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7/28/2019 Booth Biochem

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5 1 6 J . LEGGETT BAILEY 1 9 6 13 . U n l i k e o t h e r known a c t i v e p h e n o l a s e s t h eenzyme r e l e a s e d from a b r o a d - b e a n l e a f e x t r a c t byT e e p o l i s a d s o r b e d s t r o n g l y on d i e t h y l a m i n o -e t h y l c e l l u l o s e .

I t i s a p l e a s u r e t o a c k n o w l e d g e t h e t e c h n i c a l a s s i s t a n c eo f E l i z a b e t h P . M c A l l a n .

REFERENCESB o n n e r , W. D . , j u n . ( 1 9 5 7 ) . A n n u . R e v . P I . P h y 8 i o l .8 , 4 2 7 .B r o w n , F . C . & W a r d , D . N . ( 1 9 5 8 ) . J . b i o l . C h e m .

2 3 3 , 7 7 .

D a w s o n , C . R . & M a g e e , R . J . ( 1 9 5 5 ) . I n M e t h o d 8 i nE n z y m o l o g y , v o l . 2 , p . 8 1 9 . E d . b y C o l o w i c k , S . P . &K a p l a n , N . 0 . Ne w Y o r k : A c a d e m i c P r e s s I n c .F r i e d e n , E . & O t t e s e n , M . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a ,3 4 , 2 4 8 .K e n t e n , R . H . ( 1 9 5 7 ) . B i o c h e m . J . 6 7 , 3 0 0 .K e n t e n , R . H . ( 1 9 5 8 ) . B i o c h e m . J . 6 8 , 2 4 4 .K e r t e s z , D . & Z i t o , R . ( 1 9 5 7 ) . N a t u r e , L o n d . , i 7 9 , 1 0 1 7 .L o w r y , 0 . H . , R o s e b r o u g h , N . J . , F a r r , A . L . & R a n d a l l ,R . J . ( 1 9 5 1 ) . J . b i o l . C h e m . 1 9 3 , 2 6 5 .M a l m s t r o m , G . , F a h r a e u s , G . & M o s b a c h , R . ( 1 9 5 8 ) .B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a , 2 8 , 6 5 2 .P e t e r s o n , E . & S o b e r , H . A . ( 1 9 5 6 ) . J . A m e r . c h e m . S o c . 8 0 ,1 2 6 0 .

B i o c h e m . J . ( 1 9 6 1 ) 7 9 , 5 1 6

An Enzyme from Rat L i v e r C a t a l y s i n g C o n j u g a t i o n s w i t h G l u t a t h i o n eBY J . BOOTH, E . BOYLAND AND P . SIMSC h e s t e r B e a t t y R e 8 e a r c h I n 8 t i t u t e , I n 8 t i t u t e o f C a n c e r R e 8 e a r c h ; R o y a l C a n c e r H o 8 p i t a i ,Fulham R o a d , L o n d o n , S . W . 3

( R e c e i v e d 1 N o v e m b e r 1 9 6 0 )Man y compounds a r e e x c r e t e d i n u r i n e and b i l e

a s m e r c a p t u r i c a c i d s , w h i c h a r e t h i o e t h e r s o fa c e t y l c y s t e i n e , and t h e r e h a s b e e n c o n s i d e r a b l es p e c u l a t i o n on t h e s o u r c e o f t h e c y s t e i n e u s e d f o rt h e b i o s y n t h e s i s o f t h e s e c o m p o u n d s . E v i d e n c et h a t g l u t a t h i o n e i s i n v o l v e d was s u p p l i e d by t h ework o f B a r n e s , James & Wood ( 1 9 5 9 ) , who f o u n dt h a t t h e l e v e l s o f g l u t a t h i o n e i n t h e l i v e r d e c r e a s e dwhen m e r c a p t u r i c a c i d - f o r m i n g c o m p o u n d s w e r ea d m i n i s t e r e d t o r a t s . F u r t h e r m o r e , when p -c h l o r o b e n z y l c h l o r i d e wa s g i v e n t o a r a b b i t , i n -v e s t i g a t i o n s w i t h p a p e r c h r o m a t o g r a p h y p r o v i d e de v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f S - ( p - c h l o r o b e n z y l ) -g l u t a t h i o n e i n t h e l i v e r , and t h i s compound c o u l db e c o n v e r t e d i n t o S - ( p - c h l o r o b e n z y l ) c y s t e i n e byl i v e r s l i c e s and h o m o g e n a t e s and by g l u t a t h i o n a s e( B r a y , F r a n k l i n & J a m e s , 1 9 5 9 a ) . Th e N - a c e t y l -a t i o n o f some o f t h e S - s u b s t i t u t e d c y s t e i n e s t o t h ec o r r e s p o n d i n g m e r c a p t u r i c a c i d s was d e m o n -s t r a t e d i n v i v o and i n t i s s u e p r e p a r a t i o n s i n v i t r o( B r a y , F r a n k l i n & J a m e s , 1 9 5 9 b ) .

I t h a s b e e n shown t h a t r a t - l i v e r s l i c e s c o n v e r tn a p h t h a l e n e i n t o S - ( 1 : 2 - d i h y d r o - 2 - h y d r o x y - 1 - n a p h -t h y l ) g l u t a t h i o n e ( B o o t h , B o y l a n d & S i m s , 1 9 6 0 b )and 1 : 2 - d i h y d r o n a p h t h a l e n e i n t o S - ( 2 - h y d r o x y -1 : 2 : 3 : 4 - t e t r a h y d r o - 1 - n a p h t h y l ) g l u t a t h i o n e . T h i sl a t t e r r e a c t i o n c o u l d a l s o b e a c c o m p l i s h e d by r a t -l i v e r m i c r o s o m e s i n t h e p r e s e n c e o f r e d u c e d t r i -p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d e , o x y g e n and g l u t a -t h i o n e , a n d t h e amount o f g l u t a t h i o n e d e r i v a t i v ef o r m e d was i n c r e a s e d by t h e a d d i t i o n o f t h e s o l u b l e

f r a c t i o n o f r a t l i v e r ( B o o t h , B o y l a n d , S a t o & S i m s ,1 9 6 0 a ) .T h i s p a p e r d e s c r i b e s t h e p a r t i a l p u r i f i c a t i o n a ndsome o f t h e p r o p e r t i e s o f t h e l i v e r enzyme whichc a t a l y s e d t h e f o r m a t i o n o f g l u t a t h i o ne d e r i v a t i v e sf r o m v a r i o u s c o m p o u n d s .

EXPERIMENTALM a t e r i a l s . T r i p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d e ( T P N ) a s t h e

d i h y d r a t e o f t h e s o d i u m s a l t , r e d u c e d TPN ( T P N H 2 ) a s t h es o d i u m s a l t , d i p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d e ( D P N ) , r e d u c e dDPN ( D P N H 2 ) a s t h e d i s o d i u m s a l t , g l u c o s e 6 - p h o s p h a t ea s t h e d i s o d i u m s a l t , f l a v i n m o n o n u c l e o t i d e a s t h e m o n o -s o d i u m s a l t d i h y d r a t e , a d e n o s i n e 5 - t r i p h o s p h a t e ( A T P ) a st h e d i s o d i u m s a l t a n d g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s ew e r e o b t a i ne d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . P y r o p h o s p h a t eb u f f e r s w e r e p r e p a r e d f r o m K 4 P 2 0 7 a n d N a 2 H 2 P 2 0 7 a n dp h o s p h a t e b u f f e r f r o m KH2PO4 a n d N a 2 H P O 4 . C o n c e n -t r a t i o n s o f t h e c o n s t i t u e n t s o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e sr e f e r t o t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n s a t t h e b e g i n n i n g o f t h ei n c u b a t i o n s .S - ( 2 - C h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n e . T h i s wa s p r e p a r e df r o m 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o a n i l i n e b y t h e m e t h o d o f P a r k e &W i l l i a m s ( 1 9 5 1 ) , w h e n i t f o r m e d p a l e - y e l l o w n e e d l e s f r o ma q . e t h a n o l , m . p . 1 7 6 - 1 7 8 ' ( d e c o m p . ) ( F o u n d : N , 1 0 - 1 5 ;C l , 1 2 - 4 5 . C a l c . f o r C 9 H 9 0 4 N 2 C l S : N , 1 0 - 1 ; C l , 1 2 - 8 % ) .B r a y e t a l . ( 1 9 5 9 b ) r e p o r t m . p . 1 8 2 0 f o r t h i s c o m p o u n dp r e p a r e d b y t h e m e t h o d o f S u t e r ( 1 8 9 5 ) . A c e t y l a t i o n o f t h ec o m p o u n d w i t h a c e t i c a n h y d r i d e i n 2N-NaOH y i e l d e dN - a c e t y l - S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n e i n c r e a mn e e d l e s f r o m e t h a n o l , m . p . 1 9 3 0 . B r a y , J a m e s & T h o r p e( 1 9 5 7 ) r e p o r t m . p . 1 9 2 - 1 9 4 f o r t h i s d e r i v a t i v e .


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ENZYMIC CONJUGATIONS WITH GLUTATHIONES - ( 2 - C h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e . T h i s c o m p o u n dw a s p r e p a r e d f r o m g l u t a t h i o n e ( 2 g . ) a n d 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o -a n i l i n e ( 1 1 g . ) b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d f o r t h e p r e p a r a t i o no f 1 - n a p h t h y l g l u t a t h i o n e ( B o o t h e t a l . 1 9 6 0 b ) . S - ( 2 -C h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e ( 0 . 9 5 g . ) s e p a r a t e d f r o ma q . 9 0 % e t h a n o l - e t h e r a s a p a l e - y e l l o w p o w d e r , m . p . 2 1 4 0

( d e c o m p . ) ( F o u n d : N , 1 2 - 6 ; C l , 7 - 8 ; S , 6 - 8 . C 0 L H L 9 0 8 N 4 C I Sr e q u i r e s N , 1 2 - 1 ; C l , 7 - 7 ; S , 6 . 9 % ) . L i k e t h e c o r r e s p o n d i n gc y s t e i n e d e r i v a t i v e , t h e compound t u r n e d b r o w n o ne x p o s u r e t o d a y l i g h t . When t h e compound w a s h e a t e d w i t hHB r ( s p . g r . 1 . 7 ) f o r 4 h r . a n d t h e p r o d u c t s w e r e e x a m i n e do n p a p e r c h r o m a t o g r a m s ( w i t h s o l ve nt 1 , T a b l e 2 ) , c o m -p o u n d s i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) -c y s t e i n e , g l y c i n e a n d g l u t a m i c a c i d w e r e d e t e c t e d .N - A c e t y l - L - c y s t e i n e w a s p r e p a r e d b y t h e m e t h o d o fP i r i e & H e l e ( 1 9 3 3 ) a n d t r a n s - 1 : 2 - d i h y d r o - 1 : 2 - d i h y d r o x y -n a p h t h a l e n e a n d t r a n s - 9 : 1 0 - d i h y d r o - 9 : 1 0 - d i h y d r o x y p h e n -a n t h r e n e b y r e d u c t i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g o - q u i n o n e s w i t hl i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e ( B o o t h , B o y l a n d & T u r n e r ,1 9 5 0 ) . t r a n s - 1 : 2 - D i h y d r o - 1 : 2 - d i h y d r o x y p h e n a n t h r e n e w a si s o l a t e d f r o m t h e u r i n e o f a r a bb it d o s e d w i t h p h e n a n t h r e n e( B o y l a n d & W o l f , 1 9 5 0 ) .A s o l u t i o n o f o x i d i z e d g l u t a t h i o n e ( G S S G ) w a s p r e p a r e db y a d d i n g a s m a l l e x c e s s o f 5 0 m M - p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e t oa s o l u t i o n o f 5 0 mm-GSH ( 1 0 m l . ) a n d k e e p i n g t h e m i x t u r ea t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h r . T h e s o l u t i o n w a s a d j u s t e d t op H 4 w i t h a c e t i c a c i d a n d t h e GSSG a b s o r b e d o n c h a r c o a l( 4 0 0 m g . ) . T h e c h a r c o a l w a s f i l t e r e d o f f a n d w a s h e d w i t hw a t e r u n t i l t h e w a s h i n g s w e r e f r e e o f p o t a s s i u m f e r r i -c y a n i d e ( n o b l u e c o l o u r w i t h F e C l 2 ) . T h e GSSG w a s e l u t e dw i t h 1 0 m l . o f m e t h a n o l - b e n z e n e - a q . N H , ( s p . g r . 0 - 8 8 )( 8 7 : 1 0 : 3 , b y v o l . ) . T h e e l u a t e w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s sa n d t h e GSSG w a s d i s s o l v e d i n 0 - 1 m - p y r o p h o s p h a t e b u f f e r ,p H 8 - 0 ( 1 0 m l . ) .T i s s u e p r e p a r a t i o n s . T h e l i v e r f r a c t i o n s o l u b l e i n p h o s -p h a t e b u f f e r w a s p r e p a r e d b y h o m o g e n i z i n g l i v e r s f r o mm a l e a d u l t r a t s i n 4 v o l . o f 0 - M - p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 - 4 ,w i t h a P o t t e r & E l v e h j e m ( 1 9 3 6 ) t y p e o f h o m o g e n i z e r w i t ha T e f l o n p e s t l e . T h e h o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d f o r 3 0 m i n .a t 2 0 0 0 g a n d t h e s u p e r n a t a n t c e n t r i f u g e d f o r 1 h r . a t9 5 O O O g ( c e n t r e o f t u b e ) i n a S p i n c o m o d e l L p r e p a r a t i v eu l t r a c e n t r i f u g e w i t h r o t o r n o . 4 0 . T h e s u p e r n a t a n t f r o m t h eh i g h - s p e e d c e n t r i f u g e w a s d i a l y s e d a g a i n s t w a t e r a n d t h ep r e c i p i t a t e w h i c h s e p a r a t e d w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g i n gf o r 3 0 m i n . a t 2 0 0 0 g . T h e s u p e r n a t a n t w a s a d j u s t e d t op H 7 - 4 w i t h 0 - 1 M - K 4 P 2 0 7 a n d s t o r e d a t -2 . T h i s p r e p a r a -t i o n i s r e f e r r e d t o a s t h e s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n . K i d n e y sf r o m m a l e a d u l t r a t s w e r e h o m o g e n i z e d i n 4 v o l . o f 0 - 1 5 4 M -N a C l i m m e d i a t e l y b e f o r e u s e . A l l o p e r a t i o n s w e r e c a r r i e do u t a t b e t w e e n 3 0 a n d 8 0 .M e t a b o l i s m o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e . T h i s w a s i n v e s t i -g a t e d b y i n c u b a t i n g t h e f o l l o w i n g r e a c t i o n m i x t u r e s a t 3 7 0f o r 1 h r . ( 1 ) S o l u b l e l i v e r f r a c t i o n ( 0 - 5 m l . ) , GSH, c y s t e i n eo r a c e t y l c y s t e i n e ( 5 mM) a n d 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e( 1 m M , a d d e d i n 0 - 1 m l . o f e th a n o l ) i n a t o t a l v o l u m e o f6 m l . o f O - l M - p y r o p h o s p h a t e b u f f e r , p H 8 - 0 ; ( 2 ) S - ( 2 -c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e ( 1 m m ) a n d k i d n e y h o m o -g e n a t e ( 1 m l . ) i n a t o t a l v o l u m e o f 6 m l . o f 0 - 1 m - p y r o p h o s -p h a t e b u f f e r , p H 8 - 0 ; ( 3 ) S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) -c y s t e i n e ( 1 mm) a n d s l i c e s o f l i v e r ( a p p r o x . 5 g . w e t w t . )f r o m a d u l t r a t s i n 5 0 m l . o f R i n g e r p h o s p h a t e s o l u t i o n ,p H 7 - 4 ( U m b r e i t , B u r r i s & S t a u f f e r , 1 9 4 9 ) . At t h e e n d o ft h e i n c u ba t i on p e r i o d t h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e s t u d i e d b yp a p e r c h r o m a t o g r a p h y .

P a p e r c h r o m a t o g r a p h y . T h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e a d d e dt o a c e t i c a c i d ( 0 - 5 m l . ) a n d c e n t r i f u g e d , a n d t h e s u p e r n a t a n tw a s a d d e d t o a c t i v a t e d c h a r c o a l ( 5 0 m g . ) , s h a k e n a n d a g a i nc e n t r i f u g e d . T h i s s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d a n d t h ec h a r c o a l wa s r e s u s p e n d e d i n w a t e r ( 6 m l . ) a n d f i l t e r e d . T h ep r o d u c t s w e r e e l u t e d f r o m t h e c h a r c o a l w i t h 1 0 m l . o fm e t h a n o l - b e n z e n e - a q . N H 3 ( s p . g r . 0 - 8 8 ) ( 8 7 : 1 0 : 3 , b y v o l . )a n d t h e e l u a t e w a s e v a p o r a t e d t o a s m a l l v o l u m e a n da p p l i e d t o W h a t m a n n o . 1 p a p e r f o r c h r o m a t o g r a p h y .D e s c e n d i n g c h r o m a t o g r a m s w e r e d e v e l o p e d f o r 1 8 h r . w i t ho n e o f t h e s o l v e n t s y s t e m s l i s t e d i n T a b l e 2 . T h e d r i e dc h r o m a t o g r a m s w e r e e x a m i n e d u n d e r u . v . l i g h t a n d t h e ns p r a y e d w it h ( 1 ) 20% N a 2 C O 3 ( B r a y e t a l . 1 9 5 7 ) o r ( 2 )0 - I M - K 2 C r 2 O 7 - a c e t i c a c i d ( 1 : 1 ) , f o l l o w e d b y 0 - 1 M - A g N O 3( K n i g h t & Y o u n g , 1 9 5 8 ) , o r ( 3 ) d i a z o t i z e d p - n i t r o a n i l i n e( 0 - 0 2 % i n 0 - l N - H C I ) , f o l l o w e d b y a q . 10% ( w / v ) N a . , C O 3 ,o r ( 4 ) d i a z o t i z e d p - n i t r o a n i l i n e ( 0 - 0 2 % i n 4 N - H C 1 ) , a f t e rw h i c h t he p a p er s w e r e h e a t ed a t 7 0 0 u n t i l c o l o u r s a p p e a r e d( a b o u t 5 m i n . ) a n d t h e n s p r a y e d w i t h a q . 10% ( w / v )N a 2 C O 3 . O t h e r p a p e r s w e r e d i p p e d i n a s o l u t i o n o f n i n h y -d r i n ( 0 - 4 % ) i n a c e t o n e , h e a t e d i n a n o v e n a t 7 0 0 f o r 5 m i n .a n d t h e n d i p p e d i n a s o l u t i o n o f C u ( N O 3 ) 2 ( 0 - 2 %) i n a c e t o n e .E s t i m a t i o n o f e n z y m e a c t i v i t y . T h e s u b s t r a t e c h o s e n f o rt h e e s t i m a t i o n o f e n z y m e a c t i v i t y w a s 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o -b en z en e , b e c a u s e o f t h e c h a n g e i n t h e u l t r a v i o l e t - a b s o r p t i o ns p e c t r u m w h i c h o c c u r s when t h i s compound i s c o n v e r t e di n t o S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e ( F i g s . 1 a n d 2 ) .I n o b t a i n i n g t h e r e a d i n g s i n F i g . 2 , a c e l l c o n t a i n i n g a l l t h ec o n s t i t u e n t s o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e e x c e p t 3 : 4 - d i c h l o r o -n i t r o b e n z e n e w a s u s e d a s t h e b l a n k , s o t h a t t h e r a t e o fi n c r e a s e o f E a t 3 4 4 m , u i s a m e a s u r e o f t h e r a t e o f f o r m a -t i o n o f S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e . T h i s i n c r e a s ew a s m e a s u r e d o n a Unicam S P . 5 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r w i t ha U n i c a m S P . 5 7 0 c o n s t a n t - t e m p e r a t u r e - c e l l h o u s i n g . T h er e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n e d GSH ( 5 m m ) , v a r i o u s c o n c e n -t r a t i o n s o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e ( a d d e d i n 0 - 1 m l . o fe t h a n o l ) a n d e n z y m e i n a t o t a l v o l u m e o f 3 - 0 m l . o f 0 - I M -p y r o p h o s p h a t e b u f f e r , p H 8 - 0 . T h e e n z y m e w a s d i l u t e d s ot ha t t h e r a t e o f i n c r e a s e i n E w a s l e s s t h a n 0 - 2 / m i n . Ther e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 3 7 0 , t h e c o n s t i t u e n t s b e i n gb r o u g h t t o t h i s t e m p e r a t u r e b e f o r e t h e d e t e r m i n a t i o n a n dt h e r e a c t i o n w a s s t a r t e d b y t h e a d d i t io n o f t h e e n z y m es o l u t i o n t o t h e c e l l . A f t e r s t i r r i n g , r e a d i n g s a t 3 4 4 m j A w e r et a k e n a t 3 0 s e c . i n t e r v a l s f o r 5 - 5 m i n . , b e g i n n i n g 3 0 s e c .a f t e r m i x i n g . U n d e r t h es e c o nd i ti o n s t h e i n i t i a l r e a c t i o nr a t e s w e r e c o n s t a n t f o r a t l e a s t 1 0 m i n . a n d 1 u n i t o fe n z y m e i s d e f i n e d a s t h a t a m o u n t w h i c h w i l l f o r m 1 , u m o l eo f S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e / m i n . S p e c i f i c a c t i -v i t y i s e x p r e a s e d a s u n i t s / m g . o f p r o t e i n . P r o t e i n w a se s t i m a t e d b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e b i u r e t m e t h o d ( F i n c h a m ,1 9 5 4 ) o r b y t h e m e t h o d o f W a r b u r g & C h r i s t i a n ( 1 9 4 1 ) .

L o c a t i o n o f t h e e n z y m e . T o d e t e r m i n e t h e i n t r a c e l l u l a rl o c a t i o n o f t he e n z y m e , a 1 i n 1 0 h o m o g e n a t e o f a d u l t m a l er a t l i v e r i n 0 - 2 5 M - s u c r o s e w a s p r e p a r e d a s d e s c r i b e d f o rt h e p h o s p h a t e -b u f f e r h o m o g e n a t e . The s u c r o s e h o m o g e n a t ew a s f r a c t i o n a t e d b y t h e m e t h o d o f S c h n ei d e r & Hogeboom( 1 9 5 0 ) , e x c e p t t h a t t h e m i c r o s o m e f r a c t i o n w a s s e p a r a t e df r o m t h e s o l u b l e f r a c t i o n b y c e n t r i f u g i n g a t 9 5 0 0 0 g( c e n t r e o f t h e t u b e ) f o r 1 h r . i n a S p i n c o m o d e l L p r e -p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g e w i t h r o t o r n o . 4 0 . The p a r t i c u l a t ef r a c t i o n s w e r e s u s p e n d e d i n 0 - l M - p y r o p h o s p h a t e b u f f e r ,p H 8 - 0 , i n v o l u m e e q u i v a l e n t t o t h o s e o f t h e o r i g i n a lh o m o g e n a t e a n d t h e f r a c t i o n s w e r e d i l u t e d w i t h t h i s b u f f e rf o r m e a s u r e m e n t s o f e n z y m e a c t i v i t y .

V o l . 7 9 5 1 7


3/9

J . BOOTH, E . BOYLAND AND P . SIMSTo d e t e r m i n e t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e e n z y m e i n t h es o l u b l e f r a c t i o n o f v a r io u s r a t t i s s u e s , t h e t i s s u e s w e r eh o m o g e n i z e d i n 0 - m - p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 - 4 , a n d t h ep h o s p h a t e b u f f e r - s o l u b l e f r a c t i o n s p r e p a r e d a s d e s c r i b e df o r l i v e r . B l o o d w a s a d d e d t o a n e q u a l v o l u m e o f w a t e r a n da f t e r 1 0 m i n . a n e q u a l v o l u m e o f - l M - p h o s p h a t e b u f f e rw a s a d d e d . T h e s u p e r n a t a n t a f t e r c e n t r i f u g i n g f o r 1 h r . a t

9 5 0 O O g w a s t h e n u s e d f o r m e a s u r e m e n t s o f e n z y m ea c t i v i t y .P a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f t h e e n z y m e . S t e p s 1 a n d 2 a r e t h eh o m o g e n i z a t i o n o f r a t l i v e r a n d t h e p r e p a r a t i o n o f t h es o l u b l e f r a c t i o n a s d e s c r ib e d a b o v e . S t ep 3 . T h e u n d i a l y s e ds o l u b l e l i v e r f r a c t i o n w a s a d j u s t e d t o p H 5 - 2 w i t h a c e t i ea c i d ( a p p r o x . 0 -5 5 m l . / 1 0 0 m l . ) , c e n t r i f u g e d f o r 1 5 m i n . a t2 0 0 0 g a n d t h e p p t . d i s c a r d e d . T h e s u p e r n a t a n t w a sd i a l y s e d a g a i n s t w a t e r f o r 1 8 h r . , c e n tr i f u g ed a s b e f o re a n dt h e p p t . a g a i n d i s c a r d e d . T h e s u p e r n a t a n t w a s a d j u s t e d t op H 8 - 0 w i t h 0 - 1 M - K 4 P 2 0 7 a n d t h e c e n t r i f u g i n g r e p e a t e d .S t e p 4 . To t h e s u p e r na t a n t f r o m s t e p 3 , ( N H 4 ) 2 S O 4 ( 4 7 - 2 g . /

1 0 0 m l . ) w a s a d d e d a n d , a f t e r 3 0 m i n . , t h e p p t . w a sr e m o v e d b y c e n t r i f u g i n g a n d d i s c a r d e d . A s m a l l p o r t i o n o ft h e s u p e r n a t a n t w a s d i a l y s e d a g a in s t w a t e r a n d u s e d f o ra c t i v i t y m e a s u r e m e n t s . S t e p 5 . T h e s u p e r n a t a n t f r o m s t e p 4w a s a d j u s t e d t o p H 4 - 5 w i t h 5% a c e t i c a c i d a n d c e n t r i -f u g e d f o r 3 0 m i n . a t 2 0 0 0 g . T h e p p t . , w h i c h c o n t a i n e d t h ea c t i v i t y , w a s d i s s o l v e d i n 0 . 1 v o l . o f 0 - 1 M - p y r o p h o s p h a t eb u f f e r , p H 7 - 4 , a n d s t o r e d i n 0 - 5 m l . p o r t i o n s a t - 1 5 .I m m e d i a t e l y b e f o r e u s e a p o r t i o n w a s a l l o w e d t o t h a w a tr o o m t e m p e r a t u r e a n d w a s d i l u t e d 4 0 t i m e s w i t h 0 - 1 M -p y r o p h o s p h a t e b u f f e r , p H 8 - 0 , s o t h a t when 0 -2 5 m l . o f t h i ss o l u t i o n w a s p r e s e n t i n 3 m l. o f r ea c t io n m i x t u r e t h e t o t a ld i l u t i o n f a c t o r w a s 4 8 0 a n d t h e p r o t e in c o n c e n t r a t i on w a s0 - 0 1 1 7 m g . / m l . T h i s g a v e a c h a n g e i n E a t 3 4 4 m , u o f 0 - 1 5 t o0 - 2 0 / m i n . u n d e r t h e optimum c o n d i t i o n s . A l l o p e r a t i o n sw e r e c a r r i e d o u t a t b e t w e e n 3 0 a n d 8 0 . T h e p a r t i a l p u r i f i c a -t i o n o f t h e e n z y m e b y t h e s e s t e p s i s s u m m a r i z e d i nT a b l e 1 .

3 0 0 3 5 0 4 0 0

W a v e l e n g t h ( m y )F i g . 1 . A b s o r p t i o n s p e c t r a i n O - l M - p y r o p h o s p h a t e b u f f e r ,p H 8 - 0 : -, 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e ; - - - , S - ( 2 - c h l o r o - 4 -n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e .

W a v e l e n g t h ( m I . )F i g . 2 . E f f e c t o n u l t r a v i o l e t a b s o r p t i o n o f i n c u b a t i n g 3 : 4 -d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e w i t h GSH a n d e n z y m e . R e a c t i o nm i x t u r e s c o n t a i n 3 : 4 - d ic h l o r on i tr o b en z e ne ( 0 - 1 m M ) , GSH( 5 mM) a n d 0 - 2 5 m l . o f e n z y m e s o l u t i o n i n 3 m l . o f 0 - I M -p y r o p h o s p h a t e b u f f e r , p H 8 - 0 . T h e r e a d i n g s f o r e a c h c u r v eo c c u p i e d a p p r o x . 1 m i n . a n d w e r e s t a r t e d a t t h e f o l l o w i n gt i m e s ( m i n . ) a f t e r a d d i n g t h e e n z y m e s o l u t i o n -, 1 ; - - , 6 ;

* * * , 11;---, 16;--, 2 1 ; 0-0, 2 6 .T a b l e 1 . Summary o f t h e p a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f t h e e n z y m e f r o m a 1 i n 5 h o m o g e n a t eo f r a t l i v e r i n 0 - M - p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 - 4 1 0 2 x S p e c i f i ca c t i v i t yV o l u m e A c t i v i t y T o t a l P r o t e i n ( u n i t s / m g .S t e p ( m l . ) ( u n i t s / m l . ) u n i t s ( m g . / m l . ) o f p r o t e i n )

( 1 ) W h o l e h o m o g e n a t e 3 6 0 2 1 7 5 6 0 4 5 - 1 4 7( 2 ) S o l u b l e l i v e r f r a c t i o n 2 4 5 2 7 6 6 1 5 2 6 - 2 1 0 4( 3 ) P r e c i p i t a t i o n a t p H 5 - 2 a n d d i a l y s i s 2 7 0 1 9 5 1 3 0 1 2 - 1 1 5 8( 4 ) ( N H 4 ) 2 S O 4 f r a c t i o n a t i o n a t p H 8 - 0 3 3 0 9 2 9 7 0 1 - 4 6 4 3( 5 ) ( N H 4 ) 2 S O 4 f r a c t i o n a t i o n a t p H 4 - 5 3 3 9 0 2 9 7 0 5 - 6 1 6 0 7

1 2 0 0 0 o 0 8 r

II\\\II / II ~ ~ ~ ~ ~ ~I ~ ~ ~ ~ ~ ~

8 0 0 0

6 0 0 0

4 0 0 0

B 0 4 -

0 2 s2 5 0

R e c o v e r y( % )1 0 08 76 83 93 9

5 1 8 1 9 6 1

0


4/9

ENZYMIC CONJUGATIONS WITH GLUTATHIONET a b l e 2 . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e m e t a b o l i t a 9

S o l v e n t s y s t e m s : ( 1 ) b u t a n o l - a c e t i c a c i d - w a t e r ( 1 2 : 3 : 5 ) ; ( 2 ) b u t a n o l - a c e t i c a c i d - w a t e r ( 2 : 1 : 1 ) . A l l m e t a -b o l i t e s s h o w e d d a r k a b s o r p t i o n i n u . v . l i g h t a n d g a v e a p o s i t i v e r e a c t i o n w i t h t h e K 2 C r 2 O 7 - A g N O 3 r e a g e n t .

R e a c t i o n m i x t u r e or r e f e r e n c e compound3 : 4 - D i c h l o r o n i t r o b e n z e n e , d i a l y s e d s o l u b l e l i v e rf r a c t i o n a n d GSHS - ( 2 - C h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n eS - ( 2 - C h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e a n d k i d n e yh o m o g e n a t eS - ( 2 - C h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n eS - ( 2 - C h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n e a n d l i v e r s l i c e sN - A c e t y l - S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n e

S SS o l v e n t ( 1 ) S o l v e n t ( 2 )

0 - 4 50 - 4 40 - 5 70 - 5 90 - 8 90 - 8 9

0 - 6 20 - 6 10 - 6 70 - 6 70 - 8 60 - 8 6

I d e n t i f r a t i o n o f g l u t a t h i o n e c o n j u g a t e s w i t h v a r i o u s 8 u b -s t r a t e s . R e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n e d s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n( 2 m l . ) , GSH ( 5 m M) a n d 0 - l I M - p y r o p h o s p h a t e b u f f e r ,p H 8 - 0 , i n a f i n a l v o l u m e o f 6 m l . T h e s u b s t r a t e s werea d d e d i n e t h a n o l ( 0 - 2 m l . ) t o g i v e a f i n a l c on c n. o f 1 mM;some o f t h e c o m p o u n d s were p a r t i a l l y p r e c i p i t a t e d a n dw i t h t h e s e t h e exces s o f s u b s t r a t e was a l l o w e d t o r e m a i n i ns u s p e n s i o n . W i t h t h e s u b s t r a t e s i o d o b e n z e n e , n a p h t h a l e n e , 1 -c h l o r o n a p h t h a l e n e a n d p h e n a n t h r e n e t h e f o l l o w i n g c o f a c t o r swere a l s o a d d e d : DPNH2 ( 0 . 2 m M ) , n i c o t i n a m i d e ( 2 m M ) ,TPN ( 0 - 2 m M ) , g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e ( 2 m M ) , g l u c o s e 6 -p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( 0 - 0 1 %) a n d 1 m l . o f m i c r o s o m es u s p e n s i o n p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y B o o t h e t a l . ( 1 9 6 0 a ) .Tw o i n c u b a t i o n f l a s k s were u s e d f o r e a c h s u b s t r a t e , on ec o n t a i n i n g 2 m l . o f s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n a n d t h e o t h e re i t h e r 2 m l . o f s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n w h i c h had b e e nh e a t e d a t 1 0 0 0 f o r 5 m i n . b e f o r e t h e i n c u b a t i o n or 2 m l . o fb u f f e r s o l u t i o n .The m i x t u r e s were i n c u b a t e d a t 3 7 0 f o r t i m e s w h i c hv a r i e d b e t w e e n 2 m i n . a n d 1 h r . , a c c o r d i n g t o t h e s u b s t r a t e ,t h e same t i m e b e in g u s e d f o r e a c h p a i r o f f l a s k s c o n t a i n i n gt h e same s u b s t r a t e . T h e p r o d u c t s were a d s o r b e d on c h a r c o a land e l u t e d a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d t h e e l u a t e s weree v a p o r a t e d t o d r y n e s s a n d m e t h a n o l ( 0 - 2 5 m l . ) c o n t a i n i n ga q. 1% NH3 ( s p . g r . 0 - 8 8 ) was a d d e d t o t h e r e s i d u e s . F o re a c h s u bs t r a t e t h e same v o l u m e o f t h e m e t h a n o l e x t r a c tf r o m t h e two e x p e r i m e n t s ( b o i l e d a n d f r e s h s o l u b l e l i v e rf r a c t i o n ) was a p p l i e d w i t h m i c r o p i p e t t e s t o c h r o m a t o -g r a p h y p a p e r f o r c o m p a r i s o n . W i t h some s u b s t r a t e s o n l y as m a l l f r a c t i o n o f t h e m e t h a n o l was u s e d , t o a v o i d over-l o a d i n g . T h e d r i e d c h r o m a t o g r a m s were t r e a t e d w i t h t h en i n h y d r i n r e a g e n t f o l l o w e d b y t h e C u ( N O 3 ) 2 s o l u t i o n . Thes p o t s were c u t o u t , t h e c o l o u r e d c o m p o u n d s e l u t e d w i t h50% m e t h a n o l a n d t h e e x t i n c t i o n s m e a s u r e d a t 5 1 0 m , u ont h e Unicam S P . 5 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r . A r e a c t i o nm i x t u r e w h i c h c o n t a i n e d s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n a nd GSHb u t no s u b s t r a t e was t r e a t e d i n t h e same way f o r u s e a s ab l a n k .I n t h e e x p e r i m e n t s w i t h n a p h t h a l e n e and p h e n a n t h r e n e ,o t h e r p a p e r c h r o m a t o g r a m s were t r e a t e d w i t h t h e d i a z o -t i z e d p - n i t r o a n i l i n e r e a g e n t s ( 3 ) and ( 4 ) .

RESULTSM e t a b o l i s m o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e . Th e c on-v e r s i o n o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e i n t o N - a c e t y l -

S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - y s t e i n e ( B r a y e t a l .

T a b l e 3 . I n t r a c e l l u l a r l o c a t i o n o f t h e enzymeS a m p l e s o f t he f r a c t i o n s o f 1 i n 1 0 r a t - l i v e r h o m o g e n a t ei n 0 - 2 5 m - s u c r o s e were i n c u b a t e d w i t h GSH ( 5 mM) a n d

3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e ( 1 m m ) i n 0 - l M - p y r o p h o s p h a t eb u f f e r , p H 8 - 0 ( t o t a l v o l . 3 m l . ) .I n t r a c e l l u l a r f r a c t i o n

W h o l e h o m o g e n a t eN u c l e iM i t o c h o n d r i aM i c r o s o m e sS o l u b l e f r a c t i o n

A c t i v i t y( u n i t s / m l . )1 5 - 80 - 80 - 80 - 71 3 - 0

A c t i v i t y( a s % o f w h o l eh o m o g e n a t e )1 0 05548 2

T a b l e 4 . D i s t r i b u t i o n o f t h e enzyme i n t h es o l u b l e f r a c t i o n s o f r a t t i s u b e sR e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n e d GSH ( 5 m m ) , 3 : 4 - d i c h l o r o -n i t r o b e n z e n e ( 1 mM) a n d s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n s i n O - M-p y r o p h o s p h a t e b u f f e r , p H 8 - 0 ( t o t a l v o l . 3 m l . ) .

T i s s u eL i v e rH e a r tK i d n e yL u n gS p l e e nB l o o d

1 0 2 xS p e c i f i ca c t i v i t y( u n i t s / m g .o f p r o t e i n )9 6 - 22 - 92 - 41 - 60 - 50 - 1

1 9 5 7 ) i n t h r e e s t a g e s i s demonstrated by t h er e s u l t s i n T a b l e 2 . Th e f i r s t r e a c t i o n , which i sc a t a l y s e d by t h e s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n , i s t h e r e -p l a c e m e n t o f t h e para c h l o r i n e a t o m by GSH t oform S - ( 2 - c h l o r o - 4 -n i t r o p he n y l ) g l u t a t h i o n e . I f GSHi s r e p l a c e d by c y s t e i n e or a c e t y l c y s t e i n e i n t h er e a c t i o n mixture no c o r r e s p o n d i n g d e r i v a t i v e s canbe d e t e c t e d on t h e c h r o m a t o g r a m s . Kidney homo-g e n a t e removes g l y c i n e a nd g l u t a m i c a c i d fromS - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e t o form S -( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n e , which i s thena c e t y l a t e d by l i v e r s l i c e s t o t h e m e r c a p t u r i c a c i d ,N - a c e t y l - S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n e .

C o l o u r w i t hn i n h y d r i n a n dC u ( N O ) 2RedRedRedRedO r a n g eO r a n g e

C o l o u r w i t hN a 2 C O ,Y e l l o wY e l l o wY e l l o wY e l l o wP a l e y e l l o wP a l e y e l l o w

V o l . 7 9 5 1 9


5/9

J . BOOTH, E . BOYLAND AND P . SIMSL o c a t i o n o f t h e e n z y m e . Th e e s t i m a t i o n s o fenzyme a c ti v i ty i n t h e i n t r a c e l l u l a r f r a c t i o n s o f ar a t - l i v e r h o m o g e n a t e i n 0 2 5 M - s u c r o s e s h o w s t h a t82% o f t h e a c t i v i t y i s p r e s e n t i n t h e s o l u b l ef r a c t i o n ( T a b l e 3 ) . Th e a c t i v i t i e s o f t h e s o l u b l e

f r a c t i o n s o f v a r i o u s r a t t i s s u e s a r e l i s t e d i n T a b l e 4 ,w h i c h s h o w s t h a t l i v e r h a s b e t w e e n 3 0 and 2 0 0t i m e s t h e a c t i v i t y o f t h e o t h e r t i s s u e s i n v e s t i g a t e d .Some p r o p e r t i e s o f t h e p a r t i a U y p u r i f i e d e n z y m e .Th e a c t i v i t y i s c o m p l e t e l y d e s t r o y e d by h e a t i n g a t1 0 0 0 f o r 5 m i n . and i s n o t a f f e c t e d by d i a l y s i s . Th ei n i t i a l r e a c t i o n r a t e u n d e r t h e c o n d i t i o n s d e s c r i b e di s c o n s t a n t f o r a t l e a s t 1 0 m i n . and i s d i r e c t l y p r o -p o r t i o n a l t o enzyme c o n c e n t r a t i o n when t h i s i sa d j u s t e d t o g i v e a c h a n g e i n E a t 3 4 4 mu o f 0 . 2 /m i n . o r l e s s . Th e p H - a c t i v i t y c u r v e ( F i g . 3 ) s h o w sa b r o a d r e g i o n o f optimum a c t i v i t y b e t w e e n 7 5 a n d9 0 , b u t a r a p i d d e c r e a s e on e i t h e r s i d e o f t h e s ev a l u e s . R e p l a c e m e n t o f p y r o p h o s p h a t e b u f f e r byN a 2 C O 3 - N a H C O 3 b u f f e r , o f t h e same m o l a r i t y a n dpH, a t t h e pH o f optimum a c t i v i t y had n o e f f e c t ont h e r e a c t i o n r a t e .GSH was u s e d t h r o u g h o u t a t a c o n c e n t r a t i o n o f5 mM, and i n c r e a s i n g t h i s v a l u e p r o d u c e d noi n c r e a s e i n enzyme a c t i v i t y . A l t h o u g h i t c o u l d b ed e m o n s t r a t e d t h a t a d e c r e a s e i n GSH c o n c e n t r a -t i o n c a u s e d a d e c r e a s e i n a c t i v i t y , a q u a n t i t a t i v e

1 6

. 1 20

S

o0

ODaL 4Q

0

0

6 7 8 9 10p H

F i g . 3 . p H - A c t i v i t y cu rve. R e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e ( 1 m m ) , GS H ( 5 mm) a n d 0 -2 5 m l .o f e n z y m e s o l u t i o n i n 3 m l . o f 0 1 I m - b u f f e r s o l u t i o n , t h ef i n a l p H v a l u e s b e i n g s h o w n . * , E x p t . 1 i n p y r o p h o s p h a t eb u f f e r ; A, E x p t . 2 i n p y r o p h o s p h a t e b u f f e r ; 0, E x p t . 3 i nN a 2 C O - N a H C O 0 b u f f e r .

s t u d y o f t h i s f a c t o r wa s n o t u n d e r t a k e n a s i t wasu n c e r t a i n w h a t p r o p o r t i o n o f GSH r e m a i n e d i n t h er e d u c e d f o r m d u r i n g t h e e x p e r i m e n t s . No a c t i v i t ywas o b s e r v e d when GSH was r e p l a c e d by t h e samec o n c e n t r a t i o n o f GSSG, c y s t e i n e o r a c e t y l c y s t e in e .Th e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f t h e GSH, c y s t e i n e anda c e t y l c y s t e i n e d e r i v a t i v e s o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o -b e n z e n e a r e a l l v e r y s i m i l a r ( c f . Bray e t a l . 1 9 5 9 b ) ,s o t h a t i f any r e a c t i o n ha d t a k e n p l a c e a c h a n g e i nE a t 3 4 4 m , u w o u l d h a v e b e e n a p p a r e n t . T h i s c o n -f i r m s t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h p a p e r c h r o m a t o -g r a p h y , i n w h i c h GSH was t h e o n l y o n e o f t h e s et h r e e S H compounds w h i c h wa s c o n v e r t e d i n t o ad e r i v a t i v e o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e by t h es o l u b l e l i v e r f r a c t i o n .I n v e s t i g a t i o n s o n t h e e f f e c t o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o -b e n z e n e c o n c e n t r a t i o n w e r e r e s t r i c t e d by t h es o l u b i l i t y ( 1 m m ) o f t h i s s u b s t r a t e , and i t was n o tp o s s i b l e t o s a t u r a t e t h e e n z y m e . H o w e v e r , t h ee f f e c t o f v a r i o u s s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s b e l o wt h i s v a l u e a r e shown i n F i g . 4 i n t h e f o r m o f aL i n e w e a v e r & Burk ( 1 9 3 4 ) p l o t , and t h e K , m c a l c u -l a t e d f r o m t h e s e v a l u e s wa s 2 - 5 mm ( 2 . 5 x 1 0 - 3 m ) .Th e i n h i b i t i o n o f S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a -t h i o n e f o r m a t i o n b y o t h e r c o m p o u n d s w h i c h were

2 3 41 / SF i g . 4 . E f f e c t o f b e n z y l c h l o r i d e a n d 1 : 2 - e p o x y - 1 : 2 : 3 : 4 -t e t r a h y d r o n a p h t h a l e n e o n t h e r a t e o f S - ( 2 - c h l o r o - 4 -n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e f o r m a t i o n . 8 , 3 : 4 - D i c h l o r o n i t r o -b e n z e n e o o n e n . ( m m ) ; V , i n i t i a l r a t e o f f o r m a t i o n o f S - ( 2 -c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e ( ! L m o l e s / m l . / m i n . ) . R e -a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e , GSH( 5 mm) a n d 0 - 2 5 m l . o f e n z y m e s o l u t i o n i n 3 m l . o f 0 O I M -p y r o p h o s p h a t e b u f f e r , p H 8 * 0 , w i t h t h e f o l l o w i n g a d d i t i o n s -0 , n o n e ; A , 0 . 3 mm- a n d 0 0 . 6 m m - 1 : 2 - e p o x y - 1 : 2 : 3 : 4 -t e t r a h y d r o n a p h t h a l e n e ; a , 0 . 6 m m - b e n z y l c h l o r i d e .

5 2 0 1 9 6 1


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ENZYMIC CONJUGATIONS WITH GLUTATHIONEshown by p a p e r c h r o m a t o g r a p h y t o form GSHd e r i v a t i v e s i s a l s o shown i n F i g . 4 . At a l l t h e 3 : 4 -d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e c o n c e n t r a t i o n s s t u d i e d , i . e .1 , 0 - 6 7 , 0 - 5 , 0 4 , 0 3 3 and 0 - 2 8 5 m m, t h e a d d i t i o n o f0 - 6 and 03 m M - 1 : 2 - e p o x y - 1 : 2 : 3 : 4 - t e t r a h y d r o n a p h -t h a l e n e c a u s e d 5 5 and 4 0 % i n h i b i t i o n r e s p e c t i v e l y ,w h e r e a s a t t h e s ame c o n c e n t r a t i o n s o f 3 : 4 - d i -c h l o r o n i t r o b e n z e n e , 0 - 6 m M - b e n z y l c h l o r i d e c a u s e d4 4 % i n h i b i t i o n . F u r t h e r m o r e , when t h e c o n c e n -t ra t i o n o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e wa s k e p t c o n -s t a n t a t 1 m m, t h e a d d i t i o n o f 0 - 2 , 0 4 , 0 - 6 , 0 . 8 a nd1 m M - b e n z y l c h l o r i d e p r o d u c e d 1 7 , 3 3 , 4 3 , 5 8 a nd6 8 % i n h i b i t i o n r e s p e c t i v e l y . T h e r e f o r e , r e g a r d i n g3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e a s t h e s u b s t r a t e and t h eo t h e r two c o m p o u n d s a s i n h i b i t o r s , t h e i n h i b i t i o ni s o f a n o n - c o m p e t i t i v e n a t u r e s i n c e i t i s i n d e p e n d e n to f s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n b u t d e p e n d e n t oni n h i b i t o r c o n c e n t r a t i o n .The a d d i t io n o f t h e f o l l o w i n g c o m p o u n d s a t af i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 mM ha d no e f f e c t on t h ei n i t i a l r e a c t i o n r a t e : TPNH2, DPNH2, T P N , DPN,f l a v i n m o n o n u c l e o t i d e , ATP and M g S O 4 , a s c o r b i ca c i d , c y s t e i n e , a c e t y l c y s t e i n e , e t h y l e n e d i a m i n e -t e t r a - a c e t a t e , KCN, N a F , Z n S O 4 and M g C 1 2 .F o r m a t i o n o f g l u t a t h i o n e c o n j u g a t e s w i t h v a r i o u - s8 u b s t r a t e s . Th e f o r m a t i o n o f t h e GSH c o n j u g a t e sw a s d e m o n s t r a t e d b y t h e a p p e a r a n c e o f n i n h y d r i n -p o s i t i v e s p o t s when t h e s u b s t r a t e s , GSH a n ds o l u b l e l i v e r f r a c t i o n were i n c u b a t e d i n 0 - 1 M -p y r o p h o s p h a t e b u f f e r , p H 8 - 0 . With s o m e s u b -s t r a t e s a GSH c o n j u g a t e c o u l d b e d e t e c t e d o n l ywhen f r e s h s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n wa s p r e s e n t i n t h ei n c u b a t i o n m i x t u r e , i n d i c a t i n g t h a t t h e s e r e a c t i o n shad b e e n b r o u g h t a b o u t b y a n enzyme i n t h e l i v e r

f r a c t i o n . O t h e r s u b s t r a t e s f o r m e d a GSH c o n j u -g a t e i n t h e p r e s e n c e o f b o i l e d l i v e r f r a c t i o n , b u t ag r e a t e r a mo u n t o f t h e s a m e d e r i v a t i v e , a s d e t e r -m i n e d b y t h e d i f f e r e n c e i n e x t i n c t i o n a t 5 1 0 m , ua f t e r r e a c t i o n w i t h n i n h y d r i n and C u ( N O 3 ) 2 , whent h e l i v e r f r a c t i o n wa s f r e s h . I t wa s assumed t h a t i nt h e s e cases b o t h c h e m i c a l and e n z y m i c r e a c t i o n shad o c c u r r e d . I n no c a s e , h o w e v e r , wa s t h e ne wn i n h y d r i n - p o s i t i v e compound f o r m e d i f e i t h e r t h es u b s t r a t e or GSH wa s o m i t t e d . The d i f f e r e n c e i ne x t i n c t i o n s o b s e r v e d b e t w e e n t h e t wo e x p e r i m e n t sw i t h t h e s a m e s u b s t r a t e r a n g e d f r o m a t h r e e - t o at e n - f o l d i n c r e a s e . H o w e v e r , t h e y c o u l d s e r v e o n l yt o i n d i c a t e t h a t a n e n z y m i c a s w e l l a s a c h e m i c a lr e a c t i o n had t a k e n p l a c e , s i n c e a k i n e t i c s t u d y w i t he a c h s u b s t r a t e and t h e s y n t h e s i s o r i s o l a t i o n o f t h ec o r r e s p o n d i n g GSH d e r i v a t i v e would b e n e e d e d t op u t them on a q u a n t i t a t i v e b a s i s . B e n z y l c h l o r i d e ,w h i c h r e a c t s c h e m i c a l l y and e n z y m i c a l l y , wa s u s e dt o c o n f i r m t h e s p e c i f i c i t y o f t h e s y s t e m f o r GSH.P a p e r c h r o m a t o g r a m s o f r e a c t i o n m i x t u r e s i nw h i c h GSH had b e e n r e p l a c e d by GSSG s h o w e dt h a t no r e a c t i o n had t a k e n p l a c e , a nd whenc y s t e i n e or N - a c e t y l c y s t e i n e r e p l a c e d t h e GSH t h ec h e m i c a l r e a c t i o n o n l y wa s o b s e r v e d . W i t h t h es u b s t r a t e s i o d o b e n z e n e , n a p h t h a l e n e , 1 - c h l o r o -n a p h t h a l e n e and p h e n a n t h r e n e t h e r e wa s nof o r m a t i o n o f GSH c o n j u g a t e s u n l e s s m i c r o s o m e sand TPNH2 were a l s o a d d e d . Th e p r o p e r t i e s onp a p e r c h r o m a t o g r a m s o f t h e GS H c o n j u g a t e sd e t e c t e d i n t h e s e r e a c t i o n s a r e l i s t e d i n T a b l e 5 .N a p h t h a l e n e a l s o y i e l d e d a compound w h i c hg a v e a b l u e c o l o u r w i t h r e a g e n t 4 a n d w a s i n -d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t r a n s - 1 : 2 - d i h y d r o - 1 : 2 - d i h y d r -

T a b l e 5 . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f g l u t a t h i o n e c o n j u g a t e sS o l v e n t s y s t e m s a r e a s d e s c r i b e d i n T a b l e 1 . A l l c o n j u g a t e s g a v e p i n k c o l o u r s w i t h t h e n i n h y d r i n - C u ( N O 0 3 ) 2r e a g e n t . T y p e o f r e a c t i o n i s i n d i c a t e d b y A , c h e m i c a l a n d B , e n z y m i c .

S u b s t r a t e3 : 4 - D i c h l o r o n i t r o b e n z e n e2 : 4 - D i c h l o r o n i t r o b e n z e n e2 : 3 : 5 : 6 - T e t r a c h l o r o n i t r o b e n z e n e3 : 4 : 5 : 6 - T e t r a c h l o r o - 1 : 2 - e p o x y c y c l o h e x a n eB e n z y l c h l o r i d eB r o m o e t h a n eI - B r o m o p r o p a n eE t h y l m e t h a n e s u l p h o n a t eS u l p h o b r o m o p h t h a l e i n1 : 2 - E p o x y - 1 : 2 : 3 : 4 - t e t r a h y d r o n a p h t h a l e n eI o d o b e n z e n e *N a p h t h a l e n e *1 - C h l o r o n a p h t h a l e n e *P h e n a n t h r e n e *

R p o f GSH d e r i v a t i v eS o l v e n t ( 1 ) S o l v e n t ( 2 )

0 - 4 5 0 - 6 20 - 4 2 0 - 6 00 - 6 2 0 - 7 20 - 4 20 - 5 00 - 3 30 - 4 40 - 3 30 - 1 90 - 4 90 - 4 00 - 3 7 t0 - 4 90 - 4 3 t0 - 3 8 T

0 - 6 40 - 6 70 - 5 20 - 6 20 - 5 20 - 3 50 - 6 30 - 5 60 - 4 7 t0 - 6 50 - 6 1 t 10 - 5 7 T

T y p e o fr e a c t i o no b s e r v e dBBBBA , BA , BA , BA , BA , BA , BBA , BBB

R e f e r e n c e t o m e r c a p t u r i c a c i de x c r e t i o n i n u r i n eB r a y , J a m e s & T h o r p e ( 1 9 5 7 )B r a y e t a l . ( 1 9 5 7 )B r a y , H y b s , J a m e s & T h o r p e( 1 9 5 3 )B r a y , J a m e s & T h o r p e ( 1 9 5 8 )T h o m s o n , Ma w & Y o u n g ( 1 9 5 8 )G r e n b y & Y o u n g ( 1 9 5 9 , 1 9 6 0 )R o b e r t s & W a r w i c k ( 1 9 5 8 )B o y l a n d & S i m s ( 1 9 6 0 )H e l e ( 1 9 2 4 ) ; M i l l s & Wood ( 1 9 5 3 )B o u r n e & Y o u n g ( 1 9 3 4 )C o r n i s h & B l o c k ( 1 9 5 8 )

* R e q u i r e d m i c r o s o m e s a n d T P N H 2 .t G a v e b l u e c o l o u r s w i t h d i a z o t i z e d p - n i t r o a n i l i n e a n d N a 2 C O 3 ( r e a g e n t 3 ) .t G a v e o r a n g e c o l o u r s w i t h r e a g e n t ( 4 ) .

V o l . 7 9 5 2 1


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J . BOOTH, E . BOYLAND AND P . SIMSo x y n a p h t h a l e n e on p a p e r c h r o m a t o g r a m s . P h e n -a n t h r e n e y i e l d e d t wo compounds i n d i s t i n g u i s h a b l efrom t r a n 8 - 1 : 2 - d i h y d r o - 1 : 2 - d i h y d r o x y - and t r a n s -9 : 1 0 - d i h y d r o - 9 : 1 0 - d i h y d r o x y - p h e n a n t h r e n e , whichg a v e b l u e and o r a n g e c o l o u r s r e s p e c t i v e l y on p a p e rc h r o m a t o g r a m s t r e a t e d w i t h r e a g e n t 4 .

DISCUSSIONTh e d e t o x i c a t i o n o f f o r e i g n c o m p o u n d s , s u c h a st h e m o n o h a l o g e n o b e n z e n e s ( B a u m a n n & P r e u s s e ,1 8 7 9 ; J a f f e , 1 8 7 9 ) , a s m e r c a p t u r i c a c i d s h a s b e e nknown f o r m a n y y e a r s , and s e v e r a l GSH com-p o u n d s h a v e b e e n s u g g e s t e d a s t h e s o u r c e o f t h ec y s t e i n e r e s i d u e s . Th e p o s s i b i l i t y t h a t GSH wa si n v o l v e d i n t h e d e t o x i c a t i o n o f a v e r t i n wa s s u g -g e s t e d by W a e l s c h ( 1 9 3 0 ) . A d m i n i s t r a t i o n o fn a p h t h a l e n e t o r a b b i t s c a u s e d a d e c r e a s e i n t h eGSH c o n t e n t o f t h e e y e l e n s and l i v e r ( N a k a s h i m a ,

1 9 3 4 ) and Ya m a mo to ( 1 9 4 0 ) f o u n d t h a t whenb r o m o b e n z e n e wa s g i v e n t o r a b bi t s t h e r e wa s ad e c r e a s e i n t h e GSH l e v e l i n s e v e r a l o r g a n s , p a r t i c u -l a r l y l i v e r , w h i c h wa s p a r a l l e l e d b y t h e a m o un t o fp - b r o m o p h e n y l m e r c a p t u r i c a c i d e x c r e t e d . Bromo-b e n z e n e , when g i v e n t o r a t s , c a u s e d a n i n c r e a s e i nGSH l e v e l s i n t h e l i v e r and k i d n e y 3 0 m i n . a f t e ra d m i n i s t r a t i o n , f o l l o w e d b y a d e c r e a s e i n t h e l e v e l sl a s t i n g f o r 2 d a y s , and i t wa s s u g g e s t e d t h a t t h i sd e c r e a s e wa s d u e t o t h e f o r m a t i o n o f s u l p h u r i ca c i d e s t e r s and a m e r c a p t u r i c a c i d ( B i n e t & W e l l e r s ,1 9 5 1 ) . B a r n e s e t a l . ( 1 9 5 9 ) g a v e a v a r i e t y o fm e r c a p t u r i c a c i d p r e c u r s o r s t o r a t s and f o u n d f a l l si n t h e l i v e r GSH l e v e l a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o ft h e c o m p o u n d s ; t h e s e f a l l s c o u l d b e r e l a t e d t o t h eamounts o f m e r c a p t u r i c a c i d s f o r m e d . One o ft h e s e c o m p o u n d s wa s 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e ,and i t had b e e n shown t h a t r a b b i t s d o s e d w i t h t h i ss u b s t a n c e e x c r e t e d t h e m e r c a p t u r i c a c i d , N - a c e t y l -S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n e ( B r a y e t a l .1 9 5 7 ) . Th e p r e s e n t work h a s shown t h a t t h e b i o -s y n t h e s i s o f t h i s m e t a b o l i t e c a n b e c a r r i e d ou t b yt i s s u e p r e p a r a t i o n s i n t h e t h r e e s t a g e s s u g g e s t e d b yBray e t a l . ( 1 9 5 9 b ) . The f i r s t r e a c t i o n , w h i c h i sc a t a l y s e d b y t h e s o l u b l e f r a c t i o n o f r a t l i v e r , i s t h er e p l a c e m e n t o f t h e p a r a c h l o r i n e a t o m b y GSH.S i n c e t h e a c t i v i t y o f t h e f r a c t i o n i s d e s t r o y e d b yh e a t and i s not a f f e c t e d b y d i a l y s i s , i t a p p e a r s t ob e d u e t o a n enzyme w h i c h h a s no a b s o l u t e c o f a c t o rr e q u i r e m e n t s . Th e s e c o n d s t a g e i s t h e c o n v e r s i o n o fS - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e i n t o S - ( 2 -c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n e b y k i d n e y homo-g e n a t e , a r e a c t i o n w h i c h i s p r o b a b l y d u e t o t woenzymes p r e v i o u s l y f o u n d i n p i g k i d n e y and w h i c hc a t a l y s e t h e r e m o v a l o f t h e g l u t a m y l g r o u p f r o mg l u t a t h i o n e i t s e l f and t h e h y d r o l y s i s o f c y s t e i n y l -g l y c i n e ( O l s o n & B i n k l e y , 1 9 5 0 ) . T h a t g l u t a t h i o n ed e r i v a t i v e s c a n a l s o b e h a v e i n t h i s wa y h a s b e e nshown b y t h e c o n v e r s i o n o f S - ( p - c h l o r o b e n z y l ) -

g l u t a t h i o n e i n t o S - ( p - c h l o r o b e n z y l ) - L - c y s t e i n e byl i v e r s l i c e s o f v a r i o u s s p e c i e s ( B r a y e t a l . 1 9 5 9 a ) . I nt h e t h i r d s t a g e , r a t - l i v e r s l i c e s w e r e u s e d t o demon-s t r a t e t h e N - a c e t y l a t i o n o f S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o -p h e n y l ) - L - c y s t e i n e t o t h e m e r c a p t u r i c a c i d , a nda g a i n o t h e r s i m i l a r r e a c t i o n s have b e e n r e p o r t e d ,s u c h a s t h e N - a c e t y l a t i o n o f S - b e n z y l - D L - h o m o -c y s t e i n e by r a t - l i v e r and - k i d n e y s l i c e s (Gutmann &Wood, 1 9 5 1 ) and o f S - ( p - c h l o r o b e n z y l ) - L - c y s t e i n eby l i v e r s l i c e s ( B r a y e t a l . 1 9 5 9 b ) . Th e c o n v e r s i o n o fGSH d e r i v a t i v e s i n t o m e r c a p t u r i c a c i d s i n v i v o h a sb e e n d e m o n s t r a t e d by R o b e r t s & Warwick ( 1 9 5 8 ) ,wh o f o u n d t h a t when S - e t h y l g l u t a t h i o n e wa sa d m i n i s t e r e d t o r a t s i t wa s e x c r e t e d a s S - e t h y l -m e r c a p t u r i c a c i d , and S t e k o l ( 1 9 4 0 , 1 9 4 1 ) showedt h a t a d m i n i s t r a t i o n o f S - b e n z y l g l u t a t h i o n e a nd S -( p - b r o m o b e n z y l ) g l u t a t h i o n e t o r a t s r e s u l t e d i n t h ee x c r e t i o n o f N - a c e t y l - S - b e n z y l - L - c y s t e i n e a nd N-a c e t y l - S - ( p - b r o m o b e n z y l ) - L - c y s t e i n e r e s p e c t i v e l y .The enzyme c a t a l y s i n g t h e r e a c t i o n i n which t h epara c h l o r i n e a tom o f 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e i sr e p l a c e d by GSH a p p e a r s t o b e s p e c i f i c f o r GSH,b u t n o t f o r t h e o t h e r s u b s t r a t e , s i n c e i t wa s f o u n dt h a t GSH c o u l d n o t b e r e p l a c e d by GSSG, c y s t e i n e o rN - a c e t y l c y s t e i n e , w h e r e a s o t h e r compounds c o u l dr e p l a c e 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e . M a n y o f t h e s e

a r e known t o b e c o n v e r t e d i n t o m e r c a p t u r i c a c i d si n t h e body ( s e e T a b l e 5 ) . With 2 : 4 - a nd 3 : 4 -d i c h l o r o n it r o be n z e n e ( w h i c h y i e l d m e r c a p t u r i ca c i d s i n w h i c h c h l o r i n e atoms a r e r e p l a c e d byN - a c e t y l c y s t e i n e ) , and 2 : 3 : 5 : 6 - t e t r a c h l o r o n i t r o b e n -z e n e ( w h i c h y i e l d s a m e r c a p t u r i c a c i d by t h e r e -p l a c e m e n t o f t h e n i t r o g r o u p by a c e t y l c y s t e i n e ) , noGSH d e r i v a t i v e wa s o b t a i n e d i f t h e s o l u b l e l i v e rf r a c t i o n was b o i l e d b e f o r e t h e i n c u b a t i o n , i n d i c a t -i n g t h a t t h e s e r e a c t i o n s w e r e e n z y m i c . 3 : 4 : 5 : 6 -T e t r a c h l o r o - 1 : 2 - e p o x y c y c l o h e x a n e a l s o r e a c t e d w i t hGSH o n l y i n t h e p r e s e n c e o f t h e s o l u b l e l i v e rf r a c t i o n .With t h e s u b s t r a t e s b r o m o e t h a n e , 1 - b r o m o p r o -p a n e , b e n z y l c h l o r i d e , e t h y l m e t h a n e s u l p h o n a t eand 1 : 2 - e p o x y - 1 : 2 : 3 : 4 - t e t r a h y d r o n a p h t h a l e n e , a l l o fw h i c h a r e a l k y l a t i n g a g e n t s , r e a c t i o n s w i t h GSHb o t h i n t h e p r e s e n c e o f f r e s h and o f b o i l e d s o lu b lel i v e r f r a c t i o n was o b s e r v e d a l t h o u g h t h e f i r s tr e a c t i o n w a s m u ch f a s t e r . T h e s e r e a c t i o n s w e r ec a r r i e d o u t a t pH 8 , w h i c h i s t h e o p t i m u m pH o ft h e enzyme f o r 3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e , s o t h a tt h e o b s e r v e d c h e m i c a l r e a c t i o n , p r e s u m a b l yr e q u i r i n g i o n i z e d S H g r o u p s o f GSH, i s n o t u n -e x p e c t e d . S u l p h o b r o m o p h t h a l e i n , w h i c h a l s o r e -a c t e d w i t h GS H b o t h i n t h e p r e s e n c e and t h ea b s e n c e o f t h e e n z y m e , i s u s e d a s a t e s t s u b s t a n c ef o r l i v e r f u n c t i o n b e c a u s e i t i s r e m o v e d f r o m t h eb l o o d by t h e l i v e r and i t i s e x c r e t e d i n t h e b i l ep a r t l y i n t h e f o r m o f a GSH c o n j u g a t e ( J a v i t t ,W h e e l e r , B a k e r & Ramos, 1 9 5 9 ; Combes &S t a k e l u m , 1 9 6 0 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t t h i s l i v e r -

5 2 2 1 9 6 1


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V o l . 7 9 ENZYMIC CONJUGATIONS WITH GLUTATHIONE 5 2 3f u n c t i o n t e s t i s a c t u a l l y a measure o f t h e a c t i v i t yo f t h e e n z y m e .Th e s u b s t r a t e s i o d o b e n z e n e , n a p h t h a l e n e , 1 -c h l o r o n a p h t h a l e n e a n d p h e n a n t h r e n e d i d n o t r e a c tw i t h GSH i n t h e p r e s e n c e o f s o l u b l e l i v e r f r a c t i o na l o n e , b u t o n l y i f m i c r o s o m e s and TPNH2 w e r ea l s o p r e s e n t . With n a p h t h a l e n e , o n e o f t h e p r o -d u c t s t h u s o b t a i n e d was i n d i s t i n g u i s h a b l e on p a p e rc h r o m a t o g r a m s f r o m S - ( 1 : 2 - d i h y d r o - 2 - h y d r o x y - 1 -n a p h t h y l ) g l u t a t h i o n e , which h a s b e e n p r e v i o u s l yi d e n t i f i e d a s a m e t a b o l i t e o f n a p h t h a l e n e f o r m e d byl i v e r s l i c e s ( B o o t h e t a l . 1 9 6 0 b ) and i n t h e b i l e o fr a t s d o s e d w i t h n a p h t h a l e n e ( B o y l a n d , R a m s e y &S i m s , 1 9 6 1 ) . Th e s e c o n d p r o d u c t wa s t r a n 8 - 1 : 2 -d i h y d r o - 1 : 2 - d i h y d r o x y n a p h t h a l e n e , w h i c h h a s b e e nr e p o r t e d a s a p r o d u c t o f t h e a c t i o n o f m i c r o s o m e sa nd TPNH2 on n a p h t h a l e n e ( M i t o m a , P o s n e r , R e i t z& U d e n f r i e n d , 1 9 5 6 ; Booth & B o y l a n d , 1 9 5 7 ) .P h e n a n t h r e n e g a v e t wo GSH c o n j u g a t e s , and a l s oy i e l d e d t r a n 8 - 1 : 2 - d i h y d r o - 1 : 2 - d i h y d r o x y - and t r a n 8 -9 : 1 0 - d i h y d r o - 9 : 1 0 - d i h y d r o x y - p h e n a n t h r e n e , w h i c ha r e known m e t a b o l i t e s i n u r i n e ( B o y l a n d & W o l f ,1 9 5 0 ) .W h e n 1 : 2 - d i h y d r o n a p h t h a l e n e i s i n c u b a t e d w i t hr a t - l i v e r m i c r o s o m e s and TPNH2, p e r h y d r o x y l -a t i o n o c c u r s w i t h t h e f o r m a t i o n o f t r a n 8 - 1 : 2 : 3 : 4 -t e t r a h y d r o - 1 : 2 - d i h y d r o x y n a p h t h a l e n e , w h e r e a s i fGSH i s added S - ( 1 : 2 : 3 : 4 - t e t r a h y d r o - 1 - h y d r o x y - 1 -n a p h t h y l ) g l u t a t h i o n e i s a l s o f o r m e d . I f r a t s o l u b l el i v e r f r a c t i o n i s a l s o p r e s e n t t h e amounts o f t h eg l u t a t h i o n e c o n j u g a t e f o r m e d a r e m u ch i n c r e a s e d( B o o t h e t a l . 1 9 6 0 a ) . I t wa s s u g g e s t e d t h a t i n t h e s er e a c t i o n s t h e a c t i o n o f m i c r o s o m e s a n d TPNH2 wa st o c o n v e r t 1 : 2 - d i h y d r o n a p h t h a l e n e i n t o 1 : 2 - e p o x y -1 : 2 : 3 : 4 - t e t r a h y d r o n a p h t h a l e n e , w h i c h t h e n r e a c t e dw i t h GSH, e i t h e r w i t h o r w i t h o u t t h e enzymep r e s e n t i n t h e s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n , t o y i e l d t h eGSH c o n j u g a t e . I t seems p r o b a b l e t h a t , i n t h ep r e s e n t w o r k , t h e f o u r compounds r e q u i r i n g m i c r o -somes and TPNH2 i n a d d i t i o n t o t h e enzyme a r ef i r s t c o n v e r t e d i n t o s i m i l a r i n t e r r n e d i a t e s . Witht h e s e c o m p o u n d s , h o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f t h es o l u b l e l i v e r f r a c t i o n i s u s u a l l y n e c e s s a r y f o r t h ef o r m a t i o n o f t h e GSH c o n j u g a t e s , a l t h o u g ho c c a s i o n a l l y s m a l l amounts o f t h e GSH c o n j u g a t ed e r i v e d f r o m n a p h t h a l e n e , p r e s u m a b l y f o r m e d b y ac h e m i c a l r e a c t i o n w i t h t h e i n t e r m e d i a t e , h a v e b e e nd e t e c t e d i n e x p e r i m e n t s i n w h i c h b o i l e d s o l u b l el i v e r f r a c t i o n h a s b e e n u s e d .F i g . 4 s h o w s i n e f f e c t t h a t c o m p o u n d s w h i c h a r ea p p a r e n t l y a l t e r n a t i v e s u b s t r a t e s f o r t h e enzymei n h i b i t t h e r e a c t i o n o f GSH w i t h 3 : 4 - d i c h l o r o -n i t r o b e n z e n e n o n - c o m p e t i t i v e l y . T h i s i n d i c a t e st h a t t h e s e c o m p o u n d s a r e c o m b i n i n g w i t h t h eenzyme a t a p o i n t o t h e r t h a n t h e a c t i v e c e n t r e f o r3 : 4 - d i c h l o r o n i t r o b e n z e n e and w o u l d s e e m t o i m p l yt h a t t h e e n z y m i c r e a c t i o n s i n v o l v e d a r e d i f f e r e n t s of a r a s a c t i v e c e n t r e s a r e c o n c e r n e d . I t seems l i k e l y

t h a t t h e enzyme i n v o l v e d i n t h e s e r e a c t i o n s c a np r o d u c e a n a c t i v a t e d f o r m o f GSH w h i c h t h e nr e a c t s more r e a d i l y w i t h c e r t a i n c o m p o u n d s .H o w e v e r , s i n c e t h e d i a l y s e d s o l u b l e l i v e r f r a c t i o nwas u s e d t o c a t a l y s e t h e e n z y m i c r e a c t i o n s showni n T a b l e 5 , t h e p o s s i b i l i t y t h a t a l l t h e s e GSH c o n -j u g a t e s a r e n o t f o r m e d by t h e same enzyme i s n o tc o m p l e t e l y e l i m i n a t e d .

SUMMARY1 . An enzyme w h i c h c a t a l y s e s t h e f o r m a t i o n o fS - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e f r o m 3 : 4 - d i -c h l o r o n i t r o b e n z e n e h a s b e e n p a r t i a l l y p u r i f i e d f r o mt h e s o l u b l e f r a c t i o n o f r a t l i v e r .2 . S - ( 2 - C h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) g l u t a t h i o n e i s c o n -v e r t e d i n t o S - ( 2 - c h l o r o - 4 - n i t r o p h e n y l ) - L - c y s t e i n eby r a t - k i d n e y h o m o g e n a t e , and t h i s compound c a nb e a c e t y l a t e d t o t h e m e r c a p t u r i c a c i d , N - a c e t y l -S - ( 2 - c h l o r o - 4 -n i t r o p he n y l ) - L - c y s t e i n e by r a t - l i v e rs l i c e s .3 . Th e s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n c a n c a t a l y s e t h ef o r m a t i o n o f g l u t a t h i o n e c o n j u g a t e s f r o m anumber o f o t h e r m e r c a p t u r i c a c i d p r e c u r s o r s .4 . With b r o m o b e n z e n e , n a p h t h a l e n e , 1 - c h l o r o -n a p h t h a l e n e and p h e n a n t h r e n e , r a t - l i v e r m i c r o -s o m e s and r e d u c e d t r i p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d ea s w el l a s t h e s o l u b l e l i v e r f r a c t i o n a r e n e c e s s a r y i nt h e f o r m a t i o n o f t h e g l u t a t h io n e c o n ju g a t e s .5 . G l u t a t h i o n e c a n n o t b e r e p l a c e d by o x i d i z e dg l u t a t h io n e, c y s t ei n e o r N - a c e t y l c y s t e i n e i n t h e s e

s y s t e m s .T h i s i n v e s t i g a t i o n h a s b e e n s u p p o r t e d b y g r a n t s t o t h eC h e s t e r B e a t t y R e s e a r c h I n s t i t u t e ( I n s t i t u t e o f C a n c e rR e s e a r c h : R o y a l C a n c e r H o s p i t a l ) f r o m t h e M e d i c a lR e s e a r c h C o u n c i l , t h e B r i t i s h E m p i r e C a n c e r C a m p a i g n ,t h e J a n e C o f f i n C h i l d s M e m o r i a l Fund f o r M e d i c a l R e -s e a r c h , t h e Anna F u l l e r Fund a n d t h e N a t i o n a l C a n c e rI n s t i t u t e o f t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , U . S . P u bl icH e a l t h S e r v i c e .

REFERENCESB a r n e s , M . M . , J a m e s , S . P . & W o o d , P . B . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h e m .

J . 7 1 , 6 8 0 .B a u m a n n , E . & P r e u s s e , C . ( 1 8 7 9 ) . B e r . d t 8 c h . c h e m . G e 8 . 1 2 ,8 0 6 .B i n e t , L . & W e l l e r s , G . ( 1 9 5 1 ) . B u l l . S o c . C h i m . b i o l . , P a r i 8 ,3 3 , 2 7 9 .B o o t h , J . & B o y l a n d , E . ( 1 9 5 7 ) . B i o c h e m . J . 6 6 , 7 3 .B o o t h , J . , B o y l a n d , E . , S a t o , T . & S i m s , P . ( 1 9 6 0 a ) .B i o c h e m . J . 7 7 , 1 8 2 .B o o t h , J . , B o y l a n d , E . & S i m s , P . ( 1 9 6 0 b ) . B i o c h e m . J . 7 4 ,1 1 7 .B o o t h , J . , B o y l a n d , E . & T u r n e r , E . E . ( 1 9 5 0 ) . J . c h e m .S o c . p . 1 1 8 8 .B o u r n e , M . C . & Y o u n g , L . ( 1 9 3 4 ) . B i o c h e m . J . 2 8 , 8 0 3 .B o y l a n d , E . , R a m s e y , G . S . & S i m s , P . ( 1 9 6 1 ) . B i o c h e m . J .7 8 , 3 7 6 .B o y l a n d , E . & S i m s , P . ( 1 9 6 0 ) . B i o c h e m . J . 7 7 , 1 7 5 .B o y l a n d , E . & W o l f , G . ( 1 9 5 0 ) . B i o c h e m . J . 4 7 , 6 4 .


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5 2 4 J . BOOTH, E . BOYLAND AND P . SIMS 1 9 6 1B r a y , H . G . , F r a n k l i n , T . J . & J a m e s , S . P . ( 1 9 5 9 a ) .B i o c h e m . J . 7 1 , 6 9 0 .B r a y , H . G . , F r a n k l i n , T . J . & J a m e s , S . P . ( 1 9 5 9 b ) .B i o c h e m . J . 7 3 , 4 6 5 .B r a y , H . G . , H y b s , Z . , J a m e s , S . P . & T h o r p e , W. V . ( 1 9 5 3 ) .B i o c h e m . J . 5 3 , 2 6 6 .B r a y , H . G . , J a m e s , S . P . & T h o r p e , W. V . ( 1 9 5 7 ) . B i o c h e m .

J . 6 5 , 4 8 3 .B r a y , H . G . , J a m e s , S . P . & T h o r p e , W. V . ( 1 9 5 8 ) . B i o c h e m .J . 7 0 , 5 7 0 .C o m b e s , B . & S t a k e l u m , G . S . ( 1 9 6 0 ) . J . c l i n . I n v e s t . 3 9 ,1 2 1 4 .C o r n i s h , H . H . & B l o c k , W. D . ( 1 9 5 8 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 1 , 5 8 3 .F i n c h a m , J . R . S . ( 1 9 5 4 ) . J . g e n . M i c r o b i o l . 1 1 , 2 3 6 .G r e n b y , T . H . & Y o u n g , L . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h e m . J . 7 1 , 2 5 P .G r e n b y , T . H . & Y o u n g , L . ( 1 9 6 0 ) . B i o c h e m . J . 7 5 , 2 8 .G u t m a n n , H . R . & W o o d , J . L . ( 1 9 5 1 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 9 ,4 7 3 .H e l e , T . S . ( 1 9 2 4 ) . B i o c h e m . J . 1 8 , 5 8 6 .J a f f 6 , M . ( 1 8 7 9 ) . B e r . d t 8 c h . c h e m . G m e . 1 2 , 1 0 9 2 .J a v i t t , N . B . , W h e e l e r , H . O . , B a k e r , K . J . & R a m o s , 0 .( 1 9 5 9 ) . J . c l i n . I n v e s t . 3 8 , 1 0 1 5 .K n i g h t , R . H . & Y o u n g , L . ( 1 9 5 8 ) . B i o c h e m . J . 7 0 , 1 1 1 .L i n e w e a v e r , H . & B u r k , D . ( 1 9 3 4 ) . J . A m e r . c h e m . S o c . 5 6 ,6 5 8 .

M i l l s , G . C . & W o o d , J . L . ( 1 9 5 3 ) . J . b i o l . C h e m . 2 0 4 , 5 4 7 .M i t o m a , C . , P o s n e r , H . S . , R e i t z , H . C . & U d e n f r i e n d , S .( 1 9 5 6 ) . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y 8 . 6 1 , 4 3 1 .N a k a s h i m a , T . ( 1 9 3 4 ) . J . B i o c h e m . , T o k y o , 1 9 , 2 8 1 .O l s o n , C . K . & B i n k l e y , F . ( 1 9 5 0 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 6 , 7 3 1 .P a r k e , D . V . & W i l l i a m s , R . T . ( 1 9 5 1 ) . B i o c h e m . J . 4 8 , 6 2 4 .P i r i e , N . W. & H e l e , T . S . ( 1 9 3 3 ) . B i o c h e m . J . 2 7 , 1 7 1 6 .P o t t e r , V . R . & E l v e h j e m , C . A . ( 1 9 3 6 ) . J . b i o l . C h e m . 1 1 4 ,4 9 5 1 .R o b e r t s , J . J . & W a r w i c k , G . P . ( 1 9 5 8 ) . B i o c h e m . P h a r m a -c o l . 1 , 6 0 .S c h n e i d e r , W. C . & H o g e b o o m , G . H . ( 1 9 5 0 ) . J . b i o l . c h e m .1 8 3 , 1 2 3 .S t e k o l , J . A . ( 1 9 4 0 ) . P r o c . S o c . e x p . B i o l . , N . Y . , 4 3 , 1 0 8 .S t e k o l , J . A . ( 1 9 4 1 ) . J . b i o l . C h e m . 1 3 8 , 2 2 5 .S u t e r , F . ( 1 8 9 5 ) . H o p p e - S e y l . Z . 2 0 , 5 6 2 .T h o m s o n , E . A . R . , M a w , G . A . & Y o u n g , L . ( 1 9 5 8 ) .B i o c h e m . J . 6 9 , 2 3 r .U m b r e i t , W. W . , B u r r i s , R . H . & S t a u f f e r , J . F . ( 1 9 4 9 ) . I nM a n o m e t r i c T e c h n i q u e s a n d T i s s u e M e t a b o l i s m , 2 n d e d . ,p . 1 1 9 . M i n n e a p o l i s : B u r g e s s P u b l i s h i n g C o .W a e l s c h , H . ( 1 9 3 0 ) . A r c h . e x p . P a t h . P h a r m a k . 1 5 6 , 3 5 6 .W a r b u r g , 0 . & C h r i s t i a n , W. ( 1 9 4 1 ) . B i o c h e m . Z . 3 1 0 , 3 8 4 .Y a m a m o t o , K . ( 1 9 4 0 ) . M i t t . m e d . A k a d . K i o t o , 2 9 , 4 3 1 .C i t e d i n C h e m . A b s t r . ( 1 9 4 1 ) 3 5 , 4 4 8 4 .

B i o c h e m . J . ( 1 9 6 1 ) 7 9 , 5 2 4Th e I n t r i n s i c V i s c o s i t y o f M y o s i n a n d t h e I n t e r p r e t a t i o no f i t s Hydrodynamic P r o p e r t i e s

BY P . JOHNSON AD A . J . ROWED e p a r t m e n t o f C o U o i d S c i e n c e , U n i v er s i t y o f Cambrie( R e c e i v e d 1 4 N o v e m b e r 1 9 6 0 )

E a r l y work s u g g e s t e d a p a r t i c l e w e i g h t o f a b o u t8 0 0 0 0 0 f o r t h e m y o s i n m o l e c u l e , w i t h an a x i a lr a t i o ( J ) o f 1 0 0 : 1 ( P o r t z e h l , 1 9 5 0 ) , b u t morer e c e n t l y i t h a s a p p e a r e d t h a t some o f t h e d a t ae m p l o y e d w e r e i n e r r o r . F o r t h e s e d i m e n t a t i o nc o e f f i c i e n t , a d e t a i l e d a c c o u n t h a s b e e n g i v e n o f t h ep r o b a b l e c a u s e o f t h i s e r r o r i n t e r m s o f m o l e c u l a r -t r a n s f o r m a t i o n r e a c t i o n s o c c u r r i n g d u r i n g t h ee x p e r i m e n t s ( J o h n s o n & Rowe, 1 9 6 0 ) . T h e r e m a yw e l l h a v e b e e n s i m i l a r e r r o r s i n m u c h r e c e n t a s w e l la s e a r l y d i f f u s i o n w o r k ; a l s o i n v i s c o s i t y , l i g h t -s c a t t e r i n g and o s m o t i c - p r e s s u r e e x p e r i m e n t s . T h e r eh a s a s y e t , h o w e v e r , b e e n no g e n e r a l a g r e e m e n tupon r e v i s e d e s t i m a t e s o f t h e s i z e and s h a p e o f t h em y o s i n m o l e c u l e .

For t h e c o m p l e t e d e f i n i t i o n o f a n e l l i p s o i d o fr e v o l u t i o n h y d r o d y n a m i c a l l y e q u i v a l e n t t o t h em y o s i n m o l e c u l e , t h r e e i n d e p e n d e n t ( u s u a l l yk i n e t i c ) p a r a m e t e r s must b e k n o w n , t o g e t h e r w i t ht h e p a r t i a l s p e c i f i c volume ( v ) . Th e method o fS c h e r a g a & M a n d e l k e r n ( 1 9 5 3 ) t h e n p r o v i d e s a

c o n v e n i e n t means f o r t h e c a l c u l a t i o n o f t h e a x i a lr a t i o and t h e e f f e c t i v e v o l u m e / g . ( V ) o f t h i se l l i p s o i d . L e t u s t a k e t h e e x t r a p o l a t e d s e d i m e n t a -t i o n and d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s , [ S o 0 ] and [ D O ] , a ndt h e i n t r i n s i c v i s c o s i t y , [ n ] , a s t h e t h r e e k i n e t i c p a r a -m e t e r s . [ S o ] h a s b e e n a c c u r a t e l y d e t e r m i n e du n d e r c o n d i t i o n s w h e r e m y o s i n i s known t o b es t a b l e ( H o l t z e r & L o w e y , 1 9 5 6 , 1 9 5 9 ; J o h n s o n &R o w e , 1 9 6 0 ) , a s a l s o h a s [ D r o ] ( P a r r i s h & M o m -m a e r t s , 1 9 5 4 ) , a l t h o u g h t h e v a l u e g i v e n byP a r r i s h & Mommaerts s h o u l d b e c o n f i r m e d by ani n d e p e n d e n t and e q u a l l y t h o r o u g h s t u d y . Bu t t h ev a l u e s g i v e n i n t h e l i t e r a t u r e f o r [ X q ] show a s u r -p r i s i n g d e g r e e o f s c a t t e r , t h e f o l l o w i n g b e i n g amongt h o s e r e p o r t e d ( d l . / g . ) : 2 * 2 ( M o m m a e r t s , 1 9 4 5 , andW e b e r , 1 9 5 0 a , b ) ; 1 - 8 - 2 * 0 ( W e b e r & P o r t z e h l ,1 9 5 1 ; P o r t z e h l , Schramm & W e b e r , 1 9 5 1 ) ; 2 - 3 ,2 * 2 and 2 * 4 ( H o l t z e r & L o w e y , 1 9 5 6 ) . S i n c e t h ec o m p l e t i o n o f t h i s work H o l t z e r & Lowey ( 1 9 5 9 )h a v e r e p o r t e d a v a l u e o f 2 * 1 7 a t 2 5 0 , and a r a t h e rh i g h e r v a l u e ( 2 . 2 4 ) a t 0 . 7 0 . I n v i e w o f t h e o c c u r -

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