BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA

BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA

JAUNĀ

BIOTEHNOLOĢIJAI. Muižnieks, 2013. g.

rafA promotera fragmenta fūtprints ar norādītajiem

proteīniem.

Vai var atrast represora un CAP proteīna saistīšanās vietas, noteikt

to sekvences ?

SVEŠA PROTEĪNA EKSPRESIJA BAKTĒRIJĀS

REPORTIERGĒNI: -galaktozidāze; -glikuronidāze; CAT; luciferīn luciferāze; GFP. DNS TOPOLOĢIJA UN ĢEOMETRIJA

SEKVENCES ATKARĪGA DNS LIEKŠANA liekto segmentu veidošanās modeļi; liekto DNS segmentu lokalizācija

DNS SUPERSPIRALIZĀCIJA plazmīdu DNS superspiralizācijas modeļi; plazmīdu superspiralizācijas blīvuma noteikšana

SUPERSPIRALIZĀCIJAS LOMA PLAZMĪDU FUNKCIJĀSreplikācijas un struktūras stabilitātes saistība; ekspresijas regulācija; rekombinācijas regulācija

REPORTIERGĒNI

Gene Product Assay

lacZ -galactosidase

indicator plates, colorimetric enzyme assay of cell extracts,

selection for Lac+

gus -glucuronidase

indicator plates, colorimetric enzyme

assay of cell extracts -- used a lot in plants

CAT chloramphenicol acetyltransferase

enzyme assay or ELISA for gene product,

selection for chloramphenicol

resistance

LUC firefly luciferase Luminiscence of tissues,

luminometric assays

GFP green fluorescent

protein

fluorescence of colonies, fluorescence of cells or

subcellular compartments, imaging

live cells

REPORTIERGĒNI

galaktozidāze

5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-D-

galactopyranoside

galaktozidāze

galaktozidāze

United States Patent 5,268,463

Jefferson December 7, 1993

Plant promoter .alpha.-glucuronidase gene construct

Abstract

The present invention relates to the .beta.-glucuronidase (GUS) gene fusion system, and to the cloning and characterization of the .beta.-glucuronidase and glucuronide permease genes of Escherichia coli. It is based on the surprising discovery that gene fusions comprising the .beta.-glucuronidase gene may be effectively expressed in a wide variety of organisms to produce active .beta.-glucuronidase enzyme. Because of the abundance and availability of useful substrates for .beta.-glucuronidase enzyme, GUS gene fusions may serve as a superior reporter gene system as well as an effective means of altering cellular phenotype. In conjunction with recombinant glucuronide permease, which may be used to render host cells permeable to .beta.-glucuronidase substrates, the GUS gene fusion system offers almost unlimited applications in the fields of plant and animal genetic engineering.

Inventors: Jefferson; Richard A. (Cambridge, GB2)

Appl. No.: 07/447,976 Filed: December 8, 1989

glukuronidāze

5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-

Gluc)

4-methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide

(MUG)

glukuronidāze

Rice anthers and style showing

GUS expression

glukuronidāze

Proteīnu sintēze,

struktūras, modifikācija,

acetiltransferāze

Hloramfenikols, levomicetīns

ANTIBIOTIKAS: DARBĪBAS PRINCIPS, INAKTIVĀCIJA

CAT

CAT

CAT

Luciferāze

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Firefly_luciferin.svg

Luciferāze

Medūza Aequorea victoria no ZA rietumkrasta ūdeņiem

GFP

GFP veido viens 238 aminoskābes garš polipeptīds. Tā ir kausam līdzīga trešējā struktūra, kuras iekšienē 65., 66. un 67. aminoskābes veido UV un zilo gaismu absorbējošu centru, kas rada zaļu fluorescenci.

GFP

GFP

Osamu Shimomura

Martin Chalfie

Roger Y. Tsien

The Nobel Prize in Chemistry 2008 for the discovery and development of the green

fluorescent protein, GFP

GFP

GFP

DNS ĢEOMETRIJA

SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS

LIEKŠANA

DNS konformācija: A; B; Z formas

koordnātes slīpums = tip pacēlums = inclination

atvērums = openingpropellera pagrieziens propeller twist

ieliekums = buckle

R.E. Dickerson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 1797-1803.

DNS elementu ģeometrija

vērpe = twist

savērsums = tiltP

sagāzums = roll

Persistences garums – polimera elastīguma mērs: attālums, ārpus kura robežām nav iespējams

prognozēt polimēra ass orientācijas izmaiņas. DNS persistences garums ~ 50 nm jeb ~ 150 b.p.

DNS elementu ģeometrija

Secīgo bāzu pāru mijiedarbības enerģija – stacking energy

SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA

http://dna.kdna.ucla.edu/parasite_course-old/kdna/subchapters/kdna1.htm

Leishmania un citas tripanosomas satur vienu mitohondriju, kurā atrodams liels daudzums

mitohondriālās jeb t.s. kinetoplasta DNS.

Liekti DNS fragmenti PAAG elektroforēzē kustas lēnāk nekā tikpat gari taisni fragmenti



Liektās DNS struktūras veidošanās modeļi

Estimation of wedge components in curved DNA

L.E.Ulanovsky, E.N.Trifonov

Nature, 326, 720, 1987


Liektās DNS struktūras veidošanās modeļi


Liekto DNS segmentu kartēšana



Ad2 E2a late 364

Ad2 E2a late 490

Ad2 E2a late 220

Ad2 VAI 226

AluI elem. 412

IS1dim 768

IS5’ dim 548

IS10

TNFprom. 615

Ret prom 375

rafP 170





COMPUTER MODELING OF THE BENT DNA STRUCTURE

SEQUENCE DEPENDENT DNA CURVATURE

Salīdzinošā pBR322 DNS liekšanas intensitāte; O/bp.

Twister 2.0 datormodelis

Curved regions in pBR322, as determined by electron microscopy; Muzard G. et al. EMBO J., 9, 1289, 1990



PLAZMĪDU TOPOLOĢIJA

DNS SPIRĀLES UN SUPERSPIRĀLES:

Savītā (plektonomiskā) superspiralizācija

Apvītā (toroīdā) superspiralizācija

Plektonēmiska superspiralizācija -

Vinograd J, Lebowitz J, Radloff R, Watson R, Laipis PThe twisted circular form of polyoma viral DNA.Proc Natl Acad Sci U S A 1965 May;53(5):1104-11


Plazmīdu molekulas ir plektonēmiski superspiralizētas


Topoloģiski noslēgtu

plazmīdas DNS raksturo

nemainīgs sasitības skaitlis (linking number,

Lk), kuru veido DNS pavedienu

savstarpējais krustošanos

raksturojoša DNS vijumu skaitļa

(twist, Tw) un DNS dubultspirālu

savstarpējo krustošanos raksturojoša

vērpes skaiļa (wright, Wr)

summa: Lk = Tw + Wr


Lk0 ir fizioloģiskos apstākļos pilnīgi relaksētas plazmīdas molekulas saistības skaitlis.

Superspiralizācijas stāvokli raksturo saistības skaitļa starpība Lk. Fizioloģiskos apstākļos baktēriju šūnā plazmīdu DNS ir negatīvi superspiralizēta:

Lk < Lk0

t.i. DNS spirāles solis ir garāks, DNS ir daļēji atritināta


Izmaiņas plazmīdu DNS topoloģijā rada enzīmi – topoizomerāzes, topoloģijas izmaiņas var radīt arī lokālu DNS denaturēšanos

SUPERSPIRALIZĀCIJU

raksturo saistības skaitlis (linking number: Lk = Tw + Wr) un superspiralizācijas blīvums (supercoling density : = Lk / Lk0 )

Superspiralizācija šūnā tiek regulēta

Superspiralizācijas regulācijā piedalās divu tipu enzīmi:

(1) I tipa topoizomerāzes: pārrauj vienu pavedienu (“nicking-closing" enzīmi), Lk = ± 1.

(2) II tipa topoizomerāzes: pārrauj abus pavedienus, Lk = ± 2.

E.coli pie pirmā tipa topoizomerāzēm pieder topoizomerāze I and topoizomerāze III, kuras parasti realksē DNS, samazinot negatīvās superspiralizācijas

blīvumu.E.coli pie otrā tipa topoizomerāzēm pieder DNS

topoizomerāze II jeb DNS girāze, tā plielina negatīvās superspiralizācijas blīvumu.

Eikariotu šūnās tāpat ir divas pirmā un viena otrā tipa topoizomerāzes, visas nodarbojas ar superspiralizācijas

blīvuma (gan pozitīvā, gan negatīvā) samazināšanu.


Superspiralizācijas blīvums mainās:

• replikācijas laikā;

• transkripcijas laikā;

• rekombinācijā;

• baktēriju kultūrai novecojot;

• vides stresa apstākļos;

• mutagēnu iedarbībā

Interkalējošie savienojumi ietekmē superspiralizāciju. EtBr molekulas iespiešanās starp DNS bāzu pāru plaknēm samazina rotācijas leņķi starp tām par ~ 26o

Interkalējoši savienojumi vispirms atritina negatīvi superspiralizētu DNS, pēc tam ievieš pozitīvus superspirāles vijumus

Pozitīvas supersiralizācijas gadījumā DNS attālums strap DNS bāzu pāru plaknēm samazinās

Superspiralizācijas blīvumu var novērtēt elektroforēzē interkalējošo savienojumu

klātbūtnē

Plazmīdu superspiralizācijas izmaiņas baktēriju kultūras augšanas laikā

DNS/DNS hibridizācijas (Southern blot) izmantošana DNS superspiralizācijas

pētīšanai


pētīšanai

Lejupejošā DNS pārnese no agarozes gēla uz membrānas.Gēla sagatavošana 1 h

Pārnese 12-18 hImobilizācija 2-3 hPrehibridizācija 3 hZondes iezīmēšana 3 hHibridizācija 12-18 hMembrānas atmazgāšana 2 hEkspozīcija 2-24 h

Debespušu hibridizācijas ar imobilizētām makromolekulām

Southern blot* - specifisku DNS atrašana ar DNS zondi;Northern blot - specifisku RNS atrašana ar DNS zondi;Western blot - proteīnu epitopu atrašana ar Av

palīdzību;Eastern blot - plisaharīdu vai citu proteīnu

pēctranslācijas modifikācijas epitopu atrašana ar Av palīdzību;Far-Western blot ar antivielām nesaistītu

proteīnu/proteīnu mijiedarbību vai pie DNS piesasitītu proteīnu atrašana ar specifiskām Av atrašana gelā;

* E.M. Southern, Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel

electrophoresis, J. Mol.Biol. 98 (3): 503–517, 1975.

Zonde– meklējamajam NS apgabalam komplementārs, radioaktīvi vai fluorescenti iezīmēts DNS fragments, kuru parasti iegūst PCR reakcijā;

– meklējamajam proteīnam specifiskas mono- vai poliklonālas antivielas

DNS zondes iezīmēšanai ar P izotopiem izmanto random priming metodi.

Cik cpm (counts per minute, Čerenkova metode dod 30% skaitīšanas efektivitāti) iezīmes iegūsim, ja 25 ng 500 b.p. gara DNS fragmenta, kur C atlikumi veido 25% sastāva, apstrādei izmantosim 50 Ci 32P-dCTP (īpatnējā aktivitāte 3000 Ci/mmol) un ieslēgšanās efektivitāte ir 70% ?


pētīšanai

Ar EthBr krāsots gēls Tā paša gēla Sb ar ori rajona zondi


pētīšanaiDNS izdalīta no atsevišķām kolonijām


pētīšanaiAr EthBr krāsots

gēls 2D gēls (dažādas ChQ konc.)

Tā paša gēla Sb ar ori rajona zondi

STATISKIE DNS LĪKUMI, SUPERSPIRALIZĀCIJA UN PLAZMĪDU REPLIKĀCIJAS

STABILITĀTE

Rekombinantās vektorplazmīdas, atšķirībā no dabā sastopamajām

plazmīdām, netiek stabili saglabātas baktēriju kultūrās – tām ir samazināta

replikācijas stabilitāte

Plazmīdu replikācijas stabilitāti raksturo augšanas ciklu skaits barotnē bez selektīva spiediena, pēc kura vēl 50%

baktēriju šūnu populācijā ir saglabājuši plazmīdu

Plasmid Maintenance Stability

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 3 6 10 20 40

Passages in non-selective media

% o

f A

b r

ezis

tan

t cells

R 6-5 pSC101 pBR322 pBR329

26

40

>40

Plazmīdu replikācijas stabilitāte:Saglabāšanās, augot uz agarizētas barotnes bez antibiotikāmpBR grupas plazmīdu replikācijas stabilitāte dažādos E.coli celmos

PlazmīdaCelms GenotipsAugš. ciklu skaits uz barotnes bez antibiotikām (LB0)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16JC5183 recBCRR1 rec+

pBR322 HB101 recAMM294 rec+DH1 recA

JC5183 recBCRR1 rec+


JC5183 recBCRR1 rec+


- ap 50% šūinu populācijā ir zaudējušas ApR marķieri

- klonētajā kopā (100-200 šūnu) nav atrasti ApS segreganti

Rekombinantās plazmīdas un vektorplazmīdas – gēnu pārnese un klonēšana

pBR grupas plazmīdas

IS1 insercijas noteiktos plazmīdu replikona rajonos stabilizē plazmīdu

replikāciju

Rekombinantās plazmīdas un vektorplazmīdas – gēnu pārnese un klonēšana

Plazmīdu replikācijas stabilizācija nav tikai tet gēna inaktivēšanas rezultāts

p329::IS10 stabilitāte

>40

in vivo iegūtās IS10 insercijas pārklonēšana

Stabilizācijas efekts

atkarīgs no IS insercijas

orientācijas, ~20 un 3Satbilitāte

abās orientācijās ir mazāka par 3

0

20

40

60

80

100

120

4 h 6 h 8 h 10 h 12 h

Sampling time, hours

co

py

nu

mb

er/

ma

x. c

op

y n

um

be

r,

(%)

pBR329::IS10C-H

pBR329::IS10E1

pBR329::IS10E2

pBR329

Plazmīdas saglabāšanai būtiski svarīgi ir panākt efektīvu replikāciju augšanas cikla sākuma posmā

Replikācijas stabilitāte un superspiralizācija

Liektu DNS fragmentu ietekme uz plazmīdu replikācijas stabilitāti

5’- TATGTTTTGCAAAATTTTGCAAAATTTTGCAAAATTTTGCAAAAA

G- 3’

5’- TATGAAAAGCTTTTAAAAGCTTTTAAAAGCTTTTAAAAGCTTTTAG-3’

pRU984 sastāvā klonētu sintētisku

oligonukleotīdu sekvenču ģeometrija

984_del3828 bps

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

PvuII ,176

AflIII,354

ScaI,1725SspI,2049

EcoO109,2222

NdeI,2417NarI, 2469

PvuII, 2540EcoRI ,2630

SacI,2636

NarI,2954

KpnI,3215

SphI ,3353

BstEII,3531SalI ,3540

HindIII ,3823

L

ori

P3

P4

b-lact

CRP

rafR

R

Replikācijas iniciācija ar RNS praimeru

Replikācijas iniciācija ar RNS praimeru

PlacZ

-la

P Rraf

pTA_3d3164 bps

500

1000

1500

2000

2500

3000

PvuII

AflIII

ScaI

SspIEcoO109

NdeINcoI

BstEII(NarI)

KpnI

BstEII

HindIII

ori

P3

P4

rafR’

PlacZ

-la

P Rraf

pAT_3d3164 bps

500

1000

1500

2000

2500

3000

PvuII

AflIII

ScaI

SspIEcoO109HindIII

NdeINcoI

BstEII(NarI)

KpnI

BstEII

HindIII

ori

P3

P4

rafR’

Plazmīdas replikāciju regulējošo mRNS relatīvās koncentrācijas pAT_3D un pTA_3D saturošas E.coli XL1 augšanas devītajā stundā

ResultsGene Type Reaction Efficiency Expression Std. Error 95% C.I. P(H1) Result

X REF 0.99 1.000 0.930 - 1.076 0.919 - 1.088 1.000

Ap TRG 1.0 17.873 17.127 - 18.678 16.602 - 19.249 0.354

RNAI TRG 1.0 1.753 1.628 - 1.894 1.547 - 1.989 0.640

RNAII TRG 1.0 18.503 16.601 - 20.672 15.952 - 21.476 0.429

PLAZMĪDU GĒNU

EKSPRESIJA

HBc proteīnu producējošo

plazmīdu superspiralizā

cijas (Rf) dinamika baktēriju kultūru

augšanas laikā

Superspiralizācijas dinamikas (6, 10 un 24 h) un rekombinantā proteīna producēšanas

efektivitātes korelācija

Superspiralizācija korelē ar mRNS ekspresiju

DNS girāzes inhibitori

Kurš kuru ietekmē: superspiralizācija ekspresiju vai otrādi ?

Kurš kuru ietekmē: superspiralizācija ekspresiju vai otrādi ?

ori

Superspiralizācija un plazmīdu struktūras stabilitāte

Plazmīdu satsāvē esošie tiešie sekvences atkārtojumi (direct repeats, DR) bieži rekombinē

Samazināts suprspiralizācijas blīvums sekmē rekombināciju

EthBr pēc elektroforēzes EthBr gelā

Lineārās plazmīdas

CCC formas

Krāsots ar Eth-Br pēc elektroforēzes

Eth-Br gelā

Lineāra DNS

Lineāra DNS

Delēcijas neveidojoša

DNS

Samazināts suprspiralizācijas blīvums sekmē rekombināciju

Delēcijas veidojoša DNS

Documents

BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA