Borrelia Canis WB IgG, IgM

MIKROGEN Gebrauchsinformation recomBlot Borrelia canis IgG IgM

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recomBlot Borrelia canis IgGrecomBlot Borrelia canis IgMImmunoblot-Test mit rekombinant produzierten und gelelektrophoretisch aufgetrennten Antigenen zurBestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B.afzelii in caninem Serum oder Plasma.

1. AllgemeinesDer recomBlot Borrelia canis ist ein qualitativer in vitro Test zum Nachweis und zur sicherenIdentifizierung von IgG- bzw. IgM-Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi in caninem Serum oderPlasma. Der recomBlot Borrelia canis wird zur Bestätigung von im Screening Test positiven Probenverwendet. Der Test erlaubt durch die elektrophoretische Auftrennung der Antigene, im Unterschied zuEnzymimmunoassays oder IFT, eine sichere Identifizierung und Lokalisation von spezifischenAntikörpern. Antikörper gegen bestimmte Antigene können zusätzliche Hinweise auf das Stadium derInfektion geben.

2. Borrelia burgdorferi und canine Lyme BorrelioseDas zur Familie der Spirochaetaceae gehörende Bakterium Borrelia burgdorferi ist das aetiologischeAgens der Lyme Borreliose. Der Erreger wurde 1982 von W. Burgdorfer und A. Barbour entdeckt undcharakterisiert. Als Überträger werden verschiedene Zecken-Arten der Gattung Ixodes genannt. InEuropa ist dies die Schildzecke Ixodes ricinus. Die Lyme Borreliose ist weltweit die häufigste durchZecken übertragene Infektionskrankheit von Mensch und Haustier. Untersuchungen zurDurchseuchungsrate von Ixodes ricinus mit Borrelia burgdorferi zeigten in verschiedenengeographischen Regionen in Deutschland unterschiedliche Ergebnisse: So beträgt der Infektionsindex inBayern (Isarauen) 34% und in Thüringen 30%, während für Niedersachsen Werte zwischen 9% und13% angegeben werden.Die Lyme Borreliose beim Menschen wurde 1977 von A. Steere in den USA beschrieben. Ähnlichvielgestaltig wie beim Mensch sind die klinischen Symptome der Borreliose beim Hund:• Gestörtes Allgemeinbefinden, Fieber, Schmerzen, Apathie und Anorexie (ca. 48%)• Akute und chronische rezidivierende Mono- und Polyarthritis (ca. 20%) • Unklare Lahmheit (ca. 48%)• Neurologische Ausfallerscheinungen, wie z. B. Ataxie, Muskeltremor, Tortikollis, HWS-Syndrom,

Tetraplegie (ca. 24%)• Hautveränderungen, verbunden mit Pyodermie, Erythem und Juckreiz (ca. 8%)• seltene Symptome sind Lymphadenopathie, Myocarditis, Myositis, Iritis, Panophtalmie,

Glomerulonephritis u.a.Die vielgestaltige Symptomatik der caninen Borreliose stellt, neben der Ähnlichkeit mit den klinischenErscheinungen anderer Erkrankungen des Hundes, eine große Herausforderung an die Diagnostik dar.

3. DiagnostikDie direkte Kultivierung von Borrelia burgdorferi (Erregernachweis) ist der sicherste Beweis für eineInfektion. Der Erregernachweis aus Hautproben gelingt in 50 - 70 % der Fälle mit Hautmanifestationen,die bei Hunden aber wegen der Fellkleider schwer zu lokalisieren sind. Die Anzüchtung ist allerdingsschwierig und sehr zeitaufwändig und bleibt somit Speziallabors vorbehalten.Die serologische Untersuchung ist daher die praktikabelste Lösung für das Routinelabor. Der indirekteImmunfluoreszenz-Test (IFT), der indirekte Hämagglutinationstest (IHA), sowie Enzymimmunoassays(EIA) werden eingesetzt. Der serologische Befund ist abhängig vom Stadium der Erkrankung, der Dauerder Symptome und einer eventuell schon erfolgten Antibiotikatherapie oder Vakzinierung gegen Borreliaburgdorferi. Der Immunoblot weist gegenüber den genannten immunologischen Verfahren zusätzliche Kriterienhinsichtlich Sensitivität und Spezifität auf. Er ermöglicht den Nachweis und die Identifizierung von IgM-und IgG-Antikörpern und dient, wenn er als Ergänzungstest verwendet wird dazu, die Ergebnisse derindirekten Immunfluoreszenz und des Enzymimmunoassays zu bestätigen.

recomBlot Borrelia canis IgG IgM Gebrauchsinformation MIKROGEN

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Die Verwendung unterschiedlicher Borrelia burgdorferi Stämme als Antigen kann zu unterschiedlichenEIA-Testergebnissen führen. Im Frühstadium versagen die angeführten Teste oftmals. Darüber hinauskann die Serodiagnostik der caninen Borreliose durch Kreuzreaktionen mit anderen Spirochaeten, wie z.B. Leptospira interrogans, oralen und intestinalen Treponemen, aber auch durch weit entfernt verwandteBakterien wie z.B. E.coli gestört werden. Da die Testantigene im allgemeinen aus Lysaten des gesamtenErregers bestehen, werden auch Antikörper gegen sogenannte "common antigens" erfasst. Dabeihandelt es sich um weit verbreitete und in ihrer Sequenz stark konservierte Proteine, wie zum Beispielden "heat shock" Proteinen.Eine Möglichkeit, die genannten Einschränkungen zu umgehen, ist die Verwendung vongentechnologisch erzeugten Antigenen, wie sie von MIKROGEN in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. B.Wilske und Prof. V. Preac-Mursic am Max von Pettenkofer-Institut entwickelt wurden.

4. TestprinzipFür den recomBlot Borrelia canis werden spezifische Borrelia burgdorferi Antigene mit Hilferekombinanter E. coli Zellen hergestellt. Die Verwendung rekombinanter Proteine bietet als Vorteile gegenüber den herkömmlichen Lysatblotsdie Möglichkeit der Präsentation von Proteinen, die primär in vivo exprimiert werden (z.B. VlsE) sowiezur Kombination von Proteinen von verschiedenen Borrelien-Genospezies. Darüber hinaus wird durchdie selektive Auswahl von spezifischen und für die sensitive serologische Diagnostik wichtigen Antigeneder Einfluss von störenden oder kreuzreagierenden Antigenen minimiert. Im Gegensatz zum rekombinanten Blot bleiben beim Immunoblot mit Lysat-Antigen aus Borreliaburgdorferi Zellen die Antigene p100, p39, p18 und VlsE unterrepräsentiert. Dies gilt um so mehr für dasOspC-Antigen. Es wird nicht oder nur in sehr geringen Mengen von dem Borrelia burgdorferi Stamm B31gebildet. Zudem kann im Lysatblot wegen der Vielzahl möglicher Banden die Unterscheidung vonimmunrelevanten Banden und sog. common antigens, z.B. den heat shock Proteinen, sehr erschwertsein.Verwendet werden im recomBlot Borrelia canis neben den äußeren Membran-Proteinen OspA (31kD)und OspC (22kD), die sehr spezifischen Borrelia burgdorferi Antigene p100, VlsE, p39 und p18 (=Decorin binding protein A, DbpA, = Osp17), des weiteren p41 (Flagellin) und ein spezifischer internerTeil des p41 Antigens – p41/i. OspC, p18 und VlsE sind in vivo-Proteine, die in Kultur nicht oder nur in geringen Mengen exprimiertwerden. Die rekombinante Technik bietet somit die Möglichkeit, diese Antigene in ausreichendenMengen anzubieten. Gleichzeitig können homologe Proteine von verschiedenen Genospezies in einemTest angeboten werden. Dies kommt hauptsächlich bei sehr heterogenen Proteinen wie dem OspC unddem VlsE zum Tragen. Im recomBlot Borrelia canis werden die OspCs aller drei Genospeziesangeboten und darüber hinaus von zwei verschiedenen Stämmen der Genospezies B. garinii, StammT25 (OspA Serotyp 7) und Stamm 20047 (OspA Serotyp 0), im folgenden als OspC von B. garinii 1 undB. garinii 2 bezeichnet.Neben der sicheren Bestätigung von Antikörpern gegen sämtliche Borrelien- Genospezies bietet derrekombinante Immunoblot Anhaltspunkte zur Unterscheidung zwischen Vakzinierung und Infektion.Während gegen das OspA nach einer Infektion nur sehr selten Antikörper gebildet werden, entstehendiese nach einer Impfung fast immer in hoher Konzentration. Im Gegensatz dazu finden sich Antikörpergegen VlsE fast ausschließlich bei Infektionsverläufen infolge von Zeckenbissen, kaum dagegen nacheiner Vakzinierung. Zum Nachweis von Borrelien-spezifischen Antikörpern werden die Streifen mit der verdünntenSerumprobe inkubiert, wobei die Antikörper sich an die Antigene auf den Streifen anlagern. Nichtgebundene Antikörper werden anschließend abgewaschen und die Streifen in einem zweiten Schritt mitanti-Hund-IgG bzw. –IgM inkubiert, das mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist. Mit einer durch diePeroxidase katalysierten Färbereaktion werden spezifisch gebundene Antikörper nachgewiesen. Fallseine Reaktivität gegen eines der Borrelien-Proteine gefunden wird, erscheint diese als dunkle Bande aufdem Streifen.Als Reaktionskontrolle ist am oberen Ende der Streifen - unter der Nummer - eine Bande mit anti-Immunglobulin aufgetragen, die bei jedem Serum eine Reaktion zeigen muss.


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5. PackungsinhaltDie Reagenzien einer Packung reichen für 20 Bestimmungen.Jeder Reagenziensatz enthält:

100 ml Waschpuffer (fünffach konzentriert)Enthält Tris-Puffer, NaCl, Detergenz, Konservierungsmittel und Protein

45 ml Chromogenes Substrat Tetramethylbenzidin (TMB, gebrauchsfertig)

2 Stück Inkubations-Schalen mit je 10 Vertiefungen

1 Vorentwickelter Kontrollstreifen (kitspezifisch)

1 Gebrauchsinformation

1 Auswertebogen

5.1. recomBlot Borrelia canis IgGJeder Reagenziensatz enthält zusätzlich zu den unter Punkt 5 aufgeführten Komponenten:

2 Stück Röhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Western-Blot-Teststreifen,beschichtet mit rekombinant hergestellten Borrelia burgdorferi-Antigenen

40 µl Schwachpositiv Serumkontrolle IgG (Weiße Verschlusskappe)Caniner Ursprung, enthält 0,1% MIT und 0,1% Oxypyrion

40 µl Anti-Hund IgG Konjugat (Grüne Verschlusskappe)Aus Kaninchen, enthält NaN3.

5.2. recomBlot Borrelia canis IgMJeder Reagenziensatz enthält zusätzlich zu den unter Punkt 5 aufgeführten Komponenten:

2 Stück Röhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Western-Blot-Teststreifen,beschichtet mit rekombinant hergestellten Borrelia burgdorferi-Antigenen

40 µl Schwachpositiv Serumkontrolle IgM (Gelbe Verschlusskappe)Caniner Ursprung, enthält 0,1% MIT und 0,1% Oxypyrion

65 µl Anti-Hund IgM Konjugat (Lila Verschlusskappe)Aus Kaninchen, enthält NaN3

6. Zusätzlich benötigte Reagenzien und erforderliches ZubehörDeionisiertes Wasser, Absaugsystem mit Desinfektionsfalle, Mikropipetten, Plastikpinzette, Schüttler,Messzylinder.


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7. Hinweise zum Test und den Reagenzien7.1. Vorsichtsmaßregeln Seren und Plasma sind als potentiell infektiös zu behandeln. Während des gesamten Testablaufs müssen geeignete Einmalhandschuhe getragen werden. Die Konjugate enthalten Natriumazid. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu

vermeiden. Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Berührung kommen,

müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens 1 Stunde bei 121°Cautoklaviert werden.

Inkubationsschalen nur einmal verwenden. Streifen vorsichtig mit einer Plastikpinzette handhaben.

7.2. Hinweise zur Handhabung Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2°C - 8°C lagern, nicht einfrieren. Vor Testbeginn sind alleBestandteile für mindestens 30 Minuten auf 18°C - 25°C (Raumtemperatur) zu temperieren. DieTestdurchführung erfolgt ebenfalls bei Raumtemperatur.Vor Gebrauch die Kontrollseren sowie die konzentrierten Konjugate gut durchmischen. DiePatientenseren ebenfalls gut mischen.Das Röhrchen mit den Teststreifen ist erst unmittelbar vor Gebrauch zu öffnen, um eineKondenswasserbildung zu vermeiden. Die nicht benötigten Streifen verbleiben im Röhrchen und werdenweiterhin bei 2°C - 8°C gelagert (Röhrchen wieder gut verschließen, Teststreifen dürfen vorVersuchsbeginn nicht feucht werden!). Die Schwachpositiv Kontrolle muss bei jedem Versuchsdurchgang unabhängig von der Anzahl der zutestenden Seren mitgeführt werden. Nur so ist die korrekte Testinterpretation möglich.Die Packungen tragen ein Verfallsdatum, nach dessen Erreichen keine Qualitätsgarantie mehrübernommen werden kann.Es dürfen nur Einzelreagenzien verwendet werden, deren Chargennummer mit der entsprechendenChargennummer auf dem Etikett der Kitverpackung übereinstimmt.Der Test ist nur von geschultem und autorisiertem Fachpersonal durchzuführen.Bei substantiellen Änderungen am Produkt, bzw. der Anwendungsvorschrift kann die Anwendungaußerhalb der von MIKROGEN vorgegebenen Zweckbestimmung liegen.Automatisierung ist möglich, nähere Informationen erhalten Sie von MIKROGEN.

7.3. Herstellung der Lösungen7.3.1. Herstellung des gebrauchsfertigen WaschpuffersDieser Puffer wird für die Serum- und Konjugatverdünnung sowie die Waschschritte benötigt.Vor dem Verdünnen ist das Volumen des Waschpuffers für die entsprechende Anzahl derdurchzuführenden Teste zu bestimmen. Der Waschpuffer ist direkt vor der Verwendung herzustellen.Das Waschpuffer-Konzentrat enthält eine lösliche Proteinkomponente. Das Aufschütteln des Puffers istnicht notwendig. Ein Teil des Waschpuffer-Konzentrats wird mit vier Teilen deionisiertem Wasser verdünnt (Verdünnung1 + 4). Die benötigten Mengen sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Volumina für in der Tabelle nichtaufgeführte Streifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln.Nicht benötigter, gebrauchsfertiger Waschpuffer muss verworfen werden.


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Tabelle 1: Waschpuffer pro eingesetzte Teststreifen

eingesetzteTeststreifen

Waschpuffer-Konzentrat

DeionisiertesWasser

gebrauchsfertigerWaschpuffer

1 5 ml 20 ml 25 ml2 10 ml 40 ml 50 ml3 15 ml 60 ml 75 ml5 25 ml 100 ml 125 ml

10 50 ml 200 ml 250 ml15 75 ml 300 ml 375 ml20 100 ml 400 ml 500 ml

7.3.2. Herstellung der KonjugatlösungenDie Konjugatlösung für die IgG- bzw. IgM- Bestimmung ist direkt vor Gebrauch herzustellen, eineLagerung der gebrauchsfertigen Konjugatlösung ist nicht möglich.Pro Teststreifen werden 1,5 µl Anti-Hund IgG Konjugat auf 2 ml gebrauchsfertigen Waschpufferverwendet (1: 1333). Pro Teststreifen werden 3 µl Anti-Hund IgM Konjugat auf 2 ml gebrauchsfertigen Waschpuffer verwendet(1: 667) Die in Tabelle 2 aufgeführten Mengen sind einzusetzen. Volumina für in der Tabelle nicht aufgeführteStreifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln.Tabelle 2: Volumina der Anti-Hund-IgG und IgM-Konjugat-Verdünnung

EingesetzteTeststreifen

IgG-Konjugat-Konzentrat

IgM-Konjugat-Konzentrat

GebrauchsfertigerWaschpuffer

1 1,5 µl 3 µl 2 ml2 3,0 µl 6 µl 4 ml3 4,5 µl 9 µl 6 ml5 7,5 µl 15 µl 10 ml

10 15,0 µl 30 µl 20 ml15 22,5 µl 45 µl 30 ml20 30,0 µl 60 µl 40 ml

* Die Mengen sind ohne Totvolumen berechnet. Je nach Abarbeitung (manuell bzw. an einem Gerät) bitte zusätzlicheKonjugatlösung für 1 bis 3 Streifen ansetzen.

7.3.3. SubstratlösungDas Substrat ist gebrauchsfertig! Vor Beginn der Färbung auf Raumtemperatur (18°C - 25°C) bringen.Eine Kontamination der nicht verwendeten Substratlösung durch unsterile Pipettenspitzen etc. mussunbedingt vermieden werden, da dadurch die Sensitivität des Testes beeinträchtigt werden kann.

7.4. Lagerung und HaltbarkeitDie Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2°C - 8°C lagern.Gebrauchsfertiger Waschpuffer kann nicht gelagert werden.Die Konjugatlösung muss immer frisch zubereitet werden.


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8. ProbenmaterialDas Probenmaterial kann Serum oder Plasma sein, das nach Entnahme möglichst rasch vomBlutkuchen getrennt wurde. Hitzeinaktivierte Proben können zu erhöhten Hintergrundreaktionen führen.Eine mikrobielle Kontamination der Probe ist unbedingt zu vermeiden. Unlösliche Stoffe sind vor derInkubation durch Zentrifugation aus der Probe zu entfernen. Die Verwendung von lipämischen, hämolytischen oder trüben Proben kann einen dunklen Hintergrundim recomBlot Borrelia canis IgG/IgM ergeben. Diese Proben können darüber hinaus zu verfälschtenErgebnissen führen und sollten daher nicht verwendet werden.Achtung!Sollen die Bestimmungen nicht sofort erfolgen, kann das Probenmaterial bis zu 2 Wochen bei2°C - 8°C aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung der Proben ist durch Aufbewahrung bei -20°C oder tiefer möglich. Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben wird wegen derGefahr fehlerhafter Resultate nicht empfohlen.

9. Testdurchführung

9.1. AllgemeinesDie Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hängt in starkem Maße vom gleichmäßigen Waschen derStreifen ab. Die unter 9.3 und 9.5 beschriebenen Waschfrequenzen sollen deshalb immer eingehaltenwerden.

9.2. Inkubation der Proben1. Für jeden Testansatz wird eine Vertiefung einer Inkubationsschale benötigt. In die Vertiefungen

werden je 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers pipettiert. 2. Probenzugabe

IgG- und IgM-Testdurchführung: 8 µl einer unverdünnten Probe (Hundeserum oder -plasma) bzw.der entsprechenden Schwachpositiv Kontrolle werden in die dafür vorgesehenen Vertiefungenpipettiert (Verdünnung 1 + 250).Die beiden Flüssigkeiten werden durch vorsichtiges horizontales Schütteln homogenisiert.

3. Einlegen der TeststreifenIn die nun mit Waschpuffer-Proben-Gemisch gefüllten Vertiefungen wird vorsichtig je einTeststreifen mit Hilfe einer Plastikpinzette eingetaucht. Die Streifennummerierung zeigt nach oben.Es sollte darauf geachtet werden, das durch die Pinzette keine Flüssigkeiten verschleppt werden. Achtung! Die Streifen müssen vollständig mit dem Waschpuffer-Proben-Gemisch benetzt unduntergetaucht sein. Verwendete Röhrchennummer und Streifennummer im Auswertebogen notieren.Probennummern und zu detektierende Immunglobulinklasse (IgG oder IgM) im Auswertebogennotieren. Die Inkubationsschale wird mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt und unter leichtem Schütteln2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Achtung! Es ist darauf zu achten, dass die Inkubationslösungen nicht in andere Vertiefungenverschleppt werden; insbesondere beim Öffnen und Schließen des Deckels sind Spritzer zuvermeiden.


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9.3. Waschen1. Nach der Inkubation wird der Kunststoffdeckel vorsichtig von den Inkubationsschalen abgenommen.2. Die Serumverdünnung wird vorsichtig aus den einzelnen Vertiefungen abgesaugt.

Achtung! Nach dem Absaugen der Lösungen aus einer Vertiefung sind die Pipettenspitzen zuwechseln oder nach jedem Absaugvorgang gut mit deionisiertem Wasser zu spülen, da dieGefahr einer Verschleppung besteht.Bei maschineller Abarbeitung sind diesbezüglich die Hinweise des Geräteherstellers zubeachten.

3. In jede Vertiefung werden anschließend 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers gegeben und für5 Minuten unter leichtem Schütteln auf dem Schüttler gewaschen. Nach dem Waschvorgang wirdder Waschpuffer abgesaugt.

4. Der Waschschritt unter Punkt 3 wird insgesamt viermal durchgeführt.

9.4. Inkubation mit Peroxidase-KonjugatNach dem Waschen der Streifen werden in jede Vertiefung 2 ml der entsprechend vorbereitetenKonjugatlösung (siehe Tabelle 2) gegeben und 1 Stunde unter leichtem Schütteln bei Raumtemperaturinkubiert. Dabei wird die Inkubationsschale mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt.

9.5. WaschenDie Konjugatlösungen werden aus den Vertiefungen abgesaugt und die Streifen erneut gewaschen(vergleiche 9.3).

9.6. SubstratreaktionIn jede Vertiefung werden 1,5 ml Substratlösung gegeben und 5 - 10 Minuten unter leichtem Schüttelnund unter Beobachtung bei Raumtemperatur inkubiert.

Achtung!Den Färbungsprozess beobachten, und alle Streifen so lange in der Substratlösung belassen, bisbei den mit der Schwachpositiven Serumkontrolle inkubierten Streifen folgende Banden zuerkennen sind:bei der IgG-Detektion p100bei der IgM-Detektion p41 Bei hochpositiven Seren kann es zu einer Überreaktion der Färbung kommen. Es wirdempfohlen, bei solchen Streifen die Färbung vorzeitig zu beenden.

9.7. Abstoppen der Reaktion1. Nach Absaugen der Substratlösung werden die Streifen dreimal kurz mit deionisiertem Wasser

gewaschen.2. Die Streifen werden vorsichtig mit einer Plastikpinzette aus dem Wasser entnommen und zum

Trocknen für ca. 2 Stunden zwischen 2 Lagen saugfähigen Papiers gelegt. Anschließend könnendie Streifen auf dem beigelegten Auswertebogen aufgeklebt und die Ergebnisse protokolliertwerden.

3. Die Streifen sollten vor Licht geschützt aufbewahrt werden.


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10. Zusammenfassung der Testdurchführung

1. alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen.

2. 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer einpipettieren

3. jeweils 8 µl von der Probe bzw. Schwachpositiv Kontrolle einpipettieren, vorsichtighomogenisieren

4. vorsichtig die Streifen einlegen, die Streifen müssen komplett untergetaucht sein.

5. Mit dem Deckel abdecken und 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schüttelninkubieren

6. den Deckel vorsichtig abnehmen und die Flüssigkeit aus den Vertiefungen absaugen(Verschleppung vermeiden!).

7. viermal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schüttler waschen

8. 2 ml gebrauchsfertige Konjugatlösung zugeben und 1 Stunde unter leichtem Schüttelnabgedeckt inkubieren

9. viermal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schüttler waschen

10. 1,5 ml der Substratlösung zugeben; 5 - 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtemSchütteln inkubieren. Sollbanden siehe 9.6.

11. mindestens dreimal mit deionisiertem Wasser waschen

12. 2 Stunden zwischen 2 Lagen saugfähigen Papiers trocknen und das Ergebnis ablesen

11. Auswertung

11.1. Bewertung der Bandenintensität1. Bei jeder Testdurchführung muss unabhängig von der Anzahl der Proben die Schwachpositiv-

Serumkontrolle mitgeführt werden. Die Schwachpositive Serumkontrolle dient zur Abgrenzung derReaktivität von der Hintergrund-Reaktivität (Cutoff).

2. Notieren Sie im beigefügten Auswertebogen Datum, Chargen- und Röhrchen-Nummer, sowie diedetektierte Antikörperklasse.

3. Tragen Sie die Proben-Identifizierungs-Nummern in das Protokollblatt ein.4. Kleben Sie nun mit einem Klebestift die dazugehörigen Teststreifen in die entsprechenden Felder

des Auswertebogens. Richten Sie dazu die Teststreifen mit der Inkubations-Kontrollbande an dereingezeichneten Markierungslinie aus. Kleben Sie dann mit einem durchsichtigen Klebeband dieTeststreifen links von der Markierungslinie an. Flächiges Ankleben der ganzen Teststreifen mitKlebestift oder Klebeband kann zu Veränderungen der Färbung führen.

5. Den vorentwickelten Kontrollstreifen mit den markierten Antigenbanden zur Orientierung an dieaufgeklebten Teststreifen legen, und die reagierenden Banden identifizieren. Der vorentwickelteKontrollstreifen ist kitspezifisch und stammt aus demselben Nitrozellulose-Block wie die Teststreifenim Testkit. Die Molekulargewichte bzw. die Bezeichnungen der Antigenbanden sind markiert.

6. Die Bandenintensitäten auf dem Probenstreifen werden im Vergleich zur Schwachpositiv-Kontrollegesondert für jede Immunglobulinklasse bewertet (s. 11.2 bzw. Tabelle 3) und in den Auswertebogeneingetragen.


11.2. KontrollergebnisseDas Mitführen der Schwachpositiv Kontrolle ist unerlässlich. Dabei sollen die Testbedingungen(Sensitivität) geprüft und die Reaktivität mit den einzelnen Antigenbanden bestätigt werden. DieLokalisation der Banden muss mit dem beigefügten Kontrollstreifen übereinstimmen.Die Kontrollbande unterhalb der Streifennummer dient zur Überprüfung der Testdurchführung, und mussin jedem Fall eine deutliche Färbung zeigen.Die mit der Schwachpositiv-Serumkontrolle inkubierten Teststreifen sollen nachfolgende Bandenmusteraufzeigen. • IgG-Schwachpositiv-Kontrolle:

p100 p41 p39 OspA OspC p41/i p41/i p18

i i1 u lii 2

Reaktions-Ktr.

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Es sollen folgende Banden zu sehen sein: InkubationskontrSchwache Reaktivität gegen andere Antigene kann vorhand

Zur Bewertung der Bandenintensitäten wird beim ISchwachpositiv Kontrolle IgG herangezogen.

• IgM-Schwachpositiv-Kontrolle:

Es sollen folgende Banden zu sehen sein: InkubationskontrSchwache Reaktivität gegen andere Antigene kann vorhand

Zur Bewertung der Bandenintensitäten wird beim Schwachpositiv Kontrolle IgM herangezogen.

Tabelle 3: Bandenintensität

Banden

keine Reaktion

geringere Intensität als bei der Schwachpositiv- Kontrolle

gleiche Intensität wie bei der Schwachpositiv- Kontrolle (Cu

stärkere Intensität als bei der Schwachpositiv- Kontrolle

11.3. Testergebnisse und TestinterpretationZur sicheren und einfachen Testauswertung wurde auf Grmathematischen Analyse eine Punktebewertung der B. bcanis durchgeführt. Darauf basierend kann das Testerganschließende Beurteilung erhalten werden.

.gar

ini

.afz

eli

B. g

arin

ii

B. s

ensu

stri

c. a

fze

arin

ii

p100 p41 p39 OspA OspC

B. g

arin

ii 1

B. s

ensu

stri

cu

Reaktions-Ktr.

olle, p100en sein.gG-Test die Intensität der p100-Bande der

B B

+ B

B. g

p41/i p41/i p18.g

arin

ii

.afz

elii

. afz

elii

arin

ii 2

olle, p41en sein.IgM-Test die Intensität der p41-Bande der

Intensität

toff)

-

+/-

+

++

und von klinischen Evaluierungen und einerurgdorferi-Antigene im recomBlot Borreliaebnis durch Summierung der Punkte und

B B

+ B

B. g


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11.3.1. IgG-TestauswertungDas Testergebnis erhält man durch Addition der entsprechenden Punktwerte der einzelnen Banden(Tabelle 4 und Tabelle 5) Die resultierende Summe wird in die Spalte mit dem Summenzeicheneingetragen. Die positive, fragliche oder negative Beurteilung der Probe kann dann direkt bestimmt undin die Spalte Beurteilung eingetragen werden. Dabei ist es unerheblich, wie stark die Reaktionausgefallen ist, die Punktwerte sind für die + und ++ Reaktion gleich. Zu beachten ist, dass für dieReaktion der OspCs nur einmal der Punktwert berechnet werden darf, unabhängig davon, welcheund wie viele der drei OspCs reagieren.Die positive, fragliche oder negative Beurteilung der Probe kann dann direkt bestimmt und in die SpalteBeurteilung eingetragen werden.

Tabelle 4: Punktebewertung der B. burgdorferi-Antigene im recomBlot Borrelia canis IgGProtein/ Antigen

Molekulargewicht [kDa]Name Funktion/ Herkunft Punkte

100 p100 B. afzelii 8

66* VlsEFusionsprotein, repräsentiert die

immundominanten VlsE-Epitope vonverschiedenen Genospezies

4

41 p41Flagellin

B. burgdorferi sensu stricto1

39 BmpA B. afzelii 8

31 OspAOberflächenprotein

B. afzelii4

22 OspC

OberflächenproteinB. garinii 1,

B. afzelii, B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii 2

6

20 p41/iSpezifischer interner Teil des Flagellins

Stamm B. garinii1

18,5 p41/iSpezifischer interner Teil des Flagellins

Stamm B. afzelii1

18 p18Oberflächenprotein

B. afzelii8

*Das VlsE wird als 40 kDa Lipoprotein beschrieben. Im recomBlot Borrelia canis liegt VlsE als Fusionsprotein mit66 kDa vor.

Tabelle 5: Beurteilung der Testergebnisse IgG

Summe der Punkte Beurteilung IgG< 5 negativ

5 - 6 fraglich

> 6 positiv


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11.3.2. IgM-TestauswertungDas Testergebnis erhält man durch Addition der entsprechenden Punktwerte der einzelnen Banden(Tabelle 6 und Tabelle 7). Die resultierende Summe wird in die Spalte mit dem Summenzeicheneingetragen. Die positive, fragliche oder negative Beurteilung der Probe kann dann direkt bestimmt undin die Spalte Beurteilung eingetragen werden. Dabei ist es unerheblich, wie stark die Reaktionausgefallen ist, die Punktwerte sind für die + und ++ Reaktion gleich. Zu beachten ist, dass für dieReaktion der OspCs nur einmal der Punktwert berechnet werden darf, unabhängig davon, welcheund wie viele der drei OspCs reagieren.Die positive, fragliche oder negative Beurteilung der Probe kann dann direkt bestimmt und in die SpalteBeurteilung eingetragen werden.

Tabelle 6: Punktebewertung der B. burgdorferi-Antigene im recomBlot Borrelia canis IgMProtein/ Antigen

Molekulargewicht [kDa]Name Funktion/ Herkunft Punkte

100 p100 B. afzelii 1

66* VlsEFusionsprotein, repräsentiert die

immundominanten VlsE-Epitope vonverschiedenen Genospezies

6

41 p41Flagellin

B. burgdorferi sensu stricto0

39 BmpA B. afzelii 3

31 OspAOberflächenprotein

B. afzelii4

22 OspC

OberflächenproteinB. garinii 1,

B. afzelii, B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii 2

8

20 p41/ispezifischer interner Teil des Flagellins

Stamm B. garinii1

18,5 p41/ispezifischer interner Teil des Flagellins

Stamm B. afzelii1

18 p18Oberflächenprotein

B. afzelii3

*Das VlsE wird als 40 kDa Lipoprotein beschrieben. Im recomBlot Borrelia canis liegt VlsE als Fusionsprotein mit66 kDa vor.

Tabelle 7: Beurteilung der Testergebnisse IgM

Summe der Punkte Beurteilung IgM< 7 negativ

7 fraglich

> 7 positiv


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11.4. Hinweise zur InterpretationEin negatives recomBlot Borrelia canis-Testresultat kann eine Infektion mit Borrelia burgdorferi nichtin jedem Fall ausschließen. Insbesondere in der frühen Infektionsphase können Antikörper noch nichtoder in nicht nachweisbarer Menge vorhanden sein. Antibiotikabehandlung im frühen Stadium kann eineBildung von nachweisbaren Antikörpern verhindern. Bei klinischem Verdacht auf Lyme Borreliose undnegativem bzw. fraglichem Serumbefund sollte nach drei Wochen eine erneute Probenentnahme undTestung erfolgen.Bei Proben aus der frühen Infektionsphase überwiegen in der Regel Antikörper der IgM-Klasse. Für diefrühe Immunantwort (IgM) kann eine Reaktion mit OspC und p41, aber auch VlsE auftreten. Bei Serenaus späten Stadien der Infektion (IgG) kommt es, neben der auch hier auftretenden Reaktion von OspCund p41, zumeist zu einer starken Reaktion mit p100 und oft auch VlsE. Die Antikörperbildung kanndurch Borrelioseschutzimpfungen beeinflusst werden. Dabei werden in der Regel Antikörper gegenOspA gebildet, die bei natürlichen Infektionen nur selten auftreten.Ein positives Ergebnis im recomBlot Borrelia canis IgG bedeutet nicht in jedem Fall, dass eine aktiveLyme Borreliose vorliegt. Da IgG-Antikörper längere Zeit persistieren, können noch Antikörper einerzurückliegenden Borrelia burgdorferi-Infektion nachweisbar sein.Serologische Testergebnisse sollten immer im Zusammenhang mit dem klinischen Bild gesehen werden.Bei unklaren oder fraglichen serologischen Ergebnissen wird eine erneute Testung im zeitlichen Verlaufder Infektion empfohlen.

12. EvaluierungIn Infektionsstudien* wurden Hunde mittels Zecken mit Borrelien infiziert und der Infektionsverlaufanhand der klinischen Erscheinungen sowie der histopathologischen und kulturellen Befundedokumentiert. Zusätzlich wurde der Serostatus der Hunde mit dem recomBlot Borrelia canis bewertet.Vor dem Zeckenkontakt waren die Hunde nicht mit Spirochaeten infiziert. Es konnte gezeigt werden,dass in der Frühphase häufig nur Antikörper gegen das Membranprotein OspC, das Flagellin p41, aberauch gegen VlsE gebildet werden. Diese Proteine scheinen beim Hund immundominant für die IgM-Antwort zu sein. Dabei weisen anti-OspC- und anti-VlsE-Antikörper gegenüber anti-p41-Antikörpern einewesentlich größere Spezifität auf. Im weiteren postinfektionären Verlauf werden IgG-Antikörper gegendie Antigene p100, VlsE und p39 gebildet, während die anti-OspC-IgG-Antikörper einen meistabnehmenden Titer zeigen. Nur in einem einzigen Fall wurden IgG-Antikörper gegen OspA gefunden.

Tabelle 8: Nachweis der Serokonversion nach der experimentellen Infektion

recomBlot Borrelia canisAnzahl infizierter Hunde

positiv negativ

17 16 11)

1) Bei diesem Hund konnte weder eine Serokonversion mit dem recomBlot Borrelia canis noch eineklinische Symptomatik beobachtet werden.* Dankenswerterweise von Herrn Dr. R. Straubinger/ Universität Leipzig zur Verfügung gestellt

Eine Zufallsauswahl von 106 Jagdhundeseren aus Südwestdeutschland** zeigt mit dem recomBlotBorrelia canis folgende Ergebnisse (Tabelle 9).


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Tabelle 9: Seren ohne klinische Verdachtsdiagnose einer Infektion mit Borrelia burgdorferi.

recomBlot Borrelia canis IgG Anzahl %

positiv 58 54,7

fraglich 5 4,7

negativ 43 40,6

gesamt 106 100

recomBlot Borrelia canis IgM Anzahl %

positiv 7 6,6

fraglich 1 0,9

negativ 98 92,5

gesamt 106 100

** Diplomarbeit von Frau Sandra Wittmann / Fachbereich Wildbiologie, Jagdkunde, Hochschule für ForstwirtschaftRottenburg, zur Lyme-Borreliose bei Jagdhunden

Im Rahmen einer Impfstudie***, in der neun Hunde vor und nach einer Borrelioseschutzimpfung(Impfstoff Merilym) mit dem recomBlot Borrelia canis untersucht wurden, führte die Impfung in achtFällen zur Entwicklung einer starken IgG-Immunantwort gegen OspA; in nur einem einzigen Fall wurdendurch die Impfung schwache anti-VlsE-IgG-Antikörper induziert.

*** Die Studie wurde in Zusammenarbeit mit den Firmen MedPharm GmbH und Merial GmbH durchgeführt.

13. LiteraturDie ausführliche Literaturliste finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation ab Seite 3.Auf Anforderung senden wir Ihnen gerne weiterführende Literatur zur Borrelien-Diagnostik zu.

14. Erklärung der SymboleDie Tabelle mit der Erklärung der Symbole finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation aufSeite 3.

recomBlot Borrelia IgG/IgM Instructions for use MIKROGEN

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recomBlot Borrelia canis IgGrecomBlot Borrelia canis IgMImmunoblot test, with recombinant produced antigens separated by gel electrophoresis, for thedetermination of IgG and IgM antibodies against Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii and B.afzelii in canine serum or plasma.

1. General AspectsrecomBlot Borrelia canis is a qualitative in vitro test for the detection and safe identification of IgG orIgM antibodies against Borrelia burgdorferi in canine serum or plasma. recomBlot Borrelia canis isused to confirm the results obtained from samples that have proved positive in the screening test. Unlikeenzyme immunoassays or spot tests, this test permits the safe identification and localisation of specificantibodies because the antigens are electrophoretically separated. Antibodies against particular antigenscan provide further indication of the stage of the infection.

2. Borrelia burgdorferi and Lyme BorreliosisThe bacterium Borrelia burgdorferi belongs to the family Spirochaetaceae and is the etiologic agent ofLyme borreliosis. This pathogen was first reported and characterised by W. Burgdorfer and A. Barbour in1982. It is transmitted by various tick species of the genus Ixodes. In Europe, the vector is the tickIxodes ricinus. Lyme borreliosis is the most common tickborne infectious disease of human beings anddomestic animals in the world. It occurs in all areas of Germany and, unlike the early summermeningoencephalomyelitis, is not restricted to a few endemic regions. The rates of ticks infected by Borrelia varies depending on the region, e.g. in Germany from 10% in theNorth to 30% in the South. Lyme borreliosis was described by A. Steere in the United States in 1977. Similar as in human beingsthe clinical symptoms of borreliosis in dogs are variform:

• disturbed general condition, fever, pains, apathies and anorexia (approx. 48 %)• acute and chronic recidivating monoarthritis and polyarthritis (approx. 20 %)• unclear lameness (approx. 48 %)• neurological functional deficiencies, like e.g. ataxia, muscle tremor, tortikollis, neck spines shoulder

syndrome, tetraplegia (approx. 24 %)• dermatological changes, combined with pyodermia, erythema and itch (approx. 8 %)• rare symptoms are lymphadenopathia, myocarditis, myositis, iritis, panophtalmia, glomerulonephritis.

This variety of symptoms in the canine borreliosis and the similarity between the manifestations of Lymeborreliosis and other diseases of dogs poses a big diagnostic challenge.

3. DiagnosisApart from clinical diagnosis, direct cultivation of Borrelia burgdorferi (pathogen detection) is the safestproof of infection. Cultivation from skin samples is successful in 50 - 70 % of cases with skinmanifestations, but they are hardly to localise because of dogs skin. However, cultivation is difficult andvery time consuming and, therefore, can be performed only in special laboratories.For this reason, serological testing is the most convenient solution for the routine laboratory. The indirectimmunofluorescence test (IFT), the indirect hemagglutination test (IHA) and enzyme immunoassays(EIA) are used. The serological result depends on the stage of the disease, duration of symptoms and apossible previous antibiotic therapy or vaccination against Borrelia burgdorferi. In comparison with the immunological test methods mentioned above, the immunoblot exhibits additionalcriteria with regard to sensitivity and specificity. It allows the detection and identification of IgM and IgGantibodies and is used to confirm the results of the indirect immunofluorescence and enzymeimmunoassay.

MIKROGEN Instructions for use recomBlot Borrelia canis IgG/IgM

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The use of different strains of Borrelia burgdorferi as antigen can result in varying EIA results. Thetests mentioned above frequently fail in the early stage. Another problem is the cross reactivity withvarious other Spirochaetaceae, e.g. Leptospira interrogans, oral and intestinal Treponemae, but alsowith distantly related bacteria e.g. E. coli. Since the test antigens generally consist of lysates of thewhole pathogen, antibodies against common antigens are also detected. These are widely distributedproteins that have a highly conserved sequence, e.g., heat shock proteins. All these limitations can be avoided by the use of antigens produced by genetic engineering, asdeveloped by MIKROGEN in collaboration with Prof. Dr. B. Wilske and Prof. V. Preac-Mursic at the Maxvon Pettenkofer Institute.

4. Test PrincipleFor the recomBlot Borrelia canis, specific Borrelia burgdorferi antigens are produced with the help ofrecombinant E. coli cells.The use of recombinant proteins has the advantages over conventional lysate blots that proteins can bepresented that are expressed in vivo primarily and that protein combinations from different Borreliagenospecies can be offered in one test. Furthermore the selection of specific antigens that are importantfor the sensitive serological diagnosis minimises the influence of disturbing or cross reactive antigens.In contrast to the recombinant blot, in the immunoblot with lysate antigen from Borrelia burgdorferi cellsthe antigens p100, p39, p18 are underrepresented. This applies even more in the case of the OspCantigen. It is not produced by the Borrelia burgdorferi strain B31, or in very small amounts only. Also, themany different potential bands in the lysate blot can make it very difficult to differentiate immunorelevantbands from so-called common antigens, e.g. heat shock proteins.The antigens used in recomBlot Borrelia canis, in addition to the outer surface proteins OspA (31kD)and OspC (22kD), include the highly specific Borrelia burgdorferi antigens p100, p39 and p18 (=decorinbinding protein A, DbpA = OspC17), as well as p41 (flagellin) and a specific internal part of the p41antigen (p41/i).OspC, VlsE and p18 are in vivo proteins, that are not expressed in culture, or only in very small amounts.Thus the recombinant technique makes it possible to provide these antigens in sufficient amounts. At thesame time, homologues proteins from different genospecies can be offered in one test. This applies inparticular in the cases of highly heterogeneous proteins such as OspC. In recomBlot Borrelia canis,the OspCs of all three genospecies are offered, plus those from two different strains of the genospeciesB. garinii, strain T25 /OspA serotype 7) and strain 20047 (OspA serotype 0), designated below as OspCfrom B. garinii 1 and B. garinii 2.Besides the safe identification of antibodies against all relevant Borrelia genospecies the recombinantimmunoblot provides an indication for the distinction between vaccination and infection. Whereasantibodies against OspA are developed rarely in the course of an infection, they are formed after anvaccination almost always in high concentrations. In contrast, antibodies against VlsE are found in highfrequency in the course of infections after tick bites, but seldom after a vaccination.

For the detection of Borrelia specific antibodies, the strips are incubated with the diluted serum sample,whereby the antibodies bind to the antigens on the strip. Unbound antibodies are then flushed away andthe strips are incubated in a second step with anti-dog IgG or IgM coupled with horse radish peroxidase.Specifically bound antibodies are detected by means of colour reaction catalysed by the peroxidase. Ifan antigen-antibody reaction has taken place, a dark band appears at the corresponding locus on thestrip.As a control for proper serum incubation, anti-dog immunoglobulin is applied below the identificationnumber of the strip. This reaction control band must show a reaction to every serum.


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5. Package contentsThe reagents in a pack are sufficient for 20 determinations. Each reagent set contains:

100 ml Wash buffer (five times the concentration) Contains Tris buffer, NaCl, detergent, preservative and protein

45 ml Substrate solution Tetramethylbenzidin (TMB, ready-to-use))

2 pieces Incubation trays with 10 wells each

1 Predeveloped control strip (kit specific)

1 Instructions for use

1 Evaluation form

5.1. recomBlot Borrelia canis IgGAdditionally to the components listed under Point 5 each reagent set contains:

2 pieces Test tubes with 10 consecutively numbered western blot test stripscoated with Borrelia burgdorferi antigens

40 µl Weak positive serum control IgG (white screw cap) Canine origin, contains 0,1% MIT and 0,1% Oxypyrion

40 µl Anti-dog IgG conjugate (green screw cap)From rabbit, contains NaN3

5.2. recomBlot Borrelia canis IgMAdditionally to the components listed under Point 5 each reagent set contains:

2 pieces Test tubes with 10 consecutively numbered western blot test stripscoated with Borrelia burgdorferi antigens

40 µl Weak positive serum control IgM (yellow screw cap) Canine origin, contains 0,1% MIT and 0,1% Oxypyrion

65 µl Anti-dog IgM conjugate (lilac screw cap)From rabbit, contains NaN3

6. Additional reagents and accessory equipment requiredDeionised water, vacuum extraction system with disinfection trap, micro pipettes, plastic forceps, shaker,metric cylinder with graduations.

7. Information on test and reagent

7.1. Precautions Sera and plasma are to be treated as being potentially infectious. Suitable single-use gloves must be worn during the entire test procedure. The conjugates contain sodium azide. Avoid contact with skin or mucosa. All reagents and materials contaminated with potentially infectious samples must be treated with

suitable disinfectants or autoclaved at 121°C for at least 1 hour. Use incubation trays once only. Handle strips carefully with a plastic forceps.


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7.2. Handling information Store reagents before and after use at 2°C - 8°C, do not freeze. Temper all components before startingthe test for at least 30 minutes to 18°C - 25°C (room temperature). Both the test and incubationprocedures are carried out at room temperature. Mix the control sera and concentrated conjugates well before use. Mix the patient sera well before useas well.Do not open the tube containing the test strips until just before use to avoid condensation of water. Thestrips that are not used must be left in the tube and stored further at 2°C - 8°C (reclose tube tightly, teststrips must not become moist before testing!). Weak positive controls must always be run parallel to the sera being tested, regardless of how manysera are tested. This is the only way to ensure correct test interpretation. A quality guarantee can only be given up to the expiry date on the packages. Only reagents with lot numbers corresponding to the respective lot number on the label of the kitpackage may be used. The test must be performed by well-trained and authorised qualified personnel. In case of substantial modifications of the product or the instructions for use, the application of the testmight differ from the purpose intended by MIKROGEN.Automation is possible, please refer to MIKROGEN for details.

7.3. Preparation of solutions

7.3.1. Preparation of ready-to-use wash bufferThis buffer is used for serum and conjugate incubation as well as for the washing steps. Prior to dilution, the volume of wash buffer required for the corresponding number of tests must bedetermined. Prepare the ready-to-use wash buffer immediately prior to use.The wash buffer concentrate contains a soluble protein component. It is not necessary to shake up thebuffer. One part of wash buffer concentrate is diluted with four parts of deionised water (dilution 1 + 4). SeeTable 1 for the amounts required. Volumes for numbers of test strips not listed in the table have to bedetermined by calculation. Ready-to-use wash buffer not needed has to be discarded.

Table 1: Wash buffer per test strip used

Test stripsused

Wash bufferconcentrate

Deionised water Ready-to-use washbuffer

1 5 ml 20 ml 25 ml2 10 ml 40 ml 50 ml3 15 ml 60 ml 75 ml5 25 ml 100 ml 125 ml

10 50 ml 200 ml 250 ml15 75 ml 300 ml 375 ml20 100 ml 400 ml 500 ml


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7.3.2. Preparation of the conjugate solutionsThe conjugate solution for the IgG resp. IgM test has to be prepared immediately before use. It is notpossible to store the ready-to-use conjugate solution. Per test strip 1.5 µl anti-dog IgG conjugate in 2 ml ready-to-use-wash buffer are to be used (1: 1333). Per test strip 3 µl anti-dog IgM conjugate in 2 ml ready-to-use-wash buffer are to be used (1: 667). The amounts used are listed in Table 2. Volumes for numbers of test strips not listed in the table have tobe determined by calculation.

Table 2: Volumes for anti-human IgG resp. IgM conjugate dilution

Test stripsused

IgG conjugateconcentrate

IgM conjugateconcentrate

Ready-to-use washbuffer

1 1,5 µl 3 µl 2 ml2 3,0 µl 6 µl 4 ml3 4,5 µl 9 µl 6 ml5 7,5 µl 15 µl 10 ml

10 15,0 µl 30 µl 20 ml15 22,5 µl 45 µl 30 ml20 30,0 µl 60 µl 40 ml

* The volumes have been calculated without dead volume. Depending on handling (manually or by machine processing) pleaseprepare conjugate solution for additional 1 to 3 strips.

7.3.3. Substrate solutionThe substrate is ready for use! Bring to room temperature (18°C - 25°C) before starting the colourreaction.Avoid contamination of the unused substrate solution by nonsterile pipette tips, etc. at all costs since thismay affect test sensitivity.

7.4. Storage and stabilityStore reagents at 2°C - 8°C before and after use.Ready-to-use wash buffer cannot be stored.The conjugate solution is to be prepared always freshly.

8. Sample materialThe sample material can be serum or plasma that is separated from the coagulum as soon as possibleafter sampling. Heat-inactivated samples may result in raised background reaction levels. A microbialcontamination of the sample has to be avoided at all costs. Insoluble substances have to be removedfrom the sample prior to incubation by centrifugation.Use of lipaemic, haemolytic or turbid samples may result in a dark background in the recomBlotBorrelia canis IgG/IgM. These samples may also result in false results and should therefore not beused.Important!If the tests are not carried out immediately, the samples can be stored for up to 2 weeks at 2°C - 8°C. Longer storage of the samples is possible at -20°C or below. Repeated freezing and thawingof the samples is not recommended because this may affect the quality of the results.


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9. Test Procedure9.1. GeneralThe reproducibility of the results depends to a great extent on consistent washing of the strips. Thewashing frequencies described under 9.3 and 9.5 should therefore always be maintained.

9.2. Incubation of samples1. One well in the incubation tray is required per sample to be tested. 2 ml of ready-to-use wash buffer

is pipetted into each well. 2. Adding the samples

IgG and IgM test procedure: 8 µl of the undiluted sample (canine serum or plasma) resp. of thecorresponding weak positive control are to be pipetted into the proper well (dilution 1 + 250).The liquids are homogenised by careful horizontal shaking.

3. Adding the test stripsWith the help of plastic forceps, one test strip is carefully dipped into each of the wells filled withmixture of ready-to-use wash buffer and sample. The number of the strip must face upwards. Avoidcarry over of liquids by using the forceps. Important! The strip must be completely wet and immersed in the mixture of ready-to-use wash bufferand sample. Record the tube and strip numbers used on the evaluation sheet. Record the sample numbers and the immunoglobulin class (IgG or IgM) on the evaluation sheet. Cover the incubation tray with the plastic lid and incubate for 2 hours at room temperature whileshaking gently. Important!Make sure the incubation solutions are not carried over into other wells; be particularlycareful to avoid splashing when opening and closing the lid.

9.3. Washing1. Following incubation, the plastic lids are carefully removed from the incubation trays.2. The serum dilution is carefully aspirated from the individual wells.

Important! When the solutions have been aspirated from a well, the pipette tip has to be changed orrinsed well with deionised water after each aspiration procedure to prevent carry over. In the case of machine processing the references of the equipment manufacturer have to beconsidered.

3. Then add 2 ml of the ready-to-use wash buffer in each well and wash in the shaker while shakinggently for 5 minutes. The wash buffer is aspirated after the washing procedure.

4. Carry out the washing step under 3 a total of four times.

9.4. Incubation with peroxidase conjugateAfter washing the strips, add 2 ml of the appropriately prepared conjugate solution (see Table 2) intoeach well and incubate for 1 hour while shaking gently at room temperature, whereby the incubation trayis covered with the plastic lid.

9.5. WashingThe conjugate solutions are aspirated from the wells and the strips are washed again (see 9.3).


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9.6. Substrate reactionAdd 1.5 ml substrate solution into each well and incubate for 5 - 10 minutes, shaking gently and underobservation at room temperature.

Important! Observe the colour reaction process and leave all strips in the substrate solution until the stripsincubated with the weak positive serum control show the following bands: IgG detection: p100IgM detection: p41 The colour reaction may be excessive with highly positive sera. Recommendation: Stop thecolour reaction in such strips earlier.

9.7. Stopping the reaction1. After the solution is aspirated, wash the strips briefly three times with deionised water.2. Use a plastic forceps to remove the strips carefully from the water and place them between 2 layers of

absorbent paper to dry for about 2 hours. The strips may be adhesively attached to the enclosedevaluation sheet and the results may be entered in the protocol.

3. The strips should be stored protected from exposure to light.

10. Summary of the test procedure

1. bring all reagents to room temperature

2. pipette 2 ml of the ready-to-use wash buffer

3. 8 µl of the undiluted sample resp. of the weak positive control is pipetted into the designatedwell. Homogenise the sample with the pipetted buffer

4 carefully place the test strips into the wells. The strips must be completely immersed in theliquid

5. cover the incubation tray and incubate at room temperature for 2 hours while shakinggently

6. carefully remove the lid and withdraw the liquid from the wells (avoid carry over).

7 wash on the shaker four times with 2 ml of ready-to-use wash buffer for 5 minutes each time

8. add 2 ml appropriately prepared conjugate solution and incubate at room temperature for1 hour while shaking gently

9. wash on the shaker four times with 2 ml of ready-to-use wash buffer for 5 minutes each time

10 add 1.5 ml of the substrate solution, incubate while shaking at room temperature for5 – 10 minutes. Bands see 9.6.

11. wash the strips at least three times with deionised water

12. dry the strips between 2 layers of absorbent paper for 2 hours and read off the result


11. Evaluation

11.1. Evaluation of band intensity1. A weak positive control must be included in each test run, irrespective of the number of samples. The

reactivity of the weak positive control serves as cutoff and as a discrimination from the backgroundreactivity.

2. On the attached evaluation sheet, record the date, batch and tube number, and the detectedantibody class.

3. Enter the sample identification number on the protocol sheet.

4. Now attach the corresponding test strips with a glue stick into the corresponding fields of theevaluation sheet. To do this, place the test strips with the reaction control band on the marking lines.Then use clear adhesive tape to attach the test strips left from the marking line. Complete sticking ofthe test strip with glue or adhesive tape may lead to aberrations of the colouring.

5. Place the predeveloped control test strip with the labelled antigen bands on the fixed test strips insuch a way that the incubation control bands are aligned. The predeveloped test strip is kit specificand comes from the same nitrocellulose sheet as the test strips in the test kit. The molecular weightsand names of the antigen bands are marked.

6. Band intensities are assessed by comparison with the weak positive control separately for eachimmunoglobulin class (refer to 11.2 resp. Table 3). Please record the values in the evaluation sheet.

11.2. Control resultsWeak positive controls must always be run parallel to the sera being tested. The test conditions(sensitivity) are to be examined and reactivity with the individual antigen bands are to be confirmed. Thelocalisation of the antigen bands must agree with the attached control strip (kit specific).The control band (reaction control) below the strip number is used to check the correct performance ofthe test. This band must show a distinct colouring.The test strips incubated with the weak positive serum control should show the following band patterns.• IgG Weak Positive Control:

The followWeak rea

All ban

• IgM W

The followWeak rea

All ban

p100 p41 p39 OspA OspC p41/i p41/i p18
Reaction-Ctrl.
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ing bands should be visible: reaction control, p10ctivity against other antigens may be visible.ds are evaluated with reference to the p100 band

eak Positive Control:

ing bands should be visible: Reaction control, p41ctivity against other antigens may be visible.ds are evaluated with reference to the p41 band o

.gar

inii

.afz

elii

B. g

arin

ii 1

B. s

ensu

stri

cto

. afz

elii

arin

ii 2

p100 p41 p39 OspA OspC

B. g

arin

ii 1

B. s

ensu

stri

co

0

of the weak positive control.

B B

+ B

B. g

p41/i p41/i p18

.gar

inii

.afz

elii

. afz

elii

arin

ii 2

f the weak positive control.

B B

+ B

B. g


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Table 3: Band intensityBands Intensity

no reactivity

intensity weaker than the weak positive control

same intensity as with the weak positive control (Cutoff)

stronger Intensity than with the weak positive control

-

+/-

+

++

11.3. Test Results and Test interpretationOn the basis of clinical testing and a mathematical analysis a point evaluation of B. burgdorferi antigensin recomBlot Borrelia was carried out for safe and easy test evaluation. According to this, the test resultcan be obtained by adding up the points and subsequent evaluation.11.3.1. IgG EvaluationThe test result is obtained by the addition of the point values of the separate bands, that are determinedas + or ++. (Table 4 and Table 5). The resulting total of points is to be entered into the column, markedwith the sign for sums. Regardless the intensity of the reaction, whether assigned as + or ++, the pointvalues remain the same. It should be noted, that the point value for the OspC`s must be calculatedonly once, even if all 3 OspC-bands will react. Finally the positive, borderline or negative result can be determined depending on the point value andentered into the column “evaluation”.

Table 4: Point evaluation of B. burgdorferi antigens in recomBlot Borrelia canis IgG

Protein/ AntigenMolecular weight

[kDa]

Name Function/ Origin PointsIgG

100 p100 B. afzelii 866* VlsE Fusion protein, represents the immunodominant

VlsE epitopes of different genospecies4

41 p41 FlagellinB. burgdorferi sensu stricto

1

39 BmpA B. afzelii 831 OspA Surface protein

B. afzelii4

22 OspC Surface proteinB. garinii 1

B. burgdorferi sensu stricto, B. afzeliiB. garinii 2

6

20 p41/i Specific part of FlagellinB. garinii

1

18,5 p41/i Specific part of FlagellinB. afzelii

1

18 p18 Surface antigenB. afzelii

8

* VlsE is described as 40 kDa lipoprotein. In recomBlot Borrelia canis a VlsE fusion protein with 66 kDa is used.


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Table5: Test evaluation IgG

Sum of points Evaluation IgG< 5 negative

5 - 6 borderline

> 6 positive

11.3.2. IgM EvaluationThe test result is obtained by the addition of the point values of the separate bands, that are determinedas + or ++. (Table 6 and Table 7). The resulting total of points is to be entered into the column, markedwith the sign for sums. Regardless the intensity of the reaction, whether assigned as + or ++, the pointvalues remain the same. It should be noted, that the point value for the OspC`s must be calculatedonly once, even if all 3 OspC-bands will react. Finally the positive, borderline or negative result can be determined depending on the point value andentered into the column “evaluation”.

Table 6: Point evaluation of B. burgdorferi antigens in recomBlot Borrelia canis IgM

Protein/ AntigenMolecular weight

[kDa]

Name Function/ Origin PointsIgM

100 p100 B. afzelii 166 VlsE Fusion protein, represents the immunodominant

VlsE epitopes of different genospecies6

41 p41 FlagellinB. burgdorferi sensu stricto

0

39 BmpA B. afzelii 331 OspA Surface protein

B. afzelii4

22 OspC Surface proteinB. garinii 1

B. burgdorferi sensu stricto, B. afzeliiB. garinii 2

8

20 p41/i Specific part of FlagellinB. garinii

1

18,5 p41/i Specific part of FlagellinB. afzelii

1

18 p18 Surface antigenB. afzelii

3

* VlsE is described as 40 kDa lipoprotein. In recomBlot Borrelia canis a VlsE fusion protein with 66 kDa is used.

Table 7: Test evaluation IgM

Sum of points Evaluation IgG Evaluation IgM< 7 negative negative

7 borderline borderline

> 7 positive positive


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11.4. Directions for Interpretation A negative recomBlot Borrelia canis test result can not exclude an infection with Borrelia burgdorferi.Especially in the early phase of infection, it is possible that antibodies are not or not yet present indetectable amounts. Treatment with antibiotics in the early stage can prevent the formation of detectableantibodies. If Lyme Borreliose is clinically suspected and the serum is negative or borderline, samplewithdrawal and testing should be repeated after three weeks.In samples of the early phase of infection, IgM antibodies are usually predominating. Reaction with OspCand p41 is characteristic of the early immune response (IgM). Sera from late stages of infection (IgG)show, in addition to reactions with OspC and p41, strong reactions with p100 and of VlsE often as well.The production of antibodies could be influenced by Borreliosis vaccination.A positive result in recomBlot Borrelia canis IgG does not indicate an active Lyme Borreliosis in everycase. Since IgG antibodies use to persist for a longer time, antibodies from a past infection with Borreliaburgdorferi can still be detectable. Serological test results should always be considered in connection with the clinical picture. If theserological results are unclear or borderline, it is recommended to repeat the test in the course ofinfection.

12. Clinical ResultsIn infection studies dogs were infected with Borrelia burgdorferi by use of ticks. The progress of theinfection was documented with clinical, histological and bacteriological findings. Additionally theserological status of the dogs was evaluated using the recomBlot Borrelia canis. Prior to contact withthe ticks the dogs were not infected with Spirochaetacea. It was shown that in the early stagesantibodies were often formed only against the outer surface protein OspC and the flagellin p41, but alsoagainst VlsE. These proteins are immunodominant for dogs in the IgM response. Thereby anti-OspC-antibodies show a significant greater specificity than anti-p41-antibodies. In the progress of the infectionIgG antibodies against p100, VlsE and p39 are generated, whereas the concentration of anti-OspC-antibodies decreases mostly.

Table 8: Detection of the seroconversion after the experimental infection

recomBlot Borrelia canisNumber of infected dogs

positive negative

17 16 11)

1) This dog showed no clinical pathology nor could a seroconversion be detected by the recomBlotBorrelia canis.* Kindly provided by Dr. R. Straubinger/ University of Leipzig


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A random selection of 106 hounds from South-western Germany shows the following results by testingwith recomBlot Borrelia canis (Table 9).Table 9: Sera without clinical suspect of an infection by Borrelia burgdorferi

recomBlot Borrelia canis IgG Number %positive 58 54,7borderline 5 4,7negative 43 40,6total 106 100

recomBlot Borrelia canis IgM Number %positive 7 6,6borderline 1 0,9negative 98 92,5total 106 100

** Diploma thesis by Ms Sandra Wittman/ Faculty Wild Biology, Academy for Forestry, Rottenburg, Germany:„Lyme Borreliosis in Hounds“.

In the course of an vaccine study*** nine dogs were examined by the recomBlot Borrelia canis beforeand after a Borreliosis vaccination (vaccine „Merilym“). In 8 of the 9 cases a strong IgG immuneresponse developed, with focus on the OspA. Only in one case a weak response to VlsE was induced.

*** The study was performed in cooperation with the companies MedPharm GmbH and Merial GmbH


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13. Literature(1) Fawcett, P.T., O`Brien, A.F. and Doughty, R.A. (1989). An absorption procedure to increase the specificity of enzyme - linked

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We will be pleased to send you further literature on the diagnosis of Lyme borreliosis.


14. Explanation of the SymbolsContains sufficient for < n > tests(number of tests)

Inhalt ist ausreichend für < n > Ansätze(Anzahl der Ansätze)

Consult instructions for use Gebrauchsinformation beachten

Contains Inhalt, enthältin vitro diagnostic device In vitro TestBatch code Chargen-NummerDo not freeze Nicht einfrieren

Catalogue number Bestell-NummerUse byexpiry date

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Borrelia Canis WB IgG, IgM