandemové repetice (STR) . .......................... 101

Obrázek 30 – Alely STR lokusu – standardní a mikrovariantní. ................... 103

Obrázek 31 – Srovnání genotypu stopy a osoby .................................................. 106

Obrázek 32 – Struktura jednonukleotidového polymorfismu (SNP). ........ 109

Obrázek 33 – Struktura mitochondriální DNA (mtDNA) ................................ 113

Obrázek 34 – Určení pohlaví ........................................................................................ 123

8

Obrázek 35 – Základní kroky technologického zpracování stopy................ 128

Obrázek 36 – Princip organické extrakce DNA. .................................................... 133

Obrázek 37 – Princip vyvázání enzymatických kofaktorů .............................. 134

Obrázek 38 – FTA karty ................................................................................................. 135

Obrázek 39 – Vazba DNA na siliku ............................................................................ 137

Obrázek 40 – Diferenciální lýza .................................................................................. 138

Obrázek 41 – Laserová mikrodisekce (LCM) ......................................................... 139

Obrázek 42 – Spektrofotometrická kvantifikace ................................................. 142

Obrázek 43 – Fluorimetrická kvantifikace ............................................................. 143

Obrázek 44 – Specifická kvantifikace – princip .................................................... 144

Obrázek 45 – Specifická kvantifikace – slot blot hybridizace ........................ 145

Obrázek 46 – Složení PCR směsi a denaturační fáze PCR ............................... 148

Obrázek 47 – Anelační a elongační fáze PCR ........................................................ 149

Obrázek 48 – Princip elektroforézy DNA ............................................................... 154

Obrázek 49 – Princip kapilární elektroforézy ....................................................... 157

Obrázek 50 – Monoplexová a multiplexová analýza STR lokusů . ............... 159

Obrázek 51 – Sekvenace asymetrickou PCR ......................................................... 163

Obrázek 52 – Monoplexová a multiplexová analýza SNP lokusů ................ 165

Obrázek 53 – Mechanismy degradace DNA .......................................................... 166

Obrázek 54 – Klasická a miniSTR analýza ............................................................. 169

Obrázek 55 – Stochastické jevy ................................................................................... 173

Obrázek 56 – Základní kroky procesu práce s daty. ........................................... 175

Obrázek 57 – Možné formy uchovávání zdrojů genetických informací .... 190

9

10

Motto:

Cílem vědy není otvírat dveře nekonečné moudrosti, nýbrž

vytknout meze nekonečnému omylu.

Eugen Berthold Friedrich Brecht

Děkuji recenzentům za všechny cenné připomínky, výtky a postřehy, které

nemalou měrou přispěly ke zkvalitnění této publikace. Své rodině pak

děkuji za neutuchající podporu, vstřícnost a pochopení.

Věnováno mému gymnaziálnímu profesorovi biologie Petru Pačovskému,

jehož expresívní líčení tajného vnitřního života buněk, jakož i ostatních

mystérií živé přírody, bylo zcela neodolatelné.

11

Předmluva,

která by neměla zůstat nepřečtena

Forenzně genetický posudek bývá silným argumentem jak v oblasti

trestního práva, tak v rámci práva občanského. Jako každý takto

mocný nástroj může při správném použití velmi účinně pomáhat

k nastolení spravedlnosti a práva, při nesprávném použití však

může napáchat nesmírné škody.

Umět správně vnímat a posoudit výsledky jakékoliv genetické

analýzy znamená rozumět alespoň základům věci, principům, které

se v genetice uplatňují, a jejich logickým důsledkům.

Pro člověka bez přírodovědného vzdělání je ovšem velmi těžké, ba

až nemožné porozumět všem zákonitostem, postupům a závěrům

tohoto oboru na základě „samostudia“. Musí to tedy být znalec, kdo

se pokusí objasnit všechny aspekty forenzní genetiky řečí

srozumitelnou a přístupnou.

Tento breviář je proto psán jako populárně naučné pojednání,

primárně zaměřené na čtenáře, který má o genetice a forenzní

genetice jen základní představu, ale rád by do oboru pronikl

hlouběji; rozebírány jsou především univerzálně platné odborné

aspekty forenzní genetiky, přičemž publikace se současně záměrně

úzkostlivě vyhýbá právním aspektům forenzně genetických

zkoumání.

Mou snahou bylo podat někdy i poměrně obtížnou problematiku co

nejsrozumitelněji, což se místy neobešlo bez určitého vědomého

zjednodušování (proto v publikaci najdete řadu příslovcí

„zpravidla“, „často“, „obvykle“ atd., odkazujících, že zde popsané

není jediné možné). Věřím, že takový postup je ku prospěchu věci.

Podrobnější informace jsou dohledatelné v odborných publikacích,

12

přičemž tipy na některé z nich najde čtenář v závěrečné Doporučené

literatuře.

Mým přáním je, aby čtenář, ač sám zcela jiného odborného

zaměření, pročítal tento breviář s porozuměním a získal díky němu

vhled do forenzní genetiky jako oboru možná v detailech složitého,

avšak jako celku nesmírně krásného a logického.

autorka

ve východních Čechách, květen 2012

13

Forenzní genetika jako obor

Co je to genetika?

Termín genetika pochází z řeckého genetíkos, odvozeného od

genesis – původ, počátek. V nejširším pojetí je genetika nauka

o dědičnosti a proměnlivosti živých organismů a o buněčných

základech této dědičnosti, tj. o dědičné informaci nesené v DNA.

Co je to forenzní?

Termín forenzní pochází z lat. forensis, odvozeného od forum –

náměstí. Na náměstí v antickém Římě se konala veřejná soudní

jednání a slovo forenzní dnes používáme ve významu „týkající se

soudu či dokazování“.

Co je to forenzní genetika?

Forenzní genetika, též označovaná jako forenzní DNA analýza, je

v nejširším pojetí věda zabývající se genetickým zkoumáním pro

potřeby dokazování a objasňování v trestních i civilních řízeních

před státními orgány, ale též pro potřeby posuzování hypotéz mimo

tato řízení – např. v rámci jiných vědních oborů nebo v soukromých

záležitostech fyzických osob.

Jaká jsou hlavní aplikace forenzní genetiky?

Základními aplikacemi forenzní genetiky jsou: kriminalistika,

identifikace a posuzování biologické příbuznosti jedinců. Tyto

směry pochopitelně nejsou striktně oddělené a často se vzájemně

prolínají.

Kriminalistická genetika zabývá genetickým zkoumáním

biologických stop a srovnávacích vzorků osob v rámci vyšetřování a

dokazování trestných činů či jiných kriminalisticky relevantních

14

událostí. Hlavním účelem těchto zkoumání zpravidla bývá určení

původce příslušných biologických stop.

Identifikační genetika se zabývá genetickou identifikací osob

živých (imigrační řízení, ověřování totožnosti atd.) či mrtvých

(nálezy neznámých mrtvol, hromadná neštěstí, oběti válečných

konfliktů v hromadných hrobech atd.).

Posuzování biologické příbuznosti jedinců zahrnuje zejména

paternitní zkoumání v případech, kdy je třeba určit otce dítěte, ale

též posuzování jiných biologických příbuzenských vztahů pro

nejrůznější účely (dědická řízení, genealogická zkoumání atd.).

Jaké další aplikace forenzní genetika má?

Forenzně genetická analýza se uplatňuje dále v chovatelství,

zemědělství a potravinářství (zkoumání pravosti rostlinných a

živočišných produktů, identifikace zvířecích jedinců, rodokmenové

studie chovných zvířat, identifikace rostlinných odrůd a živočišných

plemen atd.).

V archeologii se uplatňuje forenzní genetice velmi blízká

archeogenetika neboli analýza starodávné DNA – aDNA (angl.

ancient DNA), užívaná ke zkoumáním archeologického biologického

materiálu, jako jsou lidské i zvířecí kosterní nálezy, ale též tkáně

mumií, rostlinný materiál atd.

Rovněž některé okruhy lékařské genetiky jsou s forenzní

genetikou metodicky téměř totožné; spadají sem například

identifikace buněčných linií, průkaz ztráty heterozygozity nebo

mikrosatelitové nestability (u pacientů s nádorovým

onemocněním), průkaz monozygozity dvojčat (v případech

závažného dědičného onemocnění u jednoho z dvojčat), průkaz či

vyloučení paternity (v případě neočekávaného výsledku

popírajícího základní pravidla genetiky při nepřímé DNA

15

diagnostice v rodině postižené dědičným onemocněním) nebo

určování chromozomálních odchylek plodu analýzou plodové vody,

choriových klků či fetální krve.

Kdy poprvé byla forenzně genetická analýza použita?

Poznatky genetiky jsou v rámci forenzních zkoumání uplatňovány

již několik desítek let. Typickým příkladem je posuzování

příbuznosti osob na základě znalosti principů dědičnosti krevních

skupin. Tyto postupy však nepracují přímo s rozborem DNA, pouze

se znalostmi dědičnosti určitých znaků.

Zásadním milníkem v historii forenzní genetiky se stal převratný

objev, který učinil v roce 1984 britský vědec Alec John Jeffreys,

genetik působící na univerzitě v Leicesteru. Při studiích věnovaných

zkoumání variability genových rodin „mimochodem“ nalezl metodu,

kterou bylo možno zobrazit genetickou jedinečnost každého

člověka. Tuto metodu nazval DNA fingerprinting, tedy „genetický

otisk prstu“.

První reálný případ, v němž byl užit DNA fingerprinting

k identifikaci pachatele, byly vraždy a znásilnění Lyndy Mann

(†1983) a Dawn Ashworth (†1986) v hrabství Leicestershire.

Biologické stopy, zajištěné v obou případech, byly analyzovány roku

1987 Alecem Jeffreysem jeho metodou DNA fingerprintingu a

posléze úspěšně ztotožněny s konkrétním mužem – místním

pekařem Colinem Pitchforkem.

V našem prostředí byla forenzně genetická analýza poprvé použita

v čerstvě porevolučním Československu; v červnu 1990 byla na

dámském WC Pedagogické fakulty Masarykovy univerzity v Brně

brutálně napadena a ubodána devatenáctiletá studentka Jana

Krkošková. Na místě činu byly mimo jiné zajištěny krevní kapky,

které mohly vzniknout otřepáním poraněné ruky. Krátce nato byl

16

zadržen podezřelý – již dříve pro sexuální napadení trestaný Milan

Lubas. Průlomový znalecký posudek, který jasně ztotožnil krevní

kapky z místa činu s tímto podezřelým a naopak – krevní stopy

z jeho oděvu se zavražděnou, zpracoval Doc. RNDr. Vladimír

Ferák, CSc., vedoucí katedry genetiky a molekulární chemie

Přírodovědecké fakulty Univerzity Komenského v Bratislavě. První

expert Kriminalistického ústavu Praha a rovněž velmi významný

průkopník oboru, RNDr. Jaroslav Brouček, CSc., začal na

kriminálních případech pracovat roku 1992, kdy byl také vyškolen

u FBI.

Jak se obor změnil od dob prvních analýz?

Přestože původní Jeffreysova metoda byla ve své době zcela

převratná, měla některá omezení: především k úspěšné analýze

bylo třeba relativně velké množství biologického materiálu,

obsahujícího nedegradovanou či jen málo degradovanou DNA, a

rovněž získaná data nebylo možno jednoduše databázovat a

vzájemně ve větším objemu porovnávat.

Další vývoj tedy směřoval k práci se vzorky degradovanými a

s malým množstvím využitelné DNA, přičemž původní Jeffreysova

metoda byla zcela opuštěna a nahrazena metodami založenými na

amplifikaci, tj. zmnožování DNA ve vzorku. Tyto nové metody navíc

poskytují data snadno převoditelná do digitální podoby, a tudíž

mnohem vhodnější pro elektronické databázové zpracování.

Kam nyní forenzní genetika směřuje?

Hlavními vytýčenými současnými směry rozvoje jsou zrychlení a

automatizace analýz včetně získání výsledků v reálném čase přímo

na místě činu, práce s vysoce problematickými vzorky (včetně

snížení hranice detekčního limitu pří zachování kvality analýz) a

rozšíření potenciálu oboru na prediktivní analýzy (tj. stanovování

17

určitých tělesných charakteristik osob ze stop na místě činu).

Pozornost oboru se též obrací k metodám umožňujícím určovat a

tkáňový původ stopy molekulárně genetickými metodami a též

určovat stáří stopy.

18

Biologické stopy a biologický materiál

Obecné pojmy

Co je to biologický materiál?

Jako biologický materiál obecně označujeme vše, co bylo či je

součástí nebo produktem živého organismu. Biologický materiál tak

může mít nesmírně mnoho podob: může jím být sušená bylinná

čajová směs stejně jako prázdná motýlí kukla, ohryzek jablka, moč

v toaletě, modřínové prkno, krev na náplasti v odpadkovém koši,

koňský trus, zkumavka s virem Eboly, cukrářské droždí, hovězí

steak, kožešinový límec atd.

Co je to biologická stopa?

Biologický materiál, který je zajištěn například na místě trestného

činu a stane se předmětem znaleckého zkoumání, je označován jako

biologická stopaPřestože z výše uvedeného příkladmého seznamu

se znalec zcela jistě nejpravděpodobněji setká s krvavou náplastí,

v určitých zvláštních situacích mohou být předmětem jeho

zkoumání i ostatní uvedené materiály. Obecně tedy lze jen velmi

obtížně vymezit, jaký typ biologického materiálu může být

forenzně zkoumán. Vždy to záleží na konkrétní situaci.

Kdy by kupříkladu připadalo v úvahu forenzně biologické a genetické

zkoumání hovězího steaku? Třeba tehdy, pokud by skot v daném státě

byl zasažen určitou infekční chorobou, například kravskou chřipkou

(taková nemoc sice zatím neexistuje, ale média ji jistě dříve nebo

později objeví...). Příslušná veterinární správa v této situaci často

nařídí likvidaci zasažených chovů. Pokud by se objevilo podezření, že

někdo z chovatelů nařízení nedodržel a zvířata z porážky neskončila

v kafilérii, nýbrž na stolech nic netušících strávníků, lze v principu

19

forenzně genetickou analýzou dohledat přesný původ takového

podezřelého masa.

V praxi se velmi často setkáme s tím, že stopa je jako „biologická“

označena už kriminalistickým technikem při zajištění. To ovšem

může být někdy zavádějící: pouze a jedině znalec totiž může

určit, zda stopa má skutečně povahu biologického materiálu či

nikoli. Zatímco někdy je tato biologická povaha stopy zjevná, a to i

laikovi (např. červenohnědá hmota na dámské hygienické vložce,

mléčně bělavá vazká hmota uvnitř použitého prezervativu atd.),

jindy je přítomnost biologického materiálu ve stopě pouze

suspektní (kupříkladu nedopalek cigarety sice biologický materiál

obsahuje často, ale ne vždy; světlejší červenohnědé skvrny na oděvu

mohou a nemusejí být krví, a to dokonce i tehdy, reagují–li pozitivně

na orientační testy, o nichž budeme mluvit později; atd.).

V případu obchodování s „bílým masem“ byly postupně na různých

místech činu zajišťovány nedopalky cigaret, a to vždy několika

značek; analýza byla bezproblémová, pouze u jedné konkrétní značky

cigaret se nikdy nepodařilo izolovat detekovatelné množství DNA a

určit genetický profil osoby, což bylo zvláštní. Po vyřešení případu se

příčina vyjasnila: jedna z pachatelek nosila s oblibou dámské

rukavičky a cigarety kouřila s použitím cigaretové špičky, takže

nedošlo ke kontaktu cigarety se rty.

Tkáňový původ, druhový původ a původce

biologického materiálu

U biologických stop nás obvykle nejvíce zajímá, jaký tkáňový

původ biologický materiál má, z jakého organismu pochází (tzv.

druhový původ) a kdo je jeho konkrétním původcem.

20

Obrázek 1 – Charakteristiky, které zpravidla chceme znát u biologické stopy: tkáňový původ, druhový původ a původce.

Co je to tkáňový původ (též označovaný jako druh)

biologického materiálu?

Tkáňovým původem (druhem) biologického materiálu

rozumíme typovou podstatu materiálu – tedy zda se jedná o krev,

sperma, sliny, moč, výkaly, poševní materiál, povrchové epitelie

kůže atd. Určení se provádí především mikroskopickými,

biochemickými a imunologickými zkouškami, v relativně blízké

budoucnosti pak lze v této oblasti očekávat rovněž nástup

molekulárně genetické diagnostiky.

21

Jaký je rozdíl mezi orientační a specifickou zkouškou

tkáňového původu biologického materiálu?

Orientační a specifické zkoušky se liší svou vypovídací hodnotou,

cenou a rychlostí provedení.

Pozitivní výsledek orientační zkoušky indikuje, že by se mohlo

(ale nemusí!) jednat o daný materiál (např. pozitivní výsledek

orientačního testu přítomnosti krve znamená, že testovaná skvrna

by mohla být krev; může se však jednat i např. o ovocnou šťávu).

Orientační zkoušky bývají zpravidla levné a rychlé, s nízkou

frekvencí falešně negativních výsledků a s vyšší frekvencí falešně

pozitivních výsledků. Bývají zaměřeny na detekci přítomnosti

určitých chemických látek či enzymů, nebo jsou to zkoušky fyzikální

povahy – užití alternativních světelných zdrojů.

Naproti tomu pozitivní výsledek specifické zkoušky prokazuje, že

se s určitostí jedná o daný materiál (např. pozitivní výsledek

specifického testu přítomnosti spermatu znamená, že testovaná

skvrna je s určitostí sperma). Specifické zkoušky bývají obvykle

zaměřeny na detekci přítomnosti specifických bílkovin, hormonů a

podobně. Nutno však mít na paměti, že i nejspecifičtější zkouška

může s určitou velmi malou pravděpodobností poskytovat falešně

pozitivní výsledek.

Kdy má smysl tkáňový původ biologického materiálu

stanovovat?

Stanovení tkáňového původu materiálu je důležité zejména

tehdy, kdy nám tato informace poslouží k potvrzení či

vyvrácení našich hypotéz.

22

Zatímco v některých případech je typ biologického materiálu

irelevantní, jindy může zásadně změnit pohled na hodnotu DNA

profilování a důkazu jako takového.

V případu znásilnění byly ke zkoumání předloženy dvě věcné stopy:

domácí telefon a parafínová svíce. Poškozená uváděla, že pachatel jí

do pochvy nejprve zasouval svíčku, poté na ní vykonal soulož

s ejakulací do pochvy a nakonec jí do pochvy zasouval sluchátko

domácího telefonu. Obviněný toto popíral. Biologickou a genetickou

analýzou byla na svíci zjištěna přítomnost většího množství poševních

epitelií poškozené, na sluchátku telefonu byla zjištěna přítomnost

směsi poševních epitelií poškozené a spermatu obviněného. Tato

zjištění významně podpořila pravdivost výpovědi poškozené. Bez

stanovení tkáňového původu biologického materiálu by v tomto

případě důkazní hodnota stop značně klesla (samotné genetické

zkoumání by se omezilo na konstatování, že na svíci se nachází

neurčený biologický materiál poškozené a na sluchátku směs

neurčených biologických materiálů poškozené a obviněného, kteří oba

mohli telefon používat k jeho původnímu účelu).

Kdy nemá smysl tkáňový původ biologického

materiálu stanovovat?

Zatímco ve výše uvedeném příkladu je určení tkáňového původu

biologického materiálu zcela zásadní, jindy je tato analýza

nadbytečná až zbytečná a někdy může být i ke škodě věci.

Především u stop s předpokládaným malým až velmi malým

obsahem biologického materiálu je vhodné vždy pečlivě uvážit,

jak moc je stanovení tkáňového původu materiálu přínosné a

potřebné, neboť toto stanovení téměř vždy znamená odebrání

určitého množství materiálu ze stopy.

Typickou situací je požadavek na průkaz slin a lidské bílkoviny

v nedopalku spojený s požadavkem na stanovení genetického

23

profilu osoby. Poměrně často totiž po provedení zkoušky na

přítomnost slin a lidské bílkoviny již pro genetickou analýzu zbývá

tak málo materiálu, že se nepodaří požadovaný genetický profil

stanovit v potřebné kvalitě. Přitom detekce slin a lidské bílkoviny je

zde ve své podstatě bezpředmětná, jelikož sama o sobě nemá

žádnou důkazní hodnotu: pokud se v nedopalku nachází biologický

materiál, pak to v drtivé většině případů jsou lidské sliny a epitelie

ústní sliznice či pokožky rtů, případně s malou příměsí krve (např.

při zánětu dásní, oparu atd.); s případem, kdy by se v nedopalku

nacházelo například prasečí sperma či kočičí moč, se – pokud je mi

známo – žádný znalec dosud nesetkal.

Dříve tyto testy mohly najít své opodstatnění jako jakési “síto“

k oddělení stop nepoužitelných pro genetické zkoumání (kupříkladu

u zmíněných nedopalků nepřítomnost slin a lidské bílkoviny

indikovala nemožnost stanovit genetický profil). V dnešní době je už

tento přístup ale překonán, neboť jednak forenzní genetika

disponuje mnohem přesnějšími metodami posouzení obsahu

využitelného biologického materiálu ve stopě, jednak i z nedopalků

s negativním výsledkem testu na přítomnost slin lze někdy stanovit

relevantní genetický profil.

Co je to určení druhového původu a průkaz lidského

původu?

Určení druhového původu materiálu, tedy zjištění, z jakého

rostlinného či živočišného druhu stopa pochází, hraje (na rozdíl od

určení druhu biologického materiálu) obvykle roli zásadní, přičemž

nejčastěji jde o průkaz lidského původu daného materiálu. Lze jej

provést samostatně imunologickými metodami (reakcí lidské

bílkoviny se specifickou protilátkou), častěji ale tento průkaz

lidského původu vyplyne „samovolně, jako vedlejší produkt“

z výsledku genetického zkoumání. Většina forenzně genetických

testů užívaných k analýzám lidského biologického materiálu totiž

24

poskytuje standardní pozitivní výsledek právě jen a pouze

u lidského materiálu – říkáme, že tyto testy jsou druhově

specifické. Tedy: poskytne–li analýza stopy pozitivní výsledek,

lze zpětně konstatovat, že stopa obsahovala s jistotou lidský

biologický materiál. Z tohoto důvodu se od imunologického

průkazu lidské bílkoviny většinou upouští, a to zejména u stop

s předpokládaným malým či velmi malým množstvím využitelného

biologického materiálu (důvody jsou obdobné jako u již

zmiňovaného určování druhu biologického materiálu).

Na policii se dostavila žena, živící se jako prostitutka, a vypověděla, že

předchozího dne měla konflikt se zákazníkem, který vyvrcholil tím, že

muž jí začal vyhrožovat zabitím. Jako důkaz, že svá slova míní vážně,

ji odvedl ke kufru auta a ukázal jí v něm ležící mrtvolu muže. Poté

odjel. Podle popisu byl tento zákazník v relativně krátké době nalezen,

přičemž v kufru jeho auta byly skutečně zjištěny krevní otěry.

Podezřelý se hájil tím, že se jedná o krev zvířecí, jelikož je členem

mysliveckého svazu. Jak imunologická, tak genetická analýza však

toto tvrzení jednoznačně vyvrátily – bylo potvrzeno, že se jedná o krev

lidskou, a genetickou analýzou byl stanoven genetický profil osoby

mužského pohlaví. Podezřelý k věci odmítl dále vypovídat. Pokud je mi

známo, mrtvola muže nebyla dosud nalezena a nebyla ani zjištěna

jeho možná totožnost.

Lze prokázat i jiný než lidský původ?

Ve zvláštních případech je třeba specificky prokázat i jiný než lidský

původ – například psí, králičí atd. Zde je nejčastěji využíváno

imunologické analýzy, založené na reakci s určitým specifickým

sérem. Genetické analýzy se v tomto směru v České republice

využívají spíše omezeně, nicméně v principu platí totéž, co bylo

řečeno u průkazu lidského původu: pozitivní výsledek určitého

druhově specifického genetického zkoumání je současně

potvrzením, že stopa byla tvořena biologickým materiálem daného

25

druhu. Genetickým analýzám jiného než lidského biologického

materiálu je věnována samostatná kapitola na konci tohoto

breviáře.

Co je to určení původce biologické stopy?

Pomyslnou nejvyšší metou, jíž lze forenzně genetickým zkoumáním

dosáhnout, je určení zdroje, původce stopy, tedy konkrétního

jedince, jehož biologickým materiálem je stopa tvořena – tedy např.

Karel Novák, r.č. 123456/7890, pes Haryk majitele Františka Flinty

atd. Jednoznačné určení původce stopy nazýváme individuální

identifikace.

Využitelnost biologického materiálu pro forenzně

genetickou analýzu

Jaký biologický materiál je pro forenzně genetickou

expertízu vhodný?

Obecně je forenzní analýza úspěšně aplikovatelná na jakýkoli

materiál, obsahující DNA v množství a kvalitě dostatečné k jejímu

provedení, což je, přiznejme si, definice kruhem (bohužel však

jediná vystihující podstatu věci). Úsloví, pocházející dle Oxford

Dictionary of Citations snad už z počátku 14. století, říká: „Zda je

puding k jídlu, to se pozná při jedení!“ („The proof of the pudding is

in the eating!“) Stejně tak my můžeme říci: „Zda je materiál

analyzovatelný, to se pozná při analýze!“

Je nějaký zásadní rozdíl ve využitelnosti biologických

materiálů analyzovaných v rámci jednotlivých

aplikací forenzní genetiky?

V praxi je velmi podstatný principiální rozdíl mezi analýzami

biologických stop a analýzami řízeně odebraných vzorků osob

26

(např. při určování příbuznosti). Kriminalistické analýzy

biologických stop jsou charakteristické tím, že znalec nemá žádnou

možnost volby, výběru biologického materiálu, musí pracovat s tím,

co je; navíc se jedná o vzorky často velice nestandardní co do

kvantity i kvality obsažené DNA. Stejně problematické mohou být i

materiály z těl vysokého stupně rozkladu či kosterních nálezů.

Naproti tomu řízené odběry srovnávacích vzorků umožňují obvykle

vybrat nejvhodnější materiál pro danou expertízu, zaručující

dostatečné množství kvalitní DNA pro její provedení.

Jaké materiály jsou zajišťovány jako srovnávací

vzorky osob?

V současnosti nejběžnějším srovnávacím vzorkem biologického

materiálu je bukální stěr, což je otěr sliznice vnitřní strany tváře

(tedy v ústech) na odběrový tampón či kartáček. Odběr je rychlý,

nebolestivý a neintimní, může ho provádět osoba sama či libovolný

k tomu pověřený pracovník, navíc odebraný materiál se následně

velmi dobře a nenáročně uchovává, a to i po dlouhou dobu.

Dříve běžně odebíraným, dnes již spíše opouštěným srovnávacím

vzorkem je periferní žilní krev, zajišťovaná nejčastěji klasicky

odběrem ze žíly v loketní jamce, případně u novorozenců a kojenců

ze žíly na hlavičce (stejně, jako při běžných zdravotnických

vyšetřeních). Odběr je rovněž rychlý, avšak spojený s jistou dávkou

diskomfortu (bolest, nepříjemné pocity) a za současného narušení

integrity těla včetně nenulového (byť nepatrného) rizika infekce,

musí ho provádět zdravotnický personál a vzorky se o něco

náročněji uchovávají. Pro forenzně genetickou analýzu mohou být

principiálně použity i krevní vzorky zajištěné pro jiný účel (např. ke

zdravotnickému vyšetření), záleží však na způsobu zajištění,

zejména na použitém protisrážlivém médiu, a též na způsobu

nakládání se vzorkem před předáním k forenzní analýze. Na tom lze

27

demonstrovat, jak neostré jsou hranice mezi zdravotnickými a

forenzními aplikacemi.

Jednoho vlahého večera zastavila policie mladého řidiče a po kontrole

dokladů jej podrobila dechové zkoušce na alkohol. Vzhledem k tomu,

že test byl pozitivní, byl řidič převezen do zdravotnického zařízení

na odběr krve, který původní podezření jednoznačně potvrdil. Kauza

se tak dostala do roviny trestní, ovšem majitel osobního dokladu pan

Karel před soudem argumentoval, že to nebyl on, kdo řídil, a že

na místě trestního činu v té době vůbec nebyl. Byl proto ustanoven

soudní znalec v oboru DNA analýzy, jehož úkolem bylo pouze

odpovědět na v podstatě jednoduchou otázku – byl pan Karel opravdu

oním řidičem, kterému byla odebrána krev na alkohol? Po porovnání

profilu pana Karla a profilu z testované krve bylo již na první pohled

jasné, že pan Karel oním řidičem nebyl, neboť dané profily se

jednoznačně lišily. Tím vše mohlo skončit a kauza mohla být

uzavřena. Pozorný znalec si však všimnul, že ve velké části

testovaných lokusů měl pan Karel s neznámým řidičem jednu alelu

shodnou, což napovídalo hypotéze o existenci biologického

příbuzenského vztahu. DNA obou byla proto navíc ještě přetestována

na haplotyp Y chromozómu, neboť pokud by muži byli příbuzní

po paternální linii, musel by být haplotyp Y chromozomu naprosto

shodný, což se následně opravdu potvrdilo. Neznámý však nemohl být

otec pana Karla, neboť ve třech autozomálních lokusech byl jako jeho

otec vyloučen (vzorky neměly společné alely). Jako

nejpravděpodobnější byla znalcem označena hypotéza, že se jedná

o bratry, čemuž by napovídal i podobný věk a podoba neznámého. Jak

jest patrno, vzorek původně odebraný pro toxikologické vyšetření byl

následně použit k identifikaci (tedy v oblasti forenzní analýzy) a ještě

později se zkoumání přesunulo do sféry určení biologické příbuznosti.

Ve zvláštních případech mohou být zajišťovány i jiné typy

srovnávacích vzorků živých osob, například odstřižené nehty či

28

kožní seškraby; děje se tak například při genetických výzkumech

lidských přírodních populací, u nichž by se odběr jiného typu

vzorku nesetkal s porozuměním.

Pro vyšetření dosud nenarozených dětí (embryí či plodů) může být

použita plodová voda odebraná amniocentézou (AMC), choriové

klky odebrané choriocentézou (CVS) či pupečníková krev plodu

odebraná kordocentézou (CC); některé genetické testy mohou být

provedeny i analýzou fetální DNA, která je přítomna v krvi matky.

Zde je třeba důrazně upozornit, že odběr plodové vody,

choriových klků i pupečníkové krve jsou invazivní metody

spojené s nezanedbatelným rizikem pro plod (udávané riziko

potratu po odběru je cca 0,5–1%) a mohou být provedeny pouze

ze zdravotních důvodů k potvrzení či vyloučení závažné genetické

odchylky plodu (např. Downův syndrom). Zbytková část materiálu

z takového odběru může být použita pro forenzní účely (např.

určení otcovství), pro čistě forenzní účel však nelze tento odběr

z etických důvodů nařídit, požadovat ani doporučovat (s

analýzou je potom třeba počkat až po narození dítěte).

Vyvraťme zde jeden hluboce zakořeněný mýtus, který stále přetrvává,

totiž tvrzení, že paternitní analýzu lze provést až v jednom roce věku

dítěte. Pro to neexistují žádné odborné ani právní důvody. Analýza je

technicky proveditelná již v okamžiku narození dítěte a – jak se lze

dočíst v předchozím odstavci – v případě, že je dostupný materiál

plodu, pak už v průběhu těhotenství. Komerční novinkou jsou dokonce

paternitní testy plodu z krve matky, které je možno provést již od cca

9. – 10. týdne těhotenství.

V případě potratu (spontánního nebo při umělém ukončení

těhotenství) může být k analýze použit plodový materiál zajištěný

z dutiny děložní; zde je třeba upozornit, že u velmi raných fází

těhotenství je velikost embrya velmi malá (v 5. týdnu těhotenství

cca 4–5 mm) a rozpoznání embryonální tkáně ve směsi s dalším

29

odsátým materiálem děložní sliznice může být dosti problematické.

V pozdějších stádiích již rozpoznání embrya problém nečiní.

U mrtvých osob je škála srovnávacích vzorků mnohem pestřejší:

dle stavu rozkladu těla mohou být odebrány krev, svalová tkáň,

kůže, nehty, zuby, tkáň některých orgánů nebo kost. Tyto srovnávací

vzorky mohou být zejména u těl ve vyšším stupni rozkladu kvůli

degradaci již poměrně náročné na získání analyzovatelné DNA, a

tedy se často svým charakterem blíží spíše stopám.

U pohřešovaných či již dříve zemřelých osob jsou za srovnávací

vzorky považovány materiály nejrůznější povahy, které lze s velkou

pravděpodobností osobě přisoudit, například materiál v jejím

zubním kartáčku, materiál z jejích osobních předmětů či materiál

zajištěný a deponovaný pro zdravotní účely (parafínem fixované

tkáně z biopsií, mikroskopické preparáty atd.). Všechny tyto vzorky

jsou co do kvality a kvantity DNA opět spíše povahy stop, a tak je

s nimi také nakládáno.

Nevhodnými srovnávacími vzorky jsou odstřižené či vypadlé vlasy a

chlupy, které obsahují jen velmi malá množství jaderné DNA.

Nakládání s biologickými stopami

Biologické stopy mohou být velmi cennými, často i rozhodujícími

důkazy o vině či nevině. Aby takto mohly posloužit, je ale nezbytné

s nimi správně nakládat, tedy je třeba dodržovat určité postupy a

zásady, popsané níže. Nevhodné zajištění, nesprávné uchovávání,

neopatrná manipulace – to vše může stopu částečně nebo úplně

znehodnotit nebo v horším případě dokonce změnit tak, že

genetická analýza poskytne zcela falešný výsledek.

30

Jak se vyhledávají stopy?

Lakonicky řečeno: aby mohla stopa posloužit jako důkaz, je

třeba ji nejprve najít. To se zdá být samozřejmé, avšak ve

skutečnosti to někdy může představovat zdlouhavou a vyčerpávající

činnost. Stopy můžeme z tohoto hlediska rozdělit do několika

kategorií:

1. stopy markantní, viditelné okem i při zběžném pohledu

2. stopy viditelné okem při podrobném ohledání

3. stopy okem neviditelné, avšak detekovatelné zvláštními

testy

4. stopy zcela latentní

Do první kategorie spadají nepřehlédnutelné stopy, jako jsou

tratoliště krve a další velké krevní stopy, velké skvrny spermatu (na

oděvu, ložním prádle apod.), lejno atd. Vyhledání těchto stop nečiní

potíž ani naprostému laikovi a stopy lze obvykle snadno zajistit.

Do druhé kategorie lze zařadit drobné biologické stopy, jako jsou

kupříkladu krevní kapky a otěry, zaschlý nosní sekret, vlasy, stopy

slin na skleničkách atd. Kvůli malé velikosti může být jejich

vyhledání někdy obtížnější, avšak stále jsou zjistitelné pouhým

okem.

Třetí kategorii tvoří stopy „neviditelné“, které ale lze odhalit

s použitím speciálních pomůcek či postupů. Těmi mohou být

například monochromatické forenzní světelné zdroje (forenzní

„baterky“), které dle použité vlnové délky pomohou zviditelnit

určitý konkrétní druh biologického materiálu. Obecně známé pak je

vyhledávání velmi zředěných (a tudíž okem neviditelných) krevních

stop pomocí chemických činidel světélkujících při kontaktu s krví

(např. Luminol, FastBlue).

31

Latentní stopy, tvořící čtvrtou kategorii, nemohou být detekovány

ani okem, a prozatím ani pomocí screeningových testů. Typickým

příkladem takové stopy jsou povrchové kožní buňky ulpivší na

telefonním sluchátku. Tyto stopy se tudíž zajišťují „naslepo“: jsou

odebírány v místech, kde výskyt biologického materiálu

předpokládáme. Úspěšnost při jejich zajišťování tak závisí

především na dobrém odhadu a zkušenostech toho, kdo je zajišťuje.

Často ke zkoumání předkládanou věcnou stopou bývá pokrývka hlavy,

kterou pachatel ztratil na útěku. Zkušený znalec odebírá stěry najisto

u okraje v oblasti záuší, kde pokrývka nejtěsněji přiléhá k hlavě a při

nošení dochází k drobným pohybům, při nichž se odírají buňky

pokožky.

Velmi cenným vodítkem při vyhledávání stop mohou být i

výpovědi aktérů události.

Oběť znásilnění, ke kterému došlo v lednu v noci za opuštěnou

vlakovou zastávkou, vypověděla, že pachatel ejakuloval volně mimo

její pochvu; podle přesného popisu míst, kde se při tom oběť a

pachatel nacházeli, se kriminalistickému technikovi podařilo najít ve

sněhu malou proláklinu, která mohla být způsobena dopadem teplého

spermatu. Stopu proto po konzultaci se znalcem zajistil uválením do

tvaru sněhové koule o průměru cca 30 cm a takto byla

transportována do laboratoře. Ve stopě byla po rozpuštění prokázána

přítomnost spermatu a byl stanoven genetický profil, který byl posléze

ztotožněn s natipovaným podezřelým. Bez použití informací

z výpovědi poškozené by tato stopa zřejmě nebyla nikdy nalezena.

Jaká jsou pravidla zajišťování stop?

Zajišťování biologických stop pro forenzně genetické

zkoumání je nezbytné provádět tak, aby:

32

1. nedošlo k degradaci stopy (zničení biologického

materiálu)

2. bylo odebráno co možná největší množství biologického

materiálu (toto neplatí jen u rozsáhlých stop, jako jsou

například krevní tratoliště)

3. nedošlo ke kontaminaci stopy (vnesení cizorodého

biologického materiálu).

Jak zabránit degradaci stopy?

Poškození či úplné zničení biologického materiálu, spojené

s poškozením v něm přítomné DNA – tzv. degradací DNA, hrozí

tehdy, když stopu vystavíme nevhodným fyzikálním, chemickým či

biologickým vlivům.

Obrázek 2 – Řada přírodních činitelů může způsobit nevratné poškození molekul DNA ve stopě; tento proces označujeme jako degradaci DNA.

33

Blíže se o tom zmíníme později, zde pouze stručně: rozkladné

procesy jsou urychlovány vysokou teplotou a vlhkem, jež podporují

rychlý růst bakterií; nevratné chemické změny v dvoušroubovici

DNA způsobuje UV záření – tedy např. přímo dopadající sluneční

paprsky, stejně jako působení některých chemikálií. Degradaci DNA

lze zabránit pouze vytvořením správných předpisů týkajících se

zajišťování stop a následným dodržením v nich uvedených postupů.

Jak zajistit dostatek materiálu ze stopy?

Dostatečné množství zajištěného biologického materiálu zvyšuje

naději na pozitivní výsledek analýzy. Je důležité i proto, že někdy se

objeví potřeba stopu reanalyzovat (například při požadavku na

vypracování revizního posudku – superposudku). Nejvhodnější je

vždy dopravit stopu do laboratoře i s podkladem či přímo

předmětem, na němž se nachází. V některých případech to ovšem

není technicky možné (stopy na velmi rozměrných předmětech,

stopy na těle atd.) – potom musí odběr biologického materiálu

provést na místě kriminalistický technik nebo musí být znalec

povolán na místo činu. V praxi je většina latentních (dotykových

stop) zajišťována na místě trestného činu stěrem místa

s předpokládaným výskytem biologického materiálu.

Pro zajištění kriminalistických stop již existují specializované

pomůcky, které mimo jiné zaručují, že ze stopy bude odebráno velké

množství materiálu. Kupříkladu speciální forenzní nylonové

mikrokartáčky, jimiž se provádějí stěry, dokážou materiál zachytit

mnohonásobně efektivněji než běžné vatové tampóny. To má

význam zejména u latentních stop minimálních rozměrů. Nutno

ovšem říci, že pořizovací cena těchto pomůcek bývá zpravidla také

mnohonásobně vyšší, a jejich plošné používání tak v praxi naráží na

nedostatek financí ve státním sektoru. Jak bude na příkladu ukázáno

níže, někdy se šetření projeví jako nemístné škudlilství.

34

Obrázek 3 – Užitím speciálních odběrových pomůcek pro forenzní účely můžeme zajistit z biologické stopy významně větší množství biologického materiálu (a tedy izolovat více DNA) než při užití běžného zdravotnického tampónu.

Jak zabránit kontaminaci stopy?

Vnesení nepůvodního biologického materiálu do stopy – tzv.

kontaminace stopy – je z hlediska svých důsledků nejzávažnější

chybou při zajišťování. Zdrojem cizorodé DNA přitom může být jiná

stopa, zajišťovací pomůcka – kupříkladu nevhodný odběrový

tampón, osoba manipulující se stopou nebo (což je zcela jistě

největší noční můrou) srovnávací vzorek osoby zasílaný spolu se

stopami. Těmto chybám se lze vyhnout pouze striktním dodržením

několika zásad:

1. Je–li zajišťováno více stop, je nutno s nimi manipulovat

odděleně, a to až do momentu, kdy jsou řádně zabaleny a

označeny.

2. Používat tzv. DNA–free (=neobsahující DNA) zajišťovací

pomůcky, především odběrové tampóny a vodu. Někdy

jsou za vhodné mylně považovány pomůcky STERILNÍ.

Ovšem: „sterilní“ znamená, že pomůcka neobsahuje

35

infekční agens (živé bakterie, viry, plísně, kvasinky apod.).

Pro odběr stop je ale třeba, aby pomůcka neobsahovala

žádnou DNA, zejména ne lidskou.

Němečtí kriminalisté se jen pomalu a obtížně vzpamatovávají

z fatálního omylu, který proslul jako „Fantom z Heilbronnu“. Od roku

1993 zajistili v celkem 40 trestných činech včetně šesti vražd

biologické stopy vykazující jeden a týž genetický profil, náležející

neznámé ženě. Sekvenací mitochondriální DNA a analýzou evolučního

původu bylo určeno, že tato žena–monstrum může velmi

pravděpodobně pocházet z východní Evropy. Skutky páchala na území

celého Německa, dokonce i v Rakousku a Francii, nikdy však

v Bavorsku. Policie po mnoha letech neúspěšného pátrání dokonce

vypsala odměnu 300 tisíc euro za informace vedoucí k dopadení této

pachatelky. Obrat nastal, když byl její genetický profil zjištěn i na

spáleném těle prokazatelně mužského žadatele o azyl ve Francii.

Vzniklo podezření, že DNA tajemné ženy se do odběrových tampónů

dostala již během jejich výroby. Všechny tampóny použité v případech

připisovaných Fantomovi totiž pocházely od jediné firmy, rakouské

Greiner Bio–One International AG, a byly určeny pro užití

ve zdravotnictví. Proto byly po zabalení sterilizovány, což v nich sice

zahubilo všechny bakterie, ovšem neodstranilo DNA. Kvůli příznivé

ceně byly ve velkém nakupovány i policejními laboratořemi, které je

používaly k odběrům stop na místě činu. Pouze bavorská policie

užívala tampóny od jiného dodavatele, a tak se v Bavorsku Fantom

nikdy neobjevil. Greiner Bio–One zaměstnával ve výrobě i řadu dělnic

původem z východní Evropy. Tato rozsáhlá blamáž konečně hlasitě

upozornila kriminalisty v řadě zemí, že investování do speciálních

pomůcek určených přímo pro forenzní odběry má své opodstatnění.

3. Osoby zajišťující stopy musí používat dostatečné osobní

ochranné pomůcky – rukavice, roušky, případně celotělové

36

overaly. Kýchající, kouřící, pijící či dokonce stravující se

osoba nemá na místě činu co dělat.

Nebezpečí kontaminace stop technikem na místě činu je často

podceňováno. Přitom některé v zahraničí provedené studie jasně

ukazují, že i při používání ochranných pomůcek dochází v nemalém

procentu k nechtěné kontaminaci. Z technického hlediska

nejvhodnější cestou je proto jednak povinná výměna rukavic mezi

sběrem jednotlivých stop a vytvoření databáze genetických profilů

techniků a dalších osob manipulujících se stopami, aby takováto

kontaminace mohla být včas rozpoznána.

Obrázek 4 – Možnými zdroji kontaminace mohou být jak jiné stopy, tak i odběrové pomůcky či osoby manipulující se stopami. Proti těmto všem zdrojům je třeba se účinně bránit.

37

4. Srovnávací vzorky osob je naprosto nezbytné zajišťovat

odděleně od ohledání místa činu, nejlépe jinde a s časovým

odstupem.

Jak dlouho je možné stopy uchovávat?

Čím dříve jsou stopy předány ke zpracování do laboratoře, tím lépe.

I u té nejlépe zajištěné stopy není vyloučena pozvolná degradace,

proto je včasná analýza jedinou zárukou, že stopa nebude

znehodnocena ještě před získáním potřebných dat. Týká se to

především stop, u nichž degradace započala už před zajištěním. Na

druhou stranu, řada stop si uchovává biologický materiál

v analyzovatelném stavu i po mnoho desítek let. Takto stabilní

bývají obvykle například zaschlé materiály (krev, sliny, sperma).

Vlastnosti a chování biologického materiálu ve

stopách

Chceme–li si na základě výsledků genetické analýzy udělat obrázek

o dění na místě činu, je nezbytné mít alespoň základní představu

o vlastnostech a chování biologického materiálu jako takového.

V této oblasti panuje řada mylných domněnek, uveďme je tedy nyní

na pravou míru!

Kde se biologický materiál ve stopách bere?

Lidské tělo je dynamický systém – pohybujeme se, dýcháme, jíme a

vylučujeme, naše buňky se stále dělí, nové vznikají a staré umírají.

To vše je spojeno s produkcí velkého množství biologického

materiálu, z nějž část naše tělo opouští a dostává se do jeho bližšího

či vzdálenějšího okolí. Mohou to být:

38

1. přirozeně odcházející tělní tekutiny, sekrety a exkrementy

– menstruační krev, moč, stolice, pot, slzy, nosní sekret, sperma,

sliny, zvratky

2. přirozeně odcházející buňky kůže a kožní deriváty – vlasy,

chlupy, nehty, odumřelé kožní epitelie (povrchové buňky)

3. přirozeně odcházející buňky sliznice – poševní epitelie

(např. při pohlavním styku), povrchové epitelie pohlavního údu

(při pohlavním styku či jiné manipulaci s ním), epitelie dutiny

ústní a krku (při ústní hygieně, jídle, líbání, orálním styku

apod.), epitelie trávicího traktu (např. sliznice střeva

uvolňovaná do stolice), epitelie dýchacích cest (při kašli,

smrkání, kýchání, dýchání, řeči), epitelie močových cest (při

zánětu uvolňované do moči) atd.

4. materiály uvolňované nepřirozeně, a to v důsledku

nemoci, zranění, lékařského zákroku – krev, kůže jako celek,

svalová tkáň, tuková tkáň, při velmi hrubém poranění (včetně

chirurgického úkonu) i jakékoli další tkáně (mozková tkáň,

kost, tkáně orgánů dutiny břišní atd.).

Lze určit, jaký byl mechanismus vzniku stopy?

Rozhodnout o tom, jak stopa vznikla, bývá často velmi obtížné.

Forenzní věda se o takové zkoumání pokouší alespoň u krevních

stop; podle jejich tvaru a rozmístění lze někdy usuzovat, zda vznikly

otěrem, odkapáváním, stříkáním (např. po úderu) atd. Tyto analýzy

však nespadají do oboru forenzní genetiky, nýbrž do oboru

biomechaniky, a nebudeme je tedy blíže rozvádět. U ostatních druhů

biologického materiálu se „analýza“ mechanismu vzniku stopy

pohybuje obvykle už čistě v rovině spekulací (neexistují relevantní

studie, ze kterých by bylo možno vycházet).

V případu pohlavního zneužívání byly předloženy lůžkoviny z gauče,

na němž ke skutku mělo dojít, a byl mimo jiné vznesen tento

požadavek: „Na základě tvaru a rozmístění skvrn (spermatu a

39

poševního sekretu) určete, v jaké sexuální poloze k pohlavnímu styku

došlo.“ Relevantně, bez srovnávacích pokusů a jisté dávky spekulací na

takovou otázku prakticky nelze odpovědět. Samozřejmě každý

dospělý normálně sexuálně aktivní člověk si v principu umí představit,

kde přibližně se mohou uvedené biologické materiály při styku v té

které poloze ocitnout, nicméně taková představa může být i velmi

ošidná (třeba proto, že nepostihneme všechny aspekty, které mohly

mít v daný moment vliv), a nelze ji proto zaměňovat za odborně

relevantní znalecké posouzení.

Lze z množství biologického materiálu ve stopě

usuzovat na nějaké okolnosti skutku?

Souvislost mezi množstvím biologického materiálu ve stopě a

mechanismem jejího vzniku sice existuje, ale jen ve velmi hrubém

měřítku. Tedy: pokud je v bytě nalezeno tratoliště krve o metrovém

průměru a majitelka tvrdí, že se tam manžel řízl při holení, je její

tvrzení přinejmenším krajně podezřelé. Pokud ale jsou nalezeny

drobné krevní kapky a otěry, může se jednat jak o stopy po říznutí

při holení, tak o stopy po brutálním útoku řeznickým nožem. Jinak

řečeno, nález extrémně velkého množství biologického

materiálu vylučuje vznik stopy při drobné události, ale nález

malého množství biologického materiálu nevylučuje vznik

stopy při „velké“ události, například násilném útoku.

Často je tento problém diskutován při nálezu biologického

materiálu osoby A za nehty osoby B, neboť vždy vyvstává otázka,

zda je takový nález důkazem násilného kontaktu nebo ne. Obecně

lze říci, že u osob, které spolu nežijí, nepracují nebo nejsou jinak

v blízkém kontaktu, se zpravidla navzájem biologický materiál za

nehty nevyskytuje vůbec nebo jen v nepatrném měřítku (např. zcela

miniaturní množství přenesená v důsledku podání ruky, použití

stejného madla v tramvaji atd.). Naproti tomu u osob, které

v blízkém kontaktu jsou, může být množství biologického materiálu

40

za nehty toho druhého značné. V normálně fungující společně žijící

rodině tak běžně má žena za nehty materiál manžela i dětí, dítě

materiál sourozence i rodičů atd. Z toho vyplývá důležitý fakt:

u osob žijících společně nebo jsoucích v úzkém kontaktu nelze

nález biologického materiálu osoby A za nehty osoby B

považovat za důkaz násilného kontaktu. Stejně tak nelze velké

množství materiálu vyloučit tam, kde došlo (třeba i jednorázově)

k intenzivnímu fyzickému kontaktu, tedy např. mezi masérem a

masírovaným, prostitutkou a klientem, zdravotníkem a pacientem

apod.

Jak se stopa mění od okamžiku svého vzniku do

zajištění a analýzy?

Biologický materiál může být tvořen živými či mrtvými buňkami,

jejich zbytky a/nebo organickými, případně anorganickými látkami

produkovanými živými organismy. Velká část těchto komponentů

ihned po opuštění těla snadno podléhá nejrůznějším typům

rozkladných procesů, které souhrnně označujeme jako

biodegradace. (Jak takový proces ve své vrcholné fázi vypadá, to si

umí představit každý, kdo uprostřed července zapomněl v kufru

auta dva dny na parkovišti nákupní tašku s půlkilem vepřových

jater.) Rychlost biodegradace a její podoba závisejí především na

podmínkách, v nichž se stopa nachází.

Z hlediska genetického zkoumání je ovšem podstatné především to,

v jaké míře je ve stopě degradována DNA. Ta může být zasažena

několika typy vlivů:

1. fyzikálními činiteli – UV zářením, radioaktivním zářením,

extrémně vysokou teplotou

2. chemickými činiteli – oxidačními činidly, silnými kyselinami a

zásadami

41

3. biologickými činiteli – bakteriemi, plísněmi, ale i enzymatickou

sebedegradací (autolýzou)

a jejich kombinacemi. V praxi se zdaleka nejčastěji setkáváme

s bakteriální degradací stopy: vlhko a teplo (20–40°C) jsou

podmínkami optimálními pro růst bakterií a stopa může být v tomto

prostředí degradována velmi rychle.

V parku byla kolem desáté hodiny večerní cestou domů z jednání

brutálně napadena mladá žena: pachatel jí opakovaně udeřil tyčí do

zátylku a oblasti krku a zad, takže jí způsobil četná silně krvácející

poranění, poté jí odcizil kabelku a mobilní telefon a z místa činu utekl.

Celou noc drobně pršelo. Těžce zraněná žena byla nalezena pejskařem

až brzy ráno; muž zavolal záchrannou službu, ta po příjezdu při

poskytování pomoci ženu svlékla ze zakrváceného a deštěm

promočeného oděvu a tento uložila do igelitového pytle. Pytel byl

policii předán až o dva dny později: rozsáhlé krevní skvrny na oděvu

již byly hnědozelené barvy, silně zapáchající, a analýza neprokázala

v žádné ze skvrn přítomnost analyzovatelné DNA. Za daných okolností

tedy nejenže nebylo reálné najít na oděvu stopy DNA pachatele, ale

nebylo již možno – kvůli pokročilé bakteriální degradaci – stanovit

ani DNA oběti. (Pachatel byl přesto vypátrán a usvědčen díky stopám

na tyči, kterou odhodil poblíž místa činu; žena útok přežila, zůstává

však trvale ochrnutá).

Dalším z důležitých faktorů, které rozhodují o tom, zda bude stopa

později snadno či hůře analyzovatelná, případně zcela

neanalyzovatelná, je přítomnost tzv. inhibitorů. Souhrnně tak

označujeme látky, které negativně ovlivňují průběh dalších analýz,

zejména blokují namnožení vybraných úseků DNA metodou

označovanou jako PCR (polymerázová řetězová reakce), a bude

o nich pojednáno v části věnované technologii.

42

Moderní forenzně genetická laboratoř ovšem již disponuje jednak

metodami na zjištění přítomnosti inhibitorů ve vzorku, jednak

izolačními postupy schopnými ve většině případů tyto inhibitory

účinně odstranit.

Muž v době nepřítomnosti své manželky brutálně znásilnil a zavraždil

své dvě nevlastní dcery (14 a 16 let), poté jejich krví popsal zeď

v domě. Vzorky odebrané z této vápnem vybílené zdi obsahovaly

extrémně vysoká množství vápenatých iontů a analyzovat se je

podařilo až po dlouhé dekalcifikaci pomocí chelatačního činidla

(činidlo vyvazující dvojmocné ionty).

Existuje nějaká časová hranice , kdy už stopu s jistotou

nelze analyzovat?

Žádná pevně definovatelná hranice neexistuje. Za určitých

podmínek – jak už bylo řečeno – může stopa podlehnout zkáze

velmi rychle, pokud se ale dostane do stabilního prostředí, může zde

vydržet v dobrém stavu „celou věčnost“, což dokládají kupříkladu

pozitivní analýzy z některých historických či archeologických nálezů

včetně analýz mumií. Je zřejmé, že pro potřeby forenzní nám

postačuje mnohem kratší časový úsek – řádově maximálně desítky

let. Správně zajištěné a uchovávané stopy tak umožňují znovu

otevřít některé sporné případy a posoudit je na základě nových

analýz.

Lze určit, kdy biologická stopa vznikla?

Určení stáří biologické stopy není při současných znalostech

forenzní genetiky možné. Je sice známo, že u stopy dochází

k degradaci materiálu a ke změně v zastoupení a struktuře

některých složek, ovšem převést tyto vcelku obecné poznatky na

relevantní výpočet stáří stopy zatím nelze ani forenzně genetickými,

43

ani jinými metodami; je to však předmětem zájmu forenzně

genetického výzkumu.

Je možné, že osoba s předmětem manipuluje, a přitom

na něm její materiál neulpí?

Velmi zajímavou a často diskutovanou otázkou je, jak velká

množství biologického materiálu po sobě člověk zanechává.

Zejména se to týká povrchových epitelií kůže, které ulpívají na

předmětech přicházejících do kontaktu s nechráněnou pokožkou

(šperky, hodinky, brýle, psací potřeby, telefonní sluchátka a mobily,

volant a řadicí páka auta, kliky, zápisníky atd.). Studie ukázaly, že

toto množství je značně individuální: někdo je dobrý donor,

zanechávající svůj materiál i při letmém kontaktu, někdo je naopak

donor extrémně špatný, u něhož i po dlouhodobém kontaktu

zůstává na předmětech materiálu jen velmi málo. Tato vlastnost je

pravděpodobně dědičná a souvisí jednak s rychlostí obnovy

pokožky (tedy jak rychle se stará pokožka odlupuje a nová zespoda

dorůstá), jednak se soudržností jednotlivých buněk v pokožce.

Je možné, že materiál jedné osoby je ve stopě

detekovatelný, i když se stopou už manipulovala další

osoba/y?

Ano, a to zcela běžně.

Lze při nálezu biologického materiálu více osob na

témže předmětu určit, kdo s předmětem manipuloval

poslední?

Jednou z dosti rozšířených, leč mylných představ je, že na

předmětech dochází k „vrstvení“ biologického materiálu a že tak lze

říci, čí materiál na něm ulpěl jako poslední. Biologický materiál však

takto až na výjimečné situace nefunguje a určení „posledního

44

manipulujícího“ tudíž není možné – ve stopě se nachází směsný

biologický materiál, u něhož nelze analýzou DNA určit, kdy došlo

k přispění jednotlivých donorů.

Co je to primární přenos biologického materiálu?

Primárním přenosem rozumíme nanesení biologického materiálu

z těla původce na primární nosič (předmět či osobu). Typickými

příklady primárního přenosu mohou být zakrvácení čepele nože při

bodnutí, vstříknutí spermatu do prezervativu při ejakulaci, nanesení

kožních buněk na sluchátko při telefonování atd.

Co je to sekundární přenos biologického materiálu?

Sekundárním přenosem rozumíme nanesení biologického

materiálu z primárního nosiče na nosič sekundární. Typickými

příklady sekundárního přenosu mohou být otření zakrvácené

čepele nože o oděv, vytečení spermatu z prezervativu na koberec,

přenesení kožních buněk prvního telefonujícího na rukáv druhého

telefonujícího při užití téhož sluchátka atd.

Obrázek 5 – Primární přenos biologického materiálu (zde krev) může být následován přenosem sekundárním.

45

V hotelovém pokoji byla jako stopa zajištěna šmouha ze stropu.

V tomto vzorku byla zkoumáním prokázána přítomnost spermatu.

Později bylo objasněno, že šmouha vznikla tak, že hotelový host si po

souloži s partnerkou sejmul prezervativ, napnul ho a vystřelil proti

stropu.

Velmi specifickým jevem je sekundární přenos vektorem – např.

krvesajným hmyzem (komár, blecha atd.) Nasátá krev obsahuje po

určitou dobu (než je strávena) DNA v analyzovatelném stavu, a

tudíž kupříkladu zabitím komára klasickou metodou prudké rány

polštářem může na stěně či textilu vzniknout krevní stopa

identifikovatelná s konkrétní osobou. Je přitom prokázáno, že tento

hmyz má dosti velký akční rádius, a krev osoby tak může být

přenesena na poměrně vzdálené místo.

Existují ovšem i jiné, bizarnější mechanismy přenosu biologického

materiálu vektorem.

Ve státě New York byl řešen kuriózní případ paternity: dívka

otěhotněla a porodila dítě poté, co její partner použil při styku

prezervativ, který předtím vytáhnul použitý z odpadkového koše a

před nasazením na penis převrátil naruby, aby se neznečistil. Otcem

dítěte se tak stal mladík, který s dotyčnou dívkou nikdy neměl

pohlavní styk.

Sekundární přenos je z forenzního hlediska značně komplikujícím

jevem, neboť ve svém důsledku může vést k tomu, že:

na předmětu se vyskytuje biologický materiál osoby,

která s ním nemanipulovala (např. muž A si odplivne na

lavičku a odejde, nic netušící žena si do sekretu sedne,

později se stane obětí znásilnění a vraždy – na jejím oděvu

je zjištěna markantní biologická stopa a stanoven profil

46

muže A, ale ten s ní ve skutečnosti vůbec nepřišel do

kontaktu);

na místě činu se vyskytuje biologický materiál osoby,

která tam nikdy nebyla (v hotelu na pokoji č. 27 komár

nasaje krev spícího hosta A, poté vyletí oknem a vletí do

pokoje č. 59, kde je bdícím hostem B zabit, následně je

ovšem neznámým pachatelem zabit host B – na stěně je

nalezena krev a stanoven profil hosta A, ale ten na pokoji č.

59 nikdy nebyl).

Existence sekundárního přenosu biologického materiálu jako

taková ovšem rozhodně není důvodem zpochybnění důkazů

postavených na analýze DNA. Je ovšem vždy absolutně

nezbytné posuzovat DNA důkaz v kontextu ostatních zjištění a

zvážit i další možné hypotézy.

Co je to „nepravý“ sekundární přenos biologického

materiálu?

Za jakýsi „nepravý sekundární přenos“ lze považovat situaci, kdy je

přenesen biologický materiál s celým předmětem, a to jak

náhodně, tak úmyslně (muž A zapomene v restauraci zapalovač,

vezme si ho muž B, který později vykrade rekreační chatu, přičemž

tam zapalovač ztratí – zapalovač je zajištěn jako stopa a je v něm

zjištěn genetický profil muže A, který ale v chatě nikdy nebyl).

Důkazní potenciál stopy

Co je důkazní potenciál?

Podstatou každého dokazování je zvážení pravděpodobnosti

jednotlivých hypotéz o skutku ve světle faktů (svědectví,

znaleckých zkoumání atd.). Nejinak je tomu u důkazů

prostřednictvím analýzy DNA: po úspěšném provedení analýzy se

47

obvykle určitá hypotéza začne jevit pravděpodobnější, zatímco jiná

méně pravděpodobná až zcela nepravděpodobná.

Krátce po nočním vloupání do obchodu zadržela policie na nedaleké

tramvajové zastávce muže. Na rozbité výloze obchodu byla zajištěna

krev, na levé ruce zadrženého muže bylo zjištěno řezné poranění.

V tento moment existují dvě základní hypotézy: 1)původcem krve na

výloze je zadržený muž, nebo 2) původcem krve na výloze je někdo

jiný a to, že zadržený má pořezané zápěstí, je jen shoda okolností.

Analýza DNA následně razantně jednu z těchto hypotéz posílí a

druhou oslabí.

Čím více je jedna hypotéza analýzou stopy podpořena na úkor

ostatních, tím větší má stopa důkazní potenciál. Důkazní potenciál

stopy pramení ze dvou základních složek: z apriorní těsnosti

vazby stopy ke skutku a z očekávané rozdílnosti výsledku

příslušného znaleckého zkoumání za platnosti jednotlivých

zvažovaných hypotéz.

Co je apriorní těsnost vazby stopy ke skutku?

Tímto pojmem rozumíme míru naší jistoty, že stopa vznikla

v souvislosti se skutkem. Určité stopy mohou být již předem

považovány za velmi silně vázané ke skutku: například biologický

materiál plodu získaný při interrupci u čtrnáctileté dívky je

prakticky s naprostou jistotou vázán k pohlavnímu zneužívání této

poškozené. Naproti tomu u celé řady ve forenzní praxi běžně

analyzovaných stop je jejich vazba ke skutku nejistá: nedopalek

zajištěný na chodníku před vraty garáže, z níž bylo odcizeno auto,

může a nemusí mít vztah k tomuto skutku.

48

Co je očekávaná rozdílnost výsledku příslušného

znaleckého zkoumání za platnosti jednotlivých

zvažovaných hypotéz?

Aby zkoumání mělo smysl, musí existovat předpoklad, že analýza

poskytne jiný výsledek za platnosti hypotézy 1 než za platnosti

hypotézy 2, 3 atd. U výše uvedeného příkladu – případ nočního

vloupání – očekáváme, že při platnosti hypotézy 1 (původcem krve

na rozbité výloze je zadržený muž) analýza zjistí shodu profilu ze

stopy a srovnávacího vzorku muže, zatímco při platnosti hypotézy 2

(původcem krve na rozbité výloze je někdo jiný) budou tyto

genetické profily různé.

V jakých situacích má stopa z principu nízký či nulový

důkazní potenciál?

Za určitých okolností lze již předem (tj. bez provedení analýzy)

vyhodnotit, že daná biologická stopa jako důkaz posloužit nemůže,

nebo jen ve velmi omezené míře – říkáme, že má nízký či nulový

apriorní důkazní potenciál. Sem patří:

situace, kdy je malá těsnost vazby stopy ke skutku, neboli

vztah zajištěného biologického materiálu a skutku je velmi

sporný až vyloučitelný

Pachatel loupežného přepadení odhodil při útěku kuklu do křoví, ta

byla zajištěna jako stopa, z nepochopitelných důvodů byla zajištěna i

značně degradovaná použitá dámská menstruační vložka, která

ležela v křoví opodál; vztah této „stopy“ ke skutku je z logiky věci

nulový.

situace, kdy u zvažovaných hypotéz očekáváme totožný

výsledek analýzy

49

Byl oznámen případ znásilnění mezi manželi, kdy žena tvrdila, že

manžel ji znásilnil, ten tvrdil, že mezi nimi došlo k dobrovolnému

pohlavnímu styku. Ke zkoumání byl předložen poševní stěr poškozené.

Zkoumání je v tomto případě irelevantní, neboť u obou hypotéz lze

očekávat zjištění přítomnosti manželova spermatu v poševním stěru

manželky.

Znalci nepřísluší rozhodovat o právních otázkách ani o tom, jak má

být při vyšetřování postupováno. Nicméně, na tomto místě se

přimlouváme za to, aby kompetentní osoby vždy pečlivě zvažovaly,

jaký bude reálný přínos znaleckého zkoumání dané stopy pro

vyšetřování.

50

Seznámení s genetikou

Základní fakta o DNA

Co je to DNA?

DNA neboli deoxyribonukleová kyselina je jednou z funkčních

makromolekul, které se vyskytují v buňce. Označení „kyselina“

poukazuje na některé její chemické vlastnosti (ve vodném roztoku

odštěpuje protony a stává se záporně nabitou, což je jedna

z charakteristik kyselin), avšak rozhodně si ji nelze představovat

jako „klasické kyseliny“ – není to žádná leptající kapalina, nýbrž

vláknitá makromolekula.

Čistá DNA není ve vodném roztoku vidět – je rozpuštěná. Lze ji ovšem

určitými postupy vysrážet a tím „zviditelnit“: například v silně

koncentrovaném etanolu bude velké množství DNA patrné jako bělavé

vláknité chomáčky.

Jakou má DNA strukturu?

Základní struktura DNA je velmi jednoduchá: jednotlivé vlákno DNA

(říkáme mu jednořetězcová DNA) vzniká řetězením stavebních

kamenů – tzv. nukleotidů – lineárně za sebou (jako do řetízku

vzájemně slepené korálky).

Nukleotid sestává ze tří funkčních částí – trifosfátu, cukru

deoxyribózy a tzv. báze. Zatímco deoxyribóza i trifosfát jsou ve

všech nukleotidech stejné, báze se vyskytuje v DNA ve 4 různých

verzích – nazýváme je adenin, guanin, cytozin a tymin a

označujeme A, G, C a T. Existují tedy čtyři základní typy nukleotidů

podle toho, kterou bázi nesou (jako bychom měli čtyři různé „barvy

korálků“).

51

Sled nukleotidů ve vlákně – tzv. sekvence nukleotidů – vytváří

jednoduchý lineární kód o čtyřech znacích. (Obdobně například

naše písmo – latinka – je lineární kód, užívající ovšem podstatně

více znaků – v anglické abecedě 26, v té české dokonce 37 – a to

počítáme pouze písmena, nikoli interpunkční a jiná znaménka!).

Obrázek 6 – Základní struktura jednořetězcové DNA. DNA je lineárním polymerem nukleotidů, každý nukleotid sestává z trifosfátu, cukru deoxyribózy a báze.

V „genetickém světě“ zapisujeme sekvenci nukleotidů v DNA pomocí

zmíněných čtyř písmen, označujících jednotlivé báze, tedy například:

ACCAGTGAGATCCCAATATAGTACACACACTGCTGCTACTTCTAGAGG

CAAACTTAGT

Vlákno DNA může za určitých okolností existovat v popsané

jednořetězcové formě, běžněji se ale v buňce setkáváme

s dvouřetězcovou DNA. Ta je tvořena dvěma řetězci nukleotidů,

52

které jsou navzájem propojeny pomocí vazeb mezi bázemi. Tento

komplex je prostorově svinutý do tvaru známé dvoušroubovice.

Při vzniku dvouřetězcové DNA se uplatňuje zásadní pravidlo,

kterému říkáme princip (pravidlo) komplementarity: každý typ

báze páruje pouze s jediným jiným typem báze. A páruje vždy s T (a

logicky T s A) a C páruje vždy s G (a logicky G s C). Oba řetězce pak

označujeme jako vzájemně komplementární.

Obrázek 7 – Struktura dvouřetězcové DNA. Dvě vlákna spolu párují prostřednictvím bazí.

Vezměme si krátký úsek jednořetězcové DNA, jehož sekvence je

AGGTAC. Při vzniku druhého řetězce se uplatní princip

komplementarity a dvouřetězec tedy bude vypadat:

AGGTAC

| | | | | |

TCCATG

V běžné tělní lidské buňce je DNA o celkové délce cca 6,6 miliardy

nukleotidů, což de facto představuje dvoušroubovici o délce zhruba

2 metry. Velikost lidské buňky je však dramaticky menší – například

53

bílé krvinky mají průměr řádově pouhých 0,00001 metru. Jedinou

možností, jak vtěsnat něco tak dlouhého do něčeho tak malého, je

mnohonásobně to smotat.

DNA je proto v buňce velmi složitě uspořádána do vyšších a vyšších

stupňů: dvoušroubovicové vlákno se ovíjí kolem bílkovinných

„klubíček“ histonů, takto navinuté vytváří smyčky uchycené na

bílkovinné „lešení“ a celá tato struktura se spirálovitě stáčí a vytváří

tzv. chromatinové vlákno.

Co jsou chromozómy?

Vzhledem ke zmíněné značné délce DNA by i toto chromatinové

vlákno bylo neúměrně dlouhé a buňka by s ním mohla jen obtížně

pracovat. Proto je rozděleno na kusy, kterým říkáme chromozómy,

podobně jako třeba Ottův slovník naučný je rozdělen do svazků.

Soubor chromozómů v jádře nazýváme karyotyp.

Obrázek 8 – Karyotyp neboli soubor chromozómů v jádře.

54

Biologické druhy mají různý počet chromozómů – např. člověk má

23 párů chromozómů, kočka 18 párů chromozómů, damašská růže

28 chromozómů atd. Vyšší počet chromozómů však neznamená, že

daný druh má delší DNA: pouze ukazuje, do kolika „svazků“ je tato

DNA rozdělena.

V lidských buňkách najdeme za normálních okolností 1 pár

chromozómů, které určují, jaké bude pohlaví jedince – říkáme jim

proto chromozómy pohlavní neboli gonozómy a označujeme je X

a Y. Zatímco muži mají jeden chromozóm X a jeden Y, ženy mají dva

chromozómy X.

Zbylých 22 párů chromozómů se na určení pohlaví nijak nepodílí –

říkáme jim proto chromozómy nepohlavní neboli autozómy a

označujeme je čísly 1–22.

Hovoříme zde o „párech“ chromozómů – to proto, že od každého

chromozómu najdeme v běžné tělní buňce dvě kopie, z nichž jedna

pochází od matky, druhá od otce. Celý princip bude popsán dále

v kapitole o podstatě dědičnosti.

Jak je v DNA zapsána informace?

Vlastní funkční uspořádání DNA je nesmírně složité, omezíme se

proto pouze na velmi zjednodušující popis.

V DNA lze nalézt úseky, které nesou informaci o struktuře

buněčných bílkovin. Těmto úsekům říkáme obecně geny. Ostatní

úseky, které takovou informaci nenesou, označujeme termínem

extragenová DNA.

V genech je využíván tzv. univerzální genetický kód. Tak jako je

DNA řetězcem nukleotidů, je bílkovina řetězcem aminokyselin,

kterých existuje 21 druhů. Každá trojice nukleotidů v genu – tzv.

triplet – představuje kód pro konkrétní aminokyselinu. Například

55

úsek DNA s kódem TCCAAAGGT znamená, že v bílkovině mají být za

sebou serin–alanin–glycin, neboť TCC je kód pro aminokyselinu

serin, AAA pro alanin a GGT pro glycin.

Obrázek 9 – Genetický kód: trojice nukleotidů (triplety) kódují konkrétní aminokyseliny zařazované do struktury bílkoviny.

Vlastní exprese (tj. vyjádření informace) genu probíhá tak, že podle

příslušného vlákna DNA je dle výše zmíněného pravidla

komplementarity syntetizováno vlákno RNA (ribonukleová

kyselina, velmi podobná DNA) – tomuto procesu říkáme

transkripce, tedy přepis. Vlákno RNA je po úpravách použito jako

předloha, podle níž se zařazují aminokyseliny do vznikající

bílkoviny – tento proces se nazývá translace, tedy překlad, nebo též

proteosyntéza neboli syntéza bílkoviny.

Na rozdíl od genů, extragenová DNA tímto způsobem překládána

není a informaci o struktuře bílkovin nenese. (Mezi námi, není to

úplně pravda – i v extragenové DNA se vyskytují kódující oblasti či

jejich zbytky; nicméně buňka je aktivně nevyužívá, spíše je jimi

56

sama někdy zneužívána, a pro potřeby této publikace zcela postačí

zjednodušující tvrzení, že v extragenové DNA kódující oblasti

nejsou.)

Co je to gen, lokus, marker?

Protože v užívání těchto pojmů nepanuje přílišná jednota ani mezi

samotnými odborníky, pokusme se je nyní blíže vyspecifikovat a

správně definovat.

Jako gen označujeme funkční úsek DNA, jehož určitá část je

překládána do struktury bílkovin a ostatní části se tohoto překladu

nějakým způsobem účastní. Pokud slovně specifikujeme, o jaký gen

se jedná, nejčastěji použijeme název příslušné bílkoviny, která podle

něj vzniká. Tedy: gen pro beta podjednotku alkoholdehydrogenázy

1, gen pro alfa podjednotku ATP syntázy atd.

Na tomto místě vyvraťme jednu oblíbenou novinářskou floskuli,

zaplevelující stránky novin i internetových portálů s pozoruhodnou

životaschopností: neexistuje nic jako „gen pro nemoc“. Titulek „Vědci

objevili gen rakoviny prostaty“ je nesmyslný. Každý gen v naší

buňce totiž má svou významnou pozitivní roli a přispívá k fungování

buňky jako celku. Sama přítomnost jakéhokoli genu nemá negativní

vliv na buňku. To, co vědci objevili v našem příkladu, je vadná forma

onoho genu; právě špatné fungování genu totiž má za následek

určitou nemoc organismu. (Nemluvě o tom, že asociativní vztah mezi

prostatou a formou genu je jen pravděpodobnostní.)

Řekněme to ještě jinak, obrazněji: to, že parašutista má ve své výbavě

padák, mu smrt nezpůsobí, naopak. Fatální pro něj bude, pokud má

nefungující padák.

Jako lokus označujeme libovolný adresný úsek DNA či místo v DNA.

Lokus DNA lze považovat za vůbec nejobecnější pojem – můžeme

57

jím myslet celý gen i jednotlivý nukleotid naprosto kdekoli,

v genové i extragenové oblasti lidského genomu.

Jako marker označujeme úsek DNA (ať už v genu či extragenové

DNA), který je předmětem testování.

Kde v buňce je DNA obsažena?

Kompletní sada 23 párů chromozómů se u živých lidských buněk

nachází v tzv. jádře (lat. nucleus), membránové organele, která je

informačním centrem buňky. Tuto DNA proto označujeme

termínem jaderná DNA (nDNA). Kromě jádra se ještě velmi

specifická DNA nachází v dalším typu buněčných organel – v tzv.

mitochondriích; říkáme jí proto mitochondriální DNA (mtDNA).

Obrázek 10 – DNA se v lidské buňce vyskytuje jednak v jádře, jednak v buněčných organelách zvaných mitochondrie.

Kompletní genetickou informaci buňky (organismu) nazýváme

genom, genetickou informaci v jádře nukleom a genetickou

informaci v mitochondrii mitom.

58

U rostlin najdeme ještě další organely, obsahující DNA – plastidy,

z nichž laikům asi nejznámější jsou chloroplasty – organely, kde

rostlinné buňky zachycují sluneční záření do fotonových pastí –

fotosyntetizují. Souboru genetické informace v plastidech říkáme

plastidom.

Kde v těle je DNA obsažena?

Kompletní genetická informace, tedy příslušných 23 párů

chromozómů, se nachází téměř ve všech typech lidských tělních

buněk (říkáme, že genetická výbava všech tělních buněk je

uniformní). Výjimku tvoří červené krvinky (erytrocyty) a krevní

destičky (trombocyty), které neobsahují DNA vůbec, a buňky

pohlavní (gametocyty), tedy spermie a vajíčka (oocyty), které

obsahují pouze polovinu této dědičné informace – od každého

chromozómu pouze jednu kopii. Proč tomu tak je se dozvíte

v následující pasáži o dědičnosti.

Základní principy fungování dědičné informace

Jak vznikají viditelné či měřitelné rozdíly mezi lidmi?

Už při prostém pohledu kolem sebe vidíme, že lidé se navzájem liší

v řadě znaků – barvě očí, vlasů, tvaru obličeje, krevní skupině,

snášenlivosti alkoholu, temperamentu… Téměř neexistuje nic, v čem

by všichni lidé byli zcela uniformní.

Tomu, jak nějaký znak u dané osoby konkrétně vypadá, říkáme

fenotyp. Tato výsledná podoba znaku je dána obvykle společným

vlivem dvou faktorů: vlivu prostředí a dědičné informace. Existují

znaky, které jsou založeny téměř výhradně na dědičné informaci, a

žádný vliv prostředí je nemůže změnit; říkáme, že jsou silně

geneticky determinované. Takovým znakem je například krevní

skupina.

59

Naproti tomu existují znaky, kde hraje prostředí významnou roli a

daný znak jím může být silně ovlivněn; genetická informace se

u nich uplatňuje pouze jako jakýsi velmi tvárný základ, nebo

chceme–li, dispozice. Říkáme, že tyto znaky jsou slabě geneticky

determinované. Typickým příkladem budiž tělesná hmotnost.

Co je polymorfismus?

Všichni lidé mají stejné geny, přičemž odhadem je genů kolem 23

tisíc. Některé geny však existují ve více verzích – říkáme, že jsou

variabilní, polymorfní, a daný jev označujeme jako

polymorfismus. Jednotlivé verze genu nazýváme alely. Lidé mají

tedy stejné geny, ale nemají stejné alely. K tomuto základnímu

principu se přidává ještě další, neméně významný: i zcela stejná

varianta genu (alela) může být u dvou osob využívána buňkami

různě často a různě intenzivně; takovým rozdílům říkáme

epigenetické.

Představit si to lze kupříkladu takto: všechny restaurace mají ve své

obrovské spíži prakticky tytéž suroviny – mouku, česnek, med, mléko,

rajský protlak, red curry, vajíčka, jablka, olivový olej, atd. – celkem

několik tisíc přísad. Každá tato surovina se ale vyskytuje ve více

verzích, takže zatímco jedna restaurace nakupuje levný česnek z Číny,

jiná má k dispozici řízný česnek od farmáře z Vysočiny. Stejně tak

existují desítky různých odrůd jablek, rozličné druhy medu atd.

Přičteme–li k tomu ještě rozdíly v postupu přípravy (jeden kuchař

používá více, jiný méně pepře, jeden do salátu dává raději konopný

olej, zatímco druhý směs olivového a palmového), bude ve výsledku

totéž jídlo v každé restauraci trochu jiné (a někdy i hodně jiné).

Jak polymorfní jsou jednotlivé lokusy v DNA?

Velmi zhruba můžeme říci, že co do variability najdeme v lidské

DNA tři typy lokusů:

60

1. lokusy nepolymorfní, tedy zcela minimálně variabilní (říkáme

jim též vysoce konzervativní sekvence); obvykle jsou to nějaké

zásadní funkční úseky, bez nichž se buňka neobejde a které

musejí mít určitou přesnou sekvenci, jinak svou funkci ztratí;

2. lokusy nízce až středně polymorfní, vyskytující se v populaci

v několika variantách; sem spadají především geny;

3. lokusy vysoce polymorfní (multialelické), vyskytující se

typicky v mnoha variantách, jejichž počet může jít i do mnoha

desítek; najdeme je především v určitých oblastech nekódující

(extragenové) DNA;

Obrázek 11 – Variabilita lokusů v DNA může být velmi rozdílná.

Největší rozdíly mezi osobami budou z logiky věci právě u posledně

jmenovaných vysoce polymorfních lokusů. Především na ně se tudíž

bude zaměřovat identifikační analýza DNA.

Lidský genom má 2 x 3,3 miliardy nukleotidů, ale jen 2 x cca 3

milióny z nich jsou variantní. To znamená, že dvakrát 3 297 000 000

nukleotidů nás činí lidmi a složení zbývajícího jednoho promile

počtu nukleotidů nás činí originálním člověkem.

61

Mimochodem, když genetici porovnali kompletní sekvenci lidského a

šimpanzího genomu, zjistili fascinující věc: 98,4 % této sekvence je

shodné, jinak řečeno, od šimpanze se lišíme v pouhém 1,6 % své

dědičné informace. Je téměř neuvěřitelné, že tak málo postačuje

k tomu, abychom byli tak velmi odlišní.

Co jsou mutace?

Termínem mutace souhrnně označujeme změny v sekvenci DNA.

Pro účely této publikace se stran mutací omezme jen na pár

základních informací:

Co do svého rozsahu mohou být mutace zcela nepatrné –

jednobodové, spočívající v záměně jediného nukleotidu v sekvenci

(např. ATTACCGTT se změní na ATTTCCGTT), přes mutace

spočívající v přesunu, vymazání nebo naopak „připsání“ části

sekvence až po mutace obrovského rozsahu, spočívající

v přestavbách celých chromozómů či dokonce změnách počtu

chromozómů či jejich sad.

Sám rozsah mutace ovšem není úměrný účinku na organismus:

jednobodová mutace v kritickém místě nějakého genu může mít

zcela fatální důsledky, zatímco některé přestavby chromozómů

nemají žádný viditelný účinek a odhalíme je až náhodně při

genetickém vyšetření.

Svým původem mohou být mutace spontánní (laicky řečeno:

změnu sekvence způsobí chyba ve vnitřních buněčných pochodech)

nebo indukované (k mutaci dojde vlivem nějakého biologického,

fyzikálního či jiného činitele).

K mutacím dochází jak v tělních buňkách – pak mluvíme o mutacích

somatických, tak v zárodečných buňkách, z nichž vznikají buňky

pohlavní – takové mutace nazýváme gametické (nebo též mutace

v germinální linii).

62

Jak je genetická informace přenášena z rodičů na děti?

Potomci dědí vlastnosti svých rodičů – to bylo známo už antickým

myslitelům. Dnes víme, že je to proto, že dítě získá od obou rodičů

kopii části jejich dědičné informace v podobě DNA.

Jak jsou děděny lokusy na nepohlavních

chromozómech?

Lokusy na autozómech (nepohlavních chromozómech) jsou děděny

tzv. mendelovskou dědičností (princip objevil J. G. Mendel).

Člověk má v tělních buňkách dvě sady autozómů, a tedy dvě kopie

každého autozomálního lokusu. Tyto dvě kopie však nemusejí být

zcela identické – mohou to být dvě různé varianty daného lokusu,

tedy dvě různé alely.

Obrázek 12 – Meióza neboli redukční dělení je mechanismus tvorby pohlavních buněk, při němž se redukuje dědičná informace na polovinu.

63

Při tvorbě pohlavních buněk se dědičná informace složitým

mechanismem nazývaným meióza redukuje na polovinu a do zralé

pohlavní buňky se dostane pouze jedna kopie každého

autozomálního lokusu, tedy jedna alela daného lokusu. Záleží

víceméně na náhodě, která z obou alel to bude.

Spojením spermie otce a vajíčka matky vznikne znovu jediná

buňka (zygota, oplozené vajíčko) nesoucí dvě kompletní sady

chromozómů, a tedy dvě kopie každého autozomálního lokusu.

Obrázek 13 – Při oplození nese každá z pohlavních buněk genetickou informaci redukovanou na polovinu. Splynutím vajíčka a spermie tak vzniká prvotní buňka (zygota) s normálním množstvím genetické informace.

Co je to heterozygot a homozygot?

Již několikrát jsme zde zmínili, že každý autozomální lokus má

člověk ve výbavě svých tělních buněk dvakrát – jednu kopii od

64

matky, druhou od otce. Pokud jsou obě kopie identické (jsou to dvě

stejné alely), říkáme, že daný lokus je v homozygotním stavu a

daný člověk je v tomto lokusu homozygot (homozygotní). Naproti

tomu pokud je na každém párovém chromozómu v daném lokusu

jiná alela, říkáme, že daný lokus je v heterozygotním stavu a daný

člověk je v tomto lokusu heterozygot (heterozygotní).

Tedy: v případě homozygotního stavu zdědil v daném lokusu

jedinec od matky a otce dvě stejné alely. V případě heterozygotního

stavu zdědil od matky a otce dvě různé alely.

Obrázek 14 – Dědičnost autozomálních lokusů se řídí tzv. Mendelovými zákony. Dědičná informace dítěte je zkombinována z části dědičné informace matky a části dědičné informace otce.

65

Prosím povšimněte si, že homozygozita či heterozygozita je

vlastností konkrétního lokusu na nepohlavních chromozómech,

nikoli genetické informace jako celku! Tedy: každý z nás je v řadě

svých lokusů heterozygotem a v řadě homozygotem.

Sám termín má původ v řeckém „homo–/hetero–“ (= stejno–/různo–)

a „zygós“ (pohlavní buňka). U homozygotního lokusu totiž všechny

pohlavní buňky dané osoby ponesou stejnou alelu tohoto lokusu (jiná

není k dispozici), zatímco u heterozygotního lokusu nese zhruba

polovina pohlavních buněk jednu alelu původem z prvního párového

chromozómu a zbytek (tj. druhá polovina) druhou alelu původem

z druhého párového chromozómu.

Jak jsou děděny lokusy na pohlavních

chromozómech?

Dědičnost lokusů na gonozómech (pohlavních chromozómech) je

různorodější – existují zde oblasti, ve kterých je sekvence X i Y

chromozómu velmi podobná – nazýváme je oblasti

pseudoautozomální, a dále oblasti, v nichž se X a Y chromozóm

zásadně liší. Pseudoautozomální oblasti obsahují na chromozómu

X i Y tytéž lokusy, jež jsou děděny mendelovsky, tak jak bylo

popsáno výše. Ostatní oblasti pohlavních chromozómů X a Y se

chovají jinak.

Chromozóm Y je přítomen v jedné kopii u mužů a dědí se

paternálně (patrilineárně, po meči). Lokusy jsou předávány

v nezměněném stavu „jako balík“ – tzv. haplotyp – z otce na syny.

Jediný mechanismus, kterým se může dědičná informace v této části

Y–chromozómu za normálních okolností změnit, je mutace.

66

Obrázek 15 – Dědičnost Y–chromozomálních lokusů. Dědičná informace syna pochází pouze od otce.

Chromozóm X je přítomen ve dvou kopiích u žen a v jedné kopii

u mužů (tam je druhým pohlavním chromozómem Y). U žen se tedy

i X lokusy vyskytují ve dvou kopiích, zatímco u mužů jen v jedné.

Žena předává potomkovi vždy jeden ze svých X chromozómů. Muž

předá potomkovi buď svůj chromozóm X – pak to bude děvče, nebo

svůj chromozóm Y – pak to bude syn.

Na tomto místě nelze nepoznamenat, že ženy byly po dlouhá staletí

obviňovány z neschopnosti dát manželovi syna a někdy za to i

zaplatily životem (že, Jindřichu VII.?!) Objevy v oblasti genetiky ovšem

ukázaly, že je to spermie muže, která nese příslušný chromozóm (X

nebo Y), a tudíž je zodpovědná za to, zda dítě bude děvče či chlapec.

Načež další objevy v oblasti fyziologie početí ukazují, že je to vajíčko,

které důmyslnými mechanismy vybírá, kterou spermii „pustit dovnitř“.

67

Ergo, ač se mi to neříká lehce, původní nařčení byla minimálně

částečně opodstatněná…

Obrázek 16 – Dědičnost X–chromozomálních lokusů. Dědičná informace dcery je zkombinována z části dědičné informace matky a části dědičné informace otce, dědičná informace syna pochází pouze od matky.

Co je to hemizygot?

Pokud se určitý lokus nachází pouze v polovině pohlavních buněk

daného člověka, zatímco ve druhé polovině zcela chybí, říkáme, že

tento člověk je v daném lokusu hemizygot (hemizygotní).

To nastává u lokusů lokalizovaných na X chromozómu: zatímco

ženy mají standardně dva X chromozómy a jsou v X–lokusech buď

homozygotní, nebo heterozygotní, muži mají pouze jeden

chromozóm X (a jeden chromozóm Y) a v X–lokusech jsou

hemizygotní. Stejně tak za hemizygotní můžeme považovat u mužů

lokusy lokalizované na Y–chromozómu. (Obé konstatování se týká

68

lokusů mimo pseudoautozomální oblasti, jejichž dědičnost byla

zmíněna výše).

Jak je děděna mitochondriální DNA?

U člověka a celé řady dalších živočišných i rostlinných druhů byla

prakticky prokázána tzv. striktní matroklinita mitochondriální

DNA, tedy dědičnost „po přeslici“: potomek (dcera i syn) dědí

mitochondriální DNA výhradně po matce, a má s ní tudíž shodný tzv.

mitotyp.

Obrázek 17 – Dědičnost mitochondriální DNA. Dědičná informace dětí pochází pouze od matky.

Mimochodem – některé výzkumy ukazují, že striktní matroklinita

nemusí u člověka vždy platit. V přírodě navíc existují druhy, u nichž je

DNA děděna jinak než „po přeslici“, například oblíbené ovoce kiwi

(Actinidia) má paternální dědičnost mtDNA, tedy „po meči“. Inu,

příroda je ráda komplikovaná…

69

Forenzní potenciál genetické analýzy

Z forenzního hlediska lze genetickou analýzou získat informace,

které nám

pomohou identifikovat původce biologického materiálu

pomohou určit typ biologického vztahu mezi osobami

(biologickou příbuznost)

pomohou predikovat některé biologické charakteristiky

původce biologického materiálu

jinak pomohou posílit/oslabit naše hypotézy,

přičemž prvý bod dominuje stávající kriminalistické genetice, druhý

zase občansko–právním řízením o určení otcovství.

Individualita a identifikace

Co je to identifikace?

Identifikací ve forenzní genetice rozumíme určení shodného

původu dvou vzorků biologických materiálů – např. stopy a

srovnávacího vzorku. V praxi to znamená, že posuzujeme určité

variabilní znaky v DNA a zjišťujeme, zda oba materiály vykazují

v takto variabilních znacích shodu.

Některé z metod principiálně umožňují identifikaci až na úroveň

konkrétního jedince s vysokou mírou spolehlivosti (blížící se jistotě)

– potom mluvíme o individuální identifikaci.

Jiné metody už ze svého principu takovou rozlišovací schopnost

nemají – sem patří například analýzy mitochondriální DNA a

haplotypu Y–chromozómu; přesto mají tyto analýzy ve forenzní

praxi své nezastupitelné místo a bude o nich též pojednáno

v samostatných kapitolách.

70

Co je to genetický profil osoby?

Termínem genetický profil (syn. DNA profil) označujeme obecně

set genotypů několika polymorfních lokusů dané osoby; v praxi je

tak nejčastěji označován set genotypů autozomálních STR lokusů.

Genetický profil osobu částečně či zcela identifikuje.

Co je to genetické individuum?

Každý lidský jedinec vzniká mechanismem pohlavního

rozmnožování, tj. proniknutím otcovy spermie do matčina vajíčka;

tento děj nazýváme oplození. Po oplození dojde uvnitř vajíčka ke

splynutí jeho prvojádra s prvojádrem spermie do jediného celku,

nazývaného synkaryon, čímž je vytvořen zcela jedinečný soubor

genů a extragenové DNA – genetická informace nového, unikátního

jedince. Tato první buňka s kompletním jádrem se nazývá zygota.

Všechny buňky, vzniklé jejím dělením, nesou prakticky totožnou

genetickou informaci a tvoří genetické individuum, nazývané

odborně geneta. Jakékoli prohlášení o shodě či neshodě dvou

biologických materiálů se vždy a bezvýhradně týká pouze toho,

zda tyto materiály mohou či nemohou pocházet z téže genety.

To je zcela zásadní atribut forenzního testování a je třeba jej

mít vždy na paměti. Jak se dozvíme později, ne vždy je totiž jedinec

genetický totožný s jedincem fyzickým.

Co je to fyzické individuum?

Fyzickým individuem rozumíme konkrétního, prostorově

ohraničeného jedince; odborně jej v biologii nazýváme rameta.

U lidí je tedy rametou konkrétní člověk a v běžném životě je tak

rameta vnímána jako základní forma individua, která je jednotkou

sociálních interakcí ve společnosti i jednotkou v právním smyslu

slova (fyzickou osobou).

71

Obrázek 18 – Typický genetický profil osoby: set genotypů autozomálních STR lokusů a amelogeninu (bližší vysvětlení, o jaké lokusy se jedná a proč je testujeme, najdete v dalších částech knihy).

72

Jaký je vzájemný vztah genety a ramety?

Člověk patří spolu s dalšími obratlovci mezi tzv. unitární

organismy – ty se vyznačují tím, že z oplozeného vajíčka se

postupně vyvíjí jedinec s poměrně striktně daným uspořádáním

těla, prochází nejprve fází růstu, potom plodným obdobím a jeho

život je zakončen stářím a smrtí. Jedna geneta se tak stává jednou

rametou.

V přírodě se můžeme setkat ještě s jiným rozšířeným modelem –

s tzv. modulárními organismy, jakými jsou například rostliny. Ty

mají naopak velmi proměnlivou a přizpůsobivou podobu těla, které

sestává z opakujících se částí – modulů (např. listy, květy), jejich

vývoj není nikdy ukončený (jejich tělo stále roste) a jednotlivé

moduly mohou dát za příznivých podmínek vzniknout dalšímu

fyzickému jedinci. Jedna geneta se tak může stát mnoha

rametami.

Tedy, souhrnně řečeno: u člověka a dalších unitárních

organismů je rameta v drtivé většině případů totožná

s genetou; jeden jedinec genetický se vyvine v jediného jedince

fyzického. U rostlin a dalších modulárních organismů naopak

může jeden jedinec genetický existovat ve formě i mnoha

desítek jedinců fyzických.

Až půjdete kolem stánku s květinami, povšimněte si některé z váz

s kyticí nádherných růží, které jsou jedna jako druhá: můžete si být

téměř jisti, že ačkoli byly před pár hodinami nastříhány kdesi

v holandské pěstírně z mnoha desítek růžových keřů, jedná se

o jediného genetického jedince.

73

Může u člověka existovat i jiný vzájemný vztah genety a

ramety?

Ano. Existuje hned několik situací, kdy výše zmíněné pravidlo

jedinec genetický = jedinec fyzický neplatí. To je z hlediska

identifikace nesmírně závažné a je nutné mít při hodnocení případu

tyto potenciální situace vždy na paměti, neboť jak již bylo řečeno,

identifikace analýzou DNA se vždy týká genety.

Těmito výjimečnými situacemi jsou především: jednovaječná

dvojčata, vrozený tetragametický chimérismus, směna buněk mezi

dvojvaječnými dvojčaty, maternální a fetální mikrochimérismus a

trvalý posttransplantační chimérismus. (Prosím čtenáře, aby

nepropadal panice – všechny tyto pojmy si v následujících

odstavcích jeden po druhém objasníme).

Jak se vzájemně liší jednovaječná dvojčata?

První a nejčetnější výjimečnou situací jsou jednovaječná

(identická, monozygotní) dvojčata, případně vícerčata. Už sám

jejich název napovídá, že jsou původem z jednoho vajíčka a že jsou

v určitém ohledu stejná – identická. Vznikají tak, že dělící se

oplozené vajíčko se v určité velmi rané fázi rozvolní na dvě (nebo i

více) skupin buněk a každá tato skupina se zanoří do děložní

sliznice samostatně a dá pak vzniknout samostatnému jedinci –

dítěti. Jednovaječná dvojčata (vícerčata) jsou tedy jednou

genetou, ale více rametami.

Díky svému společnému původu se proto jednovaječná dvojčata

prakticky neliší svou dědičnou informací; jediný mechanismus,

který může dát vzniknout rozdílům v jejich DNA, jsou mutace.

Pozorovatelné či měřitelné rozdíly jsou u jednovaječných dvojčat

ovšem častěji způsobeny nestejným vlivem prostředí – např.

rozdílná tělesná hmotnost, rozdílná barva pokožky, jiné rozložení

74

mateřských znamének, rozdílné IQ v důsledku špatného

okysličování jednoho z dvojčat v těhotenství atd.

Obrázek 19 – Genetická informace jednovaječných dvojčat je prakticky identická.

Pro forenzní genetickou analýzu má tato skutečnost jeden zásadní

důsledek: v drtivé většině případů zatím nelze standardními

identifikačními metodami mezi jednovaječnými dvojčaty

rozlišit, tj. nelze kupříkladu říci, zda původcem biologické stopy

z místa činu je dvojče A nebo dvojče B. Stejně tak nelze říci, zda

otcem dítěte je muž A nebo jeho jednovaječné dvojče – muž B.

Tento závažný nedostatek, totiž neschopnost spolehlivě rozlišit

mezi jednovaječnými dvojčaty, je významnou vadou na kráse

forenzní DNA analýzy. Proto se genetici snaží hledat metody, které

75

by dokázaly k rozlišení identických dvojčat využít těch změn v DNA,

k nimž dochází až po vzniku samostatných embryí v jejich tělních

buňkách. Přestože některé postupy se jeví jako nadějné, dosud

nebyla nalezena a v odborných časopisech publikována žádná

validní metoda, kterou by bylo možno s velkou spolehlivostí použít

jako důkazní nástroj.

Na rozdíl od analýzy DNA, jiné identifikační obory – např.

daktyloskopie, forenzní odontologie atd. – rozlišení mezi

jednovaječnými dvojčaty umožňují. Je to proto, že kupříkladu otisky

prstů vznikají sice na základě dědičné informace, ale na jejich

přesnou výslednou podobu má určitý vliv i prostředí, které není

u obou dvojčat zcela stejné (byť sdílejí tutéž dělohu). Otisky prstů

jednovaječných dvojčat se proto v malé míře liší.

Jak se vzájemně liší dvojvaječná dvojčata?

Původ dvojvaječných dvojčat (vícevaječných vícerčat) je zcela

odlišný: vznikají v důsledku vícečetného oplození, tj. při ovulaci se

uvolní více vajíček a každé toto vajíčko je samostatně oplozeno.

V některých případech nenastává ovulace současně, ale vajíčka se

uvolní a jsou oplozena s určitým časovým odstupem, někdy i

několikatýdenním.

Jednoduše lze říci, že dvojvaječná (fraternální, dizygotní)

dvojčata jsou normálními biologickými sourozenci, ovšem

počatými v témže okamžiku (či s velmi krátkým časovým

odstupem) a sdílejícími tudíž během prenatálního vývoje tutéž

dělohu. Díky tomu lze mezi nimi analýzou DNA rozlišit stejně

jako mezi biologickými sourozenci.

Protože dvojvaječná dvojčata vznikají dvěma nezávislými

oplozeními, vstupuje do hry ještě další možnost, totiž že

biologickým otcem každého z nich je jiný muž. Tento jev se odborně

76

nazývá heteropaternální superfekundace a, jak dokládá báje

o dvojčatech Héraklovi a Ífiklovi, jeho existence je lidstvu známa již

nejméně od dob starého Řecka.

Obrázek 20 – Genetická informace dvouvaječných dvojčat se liší stejně jako genetická informace běžných sourozenců.

Co je to chimérismus?

Jako chimérismus označujeme stav, kdy je jeden fyzický jedinec

tvořen buňkami původem z více zygot, neboli více genetami

(genetickými jedinci). Rozložení obou buněčných linií v organismu

může být nesmírně různorodé, závisí na způsobu vzniku

chimérismu i na řadě dalších faktorů včetně náhody. Principiálně

existuje více mechanismů, jak k chimérismu může dojít.

77

Co je to vrozený tetragametický chimérismus?

Tetragametický chimérismus je jakýmsi pomyslným opakem

jednovaječných dvojčat. Zatímco u jednovaječných dvojčat se jedna

geneta rozdělí na dvě ramety, u tetragametického chimérismu se

dvě genety spojí do jediné ramety. V těle ženy tedy dojde

k oplození dvou vajíček dvěma spermiemi, která by za normálních

okolností dala vzniknout dvojvaječným dvojčatům. Tato oplozená

dělící se vajíčka se však cestou vejcovodem přiblíží k sobě natolik,

že se navzájem slepí a do děložní sliznice zanoří jako jeden celek.

Následně dají vzniknout jedinému fyzickému jedinci, který ale je

tvořen buňkami dvojího, „sourozeneckého“ původu (celkem dvěma

vajíčky a dvěma spermiemi, tedy čtyřmi pohlavními buňkami –

odtud název tetragametický).

Tetragametický chimérismus je velmi často nepozorovatelný,

skrytý (kryptický). Na osobě často nejsou patrné žádné fyzické ani

jiné odlišnosti, které by nám napověděly, že se může jednat

o chiméru. Jinak řečeno, chimérou může být kdokoli z nás, aniž to

tuší. Nicméně nutno konstatovat, že je to jev velmi řídký – dosud

popsané případy se čítají řádově na desítky osob. Je to však jev

forenzně nesmírně zajímavý a se zásadními důsledky pro oblast

identifikace a určení biologické příbuznosti analýzou DNA.

U tetragametické chiméry totiž neplatí, že všechny tkáně daného

jedince vykazují identický DNA profil, neboť každá z obou

sourozeneckých buněčných linií nese profil jiný. Záleží tedy na tom,

jakým způsobem jsou tyto linie v těle rozmístěny: může například

nastat situace, kdy krev dotyčné osoby vykazuje jiný DNA profil než

její sperma.

78

Obrázek 21 – Genetická informace chimérického jedince vzniklého splynutím zárodků je dvojího typu; takový jedinec je vlastně spojením dvou sourozenců do jediného těla.

Co je to vzájemná směna buněk mezi dvojvaječnými

dvojčaty?

U dvojvaječných dvojčat může v některých případech dojít

k částečnému (byť třeba velmi malému) propojení jejich

krevních oběhů. Krevní buňky jednoho dítěte tak mohou putovat

krevním řečištěm druhého, a naopak. Mezi těmito buňkami jsou i

buňky krvetvorné, které se mohou „uhnízdit“ v kostní dřeni

dvojčete a dát tam natrvalo vzniknout celé skupině krvetvorných

buněk, z nichž vznikají krvinky a krevní destičky. Ve výsledku se

tedy v kostní dřeni jednoho z dvojčat nachází malá část kostní dřeně

79

druhého dvojčete, která produkuje bílé krvinky nesoucí DNA tohoto

dvojčete. Někdy je tento jev jednostranný (cizorodá linie buněk je

pouze v jednom dvojčeti), někdy vzájemný (cizorodou linii mají obě

dvojčata).

Z forenzního hlediska je to jev méně významný, protože množství

cizorodých krvinek je v poměru k množství vlastních krvinek

nepatrné a ve výsledku tato „příměs“ nijak zásadně neovlivňuje

identifikaci analýzou DNA.

Co je to maternální a fetální mikrochimérismus?

Pod tímto neprůhledným pojmem se skrývá další z mechanismů

vzniku chimérismu. Do embrya se během nitroděložního vývoje

mohou implementovat a trvale v něm přežívat buňky matky a

naopak, buňky plodu mohou v tomto období trvale kolonizovat

tělo matky. Odborné studie prokázaly přetrvávání fetálních buněk

v těle matky i po více než 50 letech od porodu. Uvedené

mechanismy tedy prokazatelně existují, avšak jejich přesné příčiny,

principy a též dopady na organismus jsou zatím předmětem

zkoumání. Z forenzně genetického hlediska má maternální/fetální

mikrochimérismus jen omezený význam. Experimentálně bylo

například potvrzeno, že v některých případech lze díky tomuto jevu

zjistit haplotyp chromozómu Y určitého muže rozborem krve jeho

matky. Ve standardní praxi se však tyto analýzy nepoužívají.

Může chimérismus vzniknout uměle?

Ano. Vznik chimérického jedince je důsledkem některých

moderních lékařských zákroků, při nichž jsou do organismu

pacienta vpraveny živé buňky jiného člověka. Trvale chiméričtí

jedinci vznikají v důsledku transplantací orgánů od dárce (ať už

biologického příbuzného, či osoby zcela nepříbuzné). Výběr

vhodného dárce se řídí tzv. tkáňovou kompatibilitou, tedy shodou

80

v tkáňových antigenech. Ty nemají nic společného s genetickým

profilem užívaným k forenzně genetické identifikaci, a dárce a

příjemce se tak genetickým profilem liší.

Z forenzního hlediska nejzávažnější důsledky má bezesporu

transplantace kostní dřeně, při níž jsou pacientovi vpraveny

krvetvorné buňky kostní dřeně od dárce. Taková osoba potom má

jiný genetický profil v krvi a prokrvených orgánech než kupříkladu

v bukálním stěru či spermatu. To může např. vést k falešnému

vyloučení osoby jako původce krevní stopy, je–li porovnávána se

vzorkem bukálního stěru. A naopak: taková stopa může být

nesprávně ztotožněna s osobou, která byla dárcem kostní dřeně.

Určení příbuznosti

Co je to biologická příbuznost?

Biologickou příbuzností dvou osob ve forenzní genetice rozumíme

jednak stav, kdy jedna z těchto osob je přímým předkem druhé,

nebo stav, kdy tyto dvě osoby mají blízkého společného předka.

V prvém případě se typicky jedná o dvojice rodič–dítě, prarodič–

vnouče, případně praprarodič–pravnouče. Ve druhém případě jsou

to nejčastěji dvojice sourozenecké a polovičně sourozenecké, a dále

dvojice strýc/teta – synovec/neteř, dvojice bratranecké, sestřenické

a dvojice bratranec–sestřenice.

Co je to stupeň příbuznosti?

Stupněm příbuznosti dvou osob vyjadřujeme, jak velké procento

autozomální genetické informace těchto osob je shodného původu.

Absolutní příbuznost představuje stav, kdy 100 % autozomální

genetické informace je shodného původu. V absolutní příbuznosti

jsou teoreticky pouze identická (jednovaječná dvojčata).

81

První stupeň příbuznosti představuje stav, kdy polovina, tj. 50 %

autozomální genetické informace je shodného původu. V prvním

stupni příbuznosti jsou dvojice rodič–dítě a úplné sourozenecké

dvojice.

Druhý stupeň příbuznosti představuje stav, kdy čtvrtina, tj. 25 %

autozomální genetické informace je shodného původu. Ve druhém

stupni příbuznosti jsou dvojice prarodič–vnouče, poloviční

sourozenecké dvojice a dvojice biologický strýc/biologická teta –

synovec/neteř.

Třetí stupeň příbuznosti představuje stav, kdy osmina, tj. 12,5 %

autozomální genetické informace je shodného původu. Ve třetím

stupni příbuznosti jsou dvojice praprarodič–pravnouče, dvojice

poloviční biologický strýc/ poloviční biologická teta –

synovec/neteř a dvojice bratranecké, sestřenické a dvojice

bratranec–sestřenice.

Jaké genetické znaky jsou pro určení příbuznosti

používány?

K posouzení příbuznosti osob užíváme v zásadě čtyř skupin DNA

lokusů:

1. lokusy autozomální, děděné dle mendelovských pravidel, tj.

z matky i z otce na všechny děti

2. X–chromozomální haplotyp, děděný z matky na všechny děti

a z otce pouze na dcery

3. Y–chromozomální haplotyp, děděný výhradně z otce na syny

4. mitotyp (lokusy mtDNA), děděný z matky na všechny děti.

Jak je vidět, každá z těchto čtyř skupin lokusů se dědí podle jiných

pravidel. Vhodné lokusy pro testování vybíráme tedy na základě

toho, jaký příbuzenský vztah chceme ověřit či vyvrátit.

82

Jak lze předpokládaný biologický vztah ověřit?

Máme–li určitou konkrétní hypotézu, tj. předpokládáme–li mezi

dvěma osobami určitý konkrétní biologický vztah (např. otec–syn),

víme, jakou měrou by se u něj měly shodovat jednotlivé výše

zmíněné typy DNA lokusů. Provedeme analýzu a posoudíme, jak

dobře zjištěná míra shody odpovídá míře očekávané.

Někdy nemáme o příbuzenství dvou osob jen jednu, ale hned dvě či

více alternativních hypotéz. Například: paní Novákové se narodil

syn Adam, jehož otcem může být manžel paní Novákové Jiří Novák

nebo jeho bratr Jindřich Novák nebo soused Novákových pan Josef

Svoboda. O dvojici Adam Novák – Jiří Novák tedy můžeme říci, že

mohou být a) otec a syn, b) strýc a synovec nebo c) nepříbuzné

osoby. V takovém případě opět posoudíme, jak zjištěná míra shody

odpovídá míře očekávané u jednotlivých hypotéz.

V extrémních případech nemáme o povaze biologického vztahu

mezi dvěma osobami žádnou informaci, pouze nás zajímá, zda jsou

tyto osoby biologicky příbuzné či nikoli. Zde je třeba upozornit, že

na jisté úrovni jsou samozřejmě navzájem biologicky příbuzní

všichni žijící lidé, a dotaz po vzájemné příbuznosti je tedy nutné

omezit jen na určitý okruh možných příbuzenství – tedy např. na

příbuzenství do třetího stupně příbuznosti. V takovém případě tedy

postupujeme tak, že testováním ověříme všechny biologické vztahy,

které připadají u dané dvojice v úvahu.

Jaká je očekávaná shoda u vybraných příbuzenských

dvojic?

Následující odstavce nejsou plným výčtem, ale představují

nejběžnější posuzované biologické vztahy a příslušnou shodu znaků

DNA.

83

matka – dcera

50 % autozomální DNA je shodné původem

obě mají po dvou X chromozómech, z toho jeden je shodný

původem

mitotyp je shodný původem

matka – syn

50 % autozomální DNA je shodné původem

matka má dva X chromozómy, syn jeden, a to shodný původem

s jedním z matčiných X chromozómů

mitotyp je shodný původem

otec – dcera

50 % autozomální DNA je shodné původem

dcera má dva X chromozómy, otec jeden, a to shodný původem

s jedním z dceřiných X chromozómů

mitotyp není shodný původem

otec – syn

50 % autozomální DNA je shodné původem

otec i syn mají po jednom X chromozómu, tyto nejsou shodné

původem

otec i syn mají po jednom Y chromozómu, tyto jsou shodné

původem

mitotyp není shodný původem

sestra – sestra

v průměru 50 % autozomální DNA je shodné původem

obě mají po dvou X chromozómech, jeden nebo oba jsou

shodné původem

mitotyp je shodný původem

84

sestra – bratr

v průměru 50 % autozomální DNA je shodné původem

sestra má dva X chromozómy, bratr jeden, tento může a nemusí

být shodný původem s jedním ze sestřiných X chromozómů

mitotyp je shodný původem

bratr – bratr

50 % autozomální DNA je shodné původem

oba mají po jednom X chromozómu, tyto mohou a nemusí být

shodné původem

oba mají po jednom Y chromozómu, tyto jsou shodné původem

mitotyp je shodný původem

babička z matčiny strany – vnučka

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

obě mají po dvou X chromozómech, z toho jeden může a

nemusí být shodný původem

mitotyp je shodný původem

babička z matčiny strany – vnuk

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

babička má dva X chromozómy, vnuk jeden, tento může a

nemusí být shodný původem s jedním z babiččiných X

chromozómů

mitotyp je shodný původem

dědeček z matčiny strany – vnučka

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

vnučka má dva X chromozómy, dědeček jeden, tento může a

nemusí být shodný původem s jedním z vnuččiných X

chromozómů

mitotyp není shodný původem

dědeček z matčiny strany – vnuk

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

85

oba mají po jednom X chromozómu, tyto mohou a nemusí být

shodné původem

oba mají po jednom Y chromozómu, tyto nejsou shodné

původem

mitotyp není shodný původem

babička z otcovy strany – vnučka

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

obě mají po dvou X chromozómech, z toho jeden je shodný

původem

mitotyp není shodný původem

babička z otcovy strany – vnuk

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

babička má dva X chromozómy, vnuk jeden, tento není shodný

původem ani s jedním z babiččiných X chromozómů

mitotyp není shodný původem

dědeček z otcovy strany – vnučka

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

vnučka má dva X chromozómy, dědeček jeden, tento není

shodný původem ani s jedním z vnuččiných X chromozómů

mitotyp není shodný původem

dědeček z otcovy strany – vnuk

25 % autozomální DNA je shodné původem

oba mají po jednom X chromozómu, tyto nejsou shodné

původem

oba mají po jednom Y chromozómu, tyto jsou shodné původem

mitotyp není shodný původem

nevlastní sestry (společná matka)

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

obě mají po dvou X chromozómech, z toho jeden nebo žádný je

shodný původem

86

mitotyp je shodný původem

nevlastní sestry (společný otec)

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

obě mají po dvou X chromozómech, z toho jeden je shodný

původem

mitotyp není shodný původem

nevlastní sestra a bratr (společná matka)

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

sestra má dva X chromozómy, bratr jeden, tento může a nemusí

být shodný původem s jedním ze sestřiných X chromozómů

mitotyp je shodný původem

nevlastní sestra a bratr (společný otec)

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

sestra má dva X chromozómy, bratr jeden, tyto nejsou shodné

původem

mitotyp není shodný původem

nevlastní bratři (společná matka)

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

oba mají po jednom X chromozómu, tyto mohou a nemusí být

shodné původem

oba mají po jednom Y chromozómu, tyto nejsou shodné

původem

mitotyp je shodný původem

nevlastní bratři (společný otec)

v průměru 25 % autozomální DNA je shodné původem

oba mají po jednom X chromozómu, tyto nejsou shodné

původem

oba mají po jednom Y chromozómu, tyto jsou shodné původem

mitotyp není shodný původem

87

Obrázek 22 – Rodokmen ilustrující stupeň příbuznosti běžných biologických příbuzenských vztahů. Osobu, k níž se porovnání vztahuje, označujeme běžně termínem proband (tak použito i v dalších obrázcích).

88

Obrázek 23 – Rodokmen zachycující dědičnost autozomálních lokusů. Každá osoba nese dvě kopie daného lokusu, přičemž se může jednat od stejné nebo různé alely.

89

Obrázek 24 – Rodokmen zachycující dědičnost X–chromozomálních lokusů. Osoby ženského pohlaví nesou vždy dvě kopie téhož lokusu, osoby mužského pohlaví pouze jednu.

90

Obrázek 25 – Rodokmen zachycující dědičnost Y–chromozomálních lokusů. Osoby ženského pohlaví nenesou žádnou kopii téhož lokusu, osoby mužského pohlaví nesou kopii jednu.

91

Obrázek 26 – Rodokmen zachycující dědičnost mitochondriální DNA. Každá osoba nese určitý mitotyp (vyjma osob s tzv. heteroplazmíí, o nichž bude pojednáno později).

92

Existují nějaké situace, kde výše uváděné míry shody

neplatí?

Ano. Námi popsané míry shody jsou platné jen tehdy, když daná

dvojice osob je právě a pouze v uvedeném vztahu a tyto osoby

nejsou zároveň příbuzné ještě jinak. Co máme na mysli?

V praxi se poměrně často setkáme s takzvaným příbuzenským

křížením neboli inbreedingem, který má významný vliv na

očekávané míry shody genetických znaků. Inbreeding zahrnuje

celou škálu jevů: jeho nejtvrdší formou je incest, tj. příbuzenské

křížení mezi otcem a dcerou, matkou a synem, dědem a vnučkou,

babičkou a vnukem nebo mezi sourozenci. O něco mírnější formou

inbreedingu je konsangvinita neboli pokrevní příbuznost –

typickým příkladem budiž manželství (a společné rodičovství)

bratrance a sestřenice. Za nejmírnější stupeň inbreedingu pak

můžeme považovat křížení osob vzdáleně příbuzných, tak jak

k němu běžně docházelo po dlouhá staletí i na našem území, a to

zejména v izolovanějších subpopulacích. Partner pro uzavření

manželství byl obvykle vybírán v té samé vesnici nebo v okruhu

několika málo vesnic, což při dlouhodobém systematickém

uplatňování této strategie vedlo k významnému zvýšení koeficientu

příbuznosti obyvatel daného regionu, zvlášť přičteme–li k tomu

ještě „posilující efekt“ skrytě konsangvinních svazků (manželé

mohli být často nevlastní sourozenci, aniž to tušili, v důsledku

nevěry svých rodičů).

Při konstruování možných hypotéz biologické příbuznosti a

určování očekávané míry shody genetických znaků je tedy třeba

vždy zohlednit případnou předpokládanou či přímo

potvrzenou konsangvinitu, či dokonce incest. Správné určení

očekávané míry shody může být u složitějších či vícestupňově

konsangvinních hypotéz opravdu nelehkou úlohou.

93

Obrázek 27 – Rodokmen ilustrující zvýšený stupeň příbuznosti osob v rodině, kde došlo jak ke konsangvinnímu sňatku bratrance a sestřenice (značen modrou úsečkou), tak k nechtěně incestnímu sňatku probanda s nevlastní sestrou (značen červenou úsečkou).

94

Byl posuzován případ možného incestního vztahu, kdy ze zjištěných

údajů vyplývalo, že muž (68) měl se svojí sestřenicí dceru, s touto

dcerou měl další dceru (tedy zároveň vnučku) a s touto dcerou–

vnučkou zplodil syna (tedy zároveň vnuka a pravnuka). Pomineme–li

trestně právní a sociální rozměr případu, je tato kauza z hlediska

stanovení správných očekávání genetické shody velmi zajímavá.

Obrázek 28 – Rodokmen ilustrující extrémní stupeň příbuznosti osob u mnohotně incestního případu (popis případu viz žlutý box výše).

95

Predikce biogeografického původu a

fenotypových znaků osoby

Co je etnický původ?

Pojem etnický původ používáme v souvislosti s pojmenováním

příslušnosti konkrétního jedince k určitému lidskému subtypu,

subpopulaci, skupině. Zcela zásadní skutečností, kterou je třeba si

v této souvislosti uvědomit a ujasnit, je, že skupiny označované

jako rasa, národ, etnikum jsou definovány primárně socio–

kulturně, nikoli antropologicky či biologicky.

Zůstává ovšem zjevné, že mezi skupinami lidí na Zemi existují

markantní biologické rozdíly – osoba původem z Afriky má jiné

biologické vlastnosti než osoba původem z Asie. V rámci biologie a

antropologie proto používáme termín biogeografický původ

osoby. Ten zahrnuje a vystihuje jak biologické (a tedy i genetické)

rozdíly mezi jednotlivými populacemi, tak geografické rozmístění

těchto populací.

Co je predikce biogeografického nebo etnického

původu analýzou DNA?

Predikcí biogeografického původu molekulárně genetickými

metodami rozumíme určení, do jaké lidské subpopulace osoba patří,

na základě analýzy DNA. Vzhledem k tomu, že – jak bylo řečeno

o odstavec výše – lidské subpopulace jsou obvykle definovány a

tedy i označovány především na základě sociokulturních souvislostí,

je praktický potenciál analýzy DNA v této oblasti limitovaný.

Zřejmé je, že vysoce spolehlivých výsledků dosahujeme tehdy,

pokud se snažíme o rozlišení „v nejhrubším měřítku“, tj. o určení,

zda osoba je evropského, asijského, afrického původu. Čím jemnější

rozlišení požadujeme, tím větší statistickou chybou je analýza

96

zatížena a tím méně se lze na její výsledek spoléhat. Kupříkladu

rozlišení mezi jednotlivými blízkými národy (Čech vs. Slovák) je

prakticky nemožné, přestože statisticky mezi nimi jisté drobné

rozdíly existují.

Současně je potenciál této analýzy významně ovlivněn dvěma

dalšími faktory: zaprvé mírou mobility obyvatelstva (např. pohyb

obyvatelstva v Evropě je významně menší než v USA) a zadruhé

podílem smíšených partnerství, tedy partnerství osob z původně

geneticky výrazně vzdálených a odlišných populací – typicky např.

žena Nativní Američanka (my bychom ji označili jako Indiánku) a

muž Afroameričan (my bychom jej označili jako černocha) – opět je

podíl těchto partnerství v Evropě významně nižší než v USA.

Národ je typickou socio–kulturně a geopoliticky definovanou

skupinou – příslušníci národa sdílejí především jazyk, kulturu,

území a historii; pochopitelně řada z nich sdílí i biogeografický

původ, ovšem toto kritérium není pro národ primární a určující.

Zatímco u národů obývajících dlouhodobě významně izolovaná

teritoria (např. ostrovy) je společný biogeografický původ silný,

u jiných tomu tak není; kupříkladu my Češi jsme typickým národem

dlouhodobě obývajícím „průchozí území“, což se odráží v našem

genofondu: lakonicky řečeno, v různých obdobích naší historie do

něj přispěl významně kde kdo (Slované, Hunové, Kelti, Turci,

Švédové, Italové, Francouzi, Němci) a hledat tak dnes jakési

„genetické češství“ je beznadějné.

Co je fenotypový znak?

Fenotypovým znakem rozumíme libovolnou vlastnost organismu

– v tomto případě člověka, která je zjevná nebo zjistitelná (např.

biochemickou analýzou). Můžeme sem zahrnout znaky tělesné

(výška, váha, tvar lebky, barva vlasů, barva očí atd.), znaky

biochemické a fyziologické (krevní skupina, rychlost „spalování“

97

glukózy atd.) i třeba znaky neurologické a psychické (svalové

napětí, motorika chůze, temperament, inteligence atd.).

Co je predikce fenotypu analýzou DNA?

Predikcí fenotypu molekulárně genetickými metodami rozumíme

určení, jak daný znak u osoby vypadá, na základě analýzy DNA. To je

pochopitelně nesmírně zajímavé především z investigativního

hlediska – moci z biologické stopy získat popis osoby, která ji

zanechala, je snem všech kriminalistů.

Jaké znaky jsou pro takovouto predikci nejvhodnější?

Především ty, které

1. jsou stálé v čase, tj. relativně neměnné (např. tělesná výška

je u dospělé osoby mnohem stálejší znak než tělesná hmotnost)

2. jsou zjevné i při běžném kontaktu s osobou, a lze je tedy

zjistit bez složitých vyšetření, a často dokonce bez vědomí

dotyčné osoby (např. barvu očí zjistíme pouhým pohledem,

zatímco krevní skupinu osoby musíme vyšetřit sérologicky či

geneticky)

3. jsou dostatečně variabilní, díky čemuž můžeme na základě

daného znaku osoby rozlišit na ty, které se se stopou shodují, a

ty, které ne (např. barva očí je mnohem variabilnější znak než

počet očí)

4. jsou silně geneticky determinované a mohou být analýzou

DNA predikovány s vysokou spolehlivostí (např. již zmíněná

barva očí je mnohem snáze predikovatelný znak než tvar a

rozměry úst).

98

Co tedy lze v současnosti z biologické stopy s relativně

velkou spolehlivostí predikovat?

1. Pohlaví (prakticky s jistotou);

2. Biogeografický původ v hrubém měřítku;

3. Přirozenou barvu očí (v hrubém rozlišení – např. modrá/

hnědá);

4. Přirozenou barvu vlasů (v hrubém rozlišení – např.

blond/rezavá/tmavá);

5. Přirozenou barvu pokožky (v hrubém rozlišení – např. velmi

světlá/velmi tmavá);

Vyjma určení pohlaví – což je rutinní záležitost – byly dosud ve

světě tyto predikce provedeny přímo z forenzních vzorků jen

v několika málo kriminálních případech a příslušné metody jsou

zatím spíše vyvíjeny a ověřovány. Problematice se v minulých letech

intenzivně věnovala americká společnost DNAprint Genomics,

sídlící na Floridě, která vytvořila první komerčně dostupné testy

predikce etnicity a fenotypových znaků; po určité době však tyto své

původně nadějné projekty revidovala, nabízené produkty stáhla a

v roce 2009 ukončila svou činnost.

Které forenzně zajímavé fenotypové znaky dosud nelze

ze stopy věrohodně predikovat?

Dosud zůstávají zcela nepredikovatelné či velmi nespolehlivě

predikovatelné například stáří osoby, tělesná výška a rysy

obličeje.

99

Obecné principy forenzně genetické

analýzy

Principy identifikace

Na základě analýzy jakých lokusů v DNA lze osobu

identifikovat?

Pro identifikace jsou užívány lokusy polymorfní až vysoce

polymorfní, tedy ty, u nichž existuje v populaci několik (často i

desítky) možných variant – alel. Právě díky existenci mnoha variant

se osoby v populaci navzájem velmi často liší tím, kterou konkrétní

alelu či alely ve své DNA nesou.

Co jsou repetitivní sekvence DNA?

Jedněmi z nejpolymorfnějších lokusů lidské (a nejen lidské) DNA

jsou tzv. repetitivní sekvence. Jsou to takové sekvence, které se

v genomu nevyskytují pouze jednou, ale opakovaně. Tedy – určitý

motiv (určitá přesná sekvence) se v genomu objevuje vícekrát.

Pokud jsou jednotlivé motivy v DNA zařazeny těsně za sebou –

v tandemu, nazýváme takový úsek DNA tandemová repetice.

Pokud se jednotlivá opakování motivu vyskytují rozptýleně na

různých místech genomu, a to třeba i na různých chromozómech,

mluvíme o repetici rozptýlené.

Které repetitivní sekvence jsou forenzně využívány pro

identifikaci?

V počátcích forenzní genetiky byly k identifikačním analýzám

užívány tzv. dlouhé tandemové repetice s variabilním počtem

opakování, označované jako VNTR (angl. Variable Number of

Tandem Repeats) neboli minisatelity. V současnosti jsou pro

100

identifikaci zdaleka nejužívanějšími lokusy tzv. krátké tandemové

repetice, označované jako STR (angl. Short Tandem Repeats) neboli

mikrosatelity.

Co jsou minisatelity neboli VNTR?

Minisatelity neboli VNTR (angl. Variable Number of Tandem

Repeats) čili dlouhé tandemové repetice s variabilním počtem

opakování jsou repetitivní sekvence s typickou délkou základního

motivu 10–100 nukleotidů; tento motiv se vyskytuje na určitém

místě DNA v jednotkách až stovkách opakování těsně za sebou.

Jednotlivé alely minisatelitu se liší počtem opakování základního

motivu, a tedy délkou.

Dejme tomu, že určitá VNTR repetice lidského genomu má délku

základního motivu 17 nukleotidů, přičemž motiv se může opakovat

70–450krát. Nejkratší alela této repetice je tedy dlouhá 1190

nukleotidů a nejdelší alela 7650 nukleotidů.

VNTR lokusy se vyskytují na mnoha místech genomu a byly prvními,

které byly pro účely identifikace využity. Dnes už jsou postupy

založené na jejich analýze překonány a pro identifikace se od

poloviny 90. let 20. století prakticky neužívají, a proto se jim

nebudeme již podrobněji věnovat.

Co jsou mikrosatelity neboli STR?

Mikrosatelity neboli STR (angl. Short Tandem Repeats) čili krátké

tandemové repetice (označované někdy též SSR – angl. Simple

Sequence Repeat) jsou repetitivní sekvence s typickou délkou

základního motivu 2–9 nukleotidů; tento motiv se vyskytuje na

určitém místě DNA v jednotkách až desítkách opakování těsně za

sebou. Jednotlivé alely mikrosatelitu se tak stejně jako

u minisatelitů liší počtem opakování základního motivu, a tedy

101

délkou, nicméně celková délka repetice je u STR výrazně kratší než

u VNTR.

Dejme tomu, že určitá STR repetice lidského genomu má délku

základního motivu 4 nukleotidy, přičemž motiv se může opakovat 8–

15krát. Nejkratší alela této repetice je tedy dlouhá 32 nukleotidů a

nejdelší alela 60 nukleotidů. (Prosím srovnejte s délkami nejkratší a

nejdelší alely typické VNTR, uvedenými v textu o něco výše).

Obrázek 29 – Struktura krátké tandemové repetice (STR) neboli mikrosatelitu.

STR lokusy se vyskytují na všech lidských chromozómech včetně

pohlavních chromozómů X a Y, nenajdeme je pouze

v mitochondriální DNA. Jsou jich známy tisíce a tvoří cca 3 %

102

lidského genomu, nicméně zdaleka ne všechny tyto mikrosatelity

jsou variabilní.

Jak mikrosatelity (STR lokusy) a jejich alely

klasifikujeme?

Jednotlivé mikrosatelity mohou mít systematická i vžitá (triviální)

označení. Obecně mikrosatelity objevené a k analýzám užívané již

dávno mají spíše označení triviální, vycházející obvykle z názvu

blízké genové sekvence – např. TPOX, FGA, vWA apod. Lokusy

„novější“ jsou označovány systematickým názvem – např. D21S11,

D19S433 či D5S818, ne však vždy (např. relativně nově užívané

pětinukleotidové lokusy jsou známy pod názvem Penta E a Penta D).

Jak již bylo řečeno výše, mikrosatelity mohou mít délku základního

motivu 2–9 nukleotidů, a právě podle ní klasifikujeme jednotlivé

mikrosatelity na di–, tri–, tetra–, penta–, hexa–, hepta–, okta– a

nonanukleotidové. Pro forenzní analýzy lidí jsou využívány

prakticky výhradně STR lokusy tetra– nebo pentanukleotidové,

tedy ty se základním motivem dlouhým 4 nebo 5 nukleotidů.

U repetic s kratším motivem (2 či 3 nukleotidy) může při analýze

docházet ve velké míře k těžko odstranitelnému nežádoucímu jevu,

zvanému stuttering (prokluz polymerázy, jev je podrobněji popsán

v kapitolách pojednávajících o technologii forenzně genetické

analýzy), repetice s delším motivem (6–9 nukleotidů) jsou již zase

celkově dosti dlouhé (čtyřnukleotidová repetice s 20 opakováními

motivu měří 80 nukleotidů, zatímco osminukleotidová repetice se

stejným počtem opakování měří 160 nukleotidů), což může vést

k problémům s jejich analýzou u vzorků s degradovanou DNA.

Jednotlivé alely STR lokusů označujeme číslem vyjadřujícím

počet opakování základního motivu u této konkrétní alely. Tedy –

alela 7 představuje takovou variantu daného STR lokusu, v níž se

základní motiv opakuje 7krát.

103

Některé alely však nejsou tvořeny celým počtem opakování

základního motivu: lokus je tvořen například 7 celými opakováními

čtyřnukleotidového motivu, za nimiž následují ještě dva nukleotidy

z osmého opakování (tj. osmé opakování motivu není celé, ale

v repetici jsou z něj přítomny jen dva nukleotidy). Takové alely

označujeme jako mikrovarianty a značíme je počtem úplných

opakování základního motivu, za nímž následuje tečka a počet

„nadbytečných“ nukleotidů – v našem příkladu tedy 7.2.

Obrázek 30 – Alely STR lokusu – standardní a mikrovariantní.

Jak byly vybrány konkrétní STR lokusy (mikrosatelity)

pro forenzní testování?

Pro potřeby forenzního testování byly zvoleny takové lokusy, které

mají kromě již výše zmíněné vhodné délky základního motivu (4

104

nebo 5 nukleotidů) také velkou variabilitu, tj. co největší počet

existujících alel, a pokud možno vyvážené frekvence těchto alel.

Nutno říci, že ne všechny z testovaných lokusů tuto podmínku

splňují a v základním setu testovaných lokusů zůstávají zejména

z historických důvodů.

Další důležitou podmínkou je, aby jednotlivé testované lokusy

nebyly v tzv. genetické vazbě – laicky řečeno, aby v DNA nebyly

příliš blízko sebe. Ideálně jsou vybírány do testování STR lokusy

lokalizované na různých chromozómech, a pokud už jsou na témže

chromozómu, pak dostatečně daleko od sebe. (Tento princip neplatí

u STR lokusů na pohlavních chromozómech X a Y, o kterých bude

později pojednáno samostatně).

Principiálně je důležité, aby po celém světě byly pro forenzní

analýzy používány pokud možno stejné lokusy – jedině tak lze

data získaná v různých laboratořích vzájemně srovnávat (u dvou

vzorků – např. stopy a srovnávacího vzorku – lze porovnat vždy

pouze výsledky analýzy stejných lokusů).

V současné době existuje pro identifikaci několik oficiálně

doporučených setů autozomálních STR lokusů, které se v mnoha

zařazených lokusech shodují. Jsou to:

The CODIS STR Loci – 13 STR lokusů jako základní standardní

set pro oblast USA;

The Expanded U.S. Core Loci – 18 STR lokusů (13 původních

+ 5 nových) jako rozšířený standardní set pro oblast USA;

The European Standard Set (ESS) – 7 STR lokusů jako

základní standardní set pro Evropu; je totožný s The Interpol

Standard Set of Loci (ISSOL);

The Extended European Standard Set (extended ESS) –

12 STR lokusů (7 původních + 5 nových) jako rozšířený

standardní set pro Evropu.

105

Pro analýzu Y chromozomálních STR lokusů rovněž existují

doporučené sety těchto markerů – hovoříme o tzv. minimálním a

rozšířeném Y–STR haplotypu. Minimální haplotyp označovaný

minHt zahrnuje 8 Y–STR lokusů, rozšířený pak dalších 8 Y–STR

lokusů.

Pro analýzu X chromozomálních STR lokusů tak významná

doporučení neexistují, v rámci forenzních analýz je otestováno

celkem cca 33 různých X–STR a výběr závisí především na

rozhodnutí dané laboratoře.

Jak vypadá genotyp STR lokusu konkrétního jedince?

U STR lokusu, který se nachází na nepohlavních chromozómech

(autozómech), má konkrétní jedinec dvě kopie daného lokusu, a

může tedy být buď heterozygotní (např. 11/12 – tj. má jednu alelu

11 a jednu 12), nebo homozygotní (např. 13/13 – tj. má dvě kopie

alely 13).

U STR lokusu, který se nachází na X chromozómu, je muž vždy

hemizygotní – má pouze jeden X chromozóm, a tedy pouze jednu

kopii daného lokusu (např. alelu 12), zatímco žena má dva

X chromozómy, a může tedy být heterozygotní (např. 12/14) nebo

homozygotní (např. 11/11).

U STR lokusu, který se nachází na Y chromozómu, je daný lokus

přítomen pouze u muže, a to v jedné kopii (má např. alelu 12). Toto

konstatování však neplatí u některých Y–STR lokusů, jež jsou na

Y chromozómu duplikovány (zdvojeny), přičemž každá ze dvou

kopií může obsahovat jinou alelu a muž pak má genotyp např.

11/14 (nejedná se však o heterozygozitu).

106

Obrázek 31 – Možné varianty srovnání genotypu stopy a osoby: neshoda, náhodná shoda nebo zákonitá shoda genotypu.

Jak probíhá identifikace (určení shody) pomocí

analýzy autozomálních STR lokusů?

Pokud mají dva biologické vzorky (např. krevní stopa a

srovnávací vzorek) téhož původce neboli stejný zdroj, pak bude

forenzně genetickou analýzou určitého STR lokusu v obou

vzorcích stanoven identický genotyp tohoto lokusu; tedy

kupříkladu je–li ve stopě zjištěn genotyp 11/15, pak i v bukálním

stěru jejího původce bude stanoven genotyp 11/15. (Bohužel, toto

tvrzení nemusí být vždy pravdivé a vzácně se objeví i situace, kdy se

genotyp dvou vzorků nemusí shodovat, přestože mají stejného

původce; jednou z nich je již dříve popsaný chimérismus, dále se

může jednat o tzv. mozaicismus – mutaci přítomnou pouze

v některých buňkách dané osoby.)

107

Naproti tomu, pokud mají dva biologické vzorky různého

původce, pak forenzně genetickou analýzou bude v poměrně

velkém procentu případů zjištěn rozdílný genotyp (např. stopa

11/15 a srovnávací vzorek 12/15). Může nicméně nastat situace,

kdy i u takovýchto vzorků s různým původcem bude zjištěn stejný

genotyp – tedy např. u obou 13/14), a to proto, že oba původci se

koincidencí, náhodou shodují v genotypu testovaného lokusu.

Je tedy zřejmé, že testování jediného STR lokusu nám nepomůže

otázku na společný respektive rozdílný původ obou vzorků

spolehlivě zodpovědět. Proto je při forenzně genetické analýze

současně testován větší počet STR lokusů (v ČR obvykle typicky

15 autozomálních STR lokusů), čímž se náhodná shoda dvou osob

stává extrémně nepravděpodobnou a testování má vysokou

vypovídací hodnotu.

Analýza setu autozomálních STR lokusů (a současně s ní

prováděná analýza pohlaví) je nejfrekventovanějším postupem

současné kriminalistické a identifikační forenzní genetiky. Své

uplatnění nachází v nejrůznějších typech kriminálních případů či

identifikačních úkonů a může v principu vést až k individuální

identifikaci zůstavitele biologického materiálu.

Jak probíhá identifikace (určení shody) pomocí

analýzy X–chromozomálních STR lokusů?

Pokud mají dva biologické vzorky téhož původce neboli stejný

zdroj, pak se u nich bude shodovat i genotyp X–

chromozomálních STR lokusů; pro přímou identifikaci se ovšem

analýza X–chromozomálních markerů prakticky nevyužívá, neboť

nepřináší žádný benefit. Je však velmi zajímavým nástrojem při

určování některých typů biologických vztahů – viz část věnovaná

principům určení příbuznosti.

108

Jak probíhá identifikace (určení shody) pomocí

analýzy Y–chromozomálních STR lokusů?

Pokud mají dva biologické vzorky téhož původce neboli stejný

zdroj, pak se u nich bude shodovat i haplotyp Y–

chromozomálních STR lokusů; opět ovšem nelze vyloučit možnost

existence drobné odchylky, způsobené mutací.

Y–chromozóm je předáván z otce na všechny syny, a to

v nezměněné podobě, proto tuto analýzu samu o sobě nelze

použít k individuální identifikaci osoby. Při identifikacích tedy

tuto analýzu užíváme v některých specifických situacích, kdy je

analýza autozomálních STR neinformativní: typicky je to analýza

stopy tvořené ženským biologickým materiálem s malou příměsí

materiálu mužského, kdy analýza autozomálních STR zpravidla není

schopna detekovat alely minoritní složky směsi, tj. alely muže.

Takovými typickými vzorky jsou

1. poševní stěr po znásilnění, při němž nedošlo k ejakulaci

pachatele do pochvy poškozené (anebo je pachatel

azoospermický, tj. nemá v ejakulátu spermie),

2. vzorek materiálu zpoza nehtů ženy fyzicky napadené mužem.

Analýzou Y–STR v těchto případech sice nedosáhneme individuální

identifikace pachatele, ale v případě neshody haplotypů můžeme

podezřelou osobu prakticky s jistotou vyloučit.

Jaké další lokusy kromě repetic jsou forenzně

využívány pro identifikaci?

Dalšími lokusy, které lze využít pro identifikaci, jsou tzv.

jednonukleotidové polymorfismy, označované jako SNP (angl.

Single Nucleotide Polymorphisms). Konečně v určitých specifických

případech je pro skupinovou identifikaci osob užívána analýza tzv.

109

hypervariabilních oblastí mitochondriální DNA, označovaných

jako HVR mtDNA (angl. Hypervariable Region of mitochondrial

DNA).

Co jsou jednonukleotidové polymorfismy neboli SNP?

Jednonukleotidové (bodové) polymorfismy jsou ve své podstatě

nejjednodušším možným polymorfismem, jaký může v DNA

existovat. V určitém konkrétním místě DNA se u jedné osoby

vyskytuje jiný nukleotid než u druhé. Kupříkladu: zatímco osoba A

má v určitém místě sekvenci AATGGATA, osoba B má v tomtéž místě

sekvenci AATGGGTA; vidíme, že šestý nukleotid této sekvence je u

obou osob různý, a dané místo je tedy polymorfní. Protože tento

polymorfismus spočívá ve změně jediného nukleotidu sekvence,

hovoříme o jednonukleotidovém polymorfismu.

Obrázek 32 – Struktura jednonukleotidového polymorfismu (SNP).

110

SNP se vyskytují po celém lidském genomu s četností cca 1 na 1000

nukleotidů – u každého z nás lze tedy nalézt miliony takovýchto

polymorfismů.

Jak SNP lokusy a jejich alely klasifikujeme?

Jednotlivé SNP lokusy jsou zpravidla specifikovány

prostřednictvím svého referenčního čísla v databázi dbSNP, vedené

NCBI (National Center for Biotechnology Information). Označení

konkrétního SNP pak je kupříkladu rs1493232.

Jednotlivé alely SNP lokusů označujeme písmenem označujícím

příslušný nukleotid – tj. A, C, G nebo T.

Principiálně mohou u každého SNP lokusu existovat nanejvýše čtyři

možné alely: A, C, T a G (více základních typů nukleotidů v DNA

není). Valná část SNP lokusů je však tzv. bialelických – to znamená,

že v populaci se vyskytují pouze dvě varianty (alely) tohoto SNP;

například větší procento populace má v daném místě nukleotid C,

menší procento pak nukleotid A. Při popisu příslušného SNP

užíváme zápis rs1493232 C>A nebo rs1493232 C/A, kterým

vyjadřujeme, jaké alely se v tomto SNP vyskytují a která z nich je

frekventovanější. Nutno však říci, že nomenklatura SNP není

v tomto směru zcela jednotná a existují i jiné způsoby zápisu.

Jak vypadá genotyp SNP lokusu konkrétního jedince?

U SNP lokusu, který se nachází na nepohlavních chromozómech

(autozómech), má konkrétní jedinec dvě kopie daného lokusu,

a může tedy být buď heterozygotní (např. AT – tj. má jednu alelu A a

jednu T), nebo homozygotní (např. TT – tj. má dvě kopie alely T).

U SNP lokusu, který se nachází na X chromozómu, je muž vždy

hemizygotní – má pouze jeden X chromozóm, a tedy pouze jednu

kopii daného lokusu (např. alelu C), zatímco žena má dva X

111

chromozómy, a může tedy být heterozygotní (např. CG) nebo

homozygotní (např. GG).

U SNP lokusu, který se nachází na Y chromozómu, je daný lokus

přítomen pouze u muže, a to v jedné kopii (má např. alelu T).

Jak probíhá identifikace (určení shody) pomocí analýzy

SNP lokusů?

Princip identifikace pomocí SNP je prakticky shodný s principem

identifikace u STR: pokud předpokládáme, že dva vzorky mají

téhož původce, měl by v nich být stanoven i stejný genotyp SNP

lokusu. Mají–li různého původce, může a nemusí být v nich

stanovený genotyp shodný.

Poměrně podstatným rozdílem oproti STR, který si musíme

uvědomit, je malá alelická škála SNP lokusu: zatímco u typického

STR jsme hovořili o desítkách možných alel, u SNP mohou

z podstaty věci existovat nanejvýše čtyři alely, ale v praxi jsou

dokonce zpravidla užívány již zmíněné lokusy bialelické, tedy

s pouhými dvěma alelami. Důsledkem je podstatně větší

pravděpodobnost náhodné shody osoby se vzorkem, jehož

původcem je někdo jiný. Abychom tento efekt malé alelické škály

vyvážili, je pro dosažení potřebné míry spolehlivosti do

testování třeba zařadit mnohem více SNP lokusů, než tomu

bylo u STR, a to až desítky.

Přestože analýza SNP má prakticky stejný identifikační potenciál

jako analýza STR, v praxi je mnohem méně využívána. Hlavními

příčinami jsou zejména

1. Nutnost převést laboratoř (včetně celé metodiky a systému

kvality) na analýzu SNP, někdy i částečně převybavit laboratoř

technologicky (analýza základních forenzních SNP je

112

proveditelná na zařízeních používaných pro STR analýzu, celá

řada SNP aplikací je však založena na odlišných technologiích)

2. Nekompatibilita dat (pokud jsou v databázích uloženy STR

profily, pak SNP profil není s nimi porovnatelný, jedná se o jiný

identifikační údaj)

3. Problematičtější použitelnost pro analýzu směsí biologických

materiálů

4. Souvislost mnohých SNP s dědičnými chorobami.

Pro svůj velmi zajímavý potenciál v oblasti predikce

biogeografického původu a fenotypových znaků (viz dále) však

pravděpodobně budou v budoucnu SNP lokusy stále

vyhledávanějším cílem forenzně genetické analýzy.

Co jsou hypervariabilní oblasti mitochondriální DNA

neboli HVR mtDNA?

Mitochondriální DNA (mtDNA) je velmi specifickou částí dědičné

informace v buňce. Je to jednoduchá kruhová molekula DNA (nemá

tedy podobu chromozómu) a typově je stejná jako DNA bakterií.

Současné teorie předpokládají, že mitochondrie mají skutečně svůj

původ v bakteriích, které se postupně začlenily do pokročilých

eukaryotních buněk a staly se jejich nedílnou součástí.

MtDNA je z velké části tvořena kódujícími sekvencemi (geny),

extragenové DNA zde najdeme relativně velmi málo. Výjimkou je

oblast tzv. D–kličky (smyčky) (angl. D–loop), zvaná též kontrolní

(řídící) oblast (angl. control region). Zhruba uprostřed této oblasti

leží tzv. ori H – místo, odkud se mtDNA kopíruje, a po jeho obou

stranách se nacházejí nekódující úseky, v nichž najdeme velký počet

variabilních míst; proto tyto úseky označujeme jako

hypervariabilní a značíme HVR (angl. Hypervariable Region).

113

V lidské mtDNA rozlišujeme dvě hlavní hypervariabilní oblasti

(HV1 a HV2) a jednu vedlejší (HV3):

1. HV1 (též HVR1 či HVI) je standardně dlouhá 341 nukleotidů

2. HV2 (též HVR2 či HVII) je standardně dlouhá 267 nukleotidů

3. HV3 (též HVR3 či HVIII) je standardně dlouhá 136 nukleotidů

Při analýzách jsou zpravidla sekvenovány především HV1, která je

delší, ale o něco méně polymorfní, a HV2, která je kratší, ale

polymorfnější; zahrnutí analýzy HV3 je spíše doplňkovou záležitostí.

Obrázek 33 – Struktura mitochondriální DNA (mtDNA) a jejích hypervariabilních oblastí HV1, 2 a 3.

114

Jak vypadá HVR mtDNA konkrétního jedince , jak

popisujeme jednotlivé alely HVR mtDNA?

Pokud porovnáme sekvenci hypervariabilní oblasti mtDNA dvou

osob, najdeme zde zpravidla několik drobných rozdílů, kterými

mohou být:

1. Drobné záměny jednotlivých nukleotidů (tedy vlastně SNP)

– tzv. nukleotidové substituce: např. osoba A má v pozici 16126

nukleotid T, zatímco osoba B má v téže pozici nukleotid C.

2. Drobné délkové změny – inzerce (vřazení) či naopak delece

(vypadnutí) jednoho, dvou či tří nukleotidů: například osoba A

má v určitém místě HVR sekvenci AAACCCCTCCAT, osoba B

sekvenci AAACCCCTTCCAT a osoba C naopak jen

AAACCCTCCAT

Popsat stav hypervariabilní oblasti konkrétní osoby bychom

samozřejmě mohli tím, že bychom uvedli její kompletní sekvenci;

takový zápis by však byl pro svou délku a nepřehlednost značně

nepraktický. Postupujeme tedy tak, že zjištěnou sekvenci

konkrétní osoby srovnáme s referenční sekvencí, kterou

označujeme jako rCRS (angl. revised Cambridge Reference Sequence),

a zapíšeme odchylky od této sekvence, a to takto:

1. U substitucí uvedeme nukleotid, který je na dané pozici

přítomen místo standardního nukleotidu referenční sekvence,

tedy kupříkladu 16126C (= „na pozici 16126 je u vyšetřované

osoby nukleotid C“).

2. U delecí uvedeme pozici a „d“, „del“ nebo „–“, tedy kupříkladu

315d respektive 315del či 315– (= „u vyšetřované osoby

nukleotid na pozici 315 chybí“).

115

3. U inzercí uvedeme poslední standardní pozici, tečku, pořadí

inzertovaného nukleotidu a typ nukleotidu, tedy kupříkladu

211.1A (=“u vyšetřované osoby je za standardní pozicí 211

navíc začleněn nukleotid A“).

4. Za určitých okolností může být některý z nukleotidů analýzou

opakovaně „nečitelný“ (nelze zjistit, který nukleotid v dané

pozici je) – potom užijeme označení „N“ – například 16143N

(=“u vyšetřované osoby nebylo možno určit typ nukleotidu

v pozici 16143“).

Ve valné většině případů mají všechny tkáně i jednotlivé buňky

osoby stejnou sekvenci hypervariabilních oblastí mtDNA. Nicméně,

neplatí to vždy; relativně vzácně se můžeme setkat s jevem,

označovaným jako heteroplazmie. Je to jednak stav, kdy některé

skupiny buněk v rámci téže tkáně mají jinou sekvenci HVR než

jiné, a jednak stav, kdy se mitochondrie s rozdílnou sekvencí

HVR nacházejí společně přímo v rámci jednotlivých buněk.

Zpravidla se obě linie liší jediným zaměněným nukleotidem – danou

pozici pak zapíšeme např. 16126C/T, někdy se lze setkat i s

označením 16126Y (Y se použije pro heteroplazmii C/T, R se

použije pro heteroplazmii A/G).

Jak probíhá identifikace (určení shody) pomocí

analýzy HVR mtDNA?

Při porovnávání dvou vzorků vycházíme opět z předpokladu, že

mají–li tyto vzorky společného původce, měly by mít i stejnou

sekvenci hypervariabilních oblastí. Porovnáme tedy námi zjištěné

odchylky od standardní sekvence obou vzorků.

Zde je třeba znovu konstatovat a zdůraznit, že sekvence HVR

mtDNA nejsou z logiky věci markery individuálně identifikující:

jsou děděny v nezměněné podobě v maternální linii (po přeslici) a

116

všechny osoby v této linii mají – nedojde–li k mutaci – sekvence

mtDNA identické. Analýzou tedy nelze rozlišit např. mezi sourozenci

(pokud mají společnou matku), mezi matkou a jejími dětmi, mezi

vnukem a babičkou z matčiny strany atd.

V případě zjištění shody sekvencí obou vzorků proto pouze

společného původce obou vzorků nevyloučíme, ale rozhodně

nepotvrdíme.

Na druhou stranu, vzhledem k mnohonásobně vyšší mutační

rychlosti DNA mitochondrií než má jaderná DNA, a též vzhledem

k již zmíněné možnosti heteroplazmie existuje statisticky nenulová

možnost, že i dva vzorky stejného původce se mohou lišit

jedním nukleotidem. Proto teprve zjištění většího počtu rozdílů

(2 a více) v HVR sekvenci obou vzorků nás opravňuje hypotézu

společného původce vzorků vyloučit.

Analýza mtDNA, podobně jako analýza Y–STR, není schopna osobu

jednoznačně identifikovat. Své uplatnění v kriminalistické a

identifikační forenzní genetice však nachází tam, kde je analýza

jaderné DNA (autozomálních, X a Y–chromozomálních lokusů)

nemožná či velmi obtížná; těmito situacemi jsou zejména:

1. Analýza kosterního materiálu s vysoce degradovanou DNA

2. Analýza fragmentů vlasů a chlupů „bez kořínku“, tj. v katagenní

či telogenní fázi vývoje, či pouhých vlasových fragmentů.

Analýzou mtDNA opět nedosáhneme individuální identifikace

pachatele, ale v případě neshody HVR můžeme podezřelou osobu –

stejně jako u haplotypu Y–chromozómu – prakticky s jistotou

vyloučit. Analýza mtDNA je rovněž cenným nástrojem při

posuzování příbuzenských vztahů (viz dále).

117

Principy určení příbuznosti

Na základě analýzy jakých lokusů v DNA lze

posuzovat biologickou příbuznost osob?

Pro posouzení příbuznosti jsou stejně jako pro identifikace užívány

lokusy polymorfní až vysoce polymorfní. V části Forenzní

potenciál genetické analýzy jsme si již řekli, že k posouzení

příbuznosti využíváme v zásadě čtyř typů DNA lokusů, a to:

1. lokusů autozomálních, děděných z matky i z otce na všechny

děti; zde se zaměřujeme (stejně jako u identifikací) zejména na

STR lokusy,

2. lokusů X chromozomálních, děděných z matky na všechny

děti a z otce pouze na dcery; ve forenzní praxi jsou využívány

téměř výhradně X–STR lokusy (principiálně by bylo možno

použít i X–SNP lokusy, které se však užívají spíše v rámci

evolučně migračních studií),

3. lokusů Y chromozomálních, děděných výhradně z otce na

syny; ve forenzní praxi jsou využívány téměř výhradně Y–STR

lokusy (principiálně by bylo možno použít i Y–SNP lokusy,

které se však užívají spíše v rámci evolučně migračních studií),

4. lokusů mitochondriálních, děděných z matky na všechny děti;

stejně jako u identifikací se zde analýza soustředí na

hypervariabilní oblasti neboli HVR.

Jak lze posoudit příbuznost osob na základě

autozomálních STR lokusů?

Základní pravidla, kterými se primárně řídí dědičnost

autozomálních lokusů, jsme zde již zmínili, a lze je shrnout takto:

1. Rodič svému dítěti předá vždy jednu ze svých dvou alel.

118

2. O tom, která z obou rodičových alel bude předána, rozhoduje

náhoda.

3. S určitou velmi malou pravděpodobností může „v době

předávání“ (tj. při vzniku vajíčka či spermie, z něhož posléze

dítě vznikne) dojít k mutaci, která předávanou alelu pozmění

(např. z alely 11 se stane alela 12).

Dvě osoby (bez ohledu na to, zda jsou příbuzné či nikoliv) mohou

nést tutéž alelu určitého lokusu – např. jedna osoba má genotyp

11/12, druhá osoba je 12/14 – shodně mají tedy obě alelu 12. Této

alele pak říkáme alela shodná stavem.

Osoby biologicky příbuzné mají některé své alely shodné

původem; to znamená, že příslušná alela pochází od společného

předka obou těchto osob, nebo dokonce že jedna z těchto osob je

přímým předkem druhé osoby.

Alely shodné původem mohou, ale nemusejí být shodné stavem

(shodné nejsou, nastala–li mezigenerační mutace). Alely shodné

stavem mohou, ale nemusejí být shodné původem (lidé se

náhodně shodují, ačkoli nejsou příbuzní). Pro lepší pochopení

uveďme konkrétní případ:

Pavel a Marie jsou manželé a – pokud je jim známo – nejsou nijak

biologicky příbuzní. Pavel má v lokusu A genotyp 8/12, Marie genotyp

8/14. Alela 8 je u nich alelou shodnou stavem, nikoli však

původem.

Pavlovi a Marii se narodí syn David, který má v lokusu A genotyp

8/14. Je zřejmé, že David alelu 14 získal od matky Marie (je to tedy

jeho maternální alela) a můžeme konstatovat, že alela 14 je

u Davida a Marie shodná stavem i původem. Alelu 8 musel proto

David získat od otce Pavla (je to tedy jeho paternální alela) a můžeme

konstatovat, že alela 8 je u Davida a Pavla shodná stavem

119

i původem. Marie má také alelu 8, ovšem tu s jistotou Davidovi

nepředala (neboť mu předala alelu 14), a můžeme tedy konstatovat,

že alela 8 je u Davida a Marie shodná stavem, nikoli však

původem.

Po čase se Pavlovi a Marii narodí syn Lukáš, který má v lokusu A

genotyp 11/14. Pavel se s Lukášem tedy neshoduje ani v jedné z alel.

Analýza řady dalších lokusů prokáže, že příčinou není Mariina nevěra,

ale mezigenerační mutace Pavlovy alely 12 na Lukášovu alelu 11.

Můžeme tedy konstatovat, že Pavlova alela 12 a Lukášova alela 11

jsou shodné původem, nikoli však stavem.

Jak již jsme konstatovali v části věnované obecným informacím

o posouzení příbuznosti, každý typ biologického příbuzenského

vztahu je charakterizován určitým podílem alel shodných

původem. Při analýze ovšem tento podíl nedokážeme nikdy určit

přímo, ale pouze zprostředkovaně – pomocí vyhodnocení

přítomnosti alel shodných stavem.

Lze posoudit otcovství muže k dítěti i bez vzorku

matky dítěte?

Ano. Znalost DNA profilu matky umožňuje zpravidla identifikovat,

která alela dítěte je paternálního původu, což zlepšuje statistické

parametry zkoumání, není však v žádném případě nezbytnou

podmínkou posouzení otcovství. K tomu stačí znalost profilu dítěte

a znalost profilu potenciálního otce.

Lze posoudit otcovství muže k dítěti i bez jeho

vzorku?

Za určitých okolností ano. Není–li k dispozici přímo vzorek

nařčeného (potenciálního otce), je možné použít ke srovnání vzorky

jeho blízkých biologických příbuzných – rodičů (tj. potenciální

120

babičky a dědečka dítěte), dalších biologických dětí nařčeného (tj.

potenciálních sourozenců dítěte) apod. Vypovídací hodnota

zkoumání pak výrazně závisí na příbuznosti a počtu takto

dostupných „nepřímých“ vzorků. Existuje zde ovšem riziko, že

dostupné osoby nejsou ve skutečnosti v předpokládaném

biologickém vztahu k nařčenému – tj. například že jeho otec (tedy

potenciální dědeček dítěte) není ve skutečnosti jeho biologickým

otcem.

Jak lze posoudit příbuznost osob na základě X–

chromozomálních DNA lokusů?

Jak již bylo popsáno dříve, ženy mají ženy dva chromozómy X,

zatímco muži mají jeden chromozóm X a jeden Y.

U ženy se při tvorbě pohlavních buněk (meióze) dostává do vajíčka

vždy jeden z jejích chromozómů X. (Mezi jejími dvěma chromozómy

X může rovněž během meiózy dojít k vzájemné výměně částí DNA –

tzv. rekombinaci; do vajíčka se pak dostane jeden rekombinovaný

chromozóm X, který je vlastně kombinací obou původních ženiných

X chromozómů). U muže tento jev nenastává – chromozóm X a Y

spolu (vyjma pseudoautozomálních oblastí) nerekombinují; do

poloviny spermií se dostane chromozóm X v nezměněné podobě,

zatímco do druhé poloviny chromozóm Y, a to rovněž v nezměněné

podobě (samozřejmě za předpokladu, že nenastane mutace).

Výše uvedené má některé důležité důsledky pro posouzení

příbuznosti. Obecně užíváme analýzu X chromozomálních

lokusů spíše výjimečně, a to v případech, kdy analýza

autozomálních lokusů nemá sama o sobě dostatečnou

vypovídací hodnotu. Typickými situacemi jsou:

1. průkaz otcovství u páru otec–dcera, kdy není k dispozici vzorek

matky

121

2. průkaz otcovství dcery, kdy není k dispozici vzorek otce, ale

pouze jeho matky (tj. analýza páru babička z otcovy strany–

vnučka)

3. průkaz mateřství u páru matka–syn či matka–dcera, kdy není

k dispozici vzorek otce

4. průkaz polovičního sourozenectví sester, které mají společného

otce

5. některé incestní situace; analýza X–STR například může pomoci

rozhodnout, zda dítě zplodil otec nebo bratr jeho matky.

Jak lze posoudit příbuznost osob na základě Y–

chromozomálních DNA lokusů?

Posouzení příbuznosti osob na základě analýzy Y–chromozomálních

lokusů je v principu velmi jednoduché: Y chromozóm se dědí

v nezměněné podobě z otce na syny, tj. po meči. Jediným

mechanismem změny genotypu Y–chromozomálních lokusů jsou

mutace.

Při hodnocení možné příbuznosti dvou osob v paternální linii proto

porovnáváme zjištěné haplotypy Y–chromozómu – u osob takto

příbuzných by měly být identické, nanejvýše s nepatrným rozdílem

způsobeným mezigenerační mutací. V případě zjištění více

odchylek, které již nelze přičíst na vrub mutacím, příbuzenství

v paternální linii vyloučíme. Tohoto jevu je hojně využíváno

v geneticko – genealogickém výzkumu.

Jak lze posoudit příbuznost osob na základě lokusů

mitochondriální DNA?

Posuzování příbuznosti pomocí analýzy HVR mtDNA je obdobou

určení příbuznosti na základě analýzy Y–chromozomálních

markerů. MtDNA se dědí v nezměněné podobě z matky na všechny

122

její děti (dcery i syny), tj. po přeslici. Jediným mechanismem změny

mtDNA lokusů jsou mutace.

Při hodnocení možné příbuznosti dvou osob v maternální linii proto

porovnáváme zjištěné sekvence HVR mtDNA – u osob takto

příbuzných by měly být identické, nanejvýše s nepatrným rozdílem

způsobeným mezigenerační mutací. V případě zjištění více

odchylek, které již nelze přičíst na vrub mutacím, příbuzenství

v maternální linii vyloučíme.

Principy predikce biogeografického původu a

fenotypových znaků osoby

Jak se pomocí analýzy DNA určuje pohlaví osoby?

Určení pohlaví je založeno na skutečnosti, že ženské tělní buňky

obsahují dva chromozómy X, zatímco mužské obsahují jeden

chromozóm X a jeden Y.

Historicky je pro DNA analýzu pohlaví nejdéle a nejčastěji

využíván gen pro amelogenin, který se vyskytuje jak na

chromozómu X, kde je plně funkční (dává vzniknout bílkovině zubní

skloviny), tak na chromozómu Y, kde se nachází jeho nefunkční

verze – tzv. pseudogen. Mezi genem na X a pseudogenem na Y

existuje několik drobných konstantních rozdílů; například určitý

úsek tohoto genu je na X chromozómu o 6 nukleotidů kratší než

tentýž úsek na Y chromozómu. Při vlastní analýze tedy tento úsek

„změříme“ (pochopitelně molekulárně genetickými metodami,

nikoliv pravítkem): u žen zjistíme jedinou délku (tzn. jedinou alelu X

o délce např. 104 bp), u mužů délky dvě (tzn. jednu alelu X o délce

např. 104 bp a jednu alelu Y o délce 110 bp).

123

Obrázek 34 – Určení pohlaví pomocí analýzy krátkého úseku DNA v genu pro amelogenin, který se nachází na X i na Y chromozómu. U muže detekujeme dva rozdílně dlouhé fragmenty, u ženy fragment jediný.

Jinou možností určení pohlaví je analýza specificky mužských

lokusů – tedy těch, které leží na Y chromozómu (např. SRY).

Pozitivní výsledek analýzy je potvrzením, že materiál obsahoval

buňky mužského původu, u srovnávacího vzorku tedy, že patří

muži. U ženy dostaneme negativní výsledek analýzy. V tom ovšem

tkví i úskalí tohoto způsobu určení pohlaví – při nesprávném

provedení analýzy či při analýze degradovaného a/nebo

inhibovaného materiálu můžeme dostat falešně negativní výsledek

(tj. vzorek je mužský, ale analýza nedala pozitivní výsledek). Bránit

tomu lze současnou analýzou nějakého kontrolního autozomálního

lokusu, který by pozitivní výsledek měl poskytnout jak u mužského,

tak u ženského vzorku.

124

Jak se pomocí analýzy DNA určuje biogeografický

původ osoby?

Jak bylo deklarováno již výše, je určování biogeografického původu

osoby analýzou DNA zatím ve svých počátcích a není možné při

těchto predikcích dosáhnout vysoké míry spolehlivosti (například

srovnatelné se spolehlivostí identifikace pomocí STR). Principiálně

při hledání biogeografického původu osoby můžeme užít analýzu

mtDNA, analýzu Y–chromozómu a analýzu některých

autozomálních lokusů, které mohou informovat o původu osoby.

Mitochondriální DNA je, jak již zde bylo vícekrát konstatováno –

děděna po přeslici neboli maternálně. Nové linie mtDNA vznikají

s velmi malou frekvencí a náhodně – mutací. Tedy – matka předá

svým dětem svou mtDNA v nezměněné podobě, při vzniku jednoho

jejího vajíčka však dojde k mutaci a jedno z jejích dětí obdrží

mutovanou verzi mtDNA; nová linie je založena. K další mutaci

dojde v průměru za několik desítek generací (současné odhady

rychlosti těchto mutací se však výrazně liší, proto neuvádíme žádné

konkrétní číslo).

Popsaný mechanismus spolu se způsobem, jakým moderní člověk

postupně osidloval jednotlivé kontinenty, má velmi zajímavý

důsledek: různé linie mtDNA se vyskytují na různých

kontinentech, nebo mají alespoň rozdílné frekvence výskytu.

Kupříkladu některé mtDNA linie nenajdeme jinde než v Asii, jiné

zase téměř výhradně v Evropě a na Blízkém východě.

Stanovením sekvence HVR mtDNA linie tak můžeme odhadovat,

odkud daná osoba pochází. Tento na první pohled půvabný princip

je však problematizován dalšími faktory. Uveďme alespoň dva:

Za prvé – analýza umožňuje odhad jen v hrubším měřítku; dle

mitotypu můžeme např. relativně spolehlivě určit, že osoba pochází

125

s velkou pravděpodobností z Evropy, avšak už nedokážeme určit, ze

kterého státu.

Za druhé – informace z mtDNA se týká výhradně již zmíněné linie

„po přeslici“, ostatní předkové nejsou při této analýze zohledněni.

Představme si například fiktivní čínskou dívku Fu Li, která se v době

Marca Pola zamiluje do některého z evropských obchodníků,

cestujících pro zboží do Asie, a odejde s ním do jeho slunné Itálie.

Jejich společná dcera, která se po čase narodí, nese plně asijský

mitotyp, který se bude dále předávat přes dcery do dalších generací.

Jednoho dne roku 2011 si na univerzitě v Bologni studentka Fulvia

udělá v rámci praktik forenzní genetiky sekvenaci HVR mtDNA.

S překvapením zjistí, že přísluší k tzv. haploskupině G, typické pro

oblast severovýchodní a centrální Asie. Je to pro ni veliké překvapení –

ona je přece každým coulem Italka, nic asijského na sobě nikdy

nepozorovala. Inu, není divu – mezi ní a její maternální prapředkyní

Fu Li, která pro lásku neváhala opustit navždy domov, leží přibližně

30 generací.

Určení biogeografického původu osoby prostřednictvím

analýzy haplotypu Y–chromozómu je založeno na stejném

principu jako prostřednictvím analýzy mtDNA. Také různé Y–

chromozomální linie jsou geograficky více či méně specifické. Stejně

jako u mtDNA, i zde je metoda limitována malou rozlišovací

schopností a tím, že nezohledňuje jinou než čistě paternální část

dědičné informace.

Velmi nadějnou metodou určení biogeografického původu je

užití autozomálních SNP lokusů, označovaných jako AIMs (angl.

Ancestry Informative Markers) – tedy markery informující o

původu. Princip této analýzy je opět jednoduchý: již jsme si uvedli,

že u typického SNP existují zpravidla dvě alely, které mají v populaci

určitou frekvenci. U AIMs je tato frekvence v různých populacích

126

různá. Kupříkladu: SNP rs729172 má alely A a C; v rámci USA se

alela A vyskytuje u Afroameričanů s frekvencí 23 %, u Asiatů

s frekvencí 6 % a u europoidního typu s frekvencí 38 %. Jinak

řečeno, alelu A najdeme čtyřikrát častěji u Afroameričanů než

u Asiatů a více než šestkrát častěji u europoidního typu než u Asiatů.

Analýza jednotlivého AIM není sama o sobě dostatečně

informativní; pokud ale analyzujeme celý set takovýchto lokusů

(zhruba kolem padesáti) a výsledky statisticky vyhodnotíme, již

můžeme dostat informaci s relativně solidní vypovídací hodnotou.

Navíc tato informace – na rozdíl od mtDNA a Y–chromozomálního

haplotypu – zohledňuje genetický příspěvek všech předků testované

osoby.

Jak se pomocí analýzy DNA určují fenotypové znaky

osoby?

Opět je třeba zdůraznit a připomenout, co již bylo řečeno výše:

predikce fenotypových znaků je v tuto chvíli ve svých počátcích a

není zatím dostatečně spolehlivá. Dílčí úspěch však již přináší, a

proto se o ní zde rovněž zmiňujeme.

Analýza fenotypových znaků je založena na stanovení genotypu

SNP, které se nacházejí v těsné blízkosti genů podmiňujících

příslušný znak, případně přímo v těchto genech. V roce 2010 byl

kupříkladu validován IrisPlex, test šesti SNP vázaných s geny

ovlivňujícími pigmentaci oční duhovky. Tento test umí s relativně

velkou spolehlivostí odlišit světlé (modré) oči od tmavých

(hnědých). V roce 2011 pak byl validován další systém – HIrisPlex,

umožňující současnou predikci barvy vlasů i oční duhovky.

127

Technologie forenzně genetické analýzy

Základní kroky forenzně genetické analýzy

Jaké technologické postupy jsou využívány při

forenzní analýze DNA?

Spektrum užívaných metod je velmi široké a nelze ho nijak striktně

omezit. Vzhledem k šíři záběru forenzní genetiky se zde v různých

situacích uplatňuje celá řada specifických postupů, a jak se obor

rozvíjí, stále další přibývají (a zastaralé jsou opouštěny). Žádná

z těchto metod není uplatňována jen a pouze ve forenzní genetice,

ale jsou užívány i jinými obory molekulární genetiky a DNA

diagnostiky – setkáme se s nimi v lékařské diagnostice,

šlechtitelství, veterinární genetice a podobně.

V následujících odstavcích budou popsány základní kroky a

postupy, běžně uplatňované při forenzně genetickém

zkoumání. Nejedná se o plný výčet, ten by ostatně ani nebyl

vzhledem k výše uvedenému možný, ale o stručný přehled, který by

měl čtenáři umožnit zorientovat se v základních otázkách technické

stránky forenzní genetiky. S ohledem na zaměření této publikace

jsou jednotlivé metody popisovány co nejjednodušeji, bez příliš

technicistních detailů – důraz je kladen na princip daného postupu.

Jaké kroky zahrnuje forenzně genetická analýza?

Po zajištění stopy a jejím uchování až do doby analýzy, kteréžto

kroky byly popsány v první části, pojednávající o stopách, následuje

– již v laboratoři – izolace neboli extrakce DNA (tyto pojmy jsou

běžně používány jako synonyma – „izolace“ znamená oddělení,

rozuměj DNA od ostatních látek, „extrakce“ znamená vytažení,

rozuměj DNA ze směsi látek).

128

Po extrakci může, ale nemusí následovat kvantifikace DNA, tedy

určení množství DNA ve vzorku, často spojené s její charakterizací,

tedy určením specifity (ve smyslu určení původu – lidská,

bakteriální apod.) a kvality (ve smyslu určení stupně degradace).

Kvantifikace je často vynechávána u vzorků do značné míry

standardních, jakými jsou například srovnávací vzorky (bukální

stěr, krev). Naopak u vzorků velmi „nejistých“, což mohou být

například plošné stěry, vzorky z těl ve vyšším stupni rozkladu apod.,

je kvantifikace zásadním krokem, který může podstatně ovlivnit

finální úspěch analýzy.

Izolace a kvantifikace jsou kroky do značné míry univerzální a

provádíme je, ať už je naším záměrem dále analyzovat kterékoli

lokusy v DNA. Další postup již se ovšem liší právě podle toho, které

DNA markery jsou cílem analýzy. Popíšeme zde proto základní

postup tří typově různých analýz: STR lokusů, HVR mtDNA a SNP

lokusů.

Obrázek 35 – Základní kroky technologického zpracování biologické stopy, neboli „od stopy ke genetickým datům“. Genotypizace může být založena na různých postupech; velmi často zahrnuje amplifikaci DNA (PCR) a elektroforetickou separaci fragmentů.

129

Jak dlouho trvá provedení forenzně genetické analýzy?

Délka celé analýzy závisí na tom, které kroky jsou do ní zařazeny a

jaká je jejich časová náročnost. Hlavním faktorem je bezesporu

délka izolace DNA, která může být u různých typů izolovaného

materiálu i řádově rozdílná – kupříkladu izolace z kostí může být

dle zvoleného postupu otázkou až dnů, naproti tomu izolace

z bukálních stěrů může být redukována na pouhé minuty. Druhým

rozhodujícím faktorem je doba potřebná k amplifikaci

zájmových lokusů, která se může dle zvoleného postupu lišit

o desítky minut. Zkrácení izolace i amplifikace je prioritou výzkumu

a na trhu již se objevují komerční kity se zkrácenou délkou těchto

kroků – u amplifikace je to např. Identifiler® Plus Kit, či PowerPlex

18D Kit.

Izolace (extrakce) DNA

Co je smyslem izolace DNA?

V biologickém materiálu (stop i srovnávacích vzorků) je kromě

DNA přítomno velké množství nejrůznějších dalších látek, např.

bílkoviny, lipidy, polysacharidy atd. Řada z těchto látek v principu

znemožňuje některé další kroky analýzy (patří mezi ně např.

takzvané inhibitory, o nichž je pojednáno dále), a proto je třeba je ze

vzorku odstranit. Navíc – DNA v biologickém materiálu je často

nestabilní a může být snadno poškozena ve stopě přítomnými

látkami (např. enzymy původem z buněk vzorku či enzymy

produkovanými mikroorganismy), je třeba ji tedy z tohoto

„ohrožení“ dostat. Ideální izolační postup je ten, který:

má co nejvyšší separační účinnost, tj. v maximální možné

míře odstraní ze vzorku všechny látky vyjma nukleových

kyselin (tj. DNA a RNA)

130

má co nejvyšší výtěžnost, tj. získá z materiálu pokud možno

veškerou přítomnou DNA; tato podmínka je důležitá především

u vzorků s malým množstvím využitelného materiálu. Naopak,

u vzorků bohatých na DNA často dáváme přednost takovému

izolačnímu postupu, který nám izoluje DNA v určitém

standardním množství (tj. víme, že na konci izolace budeme mít

k dispozici roztok DNA o určité standardní koncentraci).

převede DNA do stabilního stavu – do roztoku či na pevnou

fázi (nosič), které jsou bez problémů použitelné pro následující

analýzy.

Musí být izolace provedena vždy?

Existují některé speciální postupy či přípravky, které u určitých

typů vzorků umožňují celý izolační proces redukovat na minimum –

řadí se sem např. Prep–n–GoTM Buffer firmy Life Technologies či

SwabSolution Kit firmy Promega. Jejich užití v rámci forenzní

analýzy je možné, ale spíše jen při zpracování srovnávacích vzorků.

Co je izolát?

Izolátem DNA rozumíme finální produkt izolace DNA; obvykle je

to vodný roztok DNA (tj. ředidlem je voda, v izolátu mohou být

přítomny i další látky, např. soli).

Pozor! Zatímco pojmy „analýza DNA“ a „genetická analýza“ jsou

prakticky synonyma, pojem „izolát DNA“ a „genetický/genový izolát“

rozhodně ne: jako genetické/genové izoláty jsou označována

teritoria, kde určitá subpopulace dlouhodobě žije do značné míry

izolovaně – např. některé odlehlé horské osady.

Co jsou inhibitory?

Jako inhibitory označujeme látky nejrůznější povahy, které mají

negativní účinek na průběh jednoho ze zásadních kroků analýzy,

131

tzv. polymerázové řetězové reakce (PCR) – viz dále. Jejich

přítomnost ve vzorku může vést ke zhoršené kvalitě výsledků

analýzy či k úplnému selhání analýzy.

Inhibitory mohou mít svůj původ jednak přímo ve vzorku (tj.

jsou přítomny už v původním biologickém materiálu, který je dodán

do laboratoře ke zkoumání), nebo se mohou do vzorku dostat až

v průběhu izolace z reagencií pro izolaci užívaných.

K hlavním inhibitorům původem ze vzorku řadíme krevní barvivo

hemoglobin, jeho rezidua heminy, indigový pigment z jeansoviny,

huminové kyseliny z půdy, vlasový a kožní pigment melanin a

mnoho jiných.

Zanesení inhibitorů z reagencií je vždy důsledkem nesprávně

zvoleného nebo nesprávně provedeného izolačního postupu.

Typickými inhibitory tohoto původu jsou alkoholy, fenol či některé

typy detergentů.

Jak lze inhibitory odstranit?

Některé inhibitory lze odstranit už během izolace, některé jsou

odstranitelné specifickou purifikací izolátu (viz dále) a některé jsou

odstranitelné jen velmi obtížně. U inhibitorů původem z krevních

vzorků lze do jisté míry potlačit jejich negativní účinek až v průběhu

samotné PCR, a to přidáním tzv. bovinního sérového albuminu.

Co je purifikace DNA?

Termínem purifikace DNA označujeme přečištění izolátu DNA, a to

právě kvůli účinnému odstranění inhibitorů, případně dalších

nežádoucích látek, které zůstaly ve vzorku přítomny i po izolaci.

132

Co je zkoncentrování izolátu DNA?

Zkoncentrováním izolátu rozumíme snížení objemu izolátu při

zachování veškeré DNA, čímž se roztok „zahustí“; tento postup

používáme zejména u vzorků s malým obsahem DNA.

Zkoncentrování lze provést buď vyvázáním DNA z roztoku na

pevnou fázi (např. oxid křemičitý) a její následné uvolnění do

roztoku o menším objemu, nebo centrifugací pomocí tzv.

mikrokoncentrátorů: roztok DNA je v mikrokoncentrátoru při

centrifugaci „hnán“ přes velmi husté sítko, které propustí pouze

rozpouštědlo a drobné molekuly, makromolekuly DNA však ne – ty

v něm zůstanou zachyceny a opět mohou být uvolněny do roztoku

o menším objemu, než měl původní izolát.

Jaké jsou základní izolační mechanismy?

Prvním krokem izolace je prakticky vždy lýza buněk, tedy jejich

rozrušení a uvolnění buněčného obsahu do roztoku. Lýza je

nejčastěji založena na osmóze: buňky v destilované vodě (případně

lyzačním pufru) zvyšují svůj objem (molekuly vody pronikají přes

buněčnou membránu dovnitř), až popraskají. Často je tento

jednoduchý mechanismus podpořen zvýšenou teplotou,

protřepáváním vzorku a přidáním některých enzymů, např.

proteinázy, štěpící bílkoviny. Výsledkem je tzv. buněčný lyzát.

Po lýze buněk může následovat několik základních typů izolačních

postupů:

Postupy založené na oddělení polárních a nepolárních látek

Postupy založené na inaktivaci enzymatických kofaktorů

Postupy založené na vazbě DNA na papírový (tj. celulózový)

absorbent

Postupy založené na vazbě DNA na pevnou fázi

133

Jak fungují postupy založené na oddělení polárních a

nepolárních látek?

Postupy založené na oddělení polárních a nepolárních látek – tzv.

organická extrakce – patří k nejstarším a ve forenzní praxi dnes již

v podstatě nepoužívaným. Jejich podstatou bylo přidání směsi

fenolu a chloroformu k vodnému buněčnému lyzátu: po protřepání

a samovolném oddělení zůstala ve vodné fázi rozpuštěná DNA,

zatímco do organické fáze se rozpustily nepolární látky, např.

lipidy. Bílkoviny, které mají polární i nepolární části, zůstaly na

rozhraní obou fází. Pro dobré oddělení obou fází lze použít

komerčně dodávané gely, které se do vzorku přidají při

protřepávání a které podstatně zlepšují účinnost separace.

Obrázek 36 – Princip organické extrakce DNA.

Tato metoda však již byla víceméně opuštěna; jednak proto, že do

vodné fáze se v malém množství kromě DNA rozpouští též fenol,

který následně může působit jako PCR inhibitor, především však

proto, že používané reagencie jsou vysoce toxické a celý proces

vyžaduje hodně času a kombinaci bystré oko/pevná ruka při

odpipetování horní vrstvy.

134

Jak fungují postupy založené na inaktivaci

enzymatických kofaktorů?

Postupy založené na inaktivaci enzymatických kofaktorů jsou

založeny na jednoduché lýze a následné separaci lyzovaných

buněk pomocí centrifugace (případně s přidáním proteináz či

proteáz k rozrušení bílkovin), po nichž následuje přidání tzv.

chelatačních činidel – látek, které jsou schopny vyvazovat na sebe

některé typy iontů; v praxi je nejčastěji používán Chelex–100,

iontoměničová pryskyřice, která vyvazuje dvojmocné ionty kovů.

Při lýze buněk se do roztoku mimo jiné uvolní endonukleázy –

enzymy, které mohou napadat a rozrušovat molekuly DNA.

Endonukleázy potřebují ke svému fungování kofaktory, kterými

jsou hořečnaté ionty. Přidáním Chelexu–100 k lyzátu však dojde

k vyvázání hořečnatých iontů z roztoku, takže tyto nemohou plnit

funkci kofaktorů, a tudíž endonukleázy nemohou napadat DNA; tím

je izolát stabilizován.

Obrázek 37 – Princip vyvázání enzymatických kofaktorů při extrakci DNA.

Tento izolační postup je velmi jednoduchý, rychlý a velmi levný,

nejsou však při něm z roztoku účinně odstraňovány inhibitory, a své

uplatnění tak nachází především u vzorků s malým množstvím

135

inhibitorů – plošné stěry, vzorky slin (např. cigaretové nedopalky),

malé krevní vzorky apod. Je též velmi často používán pro izolace ze

srovnávacích vzorků bukálních stěrů.

Jak fungují postupy založené na vazbě DNA na

papírový absorbent?

Postupy založené na vazbě DNA na celulózový absorbent jsou

reprezentovány především tzv. FTA papírem (FTA kartami).

Podstatou tohoto absorbentu je papír, obsahující látky

inaktivující nukleázy a látky bránící růstu bakterií. Na FTA

papír může být nakápnut či natřen tekutý nebo rozpuštěný

biologický materiál (krev, sliny apod.). U modernějších typů FTA

karet je nanesení biologického materiálu okamžitě indikováno

změnou barvy papírku v daném místě. Materiál nasákne do papíru

a vyschne, čímž je DNA imobilizována a pevně v papíru

ukotvena. V takovém stavu může být i neizolovaný vzorek při

pokojové teplotě uchováván řadu měsíců.

Obrázek 38 – FTA karty slouží k imobilizaci a trvalému uchování DNA ve stabilním stavu.

136

Následná izolace se provádí tak, že z karty je mechanicky vyražen

malý terčík, ten se vloží do zkumavky a jsou k němu přidány izolační

reagencie; dojde k odstranění nežádoucích látek (např. vymytí

inhibitorů), přičemž DNA stále zůstává fixována na papírovém

terčíku.

Jak fungují postupy založené na vazbě DNA na

pevnou fázi?

Postupy založené na vazbě DNA na pevnou fázi využívají toho, že

DNA je molekula s parciálním (tj. částečným) záporným

nábojem. Jako zmíněná pevná fáze je zpravidla užívána silika

(polymerní oxid křemičitý), která je na povrchu rovněž záporně

nabita. V čisté vodě se tak DNA a silika navzájem odpuzují. Pokud

však do roztoku přidáme tzv. chaotropní soli, zafungují jako

zprostředkovatel vazby mezi DNA a silikou. Touto vazbou je pak

DNA pevně vázána k silice a může být spolu s ní

transportována. Po změně složení roztoku (snížení koncentrace

solí, změně pH z kyselého na zásadité) dojde ke zrušení vazby DNA

na silikát a jejímu uvolnění do roztoku.

V praxi jsou užívána dvě základní uspořádání tohoto izolačního

postupu: za prvé tzv. silikátové kolonky, kde je DNA zachycena na

kolonce během centrifugace (případně vakuovým odsátím) lyzátu,

pak přečištěna a následně uvolněna do čistého elučního roztoku; za

druhé tzv. magnetosilikové partikule, kde se DNA naváže na tyto

paramagnetické kuličky, které mohou být manipulovány pomocí

magnetu – např. vyjmuty z roztoku, přeneseny do přečišťovacích

roztoků a z nich nakonec do elučního roztoku, kde je DNA uvolněna.

137

Obrázek 39 – Vazba DNA na siliku v magnetosilikových partikulích umožňuje manipulovat DNA v roztoku pomocí magnetického pole.

Tyto postupy jsou vysoce efektivní co do odstranění nežádoucích

látek z roztoku, mají velkou výtěžnost a mohou být automatizovány

(izolace je pak prováděna roboticky), což z nich činí ideální izolační

metody pro forenzní analýzu; nevýhodou je jejich relativně vysoká

cena.

Lze nějakým mechanismem oddělit biologický

materiál jednotlivých přispěvatelů vzorku?

Za určitých okolností ano. V této souvislosti je třeba zmínit dva

postupy, a to diferenciální lýzu a laserovou mikrodisekci.

Diferenciální buněčná lýza je velmi specifickým postupem

užívaným u vzorků tvořených směsí ženských epiteliálních buněk a

spermií – typicky u vzorků poševních stěrů po znásilnění (název je

zavedeným, leč poněkud otrockým překladem původního

anglického termínu differential cell lysis – slovo „differential“ zde

ovšem funguje ve významu „odstupňovaný“, „založený na rozdílu“, a

asi vhodnější by tedy bylo užití termínu odstupňovaná buněčná

138

lýza). Smyslem tohoto postupu je oddělení ženské a mužské

frakce vzorku, a tedy rozdělení původního smíšeného vzorku na

separátní vzorky obou původců materiálu. Lze toho dosáhnout

užitím „měkčích“ a posléze „tvrdších“ lyzačních podmínek: zatímco

ženské epitelie podléhají lýze snadno, spermie jsou mnohem

odolnější. Při diferenciální lýze jsou tedy nejprve v mírně lyzačním

roztoku rozrušeny a spolu s roztokem odebrány ženské epitelie, a

teprve poté jsou v silně lyzujícím roztoku rozrušeny spermie.

Následuje samostatná izolace obou frakcí: v původním konceptu

byla užívána organická extrakce (viz výše), v současnosti jsou

k dispozici modernější metody, jako je Differex založený na vazbě

DNA na siliku (viz výše).

Obrázek 40 – Diferenciální lýza – rozdělení „mužské“ a „ženské“ složky poševního stěru.

139

Laserová mikrodisekce (LCM) (laser capture microdissection) je

vysoce pokročilou technologií mikromanipulace, užívanou

v nejrůznějších oborech pracujících s biologickým materiálem.

Podstatou je vyhledání příslušných objektů (např. buněk)

v mikroskopu, jejich oddělení od ostatního materiálu pomocí

laserového paprsku a přenesení světelným pulzem do čisté

zkumavky. V rámci forenzní analýzy mohou být takto odebrány

např. jednotlivé spermie z poševního stěru, embryonální buňky

z potratu apod.

Další postupy dělení směsí jsou založené na dělení buněčného

materiálu vzhledem k jeho odlišným imunologickým vlastnostem,

ale v oblasti forenzního zkoumání nejsou běžně používané.

Obrázek 41 – Laserová mikrodisekce (LCM) umožňuje výběr jednotlivých buněk pro analýzu.

140

Kvantifikace (a případná charakterizace) DNA

Co je to kvantifikace DNA a jak vyjadřujeme

množství DNA?

Kvantifikací rozumíme stanovení množství DNA ve vzorku. Toto

množství může být vyjádřeno několika způsoby; nejčastěji je to tzv.

hmotnostní koncentrace DNA ve vzorku, jejíž základní jednotka je

kg/m3 („kilogram na metr krychlový“). Ve forenzní analýze, která

pracuje s velmi malými objemy vzorků, však používáme odvozené

jednotky ng/μl („nanogram na mikrolitr“) a pg/μl („pikogram na

mikrolitr“). Platí, že 1 kg/m3 = 1 000 ng/μl = 1 000 000 pg/μl.

Jedna lidská tělní buňka obsahuje zhruba 6,6 pg DNA. Pokud

bychom tedy měli čistý izolát ze 100 lidských buněk o objemu 1 μl,

bude mít tento izolát hmotnostní koncentraci DNA 660 pg/μl neboli

0,66 ng/μl. A obráceně: mikrolitrový izolát o koncentraci 1,00 ng/μl

obsahuje DNA ze zhruba 152 buněk. Množství DNA ve spermiích je

poloviční – 3,3 pg. Mikrolitrový izolát o koncentraci 1,00 ng/μl tedy

obsahuje DNA ze zhruba 304 spermií.

Jaký smysl má kvantifikace DNA?

Stanovení množství DNA ve vzorku je důležité ze dvou důvodů: za

prvé, na základě výsledků můžeme vzájemně porovnat účinnost

několika izolačních postupů. Pokud například odebereme vždy ze

stopy dva stejné vzorky, tyto izolujeme dvěma různými postupy A a

B a izolát kvantifikujeme, můžeme zjistit, že izolační postup A nám

systematicky poskytuje vyšší koncentrace DNA v izolátu než postup

B, a je tedy zjevně účinnější izolační metodou.

Za druhé, stanovení koncentrace DNA ve vzorku je důležité pro

vyladění následně prováděné polymerázové řetězové reakce

(PCR – viz dále). Tato metoda je citlivá na správná vstupní množství

141

DNA – příliš malá, ale především příliš velká vstupní množství DNA

mohou vést ke zhoršenému průběhu reakce nebo k její úplné

inhibici. Kupříkladu je–li optimální vstupní množství DNA do určité

PCR reakce 1 ng, pak vstupní množství 10 ng DNA způsobí

částečnou inhibici reakce a PCR proběhne velmi problematicky.

Kvantifikace je tak nesmírně důležitá zejména u vzorků s těžko

odhadnutelným obsahem DNA (plošné stěry, tkáně v rozkladu

apod.)

Co je to nespecifická a specifická kvantifikace DNA?

Izolační postup zpravidla do výsledného izolátu převede veškerou

DNA, přítomnou původně ve vzorku. U biologických stop tak může

výsledný izolát obsahovat kromě lidské DNA též DNA zvířecí,

rostlinnou, bakteriální apod. Mimochodem – u srovnávacího vzorku

to může platit též – např. u vzorků bukálního stěru izolujeme kromě

vlastní DNA buněk bukální sliznice též DNA bakterií přítomných

v ústech, tvořících zubní plak.

Kvantifikační postupy, které určí množství veškeré DNA ve vzorku

bez ohledu na to, z jakého zdroje tato DNA pochází, označujeme jako

nespecifické. Naproti tomu postupy, zaměřené na stanovení

množství pouze určitého specifického druhu DNA (nejčastěji DNA

lidské), označujeme jako specifické.

Jaké jsou základní principy nespecifické kvantifikace

DNA?

Nejjednodušším a pro forenzní praxi nejméně vhodným postupem

je spektrofotometrická kvantifikace DNA. Je založena na tom, že

molekuly DNA silně absorbují elektromagnetické záření vlnové

délky 260 nm (tj. ultrafialové záření); paprsek této vlnové délky se

nechá procházet roztokem DNA (např. izolátem) a změří se pokles

intenzity záření – ten je tím větší, čím je roztok DNA

142

koncentrovanější. Metoda není vhodná pro forenzní účely

(užívala se pouze v naprostých počátcích), neboť není příliš citlivá,

tj. nezachytí malá množství DNA, spotřebovává se při ní velké

množství vzorku a výsledek měření může být velmi silně ovlivněn

přítomností některých dalších chemických látek ve vzorku, jako je

fenol, bílkoviny apod. Výjimku tvoří mikrospektrofotometrické

metody použitelné ve forenzní genetice především pro získání

rychlé orientační informace o množství DNA ve vzorku.

Obrázek 42 – Spektrofotometrická kvantifikace je založena na měření poklesu intenzity světla procházejícího roztokem DNA.

Pro forenzní účely vhodnější metodou je detekce nespecificky

inkorporovaného fluorescenčního barviva. Pro tyto účely se

užívají chemické sloučeniny – barviva (např. ethidiumbromid,

PicoGreen, OligoGreen), která se navážou na/do DNA, tím se změní

jejich prostorové uspořádání a začnou být při dopadu světla určité

vlnové délky silně fluorescenčně aktivní, tj. vyzařují světlo, jehož

množství měříme fluorimetrem. Množství vyzářeného světla je

tedy přímo úměrné množství navázaného barviva, a to je zase přímo

úměrné množství DNA přítomné ve vzorku. Výhodou metody je

143

relativně vysoká citlivost a přesnost měření, malé nároky na

spotřebu vzorku, možnost měření automatizovat a malá cena

analýzy; nevýhodou zůstává nespecifita měření.

Obrázek 43 – Nespecifická kvantifikace založená na navázání fluorescenčního barviva do DNA. Měření se provádí pomocí fluorimetru.

Jaké jsou základní principy specifické kvantifikace

DNA?

Při specifické kvantifikaci musí být dosaženo toho, že metoda

zobrazí výlučně příslušnou specifickou DNA – nejčastěji DNA

lidskou. Toho dosahujeme použitím tzv. druhově specifických sond

či druhově specifických primerů, což obojí jsou krátké

jednořetězcové fragmenty DNA, které jsou komplementární (laicky

144

řečeno „pasují“) pouze k určitému místu v DNA daného druhu či

skupiny blízce příbuzných druhů (např. primátů) a u ostatních

druhů komplementární nejsou, „nepasují“).

Obrázek 44 – Specifická kvantifikace je založena na hybridizaci (spárování) sondy, tj. krátkého úseku DNA, s komplementární sekvencí v testované DNA.

Historicky první kvantifikace specificky lidské DNA byly založeny na

tzv. slot blot (štěrbinové) hybridizaci: DNA byla nejprve fixována

pod tlakem přes štěrbinu na nylonovou membránu, poté

hybridizována se specifickou sondou a následně byla tato sonda

zobrazena chemiluminiscenčně nebo kolorimetricky – čím

intenzivnější byl signál sondy (záření, barva), tím větší množství

lidské DNA bylo ve vzorku obsaženo. Tyto ve své době pokrokové

145

metody (nejznámější z nich byl QuantiBlot Human DNA

Quantitation Kit) se dnes již prakticky neužívají.

Obrázek 45 – Takto vypadal výsledek kvantifikace specificky lidské DNA pomocí slot blot hybridizace: kvantita DNA v testovaných vzorcích se odhadovala porovnáním intenzity vybarvení s kalibrační řadou (tj. se vzorky známé koncentrace – v obr. uvedena v ng).

Dalším principem kvantifikace specificky lidské DNA byla

luminometrická kvantifikace AluQuant Human DNA

Quantitation System. Při ní byla DNA hybridizována se specifickou

sondou, což v roztoku vedlo k sérii enzymatických reakcí až po

finální oxidaci luciferinu enzymem luciferázou za vzniku viditelného

světla, jehož množství bylo změřeno luminometrem. (Mimochodem,

je to identická enzymatická reakce, kterou používají samečci

světlušek). Čím více lidské DNA bylo ve vzorku přítomno, tím více

sondy hybridizovalo a tím intenzivnější světlo v konečné fázi

z roztoku zazářilo. Přestože tato metoda byla po mnoha stránkách

pro forenzní účely vynikající, dnes už se prakticky neužívá, neboť

byla vytlačena moderní metodou qPCR.

Nejmodernějšími a v současnosti zdaleka nejužívanějšími metodami

specifické kvantifikace jsou metody založené na polymerázové

146

řetězové reakci (viz níže) – tzv. kvantitativní PCR (qPCR).

Technicky může mít qPCR mnoho konceptů, jejichž popis a

vysvětlení by šly nad rámec této knihy. Koncepty užívané ve

forenzní analýze jsou nejčastěji založeny na v zásadě jednoduchém

principu: je prováděna PCR, tj. cyklické kopírování vybraného

malého úseku DNA, a současně je průběžně měřeno množství těchto

nakopírovaných DNA fragmentů ve vzorku. Z toho, jakým způsobem

během PCR toto množství rostlo, lze zpětně dovodit původní

vstupní množství DNA ve vzorku (opět se kalibruje pomocí vzorků

známé koncentrace). Metoda kvantitativní PCR nám ze všech

kvantifikačních metod přináší nejvíce informací: je vysoce přesná,

vysoce citlivá (zobrazí i velmi malá množství DNA), přísně

specifická (poskytuje pozitivní výsledek prakticky pouze u daného

druhu respektive velmi blízce příbuzných druhů) a detekuje i

případnou přítomnost PCR inhibitorů a rozsah DNA

fragmentace.

Amplifikace DNA

Co je to amplifikace DNA?

Termín amplifikace označuje obecně zesílení nebo též rozmnožení

(z lat. amplificare – zvětšovat). V případě DNA tak označujeme

řízené laboratorní mnohočetné kopírování DNA, jehož smyslem

je získat ve větším počtu kopií DNA identickou s DNA původní.

Amplifikace se téměř vždy zaměřuje na určitý konkrétní úsek DNA,

který nás zajímá, a kopírování se týká právě pouze tohoto úseku

(lokusu).

Na jakém principu je amplifikace DNA prováděna?

Obecně v molekulární genetice najdeme celou řadu postupů,

kterými může být DNA namnožena. Zcela vůdčí metodou však je

PCR – polymerázová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain

147

Reaction). PCR je prakticky jedinou amplifikační metodou, užívanou

ve forenzní genetice, a to v řadě postupů; proto si ji zde blíže

popíšeme.

Co je PCR a jak probíhá?

PCR neboli polymerázová řetězová reakce je cyklická enzymatická

reakce, prováděná v laboratorních podmínkách (in vitro), která

je ve své podstatě napodobením přirozeného kopírování DNA

v buňkách (in vivo).

PCR se provádí v zařízení zvaném thermocycler (termocyklér),

což je de facto termoblok, do něhož se vloží zkumavky s reakční

směsí a který je schopný v rychlém sledu měnit teplotu v těchto

zkumavkách (proces je naprogramován a přesně řízen počítačovým

čipem).

Vstupní reakční směs obsahuje následující komponenty:

1. PCR pufr, tj. vodu obsahující ionty a další látky potřebné pro

správný průběh reakce (Mg2+, případně K+, NH4+ apod.)

2. volné nukleotidy, označované jako dNTPs, což jsou stavební

kameny DNA, z nichž budou tvořeny nově vznikající řetězce

DNA; až na výjimky je pro PCR užívána vyvážená směs 4

základních dNTP – dATP, dCTP, dGTP a dTTP.

3. primery – krátké úseky DNA o délce cca 20–30 nukleotidů,

které slouží k nalezení specifického místa v DNA, jež má být

kopírováno, a od nichž toto kopírování začíná; primery jsou

navrženy tak, aby bezchybně párovaly právě pouze na začátek a

konec zájmového úseku na každém z obou DNA vláken;

(primery v páru pak označujeme jako F – forward a R– reverse.

4. DNA polymerázu – enzym, který provádí vlastní kopírování;

jsou užívány tzv. termostabilní polymerázy, které dobře snášejí

vysoké teploty, kterým jsou během PCR vystaveny.

148

5. templátovou DNA neboli matriční DNA, což je vlastní

předloha, podle níž má kopírování probíhat; nejčastěji se jedná

o DNA izolovanou z nějakého biologického materiálu (stopy

nebo srovnávacího vzorku).

PCR probíhá formou cyklů, které se opakují 20–40krát (počet se liší

dle aplikace). Jeden cyklus zahrnuje tři po sobě jdoucí fáze:

1. fázi denaturační, při níž vlivem vysoké teploty (cca 95°C)

dojde k oddělení obou řetězců DNA (dvoušroubovice se

„rozplete“ na dvě samostatná vlákna); fáze trvá zpravidla

několik desítek vteřin.

Obrázek 46 – Složení PCR směsi a první – denaturační fáze PCR.

149

2. fázi hybridizační (anelační), při níž se teplota sníží

(konkrétní teplota závisí na sekvenci a délce užitých primerů,

pohybuje se nejčastěji kolem 50–65°C) a dojde k nasednutí

primerů na oba volné řetězce DNA v místech, kam bezchybně

párují (tj. na začátek a konec úseku, který chceme kopírovat);

tato fáze rovněž trvá několik desítek vteřin.

Obrázek 47 – Druhá – anelační – a třetí – elongační fáze PCR.

3. fázi prodlužovací (extenzní, elongační), při níž se teplota

mírně zvýší (na cca 72°C) a polymeráza začne od místa

navázaného primeru připojovat na základě sekvence v matriční

DNA komplementární nukleotidy (od primeru dále tedy vzniká

podél jednořetězcové DNA druhé komplementární vlákno, a

vytváří se tak dvoušroubovice; současně probíhá stejný proces

150

na komplementárním templátovém vláknu). Délka fáze závisí

na rychlosti polymerázy a na tom, jak dlouhý úsek je třeba

okopírovat, zpravidla se pohybuje v řádu desítek vteřin až

několika minut.

Po ukončení prodlužovací fáze ihned následuje denaturační fáze

následujícího cyklu. Nově vzniklá vlákna se při ní oddělí od matriční

DNA a v následující anelační fázi mohou sama posloužit jako

matriční DNA. Tímto mechanismem narůstá exponenciálně počet

nově nasyntetizovaných vláken DNA v roztoku; po několika

desítkách cyklů tak PCR směs obsahuje miliardy kopií příslušného

úseku DNA. Nutno ovšem upozornit, že PCR nemůže probíhat

donekonečna: po určitém počtu opakování dojde reakce do tzv. fáze

plató, kdy již nové řetězce nevznikají, a zvýšení počtu cyklů tak už

nevede ke zvýšení množství amplifikované DNA.

Čím může být PCR negativně ovlivněna?

Negativní vliv ve smyslu snížení účinnosti amplifikace (někdy až

k nule – amplifikace neprobíhá) mají látky zvané PCR inhibitory,

zmíněné již v kapitole týkající se izolací DNA.

Účinnost amplifikace též může být snížena nesprávným složením

PCR reakční směsi – nedostatečnou koncentrací dNTPs, Mg2+,

primerů či DNA polymerázy. Naopak – i příliš vysoká koncentrace

Mg2+ snižuje účinnost reakce, neboť brání úplné denaturaci

(rozpletení dvoušroubovice). V praxi však je master mix většinou

namíchán předem jako součást komerčního kitu. Účinnost snižuje i

vyšší než optimální hybridizační teplota (ani specifické primery

se „neudrží“).

Zásadní vliv na účinnost amplifikace má též vstupní množství

templátové DNA, jak již jsme zmínili v kapitole o kvantifikaci DNA:

příliš nízké množství templátové DNA vede k pomalejšímu „náběhu“

151

reakce a mohou se při něm snáze uplatnit některé náhodné

(stochastické) efekty, jako je drop–out, o nichž bude pojednáno

v kapitole o interpretaci dat (nicméně – PCR může zdárně

proběhnout i pokud je ve vstupní reakci přítomna jedna jediná

nepoškozená kopie cílového úseku DNA). Zcela fatální důsledky pro

PCR však má příliš vysoké vstupní množství DNA, které může vést

až k úplné inhibici reakce.

Negativní vliv ve smyslu nesprávného kopírování (vznikající

řetězec není zcela identický s předlohou nebo není identický vůbec)

může být dán jednak nesprávným nasednutím primerů (jinam,

než kam by měly), pak hovoříme o snížení specifity reakce, jednak

chybami při činnosti polymerázy.

Snížení specifity může být vyvoláno nesprávným složením PCR

reakční směsi – zejména příliš vysokou koncentrací Mg2+, a též

příliš nízkou anelační teplotou (v obou případech se primery

mohou „udržet“ i na místech, kam zcela nepárují).

Základní chyby, k nimž dochází během činnosti polymerázy, je

zařazení nesprávného nukleotidu a prokluz polymerázy.

Frekvence zařazení nesprávného nukleotidu je dána přirozenou

chybovostí té které polymerázy (nikdo nejsme dokonalý). Obecně

menší chybovost mají tzv. polymerázy s korektorskou funkcí

(angl. proofreading, někdy označované též jako HiFi polymerázy),

které po sobě zařazený nukleotid zkontrolují. Prokluz polymerázy je

specifickou chybou, k níž dochází při amplifikaci STR lokusů a jejímž

důsledkem je vznik tzv. koktavého píku (angl. stutter peak), a bude

blíže popsáno v kapitole o analýze LCN a degradované DNA.

Co je monoplexová a co multiplexová PCR?

Amplifikujeme–li v rámci jedné reakční směsi (tj. v jedné zkumavce)

s použitím jednoho páru primerů pouze jediný DNA lokus, hovoříme

152

o monoplexové PCR. Amplifikujeme–li lokusů více, pak zpravidla

používáme termín vystihující počet amplifikovaných lokusů –

duplexová PCR (= 2 lokusy), triplexová PCR (= 3 lokusy) atd.,

u většího počtu lokusů můžeme použít též obecný pojem

multiplexová PCR (= mnoho lokusů).

Co je symetrická a co asymetrická PCR?

Pokud jsou oba primery v rámci primerového páru přidány do

reakce ve stejném množství, hovoříme o symetrické PCR.

U některých aplikací je však vhodné, aby bylo preferováno

kopírování v jednom směru, a do reakce proto přidáváme příslušný

primer ve větším množství – pak hovoříme o asymetrické PCR. Její

extrémní formou je PCR s použitím jediného primeru, s níž se

setkáme např. při sekvenaci (popsána bude u analýzy HVR mtDNA).

Při použití jediného primeru neroste množství okopírovaných DNA

fragmentů v roztoku exponenciálně, ale lineárně.

Kde v rámci forenzně genetických technologií se

amplifikace DNA pomocí PCR uplatňuje?

Užití PCR ve forenzní genetice je široké a aplikací najdeme opravdu

mnoho. Rámcově lze říci, že:

1. Účelem PCR může být pouhé namnožení zájmových lokusů

před provedením dalších analýz (u SNP lokusů, HVR mtDNA

apod.).

2. PCR může být jedním z více kroků nějaké analýzy (mono– či

multiplexová PCR jako součást analýzy STR lokusů, asymetrická

PCR jako součást sekvenace HVR mtDNA apod.)

3. Na samotné PCR může být přímo založena určitá analýza

(qPCR jako metoda specifické kvantifikace).

153

Elektroforéza DNA

Co je elektroforéza?

Elektroforézou nazýváme souhrnně separační metody založené

na pohybu nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli,

přičemž různé částice mají různou elektroforetickou mobilitu (tj.

pohybují se v poli s rozdílnou rychlostí). Na základě této rozdílné

pohyblivosti tak dojde elektroforézou k separaci jednotlivých typů

částic.

Obecně je mobilita dána především velikostí elektrického napětí a

fyzikálně chemickými vlastnostmi média, v němž separace probíhá.

Existuje celá řada možných uspořádání elektroforézy – např.

zónová, kapilární, elektroforéza v plynné fázi atd.

Jak funguje elektroforéza DNA?

DNA je za běžných podmínek díky fosfátu ve své struktuře záporně

nabitá molekula, a ve stejnosměrném elektrickém poli se proto

pohybuje směrem ke kladné elektrodě (anodě). Pokud je tento

pohyb prováděn v médiu, které ho částečně brzdí – např. v gelu,

dojde k postupnému rozdělení DNA fragmentů podle jejich

elektroforetické mobility.

Relativní elektroforetická mobilita je primárně dána délkou

fragmentu DNA (s počtem bazí mobilita klesá, tj. čím delší fragment

je, tím pomaleji se pohybuje) a případnou přítomností na DNA

navázaných dalších molekul – např. fluorescenčních značek

(navázaná molekula zvyšuje molekulární hmotnost celého

fragmentu, a tedy snižuje jeho mobilitu). Mobilitu ovšem ovlivňují

též další faktory, například podíl C a G nukleotidů ve fragmentu (C a

G nukleotidy jsou těžší než A a T nukleotidy) a též konformace

molekul DNA. Nejčastěji jsou proto elektroforeticky separovány

154

lineární fragmenty DNA, kdy jejich mobilita není rozdílnou

konformací ovlivněna. Elektroforéza nám v takovém případě

pomůže přesně určit délku fragmentů DNA ve vzorku.

Obrázek 48 – Princip elektroforézy DNA.

S jakými typy elektroforézy DNA se lze setkat při

forenzně genetických zkoumáních?

V rámci metod forenzní genetiky se užívají především dvě možná

uspořádání elektroforézy – klasická gelová elektroforéza (GE) a

kapilární (gelová) elektroforéza (CE).

Co je klasická gelová elektroforéza DNA?

Při klasické gelové elektroforéze (GE) je vzorek DNA nanesen do

malé jamky v gelovém plátu ponořeném v pufru mezi elektrodami

155

(plát může být umístěn vodorovně či svisle) a poté je na elektrody

vloženo napětí. DNA ze vzorku se začne pohybovat gelem směrem

k anodě, přičemž – jak již bylo popsáno – kratší fragmenty putují

rychleji než delší. V praxi se nejčastěji lze setkat s užitím

agarózového (AGE) či polyakrylamidového gelu (PAGE).

Po určité době je elektroforéza ukončena a DNA v gelu je zobrazena

(zobrazovacích metod je nepřeberné množství – může to být např.

pomocí fluorescenční barvy, radioaktivně atd.). Na gelu se objeví

místa, v nichž se nachází DNA; často jsou to tzv. bandy – proužky

obsahující fragmenty stejné délky. Vzdálenost bandu od nanášecí

jamky je tím větší, čím kratší fragmenty obsahuje.

Aby bylo možno určit přesnou délku fragmentů v bandu, užívá se

tzv. velikostní standard (žebříček), což je uměle připravená směs

fragmentů několika známých délek (žebříček tedy např. obsahuje

fragmenty o délce 50, 100, 150, 200, 300 a 400 bazí). Žebříček je

nanesen vedle vzorku do sousední jamky a během elektroforézy se

separuje za stejných podmínek a stejným způsobem jako vzorek. Po

skončení elektroforézy a zobrazení DNA lze délku fragmentů

v jednotlivých bandech vzorku zjistit srovnáním s polohou bandů

žebříčku.

V jakém přístroji je klasická gelová elektroforéza

DNA prováděna?

Klasická gelová elektroforéza nevyžaduje žádné vysoce

specializované vybavení. Postačuje elektroforetická vana

s lůžkem pro gel, a to v horizontální (AGE) či vertikální (PAGE)

orientaci, a spolehlivý programovatelný zdroj napětí.

Existuje i vysoce sofistikovaná a automatizovaná forma gelové

elektroforézy – automatický analyzátor, v němž je celý proces

řízený počítačem a detekce fragmentů v gelu probíhá pomocí

156

fluorescenčního scanneru; v rámci molekulárně genetických technik

je však tento přístroj vytěsňován genetickými analyzátory

založenými na principu kapilární elektroforézy.

Co je kapilární elektroforéza DNA?

Při kapilární elektroforéze (CE) je vzorek elektrickým pulsem

nabrán na začátek tenké skleněné kapiláry naplněné polymerem

lineárního akrylamidu nebo polydimethylamidu. Na kapiláru je

pomocí elektrod zanořených do pufru přivedeno napětí a vzorek

začne putovat kapilárou, přičemž obdobně jako u klasické

gelové elektroforézy dochází k separaci fragmentů na základě

rozdílné mobility.

V případě kapilární elektroforézy je detekce fragmentů prováděna

v průběhu času: každý fragment je již před analýzou označen

fluorescenční barvou (zpravidla začleněním označeného primeru

v průběhu PCR). V koncové části kapiláry se nachází okénko, kterým

prosvěcuje laserový paprsek; ten v okamžiku průchodu

fluorescenčně značených fragmentů okénkem vybudí silnou

fluorescenci (světelné záření), která je zaznamenána CCD

detektorem (stejným, jako je v digitálních fotoaparátech).

Ani kapilární elektroforéza se neobejde bez standardizace pomocí

velikostního žebříčku. V tomto případě jej přidáváme přímo do

analyzovaného vzorku, proto jej nazýváme vnitřní žebříček.

Čím kratší fragment je, tím dříve doputuje k okénku v kapiláře:

zatímco u zonální elektroforézy tedy určujeme délku neznámého

fragmentu podle relativní vzdálenosti od nanášecí jamky, u

kapilární elektroforézy ji určujeme podle relativní doby, kterou

fragment potřebuje k dosažení okénka kapiláry (v obou případech

na základě porovnání s velikostním standardem – žebříčkem).

157

Obrázek 49 – Princip kapilární elektroforézy fluorescenčně značených fragmentů DNA.

V jakém přístroji je kapilární elektroforéza DNA

prováděna?

Kapilární elektroforéza je proces technicky velmi náročný, a proto je

prováděn téměř výhradně pomocí automatizovaných genetických

analyzátorů (často je pro ně užíván nepřesný leč vžitý slangový

název sekvenátor). Nejrozšířenějšími jsou bezesporu analyzátory

firmy Applied Biosystems (součást Life Technologies). Dnes již jsou

laboratoře běžně vybaveny 4, 16 i 96kapilárovými verzemi tohoto

přístroje, umožňujícími současnou analýzu příslušného počtu

vzorků.

158

Analýza STR lokusů

Jakými metodami jsou analyzovány STR lokusy?

Přestože technicky existuje několik možností, jak analyzovat STR

lokusy, forenzní praxi v současnosti dominuje jediná z nich: analýza

založená na PCR amplifikaci a následném stanovení délky

amplifikovaného fragmentu pomocí kapilární elektroforézy.

Jak tato analýza teoreticky probíhá?

Pro srozumitelnost popíšeme celý proces nejprve na analýze

jediného STR lokusu. V prvém kroku je připraven PCR mastermix

(viz popis PCR), který obsahuje jediný pár primerů; jeden z těchto

primerů nasedá na známé místo v DNA těsně před a druhý těsně za

náš zájmový STR lokus. Protože jsme předvídaví, je jeden z těchto

primerů označen fluorescenční barvou – tak, aby nám posléze

umožnil detekci fragmentu.

Poté je v thermocycleru provedena klasická PCR, přičemž vznikají

fragmenty dlouhé přesně tolik párů bazí, kolik měří celý úsek

ohraničený oběma primery. Protože polymorfismus STR lokusů –

jak již bylo vysvětleno dříve – je polymorfismem délkovým, bude

u různých alel našeho zájmového lokusu výsledný fragment

různě dlouhý.

Po skončení PCR proto potřebujeme stanovit délku vzniklých

fragmentů; k tomu použijeme výše zmíněnou kapilární

elektroforézu prováděnou v genetickém analyzátoru. Část

amplifikátu, tj. produktu PCR, spolu s vnitřním žebříčkem

napipetujeme do zkumavky s formamidem, který má silně

denaturující účinek, a tedy zajišťuje, že fragmenty zůstanou

v jednořetězcovém stavu. Poté již proces probíhá automaticky podle

předem nastaveného programu – vzorek je elektrokineticky

159

injikován do kapiláry, na kterou je následně vloženo napětí. Při

průchodu DNA fragmentu okénkem kapiláry excituje laser

fluorescenční barvičku, která je na fragmentu vázána, a ta následně

emituje silné záření v určité oblasti spektra, což se projeví

v elektroforetogramu (časovém záznamu elektroforézy)

charakteristickým píkem určité barvy.

Obrázek 50 – Výsledek monoplexové a multiplexové analýzy STR lokusů.

Srovnáním s píky vnitřního žebříčku software vypočte s vysokou

přesností délku námi amplifikovaného fragmentu. Protože víme,

kam přesně nasedaly primery a jak dlouhé jsou tedy konstantní

úseky po obou stranách STR, odečteme jejich délku od stanovené

délky fragmentu, čímž získáme vlastní délku repetice. Vydělením

této hodnoty délkou základního motivu repetice zjistíme, kolikrát se

v našem fragmentu tento motiv opakuje; toto číslo současně

označuje příslušnou alelu.

160

Př.: Kapilární elektroforézou jsme změřili, že námi amplifikovaný

fragment má délku 255 bp. Víme, že ohraničením pomocí primerů

byly do amplifikace kromě vlastní STR též zahrnuty konstantní úseky

po obou jejích stranách v celkové délce 167 bp. Délka samotné

repetice je tedy 255 – 167 = 88 bp. Víme, že tato repetice je

tetranukleotidová, neboli že základní motiv má délku 4 bp. Jednoduše

tudíž zjistíme, že v našem fragmentu je 88/4=22 opakování, a jedná se

tedy o alelu 22.

Jak je tato analýza prováděna v praxi?

Oproti popisu v předchozích odstavcích se reálná analýza STR

poněkud liší, a to především v následujícím:

vyjma velmi specifických situací není prováděna analýza

jediného lokusu, ale analyzuje se celý set lokusů najednou;

k tomu slouží již dříve zmíněná multiplexová PCR, při níž je

použito více párů primerů – vždy jeden pár pro jeden lokus;

veškeré komponenty potřebné pro analýzu jsou již

předpřipraveny a ověřeny výrobcem a do laboratoře jsou

dodávány ve formě tzv. kitu neboli soupravy. V českém

prostředí hojně užívanými kity jsou např. PowerPlex 16,

Identifiler, Identifiler Plus, MiniFiler, PowerPlex Y či Y–filer;

zejména pro analýzy příbuznosti jsou užívány kity s velkým

počtem testovaných lokusů – např. PowerPlex 21 a PowerPlex

Y23;

kromě primerů pro STR lokusy tyto kity zpravidla obsahují pár

primerů pro amplifikaci specifického úseku v genu pro

amelogenin, který je užíván ke zjištění pohlaví nositele

analyzované DNA;

celý proces na genetickém analyzátoru je již přednastaven,

odečet délek fragmentů a jejich přepočet na číslo alely je

prováděn automaticky pomocí software; znalec se do

161

procesu zapojuje jednak jako kontrolní entita (zda vše probíhá

podle plánu), jednak jako ten, kdo vyhodnocuje nejednoznačné

nebo komplikované výsledky – lze ho tedy přirovnat k pilotovi

dopravního letounu, který sice ve standardních situacích hojně

využívá autopilota, avšak pro kontrolu průběhu letu a řešení

situací nestandardních je jeho přítomnost absolutně klíčová.

Dlužno podotknout, že stopy jsou zřídkakdy povahy

standardního vzorku.

Analýza HVR mt DNA

Jakými metodami jsou analyzovány HVR

v mitochondriální DNA?

Polymorfismus hypervariabilních oblastí mtDNA je sekvenční;

k jeho zjišťování jsou proto užívány buď metody sekvenační, nebo

metody založené na hybridizaci s tzv. alelově–specifickou

sondou (SSO) (angl. Sequence–Specific Oligonucleotides).

Jak je prováděna sekvenace mtDNA?

Sekvenací rozumíme stanovení pořadí nukleotidů

v analyzovaném úseku DNA. Existuje mnoho konceptů a aplikací

této metody, popíšeme zde velmi stručně pouze postup v rámci

forenzní praxe v současnosti nejužívanější – sekvenaci pomocí

asymetrické PCR s tzv. terminátory.

Při tomto postupu je HVR oblast nejprve namnožena pomocí

jednoho páru primerů klasickou PCR. Poté následuje přečištění

amplifikátu a též zpravidla kontrola úspěšnosti (detekce

namnoženého fragmentu). Ten pak dále poslouží jako templát do

následující, tentokráte asymetrické PCR reakce.

162

Při sekvenační reakci je v reakční směsi přítomen pouze jeden

z páru primerů (F nebo R), a nové fragmenty tak vznikají pouze

podle jednoho z obou komplementárních řetězců sekvenovaného

fragmentu. Reakční směs dále obsahuje kromě „obyčejných“

deoxyribonukleotidů (dNTP), jež slouží jako stavební kameny nově

vznikajících řetězců, též fluorescenčně značené

dideoxyribonukleotidy (ddNTP), nazývané pro svou úlohu v reakci

terminátory: pokud je totiž do nově vznikajícího řetězce zařazen

ddNTP namísto standardního dNTP, nemůže polymeráza na něj již

připojit další stavební kámen, a syntéza řetězce tak končí. Je–li

poměr dNTP a ddNTP cca 100:1, dosáhneme stavu, kdy výsledný

produkt této asymetrické PCR sestává z fragmentů různých délek,

přičemž každý fragment má na konci fluorescenčně značený

terminátor. Stejně jako dNTP, jsou i ddNTP v reakci přítomny 4

druhy (ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP), každý značený jinou

fluorescenční barvou.

Produkt asymetrické PCR je následně elektroforeticky rozdělen

(nejběžněji pomocí kapilární elektroforézy); na elektroforetogramu

se délkově odlišné fragmenty zobrazí jako jednotlivé píky, přičemž

barva píku odpovídá typu ddNTP, který byl do fragmentu zařazen.

Celý elektroforetogram pak tedy má charakter „pík–za–píkem“

(každý následující pík představuje fragment o 1 bp delší) a

převedením barvy píků na typ ddNTP můžeme odečíst kompletní

sekvenci.

Velmi často se při této sekvenaci provádějí dvě paralelní

asymetrické PCR, přičemž do každé je použit jiný z původního páru

primerů (do jedné F, do druhé R); získané sekvence z obou reakcí

musejí být komplementární. Postup se užívá především tehdy,

pokud je z nějakého důvodu obtížné bezchybně „přečíst“ celou

délku zájmového úseku DNA s pomocí jednoho primeru; tímto

důvodem může být např. velká délka úseku, malá koncentrace

163

templátové DNA nebo problematická sekvence, přes kterou

polymeráza jen obtížně postupuje dále – typické jsou úseky

v mitochondriální DNA označované jako cytozinový pás (angl. C–

stretch), kde je v sekvenci zařazeno několik C za sebou (např.

ATTGACCCCCCCATCCT).

Obrázek 51 – Kapilární elektroforéza fragmentů vzniklých sekvenační asymetrickou PCR.

Jak je prováděna analýza HVR mtDNA pomocí

hybridizace s SSO?

Hybridizace s SSO představuje rychlejší, levnější a méně

informativní možnost analýzy HVR mtDNA; nezískáme při ní

kompletní sekvenci příslušné HVR, pouze informaci o několika

164

úsecích této HVR jako celku. Vybrány pro testování jsou úseky

zahrnující nejpolymorfnější nukleotidy. Analýza pomocí SSO se

uplatňuje především jako screeningová metoda při vyšetřování

většího množství stop či osob.

Podstata metody je velmi jednoduchá: pokud použitá SSO sonda je

zcela komplementární k příslušnému úseku HVR mtDNA ve

vyšetřovaném vzorku, dojde k jejímu navázání (hybridizaci) na

tento úsek, což je posléze detekováno nějakou vhodnou zobrazovací

metodou. Pokud se však sekvence sondy a příslušného úseku liší

byť v jediném nukleotidu, k hybridizaci nedojde. Získáme tak

informaci, zda je tento úsek jako celek komplementární se sondou či

nikoli. Pro analýzu lze užít i více různých sond pro stejný úsek, čímž

se analýza stane informativnější.

Analýza SNP lokusů

Jakými metodami jsou analyzovány SNP lokusy?

Existuje celá řada principů, na nichž může být zjištění genotypu

jednonukleotidových polymorfismů založeno. Ve forenzní praxi se

uplatňují především ty, které umožňují současnou genotypizaci

velkého množství SNPs, které je třeba k dosažení potřebné

vypovídací hodnoty analýzy. K základním patří minisekvenování

například pomocí soupravy SNaPshot; jeho obliba tkví i v tom, že jej

lze provádět se stejným laboratorním vybavením, jaké je užíváno

pro analýzu STR lokusů.

Jak je prováděna analýza SNPs minisekvenováním?

Při minisekvenování je nejprve pomocí klasické PCR reakce

namnožen úsek obsahující testovaný SNP. Poté je reakční směs

vystavena působení enzymů, které rozloží zbytky

nespotřebovaných primerů a zbylé volné dNTP.

165

Po úvodní amplifikaci následuje krok označovaný jako prodloužení

primeru: do reakce je přidán tzv. extenzní primer nasedající zcela

těsně před testovaný SNP, a směs čtyř různou barvou fluorescenčně

značených ddNTP neboli terminátorů (týchž, jaké byly popsány

v části věnované technologii sekvenování mtDNA). Polymeráza poté

na základě komplementarity s naším SNP připojí k primeru jediný

ddNTP (odtud název minisekvenování). Vzniklý fluorescenčně

značený produkt je poté analyzován pomocí kapilární elektroforézy:

barva detekovaného píku odpovídá typu terminátoru, který byl na

základě komplementarity s testovaným SNP do fragmentu zařazen.

Obrázek 52 – Výsledek monoplexové a multiplexové analýzy SNP lokusů.

Tato jednoduchá metoda může být úspěšně multiplexována, tj. je

množeno a analyzováno více zájmových lokusů najednou; pro

rozlišení příslušnosti jednotlivých píků k jednotlivým SNP je

166

používáno nejčastěji připojení různě dlouhých poly–T řetězců (úsek

tvořený pouze nukleotidy T) k extenzním primerům, což změní

výslednou pozici jednotlivých píků v elektroforetogramu.

Nakládání se stopami obsahujícími

degradovanou DNA a/nebo malá množství DNA

Co je degradovaná DNA?

V části věnované biologickým stopám jsme se již podrobněji zmínili

o jevu zvaném biodegradace včetně degradace DNA. Popsali jsme

základní činitele, podílející se na degradaci, a možné důsledky pro

analýzu.

Obrázek 53 – Dva základní mechanismy degradace DNA – fragmentace a narušení struktury.

Jako degradovanou DNA souhrnně označujeme DNA, která již není

v původním nativním stavu (tj. taková, jaká byla v živé buňce), ale

byla poškozena fyzikálními, chemickými či biologickými činiteli.

167

Toto poškození může mít charakter fragmentace, tj. rozštěpení na

kratší úseky, a/nebo narušení struktury, tj. změny jednotlivých

bází (např. v důsledku oxidace), výpadky bází apod. Uvedené změny

mohou nastat v různé míře, proto mluvíme o různém stupni

degradace DNA.

Můžeme určit stupeň degradace DNA ve vzorku?

Posoudit, do jaké míry je DNA ve vzorku poškozena a zda bude

vhodná k námi zamýšlené analýze, není nemožné, stále však platí, že

nejlepším testem, zda bude analýza fungovat, je analýza sama.

Obvykle u vzorku možnou degradaci již předvídáme na základě

nám dostupných informací (ať už získaných ze spisu, ohledáním

biologického materiálu či prostou zkušeností s daným typem

materiálu). Máme–li analyzovat čerstvou krev, odebranou osobě

den předem a uchovanou v ledničce, prakticky s jistotou očekáváme,

že DNA nebude ani mírně degradovaná. U vzorku kosti z 18. století

si naopak můžeme být vyšším stupněm degradace téměř jisti.

Lze provést některé orientační analýzy stupně degradace –

například rozdělit izolovanou DNA elektroforeticky na agarózovém

gelu a obarvit sloučeninou ethidiumbromid, která v UV světle září:

pokud se na gelu objeví dlouhá „rozplizlá“ šmouha v oblasti

krátkých fragmentů, máme co do činění s velmi fragmentovanou

DNA; pokud naopak intenzivně září pouze malá ohraničená skvrna

v oblasti, kde očekáváme velmi dlouhé fragmenty, je naše DNA

pravděpodobně velmi málo poškozena.

Míra degradace může být hodnocena i dalšími postupy, jako je

qPCR. Provedení takových testů sice nestojí příliš mnoho času,

avšak spotřebovává se při něm část vzorku; u nepatrných stop

s minimálním množstvím využitelné DNA si takové plýtvání dovolit

nemůžeme, a musíme přistoupit přímo k pokusu o analýzu.

168

Může být degradovaná DNA před analýzou nějak

reparována?

Zmínili jsme dva možné charaktery změn v degradované DNA –

fragmentaci a narušení struktury. Fragmentace je při současných

znalostech a schopnostech molekulární genetiky poškození

laboratorně nereparovatelné – neexistuje laboratorní postup,

kterým by bylo možno vyhledat a seřadit fragmenty tak, jak

původně byly v DNA za sebou, a znovu je spojit (v jiných odvětvích

molekulární genetiky se používají některé postupy „skládání

sekvence až v počítači“, ve forenzní oblasti se však zatím

neuplatňují.) Naproti tomu existují některé dílčím způsobem

úspěšné postupy opravy narušené struktury DNA pomocí

enzymatických koktejlů. Jejich užití ve forenzní genetice je však

zatím spíše otázkou budoucnosti.

Existují speciální postupy analýzy degradované

DNA?

Ano. Základním přístupem je maximalizace výtěžnosti izolačních

technik (tj. nelze si dovolit ztráty) a minimalizace délky

fragmentu potřebného k provedení příslušné analýzy (neboť je

mnohem větší pravděpodobnost, že ve vzorku se bude nacházet

několik nepoškozených zájmových fragmentů o délce 100 bp než

o délce 300 bp). V rámci analýzy STR lokusů se v tomto směru

uplatňuje především užití tzv. miniSTRs.

Co jsou miniSTRs a jak se analyzují?

Jako miniSTRs označujeme analýzy STR lokusů s pomocí primerů

nasedajících těsně před a za danou repetici; tímto blízkým

umístěním primerů se minimalizuje délka potřebného

neporušeného fragmentu, a tedy i zvyšuje pravděpodobnost, že

analýza bude úspěšná. Testování se zaměřuje na:

169

„klasické“ autozomální STR lokusy, např. zahrnuté v CODIS

Core Loci, u nichž jsou hledány pozice pro primery co nejbližší

repeticím

nově vytipované miniSTR lokusy, kde je sama repetice

relativně krátká, avšak lokus je dostatečně polymorfní

Obrázek 54 – Nasedání primerů při „klasické“ analýze a při miniSTR analýze.

Zatímco u „klasických“ autozomálních STR lokusů mohou být

výsledky miniSTR analýzy porovnávány s výsledky „standardních“

analýz – tedy např. s profily v DNA databázi, výsledky analýzy

specifických miniSTR lokusů takto srovnávány být nemohou a

užívají se spíše k porovnání ad hoc (tedy např. v rámci konkrétního

případu jsou stanoveny a porovnány genotypy specifických miniSTR

ze stopy a srovnávacích vzorků osob, avšak nelze provést plošné

prohledání DNA databáze, neboť standardně stanovované profily

tyto specifické miniSTR lokusy neobsahují).

170

Co je LCN?

Jako LCN (angl. Low–Copy Number, „malý počet kopií“) neboli LT–

DNA (angl. Low–Template DNA) jsou souhrnně označovány vzorky

s malým až velmi malým obsahem DNA využitelné pro analýzu.

Existují speciální postupy analýzy LCN (LT–DNA)?

Pro analýzu LCN vzorků bylo až dosud vyvinuto a je užíváno několik

specifických strategií, jejichž cílem je zvýšení citlivosti testování.

Základními jsou

zvýšení počtu PCR cyklů při amplifikaci, které může vést ke

zvýšení množství výsledného produktu, avšak zvyšuje i riziko

nespecifické amplifikace (tj. jevů typu drop–in);

užití tzv. nested PCR, kdy je nejprve lokus amplifikován

s pomocí páru primerů nasedajících dále od sebe (tzv. vnější

pár primerů) a poté s pomocí páru primerů nasedajících uvnitř

prvního amplikonu blíže k sobě (tzv. vnitřní pár primerů), což

může vést ke zvýšení množství výsledného produktu, avšak

vzhledem k manipulaci se vzorkem se zvyšuje i riziko

kontaminace;

snížení objemu PCR reakce, tedy jakési „zakoncentrování“

celé reakce; negativní efekt ovšem může mít současné

zakoncentrování PCR inhibitorů;

další snahy o vylepšení PCR, např. přidáním většího množství

polymerázy apod.

zvýšení objemu vzorku injektovaného do kapilární

elektroforézy

přečištění PCR produktu před injekcí do kapilární

elektroforézy, což rovněž zvýší množství vzorku, který se

nabere do kapiláry

užití „nadějnějších lokusů“, např. mtDNA, která je ve vzorku

přítomna v několikařádově více kopiích než autozomální lokusy

171

Jak se degradace DNA a/nebo malé množství DNA

projeví na analýze?

K tomu, aby analýza poskytla pozitivní výsledek, je teoreticky třeba,

aby ve vzorku byl přítomen minimálně jeden nepoškozený

fragment DNA zahrnující celý testovaný úsek DNA – v případě

PCR technik je to celý úsek mezi F a R primerem včetně obou konců,

kam tyto primery nasedají. V praxi je však pozitivní analýza vzorku

s jedinou kopií zájmového lokusu značně nejistá, závisí významně

na použité technologii a spolehlivých výsledků lze zpravidla

dosáhnout až při řádově vyšším počtu kopií, např. 10.

S postupující degradací DNA se počet nepoškozených fragmentů

zahrnujících testovaný úsek ve vzorku snižuje, ve vzorcích typu LCN

je rovněž počet nepoškozených fragmentů zahrnujících testovaný

úsek velmi malý; tím se mohou během PCR více a více projevit tzv.

stochastické efekty – laicky řečeno vlivy náhody, které snižují

spolehlivost získaných dat. Se snížením počtu nepoškozených

fragmentů zahrnujících testovaný úsek rovněž dramaticky roste

riziko, že se při analýze projeví přítomnost třeba i malého množství

kontaminující DNA (neboli cizorodé DNA zanesené do vzorku).

K jakým stochastickým efektům může docházet při

analýze degradované DNA či LT–DNA?

Nejčastějšími stochastickými efekty jsou

nerovnováha píků u heterozygota

alelický drop–out

lokusový drop–out

zvýšení stutteringu (tj. tvorby koktavých píků)

alelický drop–in

172

Jako nerovnováhu píků u heterozygota označujeme stav, kdy oba

píky reprezentující dvě alely heterozygotního lokusu nejsou stejně

vysoké (tak, jak by u vzorku jediné osoby měly být), ale svou výškou

se významně liší; pokud se výška jednoho z obou píků sníží až k nule

(tj. pík není de facto přítomen), mluvíme o ztrátě alely neboli

alelickém drop–outu. Dojde–li ke ztrátě obou alel lokusu (tj. žádný

pík daného lokusu není de facto přítomen), mluvíme o ztrátě lokusu

neboli lokusovém drop–outu.

Při amplifikaci lokusů typu STR dochází u čtyř– a

méněnukleotidových repetic k občasnému prokluzu polymerázy:

polymeráza během kopírování repetice „odpadne a znovu nasedne“,

přičemž v určitém procentu případů nasedne na templátovou DNA

až o motiv dále než odpadla, takže výsledný produkt amplifikace je

o motiv kratší. Tím vznikne určité množství fragmentů, které se

v elektroforetogramu objeví jako menší pík předsazený před vlastní

alelou o délku motivu, tedy kupříkladu o 4 bp. Tento jev nazýváme

zadrhávání, koktání (stuttering) a zmíněný „předpík“ označujeme

jako koktavý pík (stutter). U standardních vzorků s dostatečným

množstvím nepoškozené DNA se při klasické analýze autozomálních

tetranukleotidových STR pohybuje míra stutteringu kolem 10–15

%, u degradované DNA či LCN vzorků však může významně

narůstat, což spolu s ostatními stochastickými jevy vede k nejistotě,

zda daný pík představuje pouze zvýšený stutter, nebo se jedná

o relevantní alelu.

Vzhledem k malému obsahu templátové DNA v degradovaných či

LCN vzorcích se při amplifikaci může projevit i sporadická

kontaminace (kontaminace malými DNA rezidui), a to nejčastěji

v podobě tzv alelických drop–inů, tj. píků „navíc“.

173

Obrázek 55 – Stochastické jevy, k nimž dochází při analýze degradované DNA a/nebo LT–DNA.

Lze stochastické efekty při analýze degradované DNA či

LT–DNA nějak omezit?

Kromě výše popsaných principů, vedoucích ke zlepšení analýzy jako

takové, se při práci s degradovanou či LT–DNA hojně užívá

jednoduchého principu, a to několikanásobného provedení

analýzy téhož vzorku. Podstatou stochastických efektů je totiž to,

že se neprojevují vždy, ale nahodile: opakováním PCR tak můžeme

dostat několik ne zcela stejných výsledků, z nichž lze za určitých

podmínek stanovit nejpravděpodobnější skutečný DNA profil – tzv.

konsenzuální profil.

174

Jaká hlavní rizika přináší užití vzorků s degradovanou

DNA a/nebo LCN vzorků ve forenzní praxi?

Jak již bylo naznačeno výše, analýza tohoto typu vzorků s sebou

vždy přináší snížení spolehlivosti získaných dat: uplatňují se snáze

stochastické efekty a roste riziko, že se projeví kontaminující DNA.

Přes tato negativa mohou být degradované a LCN vzorky

principiálně pro forenzní analýzu užity, pokud je s nimi správným

způsobem nakládáno a z nich získaná data jsou správně a obezřetně

interpretována. Na druhou stranu – data velmi sporné kvality a

původu již by neměla být referována jako relevantní a neměla by

být pro jakékoli forenzní interpretace užívána.

175

Interpretace forenzně genetických dat

Obecné kroky a pravidla interpretace dat

Co si představit pod pojmem interpretace dat?

Po vlastní analyzační fázi, tj. genetické analýze v laboratoři,

nastupuje neméně důležitá fáze interpretační; jejím smyslem je

zhodnotit získaná data, stanovit jejich spolehlivost a následně

určit jejich vypovídací hodnotu, tj. převést získanou informaci

z roviny úzce odborné do roviny reálného světa a života – neboli

říci, co vlastně výsledky analýzy v daném případě „znamenají“.

Obrázek 56 – Základní kroky procesu práce s daty neboli „od dat k posudku“.

Z čeho vycházíme při hodnocení spolehlivosti dat?

Abychom mohli odhadnout míru spolehlivosti dat (či naopak

chcete–li míru nejistoty), musíme především posoudit:

176

jak jsou získaná data technicky kvalitní, a jaká je tedy

spolehlivost vlastního odečtu dat

jak v principu spolehlivé jsou námi použité metody

analýzy a jak je z hlediska možného ovlivnění výsledků

bezpečný a vůči chybě odolný celý laboratorní proces

jak logicky konzistentní jsou jednotlivá dílčí zjištění

v procesu forenzně genetické analýzy navzájem (tj. zda si

např. dva dílčí výsledky zkoumání téhož vzorku neodporují)

jak dobře data odpovídají empirii (tj. zda jsou data

v souladu se zkušeností znalce a uživatele dat – soudce, či

naopak zda z ní vybočují).

Jakým způsobem posuzujeme vypovídací hodnotu dat?

Další posouzení dat by mělo vždy být založeno na inferenci

pravděpodobnostních jevů, tj. na vyjádření pravděpodobnosti

daného výsledku za platnosti dvou či více alternativních hypotéz.

Všechny ostatní způsoby posouzení dat (kategorické soudy,

frekventistický přístup aj.), které jsou užívány v některých jiných

forenzních oborech, jsou v rámci forenzně genetické analýzy

nedostatečné či dokonce hrubě zkreslující a znalec by se jich měl

vyvarovat.

Spolehlivost dat – technická kvalita dat

Jakou podobu mají výstupní laboratorní data?

Laboratorní data, která jsou výsledkem forenzně genetické analýzy,

mohou v principu mít nejrůznější podobu; v praxi se ovšem

nejčastěji setkáme s časovým záznamem změn fluorescence

v průběhu kapilární elektroforézy (tzv. elektroforetogramem), a to

jak u klasické identifikační STR analýzy, tak například při

sekvenování mtDNA či při minisekvenování SNP lokusů.

177

Co rozumíme pod pojmem technická kvalita

laboratorních dat?

Technickou kvalitou dat rozumíme to, jak zřetelně odečitatelná tato

data jsou, tj. do jaké míry jednoznačně z nich lze určit konkrétní

podobu studovaných polymorfismů DNA. Naše data mohou být

od vysoce kvalitních, úplných a bez nejasností, přes středně kvalitní,

neúplná a s určitými nejasnostmi až po zcela neinterpretovatelná.

Jak hodnotíme technickou kvalitu laboratorních dat?

Posouzení technické kvality dat spočívá v hodnocení celé řady

parametrů, jako je výška a tvar píků, vzájemné poměry výšek píků,

míra stutteringu, výška a charakter tzv. pozadí a podobně. Při

hodnocení přitom vycházíme ze standardu, který představují

data z validace (o validaci viz dále). Posouzení může být primárně

svěřeno kvalitnímu vyhodnocovacímu softwaru, stále ovšem platí,

že finální posouzení dat včetně jejich technické kvality je na

expertovi a jeho „cvičeném oku“.

Jak pracujeme s technicky středně a nízce kvalitními

daty?

Prvním krokem by vždy měla být snaha kvalitu dat zvýšit; v praxi

tak často po první analýze vzorku následuje i několik dalších

opakování s různými modifikacemi (změna vstupního množství

DNA do PCR, změna parametrů PCR, změna parametrů kapilární

elektroforézy atd.) Cílem je optimalizovat průběh celé analýzy

tak, aby výsledná data byla co nejčitelnější. Na tomto místě

zdůrazňuji, že se v žádném případě nejedná o snahu tak dlouho

zkoušet analýzu, až konečně dostanu výsledek, jaký potřebuji; jde

o snahu „vyladit“ celou analýzu tak, aby poskytla co nejúplnější a co

nejspolehlivější data.

178

V případě práce se silně degradovanou DNA a/nebo LCN vzorky,

kde se silně uplatňují již dříve popsané stochastické jevy (alelický

drop–out, nevyváženost píků atd.), se můžeme setkat se

sestavováním tzv. konsenzuálních profilů. Podstatou je

opakovaná analýza téhož vzorku s pomocí několika nezávislých PCR

a následné pomyslné spojení odečtených dat ze všech těchto analýz;

tím lze do značné míry eliminovat právě stochastické jevy, které se

objevují náhodně a pouze v některých PCR téhož vzorku.

V případě, že ani opakované analýzy a modifikované postupy

nevedou ke zkvalitnění dat, je třeba míru technické nekvality

zohlednit při stanovení vypovídací hodnoty dat.

V praxi tak můžeme například dospět k závěru, že:

u určitého autozomálního lokusu, v němž byla stanovena pouze

jediná alela (označme ji A), připouštíme možný drop–out druhé

alely; skutečný genotyp vzorku tudíž může být nejen AA, ale i AX,

kde X je libovolná jiná alela;

u určitého autozomálního lokusu byla jednoznačně stanovena

alela A a dále alela B cca poloviční výšky na pozici odpovídající

stutteru alely A, u níž vzhledem k technické kvalitě vzorku nelze

jednoznačně rozhodnout, zda se jedná o stutter či o druhou

relevantní alelu; skutečný genotyp vzorku tudíž může být jak AA,

tak AB;

u určitého autozomálního lokusu nebyla stanovena ani jedna

alela; skutečný genotyp vzorku tudíž může být jakýkoli.

U dat nízce kvalitních je často zdrojů nejistoty tak mnoho, že je již

prakticky nelze jako důkaz použít. Správný postup v tomto případě

neznamená snažit se i vysoce nekvalitní data interpretovat, ale

naopak: nekvalitní data rozpoznat a označit je jako

nehodnotitelná (nepoužitelná).

179

Kvalita v laboratoři

Proč laboratoře zavádějí systémy řízení kvality?

Řízení kvality ve forenzně genetických laboratořích sleduje několik

základních cílů:

prevence chyb ze známých zdrojů a prevence snížení kvality

(např. prevence záměny vzorků, prevence poškození vzorků

nevhodnou teplotou atd.)

odhalování nových, neznámých zdrojů chybovosti a

neznámých zdrojů snížení kvality (např. zjištění negativního

vlivu určité látky na průběh analýz apod.)

systémový přístup a standardizace analýz (se stejnými

vzorky je nakládáno stejně)

optimalizace laboratorních procesů z časového i

ekonomického hlediska (snaha dosáhnout rychlého zpracování

vzorků, snaha maximalizovat finanční efektivitu analýzy – tj.

množství informace získané ze vzorku za určitou jednotkovou

částku)

průběžné zkvalitňování analýz s ohledem na vývoj v oboru.

Co jsou to certifikace a akreditace laboratoří? Jaký je

mezi nimi rozdíl?

Certifikací rozumíme dobrozdání (certifikát) certifikačního

orgánu, že daný výrobek, postup nebo služba je ve shodě

s předepsanou normou nebo jiným normativním dokumentem.

V souvislosti s forenzně genetickou laboratorní praxí se nejčastěji

setkáme s certifikací o shodě s normou ISO 9001:2008 (týká se

systému managementu kvality).

180

Akreditací rozumíme dobrozdání akreditačního orgánu, že buď

a) daný certifikační orgán je po stránce odborné i jiné (nezávislost,

nestrannost atd.) způsobilý k certifikacím, nebo že b) daný subjekt

je odborně i jinak způsobilý k provádění určité činnosti.

V souvislosti s forenzně genetickou laboratorní praxí se nejčastěji

setkáme s akreditací laboratoří dle normy ISO 17025:2005 (týká

se všeobecných požadavků na způsobilost zkušebních a

kalibračních laboratoří, pro akreditaci forenzních laboratoří bylo

vydáno doporučení ILAC G19), případně okrajově s akreditací dle

normy ISO 15189:1998 (týká se zvláštních požadavků na kvalitu a

odbornou způsobilost zdravotnických laboratoří).

V souvislosti s ohledáním místa činu se můžeme setkat s akreditací

dle normy ISO 17020:1998 (týká se inspekce a inspektorů obecně,

pro akreditaci ohledání místa činu bylo vydáno zvláštní doporučení

EA–5/03).

Souhrnně lze konstatovat, že mezi certifikací forenzní laboratoře

dle ISO 9001:2008 a akreditací forenzní laboratoře dle ISO

17025:2005 je zásadní rozdíl: certifikace dle ISO 9001:2008

garantuje, že laboratoř má zaveden a uplatňuje systém řízení

kvality, ovšem již nijak negarantuje odbornou způsobilost dané

laboratoře k provádění příslušných zkoušek; naproti tomu

akreditace dle ISO 17025:2005 garantuje jak zavedení a

uplatňování systému managementu kvality, tak odbornou

způsobilost laboratoře k provádění příslušných zkoušek.

Znamená to tedy, že forenzně genetická laboratoř,

která není akreditována dle ISO 17025:2005 , není

odborně způsobilá a produkuje „špatná“ dat a?

Nikoliv. I laboratoře neakreditované mohou být velmi kvalitní, mít

vlastní systémy řízení kvality a kontroly správnosti dat a

181

produkovat vysoce validní data; tato jejich schopnost však není

garantována žádnou akreditační autoritou a je pouze na uvážení

„zákazníka“ (v tomto případě např. orgánu činného v trestním

řízení), jakou důvěryhodnost datům přikládá. V řadě oborů se již

akreditace laboratoře stala dokonce právně zakotvenou nezbytnou

podmínkou výkonu dané činnosti. Naproti tomu sama akreditace

není absolutní zárukou validity dat, pokud nejsou laboratoří

všechna pravidla důsledně uplatňována a naplňována.

Jak laboratoř vybírá vhodné metody pro danou

analýzu? Jak pozná, že metoda je v jejích podmínkách

funkční?

Při výběru metod pro analýzu se laboratoř řídí vědeckými poznatky

ve svém oboru; relevantní metody jsou vždy popsány v odborné

literatuře jako výstup vědeckých studií a zpravidla jsou

mnohonásobně ověřeny dalšími nezávislými studiemi jiných

odborných pracovišť. Řada metod je dnes dostupná komerční

cestou v podobě tzv. analyzačních kitů; firmy produkující tyto

kity garantují jejich funkčnost při dodržení stanoveného pracovního

postupu – kity jsou validované. Validací obecně rozumíme

„potvrzení prostřednictvím poskytnutí objektivních důkazů, že

požadavky na specifické zamýšlené použití nebo na specifickou

aplikaci byly splněny“. I validovaný kit však musí být verifikován

(tj. přezkoušen) přímo laboratoří, čímž je zaručeno, že funguje

správně i v podmínkách tohoto konkrétního pracoviště (tzn. na

jeho přístrojích atd.).

Jak laboratoř průběžně ověřuje, že produkuje

relevantní data?

Jednou z nejspolehlivějších metod ověření kvality a správnosti dat

produkovaných laboratoří je účast v tzv. okružních

(proficienčních) testech. Ty spočívají v tom, že zadavatel testů

182

připraví testovací vzorky, rozešle je testovaným laboratořím, ty je

analyzují a odešlou výsledky analýzy zpět zadavateli, který posoudí

správnost výsledků. Úspěšné laboratoře získají certifikát; testy se

opakují v určitých intervalech, kupříkladu jednou ročně. Tento

systém mezilaboratorní kontroly kvality může být organizován jak

na mezinárodní, tak i na národní úrovni.

Vypovídací hodnota dat

Jak funguje inferenční logika hodnocení dat?

Inference neboli usuzování, odvozování jedné skutečnosti z druhé,

je ve forenzní analýze založena na jednoduchém principu: některé

hypotézy jsou při daném výsledku pravděpodobnější a jiné

méně pravděpodobné; platí to tehdy, pokud jsou předpoklady

hypotézy a výsledky analýzy jevy závislé. Pro porozumění si

uveďme nejprve jednoduchý příklad zcela mimo forenzní obor:

Na konzultaci k panu Petrovi má přijít žena, říkejme jí Marie, o níž

Petr ví pouze to, že je jí právě 30 let. Klade si v duchu otázku, zda je

svobodná či nikoli. V tuto chvíli mu vodítkem může být pouze nějaká

obecná, předběžná (neboli apriorní) pravděpodobnost: dejme tomu,

že celorepubliková statistika říká, že v ročníku třicetiletých je dosud

svobodných zhruba 25 % žen. Z toho vyplývá, že i Marie bude

svobodná s pravděpodobností 25 %. Poté však kolega Petrovi během

řeči sdělí, že pokud je mu známo, vystudovala Marie práva. S novou

informací se původní (apriorní) pravděpodobnost změní: v ročníku

třicetiletých vysokoškolaček je totiž podle statistiky dosud svobodných

plných 40 %. O několik minut později zaklepe Marie na Petrovu

kancelář, a zatímco ji Petr vítá, všimne si, že na levém prsteníčku má

Marie zlatý prsten bez kamenu: pravděpodobnost, že je svobodná, v tu

chvíli dramaticky klesne.

183

Jak vidíme v našem příkladu, inferenční logika je založena na

úpravě našich očekávání na základě získání nových dat

(informací).

Stejným způsobem funguje hodnocení síly důkazu ve forenzní

oblasti – opět si uveďme příklad:

Manželé Novákovi ohlásili na policii, že jejich soused, pan Svoboda,

pravděpodobně zneužívá svou nezletilou dceru Lucii. Je známo, že cca

50 % takovýchto podezření se posléze potvrdí, zatímco ve zbylých 50

% případů se obvinění ukáže jako účelové nebo nesprávné. Prvotní

pravděpodobnost zneužívání Lucie (tj. ještě předtím, než kdokoli

cokoli začne zjišťovat), je tedy cca 50 %. Při následném pohovoru

s policejním psychologem si tento všimne, že Lucie si kouše nehty. Ze

studií přitom vyplývá, že kousání nehtů lze zaznamenat u cca 80 %

zneužívaných dětí a pouze u 10 % dětí nezneužívaných. Jinak řečeno:

kousání nehtů je 8x pravděpodobnější u zneužívaného dítěte než

u nezneužívaného. Na základě zjištění, že Lucie si kouše nehty,

stoupne i pravděpodobnost, že je zneužívána.

Jak funguje inferenční logika ve forenzní genetice?

Inferenční logika se ve forenzní genetice vztahuje především ke

třem typům hypotéz, a to:

hypotéz o shodném/rozdílném původci dvou vzorků

hypotéz o přítomnosti/nepřítomnosti biologického

materiálu určité osoby ve smíšené stopě

hypotéz o existenci/neexistenci určitého biologického

příbuzenského vztahu mezi dvěma osobami

V prvém případě nás zajímá především, jak významným důkazem

o stejném původci je shoda genotypů (genetických profilů). Ve

druhém případě nás zajímá, jak významně svědčí výsledek analýzy

184

smíšené stopy pro přítomnost biologického materiálu konkrétní

osoby. Ve třetím případě nás zajímá, jak silně pro hypotézu či proti

hypotéze o určitém příbuzenském vztahu svědčí zjištěné genotypy

(genetické profily) obou osob.

Jak konkrétně při určování vypovídací hodnoty

forenzně genetického důkazu znalec postupuje?

Vlastní interpretace dat je problematika nesmírně rozsáhlá a je

záměrem realizačního týmu Československé společnosti pro

forenzní genetiku vydat k tomuto tématu samostatnou podrobnou a

názornou publikaci o rozsahu minimálně takovém, jako má tento

breviář. Pro jeho potřeby se proto omezme na některá základní

konstatování:

znalec zvažuje výsledky analýzy za platnosti definovaných

alternativních hypotéz a s ohledem na specifika případu,

přičemž užívá tzv. bayesiánský přístup, založený na inferenční

logice

vychází z četnosti jednotlivých znaků v populaci a ze

způsobu, jakým jsou děděny

zohledňuje míru mutací, tj. změn v DNA, které mohou

zasáhnout i testované lokusy

hodnotí nejistotu měření neboli spolehlivost dat

bere v potaz velikost a strukturu populace, počet možných

pachatelů, míru příbuznosti osob v populaci atd.

Co by mělo být zásadním výstupem forenzně

genetické analýzy?

Výstupem práce znalce je tzv. věrohodnostní poměr (LR) (angl.

Likelihood Ratio) pro každou dvojici alternativních hypotéz; tento

věrohodnostní poměr může být kombinován s věrohodnostním

poměrem vzešlým jiných zkoumání (např. daktyloskopie) ke

185

stejné dvojici hypotéz nebo s dalšími – i nevědeckými – důkazy,

např. očitým svědectvím. Vynásobením věrohodnostního poměru a

apriorního podílu šancí získáváme aposteriorní podíl šancí

(převeditelný na aposteriorní pravděpodobnost).

Nutno říci, že praxe v tomto směru ještě stále zaostává za teorií:

věrohodnostní poměr není dosud v rámci našeho soudnictví příliš

vyžadován (soud obvykle volí jiný, mnohem intuitivnější přístup

k hodnocení důkazů jako celku), a není tudíž ani bezvýhradně

poskytován. Forenzně genetické posudky často obsahují jiné

statistické parametry – u identifikací to je pravděpodobnost náhodné

shody (RMP), u paternitních analýz například pravděpodobnost

otcovství (P) či síla vyloučení (PE). Tyto hodnoty nejsou zásadně

nesprávné, pro budoucnost je však žádoucí, aby se systém

hodnocení forenzních důkazů všech typů sjednotil a kodifikoval.

Blíže o tom bude pojednáno v samostatné publikaci o interpretaci

forenzních dat.

Zdroje chyb ve forenzně genetické expertíze

Je možné, aby při forenzně genetickém zkoumání došlo

k chybě?

Samozřejmě. Chybovost je přirozenou vlastností veškerých

procesů, ať už prováděných člověkem, strojem nebo přírodou, a

nevyhýbá se ani forenzně genetickému zkoumání (přestože bychom

rádi byli neomylní, nejsme). Pro věc je podstatné umět poznat a

popsat příčiny a mechanismy vzniku chyb a jejich důsledky, neboť

jedině tak je můžeme eliminovat či alespoň snížit pravděpodobnost,

že k nim dojde.

186

Kde v procesu forenzně genetické analýzy se chyby

objevují?

Prakticky kdekoli, ze statistik forenzních i jiných – například

klinických – laboratoří však vyplývá, že chyby mnohem častěji

vznikají mimo vlastní vědecké zkoumání a z jiných příčin než je

neodbornost. Spadají sem chyby jako nesprávné označení vzorku,

špatné přečtení označení vzorku (např. pro nečitelnost písma),

umístění vzorku na nesprávné místo, záměna dvou podobných stop

atd.

Jaké jsou zdroje chyb při zkoumání?

Četné příčiny chyb v laboratoři můžeme alespoň zhruba rozdělit

takto:

člověk vedený přímým úmyslem zkreslit či zcela změnit

výsledek zkoumání (např. osoba k tomu finančně motivovaná

pachatelem)

člověk vedený nepřímým úmyslem, kterému nejde

primárně o změnu výsledku, ale ví, že svým jednáním může

takovou změnu způsobit, a je s tím srozuměn (např. osoba,

která manipuluje s daty, aby zakryla svou chybu v pracovním

postupu)

člověk vědomě nedbalý, který ví, že svým jednáním může

způsobit chybu, ale doufá, že se tak nestane (dříve

všeobecně známo jako hřích „opovážlivé spoléhání na

milosrdenství Boží“; například osoba, která vědomě porušuje

pracovní postup, aby si ulehčila práci, přičemž tuší, že to může

způsobit chybu, ale doufá, že nezpůsobí)

člověk nevědomě nedbalý, který neví, že může způsobit

chybu, ale vědět by to měl (např. osoba manipulující

s přístrojem bez řádného proškolení)

187

běžný lidský omyl (přestože to mnozí neradi slyší, je

chybovost bez znaků nedbalosti integrální vlastností lidského

mozku – např. přepsání se v čísle, napipetování vzorku do

nesprávné zkumavky, překouknutí atd.)

technická chyba z očekávatelných příčin (počítačový virus,

závada na přístroji, nekvalitní chemikálie pro analýzu atd.)

technická chyba z neočekávatelných příčin (neodhalený

negativně působící fyzikální, chemický či biologický faktor –

v minulosti byly takto dodatečně „odhaleny“ např. pudrová

tvářenka laborantky či pylová zrna jasanu ve dvoře objektu,

které oboje velmi účinně blokovaly PCR).

Jaké se chybám uvedených typů bránit?

Pro jednotlivé zdroje chyb pochopitelně existují výrazně odlišné

mechanismy prevence:

v přímém či nepřímém úmyslu zkreslit či zcela změnit

výsledek zkoumání lze pracovníku laboratoře zabránit

poměrně obtížně, zejména je–li to osoba důvěrně znalá

prostředí a všech v něm fungujících procesů. Primárním

opatřením je samozřejmě prověření osob předtím, než se

pracovníky stanou; znesnadnit úmyslnou manipulaci lze

primárně výběrem pracovníků s morálním kreditem,

zavedením kontrolních bodů, jako jsou kontrolovaný pohyb

osob (např. čipové karty, přístup jen do určitých prostor),

kontrolovaný pohyb vzorku (uzamykatelné chladničky,

mrazáky apod.), kontrolovaný přístup do počítačů, řídících

jednotek přístrojů, databází (logování pomocí hesla, otisku

prstu apod.). I tak ovšem může zručný „insider“ najít slabá

místa systému.

v přímém či nepřímém úmyslu zkreslit či zcela změnit

výsledek zkoumání lze osobě zvenčí zabránit obdobnými

188

mechanismy jako v předchozím případě; účinnost opatření

bude u cizí osoby zcela jistě mnohem větší (osoba se nemůže

v laboratoři pohybovat „nenápadně“, není tak dobře

obeznámena s chodem laboratoře atd). Obecně je tendence

zcela minimalizovat přístup cizích osob do laboratorních

prostor (i proto, že tyto osoby mohou být zdrojem

kontaminující DNA).

nedbalostní jednání (ať už vědomé, či nevědomé) lze

nejlépe eliminovat zavedením přesných pravidel práce

v laboratoři a průběžnou kontrolou jejich dodržování

jednotlivými pracovníky; dobrým pomocníkem v tomto směru

může být software monitorující procesy v laboratoři, který umí

indikovat problematický faktor mnohem dříve, než by si jej

všiml člověk (např. identifikuje provázanost mezi častějšími

špatnými výsledky a určitým konkrétním pracovníkem).

je někdy snaha eliminovat běžný lidský omyl hrozbou trestu;

to je ovšem opatření zcela neúčinné, ba co víc –

kontraproduktivní. Člověk nemůže přestat přirozeně chybovat

jen proto, že mu hrozí trest; naopak – často hrozba trestu

způsobí, že osoby, která svůj omyl zjistí, se snaží na něj

neupozorňovat, případně jej i zastřít. Jedinými účinnými

opatřeními proti běžným chybám jsou zavedení kontrolních

mechanismů (např. data odečítají nezávisle na sobě dva experti

a musejí se shodnout, při pipetování jedna osoba kontroluje

druhou atd.) a především automatizace procesů, která vyloučí

lidský faktor ze hry (např. automatická izolace a amplifikace,

kdy vše provádí robot a vzorky jsou v procesu značeny a

identifikovány pomocí čárového či QR kódu)

technické chyby jsou do značné míry eliminovatelné

zavedením managementu kvality (zmíněné ISO17025), jehož

součástí jsou standardní operační postupy, které zahrnují i

pravidelné údržby, kalibrace a kontroly funkčnosti přístrojů,

189

kontroly kvality používaných chemikálií a laboratorního

materiálu atd.

Zásadním mechanismem, který nám pomáhá zvyšovat efektivitu

preventivních opatření, je zjištění příčiny a mechanismu každé

chyby, kterou v laboratoři odhalíme. Jedině tak můžeme

identifikovat a průběžně odstraňovat slabá místa celého procesu. I

tak ovšem zůstává pravděpodobnost chyby nenulová, a to i v té

nejspolehlivější laboratoři. Pokud takové důvodné podezření

existuje, je samozřejmě namístě – pokud je to možné – zpracování

revizního posudku v jiné laboratoři.

190

Uchovávání zdrojů genetických informací

Obrázek 57 – Možné formy uchovávání zdrojů genetických informací.

Banky (archivy, depozity) biologického materiálu

Co je banka biologického materiálu?

Základní možností, jak uchovat zdroj forenzně genetických

informací, je deponovat samotnou stopu či její část (např. setřený

biologický materiál). Bankou tedy rozumíme takovýto depozit;

jednotlivé stopy (biologické materiály) jsou evidovány pod

identifikačním kódem a k němu jsou vázána data – údaje o typu

stopy či materiálu, původu atd.

Jaké výhody a nevýhody má banka biologického

materiálu?

Provozní banka biologického materiálu funguje v každé forenzně

genetické laboratoři. Materiál je v ní uchováván po dobu provádění

191

expertíz a může být případně opakovaně testován či odebrán pro

novou izolaci DNA. Materiál v původním stavu navíc obsahuje i další

informace kromě vlastní DNA – lze z něj např. určit krevní skupinu,

mikroskopicky jej zkoumat a podobně. Nevýhodou uchovávání stop

a biologických materiálů však je, že ne vždy je při dlouhodobém

skladování možné zcela zabránit postupné degradaci

biologického materiálu ve stopě. Z provozního hlediska pak

zjevnou nevýhodu představují značné nároky na prostory

depozitáře.

Jak se biologický materiál deponuje?

Způsob depozice závisí na charakteru biologického materiálu.

Materiály, které jsou v suchém stavu nebo které je možné do něj

převést, se zpravidla uchovávají při pokojové teplotě v suchu a

temnu v prodyšných (např. papírových) obalech. Materiály jako je

tekutá krev lze krátkodobě skladovat v chladničce při 4°C, trvale

uchovány však tímto způsobem být nemohou. Materiály ze své

podstaty vlhké (např. svalová tkáň) se uchovávají hluboce zmražené

při teplotách kolem –80°C. Pravidla pro deponování biologického

materiálu jsou samozřejmě významně podrobnější, zde se

omezujeme jen na hlavní principy.

Banky izolátů DNA

Co je banka izolátů DNA?

Jak bylo popsáno v části věnované technologii forenzně genetické

analýzy, je z každého biologického materiálu nejprve izolována

DNA. Většina metod izolace, které jsou v rámci forenzní praxe

užívány, izoluje totálně, tj. izolát obsahuje veškerou DNA ze vzorku

(samozřejmě s určitými ztrátami danými účinností příslušné

metody; některé izolační metody také nepřevedou do izolátu velmi

krátké fragmenty DNA). Lze tedy říci, že z izolátu lze provádět

192

analýzu libovolných DNA lokusů. Stejně jako banka biologického

materiálu, i banka izolátů má evidenci vzorků založenou na

identifikačním kódu, k němuž jsou navázána data o izolátu (z jaké je

stopy, kdy a jakou metodou byl vytvořen atd.)

Jaké výhody a nevýhody má banka izolátů DNA?

Provozní banka izolátů funguje – stejně jako banka biologických

materiálů – v každé forenzně genetické laboratoři. Izoláty jsou v ní

uchovávány po dobu provádění expertíz a mohou být opakovaně

použity pro testování (kolik opakování lze provést, to závisí na

celkovém množství izolátu). Pokud laboratoř uchovává trvale

materiály, z nichž byla expertíza prováděna, pak se nejčastěji

jedná právě o izoláty DNA. Jejich skladování je mnohem snazší a

prostorově podstatně méně náročné než uchovávání biologického

materiálu jako takového.

Jak se izoláty DNA deponují?

V praxi jsou užívány dva hlavní způsoby depozice izolátů DNA:

zamražení (doporučovány teploty pod –50°C, ale prakticky lze i

kolem –20°C) nebo deponování v suchém stavu na FTA kartě.

Vzhledem k historicky relativně krátké době, po kterou je DNA

analýza prováděna, nelze přesně říci, jak dlouho zůstává

v deponovaném izolátu analyzovatelná DNA, rozhodně se však

jedná řádově o roky či spíše desítky let.

DNA databáze

Co jsou DNA databáze?

DNA databáze jsou organizované soubory DNA dat, tedy informací

vzniklých genotypováním (analýzou) určitých markerů v DNA.

V současnosti jsou provozovány již výhradně v elektronické podobě.

193

Setkáme se s nimi ve všech oblastech, v nichž se uplatňuje genetická

analýza – v klinické diagnostice, výzkumu i forenzní oblasti.

Jakou podobu mají forenzní (kriminalistické) DNA

databáze?

Ve forenzních DNA databázích jsou uchovávány výsledky

forenzních analýz jednotlivých vzorků v elektronické podobě –

mohou to být „klasické“ identifikační genetické profily STR lokusů,

výsledky Y–STR a Y–SNP genotypování, výsledky sekvenace HVR

mtDNA, ale i další markery užívané ve forenzním identifikačním

testování (vždy závisí na legislativě příslušného státu).

Data o jakých vzorcích jsou ve forenzních DNA

databázích vedeny?

Primárním úkolem forenzních DNA databází je objasňování

trestné činnosti; proto největší podíl v těchto databázích tvoří

jednak profily z biologických stop nalezených na místě

trestných činů, jednak profily osob – pachatelů trestné činnosti.

Dále se v databázích vyskytují profily osob neznámé totožnosti,

profily pohřešovaných či jejich příbuzných, profily obětí a též tzv.

eliminační profily – například profily pracovníků laboratoře.

Každý stát, provozující národní DNA databázi, má svá pravidla.

K čemu forenzní (kriminalistické) DNA databáze

slouží?

Strukturování dat ve forenzních DNA databázích a softwarová

nadstavba, která je zpravidla nedílnou součástí databáze, umožňují:

uchovávat forenzní DNA data

provádět srovnání DNA profilů jednotlivých vzorků

získávat z vložených dat statistické analýzy – populační data

194

Jaká porovnávání umožňuje DNA databáze?

Databázový software je obvykle postaven tak, aby umožňoval velmi

komplexně nastavovat parametry prohledávání. To umožňuje

přizpůsobit „odpověď“, kterou nám databáze dá, našim

požadavkům.

Máme například úplný genetický profil osoby, který jsme stanovili

z analyzačních dat vysoké technické kvality; chceme zjistit, zda se

v databázi nenachází profil téže osoby. V takovém případě nastavíme

parametry tak, aby prohledávání jako potenciálně shodný profil

označilo pouze ten, který se liší maximálně v jedné alele jednoho

markeru.

Naproti tomu pokud máme profil z dat nižší technické kvality, kde je

nejistota ohledně přesného stanovení genotypů větší, lze nastavit vyšší

toleranci odchylek – např. maximálně 6 alel.

Při vyhledávání možných biologických dětí genotypovaných osob

nastavujeme parametry tak, aby prohledávání označilo jako

potenciálně vyhovující takové profily, které se s naším shodují

v minimálně jedné alele v každém lokusu. Opět jiné bude nastavení

prohledávání při posuzování smíšených profilů.

Z výše uvedeného vyplývá jedna zásadní skutečnost: výsledek

každého porovnávání je pouze návrh, že označené profily by

mohly být potenciálně shodné či příbuzné. V případě, že se

nejedná o úplnou shodu ve všech alelách všech srovnávaných

lokusů, je namístě porovnat následně analyzační data obou vzorků a

teprve poté provádět další hodnocení a interpretaci včetně evaluace

míry shody.

195

Na jakém software stojí česká kriminalistická DNA

databáze?

Česká kriminalistická DNA databáze vznikla v roce 2002, kdy byl

České republice poskytnut databázový software CODIS, vyvinutý a

provozovaný americkým FBI. Na bázi tohoto software je

provozována řada národních databází v Evropě i ve světě.

Lze srovnávat profily i mimo Národní DNA databázi ,

tedy v zahraničí?

Možnosti srovnávání závisí jinak na technických, jednak na

legislativních podmínkách.

Po technické stránce lze srovnávat profily tehdy, pokud jsou

k testování užívány stejné markery (lokusy). Blíže se o tomto

tématu zmiňuje část věnovaná STR lokusům v kapitole Principy

identifikace.

Po legislativní stránce závisí možnost porovnání na konkrétních

podmínkách daného případu, typu požadavku, právních předpisech

partnerského státu atd.

Kromě individuálních požadavků na srovnávání jsou v současnosti

intenzivně budovány systémy mezinárodní výměny dat; na

celosvětové úrovni je vůdčím projektem Interpol DNA Gateway. Na

evropské úrovni je systém výměny genetických dat budován na

základě Prümské úmluvy.

196

„Non–human“ forenzní analýza živočišné,

rostlinné a mikrobiální DNA

Forenzní analýza živočišné DNA

Jaké forenzní analýzy lze u živočichů provádět?

Z biologického pohledu je člověk de facto pouze jedním z živočichů.

Proto zjevně nepřekvapí, že potenciál genetické analýzy je u

živočichů prakticky týž jako u člověka. Živočichy lze tedy stejně

jako osoby individuálně identifikovat a provádět u nich analýzu

biologické příbuznosti.

Kromě toho jsou v rámci živočišné forenzní genetiky prováděny též

specifické analýzy, jejichž cílem je určit živočišný druh, ze kterého

pochází daný biologický materiál.

Které živočišné druhy jsou nejčastěji zkoumány?

Identifikační a příbuzenské analýzy jsou prováděny zejména

u domestikovaných druhů. Jednak jsou to ty, které souhrnně

označujeme jako „domácí miláčky“ – tj. především kočka a pes, a

dále hospodářská zvířata, jako je skot, koně, ovce, prasata atd.

Účelem je zkoumání živočišného biologického materiálu v rámci

kriminálních případů, napadení člověka zvířetem, ale i např. pro

potřeby chovatelství.

Druhové identifikace jsou prováděny naopak zejména u živočichů

volně žijících; přitom dominují analýzy vzácných a chráněných

druhů v rámci aktivit na jejich ochranu (např. boj s ilegálním

obchodem s těmito druhy, s pytláctvím v národních parcích).

197

Jak je prováděna identifikační analýza u koček a psů?

U koček i psů jsou k identifikaci používány vybrané specificky psí či

kočičí tetranukleotidové krátké tandemové repetice (STR).

Metodika analýzy je tudíž prakticky identická s metodikou užívanou

v identifikačních analýzách člověka. DNA je dle charakteru případu

izolována ze srovnávacích vzorků (tekutá krev, bukální stěr) nebo

z biologických stop (chlupy, krev, sliny). Výraznější rozdíl zde

nacházíme pouze v interpretaci dat: některá plemena jsou vnitřně

mnohonásobně příbuzná oproti jiným, což je třeba vždy zohlednit

při výpočtu statistických parametrů míry identifikace.

U koček i psů lze též zkoumat patrilineárně či matrilineárně děděné

lokusy, jako jsou hypervariabilní oblasti mtDNA či Y–STR a Y–SNP

markery.

Jak je prováděna identifikační analýza

u hospodářských zvířat?

U hospodářských zvířat jsou k testování rovněž využívány nejčastěji

krátké tandemové repetice (STR), často se však jedná o repetice

s kratším, dinukleotidovým motivem.

Jak je prováděna identifikace živočišných druhů?

Druhová identifikace je založena na zkoumání takových lokusů

DNA, jejichž sekvence jsou identické nebo velmi podobné uvnitř

druhu (tj. u všech příslušníků daného druhu) a zároveň významněji

odlišné mezi jednotlivými druhy. Optimální v tomto směru se jeví

některé specifické lokusy v mitochondriální DNA: cytochrom B

gen, 12S rRNA gen a COI gen.

Analýza všech těchto lokusů je založena na sekvenaci a následném

porovnávání získané sekvence s databází sekvencí jednotlivých

druhů.

198

Hovězí steak může být např. zkoumán, pokud někdo

prodává/servíruje maso chráněných živočichů a vydává je za hovězí

dobytek nebo pokud je potřeba potvrdit, že steak je opravdu

připraven z býků plemene wagyu. Pomocí DNA analýzy nejde ovšem

potvrdit, že býk wagyu byl opravdu napájen saké...

Forenzní analýza rostlinné DNA

Jaké forenzní analýzy lze u rostlin provádět?

Forenzní analýza rostlinné DNA se zaměřuje na dvě základní

oblasti: prvou je identifikace rostlinného jedince v rámci

kriminalistických zkoumání, kdy smyslem je zpravidla určit

konkrétní místo původu nějakého rostlinného materiálu.

Druhou oblastí zkoumání je identifikace rostlinných drog,

především marihuany.

Jaké metody zkoumání se ve forenzní analýze

rostlinné DNA užívají?

Identifikační analýza rostlin je opět založena nejčastěji na

genotypizaci vysoce variabilních krátkých tandemových repetic

(STR). Významným faktorem, který je u rostlin třeba brát v potaz, je

to, že se jedná o modulární organismy, jak již bylo zmíněno v části

věnované individualitě a identifikaci. Jednoduše řečeno: tentýž

genetický jedinec může existovat jako mnoho jedinců fyzických.

Zatímco nový genetický jedinec vznikne pohlavním rozmnožováním

(tvorbou semen), noví fyzičtí jedinci mohou vznikat i nepohlavním

rozmnožováním (dělením cibulí, oddenků, řízkováním atd.).

Identifikace analýzou DNA se vždy týká jedince genetického.

I pro rostlinnou říši jsou užívány metody identifikace druhů na

základě sekvenace genů lokalizovaných v mitochondriální DNA;

199

v některých případech však neposkytují tak spolehlivé výsledky

jako u živočichů.

Forenzní analýza mikrobiální DNA

V jakých forenzních aplikacích je užívána analýza

mikrobiální DNA?

Analýza mikrobiální DNA je oborem ležícím na hranici forenzní

genetiky a forenzní mikrobiologie. Mikroorganismy jsou velmi

různorodá skupina organismů, vyskytující se v nejrůznějších

prostředích, proto i škála situací, kdy jsou mikroorganismy

předmětem forenzního zkoumání, je velmi pestrá.

Pomocí identifikace bakteriálních a houbových druhů lze

porovnávat půdní vzorky, a to nejlépe v kombinaci s fyzikálními

zkoumáními struktury, barvy atd. Každá půda je totiž osídlena

charakteristickým společenstvem mikroorganismů, tzv.

mikrobiomem, který je sice v čase ne zcela stálý, přesto však může

být k okamžitému porovnávání použit.

Identifikace konkrétních kmenů virulentních organismů, jako

jsou bakterie a viry, může být použita též k vysledování šíření

nákazy, typicky například u osob, které vědí, že jsou přenašeči

závažné infekční choroby (např. HIV, hepatitidy atd.), přesto však

nebrání nakažení dalších osob nebo je dokonce nakazí záměrně.

Určité mikroorganismy a jejich společenstva – tzv. mikroflóra – jsou

též charakteristické pro určitá tělní prostředí a tělní tekutiny.

Toho může být využito při identifikaci těchto materiálů – například

identifikace vaginálního sekretu je založena na stanovení

přítomnosti některých druhů laktobacilů.

200

Jaké metody zkoumání se ve forenzní analýze

mikrobiální DNA užívají?

Mikrobiální, a zejména bakteriální genom se výrazně odlišují od

genomu mnohobuněčných organismů, jakými jsou rostliny,

živočichové i člověk. Lokusy, které jsou u nich studovány, jsou proto

dosti odlišné a k jejich genotypizaci se používá celá řada

molekulárně genetických metod, s nimiž se v „klasické“ forenzní

genetice nesetkáme. Výčet a popis těchto metod už jde nicméně nad

rámec této publikace.

201

Doslov

Forenzně genetická analýza je pilířem kriminalistické práce při

vyšetřování závažných trestních činů, ale podílí se i na vyšetřování

méně závažných přestupků proti trestnímu i občanskému právu.

Z laického pohledu televizního diváka ovlivněného sledováním

seriálů typu CSI se jedná o bezchybnou a nezpochybnitelnou

metodu usvědčování zločinců. Z pohledu jiného genetického laika,

bojovníka za občanské soukromí, se jedná o potenciální hrozbu

úniku zneužitelných osobních údajů z kriminalistické DNA databáze.

Oba pohledy jsou pokřivené neznalostí. Pro pochopení výhod a

nevýhod použití DNA profilování a databázování kriminálníků je

nutné nejprve pochopit biologii genetických markerů, technologii

sběru stop, amplifikace DNA a detekce amplikonů a zásady

inferenční logiky.

V anglosaských zemích byla forenzní DNA analýza ve svých

počátcích podrobena důkladné kritice a široké diskusi, což umožnilo

obecné pochopení a přijetí jejich zákonitostí, postupů a omezení

všemi profesionálními účastníky soudního řízení a velké části laické

veřejnosti. Naproti tomu v české společnosti diskuse o DNA probíhá

kampaňovitě, vedena dílčími komerčními zájmy, a je ovlivněna

neznalostí základů forenzní genetiky. Je to zčásti proto, že v české

literatuře dosud chyběla kniha, která by uvedla do problematiky

soudce, státní zástupce, vyšetřovatele, obhájce, budoucí forenzně

genetické znalce nebo zainteresované laiky.

Autorce se podařilo čtivou formou otázek a odpovědí, doplněnou o

šťavnaté příklady z praxe, nastínit všechny důležité pojmy a

procesy, týkající se forenzní DNA analýzy předtím, než dojde k

završení analýzy – k vyhodnocení síly důkazů pomocí

věrohodnostního poměru. S obezřetností jsou přeskočeny všechny

vzorce a právní floskule, které by mohly čtenáře odradit.

202

Kniha může sloužit jako odrazové prkno pro všechny právníky, kteří

se chystají skočit do bazénu forenzně genetických analýz, i pro laiky,

kteří se cítí ohroženi existencí kriminalistické DNA databáze.

Ilustrativní obrázky svou přehledností a výpovědní hodnotou

nemají konkurenci na trhu českých genetických učebnic a

monografií.

Čtenáři, vychutnej si toto počtení!

doc. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D.,

předseda Československé společnosti

pro forenzní genetiku

v Olomouci, červen 2012

O autorce

Mgr. Halina Šimková vystudovala odbornou biologii se specializací

na genetiku člověka a antropologii na Přírodovědecké fakultě

Univerzity Karlovy v Praze. Už v době studia působila dva roky jako

civilní stážistka na Kriminalistickém ústavu Praha Policie ČR, od

roku 2002 zde pracuje jako DNA expertka na oddělení genetických

expertíz. V roce 2005 se jako DNA specialistka účastnila mise

Interpolu při identifikacích obětí tsunami v Thajsku. Po ukončení

studií v r. 2002 spoluzaložila a přednáší předmět Forenzní genetika

na PřF UK. Velkou prioritou pro ni vždy byla a je didaktika oboru –

kromě odborných přednášek na univerzitě se věnuje přípravě

budoucích expertů, specializačnímu dalšímu vzdělávání stávajících

znalců a expertů, odbornému vzdělávání kriminalistů, přednáší pro

soudce a státní zástupce, ale nesmírně ráda také přibližuje obor

naprostým laikům při přednáškách pro veřejnost. Je zakládající

členkou Československé společnosti pro forenzní genetiku, od roku

2007 je její místopředsedkyní.

203

Doporučená literatura a informační zdroje

V českém jazyce pohříchu existuje jen velmi málo aktuální literatury

k tématu forenzně genetické analýzy (což byl ostatně jeden

z hlavních důvodů, proč vznikl tento breviář). Odborné informace

k oboru existují (jak už tomu u přírodních věd bývá) především

v jazyce anglickém. Zde odkazuji zejména na novější publikace, jako

například:

John M. Butler: Fundamentals of Forensic DNA Typing

John M. Butler: Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology

A. Jamie Cuticchia: Genetics: A Handbook for Lawyers

J. Thomas McClintock: Forensic DNA Analysis: A Laboratory Manual

Richard Li: Forensic Biology: Identification and DNA Analysis of

Biological Evidence

a další.

Z odborných periodik se tématu forenzní genetiky věnuje

především žurnál Forensic Science International: Genetics, dále

Journal of Forensic Sciences, Science & Justice a další.

Mezinárodní odbornou společností, která sdružuje odborníky

věnující se forenzní genetice, je ISFG – International Society for

Forensic Genetics (www.isfg.org). Na české národní úrovni je

takovouto odbornou společností ČSSFG – Československá

společnost pro forenzní genetiku (www.cssfg.org).

Existuje nepřeberné množství internetových zdrojů (ať už

otevřených, či uzavřených); zde však velmi důrazně varuji, že

mnoho z těchto zdrojů přináší nepřesné, zavádějící či zcela

nepravdivé informace, přičemž pro laika je velmi obtížné kvalitu

posoudit.

204

Rejstřík

1

12S rRNA gen ........................................ 197

A

adenin .......................................................... 50

AIMs ........................................................... 125

akreditace ............................................... 179

akreditační orgán ................................ 180

alela ....................................................... 59, 62

mikrovariantní . viz mikrovarianta

shodná původem ........................... 118

shodná stavem ............................... 118

alelově–specifická sonda ................. 161

AluQuant Human DNA Quantitation

System ................................................ 145

AMC ............................... viz amniocentéza

amelogenin ...................................122, 160

amniocentéza ........................................... 28

amplifikace DNA ........................146, 152

analyzátor genetický ...............156, 157

Ancestry Informative Markers ....... viz

AIMs

archeogenetika ........................................ 14

autozómy...................... viz chromozómy

nepohlavní

B

banka

biologického materiálu .............. 190

izolátů DNA ...................................... 191

barvivo

fluorescenční ................................... 142

biodegradace ................................. 40, 166

biologická stopa ...................................... 18

autolýza................................................. 41

degradace ............................................. 32

důkazní potenciál ............................. 46

důkazní potenciál nízký, nulový48

kontaminace ....................................... 34

latentní .................................................. 31

mechanismus vzniku ...................... 38

původce................................................. 25

uchovávání .......................................... 37

určení doby vzniku .......................... 42

vyhledávání ......................................... 30

biologický materiál ................................ 18

druhový původ .................................. 23

odběr ...................................................... 33

primární přenos ................................ 44

průkaz lidského původu ............... 23

sekundární přenos .......................... 44

sekundární přenos nepravý ........ 46

sekundární přenos vektorem ..... 45

tkáňový původ ................................... 20

určení množství ................................ 39

za nehty ................................................. 39

zdroje ..................................................... 37

bovinní sérový albumin ................... 131

BSA ........... viz bovinní sérový albumin

bukální stěr ............................................... 26

buňky

pohlavní ..................... viz gametocyty

C

Cambridge Reference Sequence ... 114

CE viz elektroforéza DNA kapilární

205

certifikace ............................................... 179

CODIS STR Loci ..................................... 104

COI gen ..................................................... 197

CVS................................. viz choriocentéza

cytochrom B gen .................................. 197

cytozin .........................................................50

cytozinový pás ...................................... 163

Č

červené krvinky ............. viz erytrocyty

činidlo

chelatační .......................................... 134

D

ddNTP .................. viz dideoxynukleotid

dědičnost

mendelovská ......................................62

mitochondriální DNA .....................68

na nepohlavních chromozómech

.............................................................62

na pohlavních chromozómech ...65

degradace DNA ................... 32, 166, 171

stupeň ................................................. 167

degradovaná DNA ............................... 173

dělení redukční...................... viz meióza

deoxyribonukleová kyselina . viz DNA

deoxyribóza ..............................................50

detekční činidlo

FastBlue ................................................30

Luminol .................................................30

dideoxyribonukleotid ........................ 162

diferenciální lýza ......................... viz lýza

diferenciální

Differex ..................................................... 138

D–klička ................................................... 112

DNA ...............................................................50

báze ........................................................ 50

degradovaná ......................... 166, 168

dvouřetězcová .................................. 51

extragenová........................................ 54

jaderná .................................................. 57

jednořetězcová ................................. 50

mikrobiální ............................ 196, 199

mitochondriální ............................... 57

rostlinná .................................. 196, 198

struktura .............................................. 50

templátová ............................. 148, 150

živočišná ............................................196

DNA databáze ........................................192

obsah ...................................................193

porovnávání .......................... 194, 195

software .............................................195

DNA fingerprinting ............................... 15

DNA polymeráza ..................................147

DNA profil .............. viz genetický profil

DNA profil osoby. viz genetický profil

osoby

drop–in

alelický ................................................172

drop–out

alelický ................................................171

lokusový .............................................171

druh

rostlinný - identifikace ................198

živočišný ............................................196

živočišný - identifikace ...............197

důkaz

vypovídací hodnota ......................184

dvojčata

dizygotní viz dvojčata dvojvaječná

dvojvaječná ................................. 75, 77

fraternální ....................... viz dvojčata

dvojvaječná

identická .......................... viz dvojčata

jednovaječná

jednovaječná ...................................... 73

206

monozygotní .................. viz dvojčata

jednovaječná

E

elektroforetická vana ........................ 155

elektroforetogram ....................159, 162

elektroforéza DNA .............................. 153

gelová ........................................154, 155

kapilární ............................................ 156

endonukleáza ........................................ 134

epigenetické rozdíly ............................. 59

erytrocyty .................................................. 58

ethidiumbromid................................... 142

etnicita ......................... viz původ etnický

etnikum ....................................................... 95

European Standard Set ..................... 104

extrakce DNA ............... viz izolace DNA

F

Fantom z Heilbronnu ........................... 35

fenotyp ........................................................ 58

fenotypový znak viz znak fenotypový

fluorimetr................................................ 142

forenzní světelné zdroje ..................... 30

fragmentace DNA ................................ 167

FTA card .............................. viz FTA papír

FTA papír ................................................ 135

G

GE

ciz elektroforéza DNA gelová .. 154

gel

agarózový ......................................... 155

polyakrylamidový ......................... 155

gen ................................................................. 56

geneta.................................... 70, 72, 73, 77

genetická data

spolehlivost ...................................... 175

technická kvalita............................ 176

uchovávání ....................................... 190

vypovídací hodnota ........... 175, 176

genetický kód

univerzální .......................................... 54

genetický profil ............................... 70, 71

genetický profil konsenzuální ...... 173,

178

genetický profil osoby.......................... 70

genetika....................................................... 13

forenzní ................................................. 13

identifikační ........................................ 14

kriminalistická................................... 13

lékařská................................................. 14

genom .......................................................... 57

geny ............................................................... 54

gonozómy . viz chromozómy pohlavní

guanin .......................................................... 50

H

haplotyp

Y-chromozómu ............. 79, 108, 125

Y-STR ................................................... 105

Y-STR minimální ............................ 105

Y-STR rozšířený ............................. 105

heminy ...................................................... 131

hemizygot ....................................... 67, 105

hemoglobin ............................................ 131

heteropaternální superfekundace viz

superfekundace heteropaternální

heteroplazmie ....................................... 115

heterozygot .................................... 63, 105

heterozygozita ......................................... 65

homozygot ...................................... 63, 105

207

homozygozita ...........................................65

huminové kyseliny.............................. 131

HV1 ............................................................. 113

HV2 ............................................................. 113

HV3 ............................................................. 113

HVR mtDNA................................. 109, 124

alely ...................................................... 114

analýza ............................................... 161

Ch

charakterizace DNA ........................... 128

Chelex–100 ............................................. 134

chimérismus .............................................76

posttransplantační .................. 73, 79

tetragametický .......................... 73, 77

chloroplasty ..............................................58

choriocentéza ...........................................28

chromatinové vlákno ............................53

chromozóm

X 54, 105, 120

Y 54, 65, 66, 105, 120, 121

Y - určení biogeografického

původu ......................................... 125

chromozómy .............................................53

nepohlavní ...........................................54

pohlavní ........................................ 54, 65

chybovost ................................................ 185

zdroje chyb ....................................... 186

I

identifikace

individuální .........................................25

identifikace ................................................69

identifikace

individuální .........................................69

identifikace ................................................70

identifikace

principy ................................................ 99

identifikace

individuální ......................................108

identifikace

individuální ......................................116

identifikace

rostlinných drog ............................198

Identifiler .................................................160

Identifiler Plus ......................................160

Identifiler® Plus Kit ...........................129

inbreeding ................................................. 92

incest ........................................................... 92

individuální identifikace .................... viz

identifikace individuální

individuum

fyzické .................................. viz rameta

genetické ............................. viz geneta

inference ..................................................182

pravděpodobnostních jevů .......176

inferenční logika hodnocení dat ...182

inhibitory .............................. 41, 130, 146

Interpol DNA Gateway ......................195

Interpretace forenzně genetických

dat .........................................................175

izolace DNA ................................. 127, 129

fenol-chloroformová ....................133

chelexová ...........................................134

na FTA papíru..................................135

vazbou na pevnou fázi ................136

izolát

DNA ......................................................130

genový (genetický) .......................130

J

jádro

buněčné ................................................ 57

jedinec

208

fyzický .................................. viz rameta

genetický .............................. viz geneta

Jeffreys, Alec John .................................. 15

K

karyotyp ..................................................... 53

kolonka

silikátová ........................................... 136

koncentrace DNA

hmotnostní ....................................... 140

konsangvinita........................................... 92

kontrolní oblast... viz oblast kontrolní

krevní destičky ............. viz trombocyty

křížení

příbuzenské ............... viz inbreeding

kvalita v laboratoři ............................. 179

kvantifikace DNA .......................128, 140

luminometrická ............................. 145

nespecifická ..................................... 141

specifická ................................141, 143

spektrofotometrická .................... 141

L

laserová mikrodisekce ............. viz LCM

LCM ..................................................137, 139

LCN ............................................................. 170

Likelihood Ratio..... viz věrohodnostní

poměr

lokus ............................................................. 56

mitochondriální ............................. 121

X-chromozomální ......................... 120

Y-chromozomální ......................... 121

lokusy

multialelické ....... viz lokusy vysoce

polymorfní

nepolymorfní ..................................... 60

nízce a středně polymorfní .......... 60

vysoce polymorfní ........ 60, 99, 117

Low–Copy Number ..................... viz LCN

Low–Template DNA ........... viz LT-DNA

LR viz věrohodnostní poměr

LT–DNA .................................................... 170

luminometr ............................................ 145

lýza

buněk .................................................. 132

diferenciální ..................................... 137

lyzát

buněčný .................................. 132, 134

M

marker ......................................................... 57

matroklinita .............................................. 68

meióza ......................................................... 63

melanin .................................................... 131

mikrodisekce

laserová ..................................... viz LCM

mikrochimérismus

fetální ............................................. 73, 79

maternální ................................... 73, 79

mikrokoncentrátor ............................. 132

mikrosatelity ................................. viz STR

mikrovarianta ....................................... 103

mikrovariantní alela ............................ viz

mikrovarianta

minHt . viz haplotyp Y-STR minimální

MiniFiler .................................................. 160

minisatelity ................................ viz VNTR

minisekvenování ................................. 164

miniSTRs ................................................. 168

mitochondriální DNA ...... 57, 112, 124

sekvenace .......................................... 161

určení biogeografického původu

.......................................................... 124

mitom ........................................................... 57

209

mitotyp ........................................................68

mobilita

elektroforetická ............................. 153

motiv

sekvenční .............................................99

mtDNA

viz mitochondriální DNA ..............57

mutace .........................................................61

gametické .............................................61

indukované..........................................61

somatické .............................................61

spontánní .............................................61

N

národ .................................................... 95, 96

narušení struktury DNA ................... 167

násilný kontakt

důkaz ......................................................40

nDNA ............................... viz jaderná DNA

nehty ..................................................... 27, 39

nerovnováha píků ............................... 171

non–human analýza ........................... 196

norma

ISO 17020

1998 ............................................... 180

ISO 17025

2005 ............................................... 180

nucleus ....................... viz jádro buněčné

nukleom ......................................................57

nukleotid ....................................................50

nukleotidová sekvence .. viz sekvence

nukleotidů

nukleotidy

volné .................................................... 147

O

oblast

hypervariabilní .... viz HVR mtDNA,

viz HVR mtDNA

kontrolní ............................................112

pseudoautozomální ........................ 65

okružní testy ..........................................181

OligoGreen ..............................................142

oocyty .......................................... viz vajíčka

oplození ...................................................... 70

organismy

modulární............................................ 72

unitární ................................................. 72

ori H ...........................................................112

otcovství ...................................................119

P

partikule

magnetosilikové .............................136

PCR ........................................ 131, 140, 146

asymetrická ......................................152

fáze denaturační ............................148

fáze hybridizační (anelační) .....149

fáze plató ...........................................150

fáze prodlužovací (elongační,

extenzní) ......................................149

kvantitativní.......................... viz qPCR

monoplex ...........................................151

multiplex ............................................151

negativní vlivy .................................150

nested ..................................................170

reakční směs ....................................147

sekvenační ........................................162

symetrická ........................................152

PicoGreen ................................................142

pigment

indigový .............................................131

210

vlasový a kožní ............................... 131

pík

koktavý ......................... 151, 171, 172

plastidom ................................................... 58

plastidy,....................................................... 58

plodová voda ............................................ 28

plodový materiál .................................... 28

pohlaví osoby

určení ........................................122, 160

polymeráza

prokluz .....................................151, 172

s korektorskou funkcí ................. 151

polymerázová řetězová reakce ...... viz

PCR

polymorfismus ........................................ 59

bodový ........................................ viz SNP

jednonukleotidový ............... viz SNP

poly–T řetězec ...................................... 166

pomůcky

DNA-free ............................................... 34

ochranné .............................................. 35

sterilní ................................................... 34

PowerPlex 16 ........................................ 160

PowerPlex 18D Kit ............................. 129

PowerPlex 21 ........................................ 160

PowerPlex Y ........................................... 160

PowerPlex Y23 ..................................... 160

pravidlo komplementarityviz princip

komplementarity

predikce

biogeografického původu ............ 95

fenotypu ............................................... 97

Prep–n–GoTM Buffer ........................... 130

primer .............................................147, 152

prodloužení ...................................... 165

princip komplementarity ................... 52

proband ...................................................... 87

proficienční testy ................................ 181

proteosyntéza .......................................... 55

Prümská úmluva.................................. 195

pryskyřice

iontoměničová ................................ 134

příbuznost

biologická ..................................... 14, 80

pokrevní ............... viz konsangvinita

principy určení ............................... 117

stupeň .................................................... 80

půdní vzorky.......................................... 199

purifikace DNA ..................................... 131

původ

biogeografický ........................ 95, 124

etnický ................................................... 95

Q

qPCR ............................................... 146, 167

QuantiBlot Human DNA Quantitation

Kit ......................................................... 145

R

rameta................................... 70, 72, 73, 77

rasa ................................................................ 95

rCRS .............. viz Cambridge Reference

Sequence

reparace DNA ........................................ 168

repetice ..........viz sekvence repetitivní

rozptýlená ............................................ 99

tandemová ........................................... 99

tandemové dlouhé ............ viz VNTR

tandemové krátké ................. viz STR

ribonukleová kyselina.............. viz RNA

RNA ............................................................... 55

rozptýlená repetice ........... viz repetice

rozptýlená

211

Ř

řídící oblast............ viz oblast kontrolní

S

sekvenace ................................................ 197

sekvenátor .............................................. 157

sekvence

nukleotidů ...........................................51

repetitivní ............................................99

silika........................................................... 136

slot blot hybridizace .......................... 144

SNaPshot ................................................. 164

SNP .................................................. 108, 109

alely ...................................................... 110

analýza ............................................... 164

autozomální ..................................... 110

identifikace ....................................... 111

určení biogeografického původu

.......................................................... 125

X-chromozomální .......................... 110

Y-chromozomální .......................... 111

spermie ............................................... 58, 70

srovnávací vzorky

mrtvá osoba ........................................29

pohřešovaná osoba .........................29

srovnávací vzorky

typy .........................................................26

SRY ............................................................. 123

SSO ................................................... 161, 163

SSR ...................................................... viz STR

starodávná DNA ......................................14

stochastické efekty ............................. 171

STR .................................................. 100, 197

alely ...................................................... 102

analýza ............................................... 168

autozomální ................ 105, 106, 117

genotyp .............................................. 105

klasifikace .........................................102

lokusy doporučené sety .............104

X-chromozomální ............... 105, 107

Y-chromozomální ............... 105, 108

základní motiv ..................... 100, 102

STR lokus

analýza ................................................158

stutter peak .................... viz pík koktavý

superfekundace

heteropaternální .............................. 76

SwabSolution Kit .................................130

syntéza bílkoviny ... viz proteosyntéza

T

tandemová repetice ........... viz repetice

tandemová

terminátor .................................... 162, 165

termocyklér ................ viz thermocycler

thermocycler .........................................147

transkripce ............................................... 55

transplantace ........................................... 79

kostní dřeně ....................................... 80

trifosfát ....................................................... 50

trombocyty ............................................... 58

tymin............................................................ 50

U

U.S. Core Loci .........................................104

účinnost

separační ...........................................129

V

vajíčka ......................................................... 58

vajíčko ......................................................... 70

212

validace .................................................... 181

verifikace ................................................. 181

věrohodnostní poměr ....................... 184

vícerčata

jednovaječná .................. viz dvojčata

jednovaječná

vícevaječná ...................... viz dvojčata

dvojvaječná

VNTR ................................................. 99, 100

výtěžnost

izolace ................................................. 130

Y

Y–filer........................................................ 160

Z

zkoncentrování izolátu DNA .......... 132

zkouška

orientační ............................................. 21

specifická.............................................. 21

znak

fenotypový ................................ 96, 126

ztráta alely ............................ viz drop-out

zygota ................................................... 63, 70