Biologia Strutturale: dai sincrotroni ai Biologia strutturale e radiazione X 1E+00 1E+03 1E+06 1E+09

  • View
    2

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Biologia Strutturale: dai sincrotroni ai Biologia strutturale e radiazione X 1E+00 1E+03 1E+06 1E+09

  • Biologia Strutturale: dai sincrotroni ai FEL

    Roma, 22 aprile 2014

    Francesco Stellato

    I.N.F.N. – Sezione di Roma ‘Tor Vergata’

  •  Biologia strutturale e radiazione X

    Sincrotroni e FEL

     Imaging con radiazione coerente

     Cristallografia seriale: dai sincrotroni ai FEL e viceversa

     Prospettive future

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

    Sommario

  • Biologia strutturale e radiazione X

    1E+00 1E+03 1E+06 1E+09 1E+12 1E+15 1E+18 1E+21 1E+24 1E+27 1E+30 1E+33 1E+36

    1880 1910 1940 1970 2000 2030

    Year

    S o u rc

    e P

    e a k B

    ri lli

    a n c e

    Röntgen

    Bragg & Bragg

    reflections

    von Laue

    crystal diffraction

    Hodgkin

    penicillin,

    B12

    Perutz & Kendrew

    myoglobin Franklin,

    Crick,

    Watson

    DNA

    MacKinnon

    Potassium

    channel

    Kornberg

    RNA

    polymerase

    Jacobsen

    Holography

    Kirz &

    Schmahl

    Microscopy

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Sincrotroni e FEL

    -Simile brillanza media, diversa brillanza di picco

    1012 fotoni in ~0.05 μm2

    Frequenza impulsi FEL: 100 Hz

    -Diversa lunghezza degli impulsi: 10 -100 fs FEL

    10-100 ps sincrotroni

    -Piccola lunghezza d’onda: Fino a 10 keV FELs

    Fino a 100 keV sincrotroni

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Diffrazione prima della distruzione

    Pattern di diffrazione

    Impulso FEL

    Iniezione di particelle

    Un impulso,

    una misura

    R. Neutze et al, Nature 406 (2000)

    E’ necessario ottenere

    un segnale sufficiente

    prima che il campione

    si distrugga

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Imaging con radiazione coerente

    Diffrazione prima della distruzione

    Primo impulso

    Secondo Impulso

    1 micron

    Immagine SEM della struttura incisa

    su una membrana di Si3N4

    Chapman et al. Nature Physics (2006)

    Immagine ricostruita

    con risoluzione di 32 nm

    1 micron

    FLASH

    Pattern di diffrazione Pattern di diffrazione

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Imaging con radiazione coerente

    Ricostruzioni 2D – Campioni riproducibili e non

    Mimivirus: uno dei virus più grandi

    ~500 nm diametro

    200 nm

    Impulso LCLS:

    10 to 300 fs,1.8 keV (0.68 nm) Focalizzato a 7 μm 1016 W/cm2

    Seibert et al. Nature 470 (2011)

    Ricostruzione 2D

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Imaging con radiazione coerente

    Ricostruzioni 3D – Campioni riproducibili

    Tomografia X al sincrotrone

    Uno (o pochi) campioni

    Misure da diverse angolazioni

    Temperatura criogenica Larabell et al. Mol Biol Cell (2004)

    J. Miao, Hodgson, Sayre, PNAS 98 (2001)

    Molti (106) campioni

    Misure da angolazioni casuali

    Temperatura ambiente

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Imaging con radiazione coerente

    Misure analoghe possibili a DiProI@FERMI

    nel prossimo futuro

    Yoon et al. Optics Express (2014)

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Cristallografia seriale

    - Misura di pattern di diffrazione da

    singoli cristalli (tipicamente >104)

    - Indicizzazione di ciascun pattern

    - Media dei fattori di struttura

    - Metodi standard (e non) per la

    fasazione

    Studio di cristalli piccoli.

    Studi risolti in tempo.

    0

    10000

    20000

    30000

    40000

    50000

    60000

    70000

    1972 1976 1980 1984 1988 1992 1996 2000 2004 2008

    Electron

    NMR

    X-ray

    Sono necessari cristalli

    sufficientemente grandi

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Cristallografia seriale al FEL

    Setup sperimentale

    Chapman et al. Nature 470, (2011)

    Struttura del Fotosistema I con

    risoluzione di 7Å

    (limitata dalla lunghezza d’onda

    del FEL)

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

    water-jet-2.mov water-jet-2.mov

  • Cristallografia seriale al FEL

    Catapsina B

    Proteina coinvolta nelle tripanosomiasi

    Struttura della forma glicosilata ignota

    Comparsa di cristalli

    aghiformi in cellule

    di insetto che over-

    esprimono la

    proteina

    10

    μm

    Immagine SEM di

    alcuni cristalli

    purificati

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Cristallografia seriale al FEL

    Pattern di diffrazione di un singolo

    microcristallo di catapsina B Proiezione delle intensità misurate

    su un piano dello spazio reciproco

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Cristallografia seriale al FEL

    Struttura tridimensionale della

    forma glicosilata della proteina

    Redecke et al., Science

    2013

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

    Applicazioni di drug-design

  • Cristallografia seriale – Sviluppi e Applicazioni

    Misure pump-probe risolte in tempo Lipidic Cubic Phase su GPCR

    Aquila et al. Optics Express 470 (2011) A breve Fotosistema I e II ad alta risoluzione

    Liu et al. Science (2013) Johanssonn et al. Nature Methods (2012)

    Sponge phase su centri di

    reazione fotosintetici

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Scattering & spettroscopie

    Emissione di raggi X (XES)

    Assorbimento di raggi X (XAS)

    Scattering a piccolo angolo (SAXS)

    Scattering a grande angolo (WAXS)

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Cristallografia seriale al sincrotrone

    La metodologia seriale ‘spinta’ può essere re-importata ai sincrotroni

    500 patterns da microcristalli di

    catapsina B a temperatura

    criogenica

    Gati et al., IUCrJ 2014

    40,000 patterns di microcristalli di lisozima

    a temperatura ambiente

    Stellato et al., to be published

    Riduzione del danno da radiazione

    Misure a temperatura ambiente

    Misure risolte in tempo

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Prospettive future

    FEL con repetition rates più elevate (XFEL)

    Sincrotroni con brillanza più elevata (ESRF, PETRA III)

    Migliori sistemi di iniezione del campione

    FEL con brillanza di picco più elevata Brillanze maggiori consentiranno di

    spingersi verso l’imaging di singola

    molecola ad alta risoluzione

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Prospettive future

    avrà una

    repetition rate

    di 27 kHz

    I sistemi di iniezione del campione

    devono essere ottimizzati in funzione

    della repetition rate della sorgente

    E’ necessario un hardware in grado

    di archiviare tipicamente 8 Mb x 106

    pattern/ dataset = 8 Tb / dataset

    Sono necessari computer paralleli in

    grado di processare in tempo breve

    questa mole di dati.

    E’ necessario avere detector in

    grado di registrare pattern di

    diffrazione ad alta frequenza

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014

  • Grazie per l’attenzione

    Contatti

    Francesco Stellato

    I.N.F.N. Sezione di Roma Tor Vergata

    Via della Ricerca Scientifica, 1

    Tel: 0039 06 7259 4284

    francesco.stellato@roma2.infn.it

    Luci di Sincrotrone

    CNR – Roma, 22 Aprile 2014