Biomolekule u analitickoj hemiji 211014.pdf

8/19/2019 Biomolekule u analitickoj hemiji 211014.pdf

1/12

Biomolekule u analitičkoj hemiji

Hemijska analiza biomolekula kao što su peptidi, proteini i

nukleinske kiseline često je sasvim različita od “klasične”

analize relativno malih organskih molekula kao što su

pesticidi, lijekovi ili npr. ostaci eksploziva.

Analitički hemičar se susreće sa brojnim problemima, koji

se mogu grubo razvrstati u četiri kategorije:

1) Kvalitativna analiza smjese spojeva

2) Kvalitativna analiza čistog spoja

3) Kvantitativna analiza odabranog spoja u smjesi

4) Određivanje strukture čistog spoja


2/12

Klasična analitička hemija i njena ograničenja

Za rješavanje navedenih problema u klasičnoj analizi

koriste se brojne metode. Kvalitativna, kao i kvantitativna

analiza smjesa može se postići hromatografskim

metodama kao što su gasna hromatografija (GC) i tečna

hromatografija (LC). Hemijski senzori i biosenzori

također mogu biti uključeni za selektivno kvantificiranje

spoja u smjesi, ali za ograničeni broj analita.

Za identifikaciju čistih spojeva mogu se koristiti nuklearna

magnetna rezonancija (NMR), masena spektrometrija (MS),

infracrvena spektroskopija (IR), UV/vidljiva spektroskopija,

difrakcija X-zraka itd.

Međutim, većina ovih “klasičnih” metoda nije (ili je to samo u

ograničenom stepenu) prikladna za analizu nukleinskih kiselina

i proteina. GC zahtijeva da analiti budu isparljivi i termo

stabilni, svojstvo koje biomolekule rijetko pokazuju.


3/12

MS se često koristi za određivanje molekulske mase.

Međutim, biomolekule velike molekulske mase se značajno

fragmentiraju upotrebom konvencionalnih metoda jonizacije,

čineći određivanje molekulskih masa nemogućim. NMR

spektroskopija je vrlo pogodna za određivanje strukture

molekula srednje veličine. Međutim, znatan broj spin-aktivnih

nukleusa, posebno 1H, u DNA ili proteinskoj molekuli rezultira

mnoštvom signala, koji čine strukturna određivanja ekstremno

teškim ili nemogućim. Slični problemi se javljaju u strukturnim

određivanjima sa IR- i UV-spektroskopijom (broj funkcionalnihgrupa i kromofora čini identifikaciju nemogućom).

Biohemičari često rade sa parametrima koji nisu primjenjivi

za većinu klasičnih analita. Ne samo da metode

sekvencioniranja (aminokiselina u proteinima i baza u DNA i

RNA) moraju biti tačne, već trebaju imati mogućnost

automatizacije, kada se radi sa većim brojem uzoraka za

analizu i poređenje. Separacione metode za biomolekule

moraju biti ekstremno moćne. Broj proteina u jednoj stanici

dostiže hiljade.


4/12

Za sekvencioniranje, biomolekule se često djelimičnocijepaju u manje fragmente, koji se moraju međusobno

razdvojiti. Potrebne su i preparativne i analitičke

separacione tehnike. Količina raspoloživog uzorka često je

vrlo mala. Za određivanje trodimenzionalne strukture

biomolekula sa molekulskom težinom u hiljadama

kilodaltona (kDa) potrebne su vrlo sofisticirane metode.

Bioanalitička hemijaBez razvoja i poboljšanja bioanalitičkih metoda u prošlim

dekadama, ogromni napredak u genomiksu (eng.

genomics) i proteomiksu ( proteomics) bio bi nemoguć.

Metode za tačno određivanje visokih molekulskih masa, za

sekvencioniranje DNA i proteina i za separiranje hiljada

molekula u jednoj seriji ubrzale su razvoj bioanalitičke

hemije. U slj. tabeli prikazane su brojne metode uključene u

analizu nukleinskih kiselina i proteina sa pregledom i

naglašavanjem razlika između klasičnih i bioanaliza.


5/12

Poređenje klasične i bioanalitičke hemije

elektronska mikroskopijadifrakcija X-zraka

difrakcija X-zrakaIR

NMR MS

sekvencioniranje

aminokiselinaDNA

sekvencioniranje

NMR Određivanjestrukture čistog spoja

inkubacija tripsinom

i GE, MALDI-TOF-

MS, ESI-MS

DNA arrays NMR

aminokiselinski

sastavPCR MSKvalitativna

identifikacija čistog

spoja

biosenzori

DNA arraysenzori ili biosenzori

Real-Time

PCR

LC biotest

CEGCSelektivno

kvantificiranje spoja

u smjesi

GE, 2D-GELC

MALDI-TOF-MSCEGCKvalitativno

istraživanje smjese

ProteiniDNA, RNANiskomolekulske tvari

Bioanalitička hemijaKlasična analitička

hemija

Predmet analize

Analiza nukleinskih kiselina

Polje genomiksa odnosi se na izučavanje ukupnog genomastanice ili organizma, npr. kompletne DNA sekvence iodređivanje svih gena unutar te sekvence. Ljudski genomima 3 x 109 baznih parova. 30 000 – 40 000 određenih genasadržani su unutar ove sekvence.

Prije reakcija sekvencioniranja, nukleinske kiseline (NA)moraju biti izolirane iz stanice i prečišćene. Za dobijanjedovoljne količine uzorka, obično je potrebno “pojačavanje”(eng. amplification) DNA molekula. Stoga se analiza NA

može podijeliti u sljedeće korake:

1) izolacija i prečišćavanje

2) kvantifikacija i pojačavanje

3) sekvencioniranje


6/12

Za izolaciju DNA ili RNA iz stanice mogu biti uključenebrojne konvencionalne metode kao što su ekstrakcija tečno-

tečno, taloženje i centrifugiranje.

Izolirana NA može se potom kvantificirati npr. UV

spektroskopijom. Aromatske grupe baza imaju

apsorpcioni maksimum pri oko 260 nm. Alternativno,

mogu se vezati fluorescentni ili radioaktivni markeri i preko

njih izvršiti kvantifikacija. Smjesa DNA molekula može sekvantificirati metodama kapilarne elektroforeze.

DNA molekula može se pojačati lančanom reakcijom

polimeraze (PCR, eng. polymerase chain r eaction) u dijelu

njene poznate sekvence. Jedna molekula DNA je dovoljna za

stvaranje miliona identičnih kopija u kontroliranoj reakciji

pojačavanja. Količina DNA tokom reakcije pojačavanja može

se mjeriti sa real-time PCR. Druge metode kvantifikacije DNA

uključuju DNA arrays i biosenzore, ako su dostupni.


7/12

Metode sekvencioniranja DNA uključuju Maxam-Gilbert

metodu, Sanger-ovu metodu, DNA arrays i

pirosekvencioniranje. Obično se DNA molekule prije

sekvencioniranja tretiraju sa restrikcijskim enzimima. Tako

nastaju brojni fragmenti, koji se potom separiraju gel

elektroforezom prema njihovim molekulskim masama.

Najefikasnija metoda separacije je dvodimenzionalna gel

elektroforeza (2D-GE).

Analiza proteinaU istraživanjima proteomiksa cilj je ispitati sve proteine u

stanici, tkivu ili organizmu za dobijanje slike o uzajamnom

djelovanju stanica i organizma. Proteinska analiza često

uključuje izolaciju i istraživanje jednog proteina u datom

trenutku.

Koncentracije proteina u stanicama obično su vrlo niske, a

reakcija pojačavanja, kao što je PCR za DNA, ne postoji zaproteine. Izolacija proteina iz kompleksnog staničnog

matriksa u visokom prinosu, a bez mijenjanja njegove

biološke funkcije, može biti težak zadatak.


8/12

Neke od uključenih analitičkih metoda su ekstrakcija tečno-

tečno, taloženje i centrifugiranje. Često se protein ili grupa

proteina separira od nečistoća tečnom hromatografijom ili

poliakrilamidnom gel elektroforezom (PAGE).

Kvantitativna analiza proteina može se postići UV

spektroskopijom. Peptidna veza ima apsorpcioni

maksimum pri oko 205 nm, a aromatski prstenovi

aminokiselina fenilalanina, triptofana i tirozina snažno

apsorbiraju na oko 280 nm. Također se često koriste ikolorimetrijske metode sa reagensima koji specifično

grade obojene komplekse sa proteinima.

Ove kvantitativne metode obično mjere koncentraciju ukupnih

proteina. Protein od interesa mora biti izoliran prije analize, ili

mora postojati vrlo specifična metoda kvantifikacije samo

datog proteina. Vrlo osjetljiva i specifična analiza antitijela i

antigena može se postići sa biotestovima ili biosenzorima.

Aminokiselinski sastav proteina može se odrediti prvo

kompletnom hidrolizom peptidnih veza, a zatim separiranjem i

kvantifikacijom dobijenih aminokiselina npr. sa

jonoizmjenjivačkom hromatografijom (IEC), tečnom

hromatografijom visoke efikasnosti na obrnutim fazama (RP-

HPLC) i kapilarnom elektroforezom (CE).


9/12

Alternativno, protein se može djelimično pocijepati enzimima

kao što je npr. tripsin. Fragmenti ove inkubacije tripsinom

mogu se potom separirati, a njihove molekulske mase odrediti

masenom spektrometrijom. Metode raspoložive za takve

analize su masena spektrometrija uz matriksom olakšanu

lasersku desorpciju/jonizaciju (MALDI) mjerenjem vremena

leta (TOF), kao i masena spektrometrija uz jonizaciju

elektroraspršivanjem (ESI-MS), uvezanu sa tečnom

hromatografijom (LC-ESI-MS) ili kapilarnom elektroforezom

(CE-ESI-MS). Često se protein može identificirati na osnovu

molekulskih masa fragmenata nastalih djelovanjem tripsina.

Ako protein ne može biti određen prethodno opisanimmetodama, sekvencioniranje aminokiselina postaje

neizbježno.

Za analizu proteomicsa svi proteini iz stanice moraju biti

ekstrahirani, a potom međusobno separirani, za šta su

najmoćnije metode gel elektroforeze, posebno

dvodimenzionalna gel elektroforeza (2D-GE), koja može

separirati hiljade proteina u jednoj seriji.

Trodimenzionalne strukture proteina i NA mogu se odrediti

sofisticiranim NMR eksperimentima, elektronskom

mikroskopijom, te difrakcijom X-zraka ako se može dobiti

monokristal.


10/12

Sažetak

DNA je nasljedna molekula svih staničnih oblika života.

Ona pohranjuje i prenosi genetičku informaciju. DNA je

relativno jednostavna molekula, sastavljena samo od četiri

različita nukleotida sa bazama adeninom, gvaninom,

timinom i citozinom, te β-D-dezoksiribozom kao šećernom

komponentom. Milioni nukleotida mogu se vezati skupa.

Dva komplementarna lanca uvijaju se jedan oko drugog u

obliku dvostruke spirale (heliksa), a drže se skupa H-vezama između baznih parova adenin-timin i citozin-

gvanin.

RNA se sastoji od nukleotida sa bazama adeninom,

gvaninom, uracilom i citozinom, te β-D-ribozom kao

šećernom komponentom. RNA je jednolančana molekula sa

baznim parovima samo u dijelovima ovog lanca.

Proteini su relativno komplicirane molekule, izgrađene od 20

prirodno zastupljenih α-L-amino kiselina, koje su međusobno

povezane peptidnim vezama. Vlaknasti proteini daju

mehaničku čvrstoću kostima i mišićima. Globularni proteini

kao što su antitijela i enzimi imaju specifične funkcije u

imunom sistemu i metabolizmu. Makromolekulski lanacproteina uvija se na vrlo specifičan način. Ovo uvijanje je

osnova za proteinsku funkciju i aktivnost.


11/12

Redoslijed (sekvenca) aminokiselina čini primarnu strukturu

proteina. Dijelovi aminokiselinskog lanca grade područja(domene) regularnih struktura kao što su α-heliksi i β-

plošne strukture, što čini sekundarnu strukturu proteina.

Kompletan trodimenzionalni oblik aminokiselinskog lanca

uključujući interakcije između različitih sekundarnih domena

predstavlja tercijarnu strukturu. Neki proteini sastavljeni su

od dva ili više lanaca i od drugih neaminokiselinskih

(neproteinskih) komponenata, što se opisuje kao kvaterna

struktura proteina.

Trodimenzionalna struktura DNA i proteina, stabilna je

samo unutar određenih fizikalno-hemijskih parametara date

sredine. Promjene temperature, pH i jonske sile mogu

uzrokovati denaturaciju biomolekule, koja je često

nepovratna (ireverzibilna).

DNA sadrži genetski kod u stanici. Kada je gen “uključen ili

aktiviran”, on inicira sintezu proteina, koja se dešava uz

pomoć procesa transkripcije i translacije.


12/12

Metode za analizu i identifikaciju biopolimera (nukleinskih

kiselina (NA) i proteina) znatno se razlikuju od analiziranja

relativno malih organskih molekula. Njihova separacija (NA i

proteina) najčešće se izvodi gel- i kapilarnom elektroforezom

(GE i CE). Hromatografija se ne koristi mnogo kao metoda

separacije, već uglavnom kao metoda prečišćavanja i

izolacije spojeva. Molekulsko prepoznavanje koje mnoge

biomolekule pokazuju, koristi se u brojnim analitičkim alatima

uključujući imunotestove, biosenzore i DNA arrays.

Struktura biopolimera ne može se lahko odrediti

spektroskopskim metodama. Određivanje strukture proteina i

NA uključuje brojne reakcije i korake analize.

Documents

Biomolekule u analitickoj hemiji 211014.pdf