Binding Specificity of the Periplasmic Oligopeptide

8/3/2019 Binding Specificity of the Periplasmic Oligopeptide

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V o l . 1 6 8 , N o . 2OURNAL O F B A C T E R I O L O G Y , N o v . 1 9 8 6 , p . 7 7 5 - 7 7 90 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 6 / 1 1 0 7 7 5 - 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 6 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

B i n d i n g S p e c i f i c i t y o f t h e P e r i p l a s m i c O l i g o p e p t i d e - B i n d i n g P r o t e i nf r o m E s c h e r i c h i a c o l iCHERYL A . GUYER, DAVID G . MORGAN,t A N D JAMES V . STAROS*

D e p a r t m e n t o f B i o ch e m i s t r y , V a nd e r b i l t U n i v e r s i t y , S c h o o l o f M e d i c i n e , N a s h v i l l e , T e n n e s s e e 3 7 2 3 2R e c e i v e d 1 2 Ma y 1 9 8 6 / A c c e p t e d 1 A u g u s t 1 9 8 6

T h e s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s r e q u i r e d f o r t h e b i n d i n g o f p e p t i d e s u b s t r a t e s t o t h e E s c h e r i c h i a c o l i p e r i p l a s m i cp r o t e i n i n v o l v e d i n o l i g o p e p t i d e t r a n s p o r t w e r e s u r v e y e d b y m e a s u r i n g t h e a b i l i t y o f d i f f e r e n t p e p t i d e s t oc o m p e t e f o r b i n d i n g i n a n e q u i l i b r i u m d i a l y s i s a s s a y w i t h t h e t r i p e p t i d e A l a - P h e - [ 3 H ] G l y . T h e p r o t e i ns p e c i f i c a l l y b o u n d o l i g o p e p t i d e s a n d f a i l e d t o b i n d a m i n o a c i d s o r d i p e p t i d e s . A c e t y l a t i o n o f t h e p e p t i d e a m i n ot e r m i n u s o f ( A l a ) 3 s e v e r e l y i m p a i r e d b i n d i n g , w h e r e a s e s t e r i f i c a t i o n o f t h e c a r b o x y l t e r m i n u s s i g n i f i c a n t l yr e d u c e d b u t d i d n ot c o m p l e t el y e l i m i n a t e b i n d i n g . P e p t i d e s c o m p o s e d o f L - a m i n o a c i d s c o m p e t e d m o r ee f f e c t i v e l y t h a n d i d p e p t i d e s c o n t a i n i n g D - r e s i d u e s o r g l y c i n e . E x p e r i m e n t s w i t h a s e r i e s o f a l a n y l p e p t i d eh o m o l o g s d e m o n s t r a t e d a d e c r e a s e i n c o m p e t i t i v e a b i l i t y w i t h i n c r e a s i n g c h a i n l e n g t h b e y o n d t r i p e p t i d e .C o m p e t i t i o n s t u d i e s w i t h t r i p e p t i d e h o m o l o g s i n d i c a t e d t h a t a w i d e v a r i e t y o f a m i n o a c y l s i d e c h a i n s w e r et o l e r a t e d b y t h e p e r i p l a s m i c p r o t e i n , b u t s i d e - c h a i n c o m p o s i t i o n d i d a f f e c t b i n d i n g . F l u o r e s c e n c e e m i s s i o n d a t as u g g e s t e d t h a t t h i s p e r i p l a s m i c p r o t e i n p o s s e s s e s m o r e t h a n o n e s u b s t r a t e - b i n d i n g s i t e c a p a b l e o f d i s t i n g u i s h i n gp e p t i d e s o n t h e b a s i s o f a m i n o a c y l s i d e c h a i n s .P e p t i d e s p l a y a m a j o r n u t r i t i o n a l r o l e b y a c t i n g a s a s o u r c eo f c a r b o n a n d n i t r o g e n ( 1 3 ) i n e n t e r i c b a c t e r i a s u c h a sS a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m a n d E s c h e r i c h i a c o l i . O f t h e t r a n s -p o r t s y s t e m s r e s p o n s i b l e f o r u p t a k e o f p e p t i d e s i n t h e s eb a c t e r i a , t h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e i s t h e m o s t c o m p l e t e l yc h a r a c t e r i z e d . T h i s p e r m e a s e i s c a p a b l e o f t r a n s p o r t i n gp e p t i d e s c o m p o s e d o f t w o t o s i x a m i n o a c i d s ( 1 1 , 2 4 , 3 7 ) .T h e u p p e r l i m i t f o r t r a n s p o r t d e p e n d s o n t h e h y d r o d y n a m i cv o l u m e o f t h e p e p t i d e r a t h e r t h a n o n t h e n u m b e r o f a m i n oa c y l r e s i d u e s ( 3 2 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h i s p r o p e r t yr e s u l t s f r o m t h e s i e v i n g p r o p e r t i e s o f t h e o u t e r m e m b r a n e ,r a t h e r t h a n f r o m i n h e r e n t c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e p e r m e a s e( 3 2 ) . T h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e r e q u i r e s i t s p e p t i d e s u b -s t r a t e s t o b e a - l i n k e d ( 2 6 , 2 9 ) a n d t o p o s s e s s a n i o n i z a b l e

p n m a r y o r s e c o n d a r y N - t e r m i n a l g r o u p ( 1 1 , 2 5 , 2 8 ) . A l -t h o u g h a f r e e c a r b o x y l t e r m i n u s i s n o t r e q u i r e d f o r t r a n s p o r t ,t h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e s h o w s a r e d u c e d a f f i n i t y f o rp e p t i d e s i n w h i c h t h e t e r m i n a l c ar b o x y l g r o u p h a s b e e nm o d i f i e d ( 3 0 , 3 1 ) . I n t e r m s o f s t e r e o s p e c i f i c i t y , t h e p e r m e a s ep r e f e r s L - i s o m e r s a s t h e f i r s t t w o r e s i d u e s b u t c a n t o l e r a t eD - i s o m e r s i n s u b s e q u e n t p o s i t i o n s ( 3 , 2 1 ) . A l t h o u g h t h ea m i n o a c y l s i d e c h a i n s a f f e c t b o t h t h e a f f i n i t y ( 3 3 ) a n d r a t e( 3 0 ) o f p e p t i d e u p t a k e , t h e o l i g o p e p t i d e s y s t e m i s c a p a b l e o ft r a n s p o r t i n g a w i d e v a r i e t y o f p e p t i d e s u b s t r a t e s ( 2 , 7 , 8 , 1 2 ,2 4 , 3 0 ) . T h i s i s u n d e r s t a n d a b l e i n l i g h t o f t h e v a s t n u m b e r o fp o s s i b l e p e p t i d e p e r m u t a t i o n s t h a t m i g h t b e a v a i l a b l e f o rt r a n s p o r t .T h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e h a s b e e n g e n e t i c a l l y c h a r a c -t e r i z e d . T h e o p p l o c u s m a p s a t 3 4 m i n o n t h e S . t y p h i m u r i u mc h r o m o s o m e a n d 2 7 m i n o n t h e E . c o l i c h r o m o s o m e ( 1 7 ) .T h e l o c u s c o n s i s t s o f f o u r g e n e s , o p p A , o p p B , o p p C , a n do p p D , o r g a n i z e d a s a s i n g l e o p e r o n a n d c o t r a n s c r i b e d i no r d e r f r o m o p p A t o oppD ( 1 8 ) . O l i g o p e p t i d e t r a n s p o r t i ss e n s i t i v e t o o s m o t i c s h o c k a n d r e q u i r e s a s o u r c e o f p h o s -p h a t e - b o n d e n e r g y ( 6 ; D . G . M o r g a n , P h . D . d i s s e r t a t i o n ,V a n d e r b i l t U n i v e r s i t y , N a s h v i l l e , T e n n e s s e e 1 9 8 5 ) , i n d i c a t -* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , B i o l o g i c a l S c i -e n c e s W e s t , U n i v e r s i t y o f A r i z o n a , T u c s o n , A Z 8 5 7 2 1 .

i n g t h a t t h i s p e r m e a s e c a n b e c l a s s i f i e d a s a s h o c k - s e n s i t i v et r a n s p o r t s y s t e m ( 1 5 ) . T h e oppA l o c u s e n c o d e s a 5 2 , 0 0 0 -d a l t o n p e r i p l a s m i c p r o t e i n i n S . t y p h i m u r i u m ( 1 6 ) . T h ee q u i v a l e n t p e r i p l a s m i c p r o t e i n f r o m E . c o l i W h a s b e e np u r i f i e d , p h y s i c a l l y c h a r a c t e r i z e d , a n d s h o w n t o b i n d p e p -t i d e s ( 1 4 ) . T h e o p p A - e n c o d e d p r o t e i n f r o m S . t y p h i m u r i u mh a s a l s o r e c e n t l y b e e n p u r i f i e d , a n d t h e a m i n o a c i d s e q u e n c eh a s b e e n d e d u c e d f r o m t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e g e n e( 1 7 a ) .To f u r t h e r a n a l y z e t h e p r o c e s s o f o l i g o p e p t i d e t r a n s p o r t i nb a c t e r i a , t h e s u b s t r a t e s p e c i f i c i t i e s c o n f e r r e d u p o n t h e s y s -t e m b y e a c h t r a n s p o r t c o m p o n e n t m u s t b e i d e n t i f i e d . S i n c et h e o l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n a p p e a r s t o b e t h e i n i t i a lr e c e p t o r i n p e p t i d e t r a n s p o r t , i t s s p e c i f i c i t i e s f o r b i n d i n g mayr e f l e c t t h o s e o f t h e e n t i r e s y s t e m . I n t h i s s t u d y , c e n t r a ls t r u c t u r a l f e a t u r e s o f p e p t i d e s w e r e s u r v e y e d t o d e t e r m i n et h e i r e f f e c t u p o n b i n d i n g . Am ong t h e p r o p e r t i e s i n v e s t i g a t e dw e r e t h e a m i n o a n d c a r b o x y l t e r m i n i , t h e s t e r e o c h e m i s t r y o ft h e r e s i d u e s , t h e l e n g t h o f t h e p e p t i d e c h a i n , a n d t h e a m i n oa c y l s i d e c h a i n s .

MATERIALS AND METHODSP e p t i d e s . A l l p e p t i d e s w e r e c o m p o s e d o f L - a m i n o a c i d su n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . T h e f o l l o w i n g p e p t i d e s w e r e p u r -c h a s e d f r o m C h e m i c a l D y n a m n i c s C o r p . : A l a - P h e - G l y ,( A l a ) 3 , ( A l a ) 4 , L - A l a - D - A l a - L - A l a , A l a - G l y - G l y , ( G l n ) 3 ,( G l u ) 3 , ( G l y ) 3 , ( L e u ) 3 , ( M e t ) 3 , ( P h e ) 3 , a n d ( P r o ) 3 . P e p t i d e so b t a i n e d f r o m n Bachem w e r e ( S e r ) 3 , ( T h r ) 3 , ( T y r ) 3 , a n d( V a l ) 3 . P e p t i d e s o b t a i n e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t .

L o u i s , M o . ) w e r e a s f o l l o w s : ( A l a ) 2 , ( A l a ) 5 , ( D - A l a ) 3 , N-a c e t y l - A l a - A l a - A l a , a n d A l a - A l a - A l a - O - m e t h y l e s t e r . A l a -P h e was o b t a i n e d f r o m R e s e a r c h O r g a n i c s . ( L y s ) 3 a n d ( O M ) 3w e r e f r o m S e r v a ( H e i d e l b e r g , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r -m a n y ) . ( O r n ) 3 w as a l s o o b t a i n e d f r o m M i l e s S c i e n t i f i c ( D i v .M i l e s L a b o r a t o r i e s , I n c . , N a p e r v i l l e , I l l . ) . A l a - P h e - [ 3 H ] G l y( 9 0 m C i / m m o l ) w as s y n t h e s i z e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 4 ) .A l l p e p t i d e s a n d a m i n o a c i d s were a n a l y z e d b y t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y t o e n s u r e p u r i t y .C h e m i c a l s . A CS s c i n t i l l a t i o n f l u i d w as f r o m Amer shamC o r p . ( A r l i n g t o n H e i g h t s , I l l . ) . I m i d a z o l e , o b t a i n e d f r o m7 7 5


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7 7 6 GUYER ET A L .T A B L E 1 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f b i n d i n g

C o m p e t i n g % A l a - P h e - [ 3 H l G l y r e m a i n i n g b o u n d w i t h t h eC m p e p t i n gofollowing c o n c n o f c o m p e t i t o r " :p e ptideor___ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _a m i n o a c i d s 5 0 , u M 1 0 0 , u M 1 mMNone ( 1 0 0 ) ( 1 0 0 ) ( 1 0 0 )A l a , P h e , G l y 1 0 6 4 1 0 5 5 1 0 8 5A l a - P h e - G l y 2 1 o b NDcA l a - P h e 1 0 0 0 8 7 1 5 2 3 1 7A l a - P h e , G l y 1 0 7 2 ND ND

a T h e a b i l i t y t o c o m p e t e f o r b i n d i n g w a s d e t e r m i n e d b y e q u i l i b r i u m d i a l y s i sw i t h 1 . 7 ,M o l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n a n d 1 . 5 I L M A l a - P h e - [ 3 H ] G l y . U n d e rc o n d i t i o n s i n w h i c h n o c o m p e t i n g p e p t i d e w a s p r e s e n t , t h e p e r c e n t a g e o fA l a - P h e - [ 3 H ] G l y b o u n d w a s c o n s i d e r e d t o b e 1 0 0 % 6 . A l l r e s u l t s a r e t h e a v e r a g eo f t w o t o t h r e e i n d e p e n d e n t a s s a y s r a n g e .b B i n d i n g o f A l a - P h e - [ 3 H ] G l y w a s b e l o w t h e l e v e l o f d e t e c t i o n .c ND, N o t d e t e r m i n e d .S i g m a , w a s r e c r y s t a l l i z e d f r o m b e n z e n e a t 4 0 C a n d t h e na g a i n f r o m b e n z e n e a t room t e m p e r a t u r e . A l l o t h e r c h e m i -c a l s w e r e r e a g e n t g r a d e o r b e t t e r . W a t e r was d e i o n i z e d a n dt h e n g l a s s d i s t i l l e d .O l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n . T h e o l i g o p e p t i d e - b i n d i n gp r o t e i n w a s p u r i f i e d f r o m E . c o l i W (ATCC 9 6 3 7 ) a s p r e v i -o u s l y d e s c r i b e d ( 1 4 ) . P r e p a r a t i o n s o f t h e b i n d i n g p r o t e i nw e r e g r e a t e r t h a n 97% h o m o g e n e o u s a s d e t e r m i n e d b ys o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ,i s o e l e c t r i c f o c u s i n g , a n d i m m u n o b l o t t i n g .C o m p e t i t i v e b i n d i n g a s s a y s . C o m p e t i t i o n w i t h A l a - P h e -[ 3 H ] G l y f o r b i n d i n g t o t h e p u r i f i e d o l i g o p e p t i d e - b i n d i n gp r o t e i n w a s m o n i t o r e d b y e q u i l i b r i u m d i a l y s i s . A s s a y s w e r ec a r r i e d o u t i n a H o e f e r e q u i l i b r i u m m i c r o v o l u m e d i a l y z e rw i t h S p e c t r a / P o r 1 ( f l a t s h e e t , Mr c u t o f f = 6 , 0 0 0 t o 8 , 0 0 0 )d i a l y s i s m e m b r a n e s ( S p e c t r u m M e d i c a l I n d u s t r i e s ) . O n e s i d eo f e a c h c e l l c o n t a i n e d a 7 0 - p I s a m p l e o f 1 . 7 , u M ( 0 . 1 m g / m l )p u r i f i e d o l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n . T h e o t h e r s i d e c o n -t a i n e d a n e q u a l v o l u m e s o l u t i o n o f 1 . 5 , u M A l a - P h e - [ 3 H ] G l yp l u s t h e c o m p e t i n g p e p t i d e o r a m i n o a c i d a t a s p e c i f i e dc o n c e n t r a t i o n . C o m p e t i t i o n s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t i n 1 0mM i m i d a z o l e a c e t a t e ( p H 7 . 3 ) c o n t a i n i n g 1 0 0 mM N a C l .T h e d i a l y s i s c h a m b e r s w e r e r o t a t e d f o r 1 8 h a t 4 C t o a l l o we q u i l i b r a t i o n , a n d m u l t i p l e s a m p l e s w e r e r e m o v e d f r o m e a c hs i d e a n d c o u n t e d i n a B e c k m a n L S - 7 5 0 0 l i q u i d s c i n t i l l a t i o nc o u n t e r .F l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s p e c t r o s c o p y . F l u o r e s c e n c e e m i s -s i o n s p e c t r a w e r e d e t e r m i n e d i n a n SLM-Aminco S P F - 5 0 0 Cr a t i o r e c o r d i n g s p e c t r o f l u o r o m e t e r . E x c i t a t i o n w a s a t 2 9 0n m , a n d t h e b a n d p a s s w a s 2 n m . S p e c t r a w e r e o b t a i n e d o ft h e o l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 7 , u M( 0 . 1 m g / m l ) i n 1 0 mM i m i d a z o l e a c e t a t e ( p H 7 . 3 ) - 1 0 0 mMN a C l i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f e a c h s p e c i f i e d p e p t i d e a ta c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 , u M . F l u o r e s c e n c e e m i s s i o n w a sm o n i t o r e d f r o m 3 0 0 nm t o 4 5 0 nm a t r o o m t e m p e r a t u r e .

RESULTST h e t r i p e p t i d e A l a - P h e - [ 3 H ] G l y , w h i c h i s t r a n s p o r t e d v i at h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e , b i n d s t o t h e p u r i f i e d o l i g o p e p -t i d e - b i n d i n g p r o t e i n w i t h a d i s s o c i a t i o n c on s t a n t o f 0 . 1 , u Ma n d a b i n di n g s t o i c h i o me t r y o f 1 . 1 m o l o f t r i p e p t i d e b o u n dp e r m o l o f b i n d i n g p r o t e i n ( 1 4 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d i e s , t h ea b i l i t y o f a n u m b e r o f a m i n o a c i d s a n d p e p t i d e s t o c o m p e t ew i t h A l a - P h e - [ 3 H ] G l y f o r b i n d i n g t o t h e p u r i f i e do l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n w a s m e a s u r e d t o c h a r a c t e r i z et h e s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s o f p e p t i d e s r e q u i r e d f o r b i n d i n g .S p e c i f i c i t y f o r o l i g o p e p t i d e s . T h e a m i n o a c i d s A l a , P h e , a n dG l y , e i t h e r i n d i v i d u a l l y o r i n c o m b i n a t i o n , w e r e u n a b l e t o

r e d u c e b i n d i n g o f A l a - P h e - [ 3 H ] G l y , e v e n when p r e s e n t i ng r e a t e r t h a n 6 0 0 - f o l d e x c e s s ( T a b l e 1 ) . I n c o n t r a s t , u n l a b e l e dA l a - P h e - G l y w a s a n e x c e l l e n t c o m p e t i t o r , c o m p l e t e l y e l i m -i n a t i n g A l a - P h e - [ 3 H ] G l y b i n d i n g . T h e d i p e p t i d e A l a - P h ed e m o n s t r a t e d some d e g r e e o f c o m p e t i t i o n , b u t o n l y a t e l e -v a t e d c o n c e n t r a t i o n s . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e p u r i f i e dp r o t e i n s p e c i f i c a l l y b i n d s p e p t i d e s a n d d i s p l a y s a s t r o n gp r e f e r e n c e f o r t r i p e p t i d e s o v e r d i p e p t i d e s .E f f e c t o f t e r m i n i . A c e t y l a t i o n o f t h e a m i n o t e r m i n u s o f( A l a ) 3 d r a s t i c a l l y i m p a i r e d t h e a b i l i t y o f t h i s p e p t i d e t oc o m p e t e w i t h A l a - P h e - [ 3 H ] G l y f o r b i n d i n g ( T a b l e 2 ) . Even a t1 mM, N - a c e t y l - ( A l a ) 3 d i s p l a y e d v i r t u a l l y n o c o m p e t i t i o n . I nc o m p a r i s o n , u n m o d i f i e d ( A l a ) 3 r e d u c e d t h e b i n d i n g o f l a -b e l e d p e p t i d e b y 96% w h e n p r e s e n t a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0, u M . E s t e r i f i c a t i o n o f ( A l a ) 3 s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d b u t d i d n o tc o m p l e t e l y e l i m i n a t e t h e a b i l i t y o f t h i s p e p t i d e t o c o m p e t ef o r b i n d i n g . T h e s e r e s u l t s i m p l y t h a t b o t h t h e a m i n o a n dc a r b o x y l t e r m i n i a r e s t r u c t u r a l l y i m p o r t a n t f o r t h e r e c o g n i -t i o n a n d b i n d i n g o f p e p t i d e t o t h e p r o t e i n . H o w e v e r , t h ea m i n o t e r m i n u s a p p e a r s t o p l a y a more c r i t i c a l r o l e i n t h i sf u n c t i o n t h a n d o e s t h e c a r b o x y l t e r m i n u s .E f f e c t o f s t e r e o c h e m i s t r y . A s i n d i c a t e d i n T a b l e 2 , ( D - A l a ) 3d i d n o t c o m p e t e w i t h A l a - P h e - [ 3 H ] G l y f o r b i n d i n g . M o r e -o v e r , i n t r o d u c t i o n o f a D - r e s i d u e i n t h e s e c o n d p o s i t i o n , a s i nL - A l a - D - A l a - L - A l a , w a s s u f f i c i e n t t o a b o l i s h c o m p e t i t i o n .P e p t i d e s c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s w i t h L - s t e r e o c h e m i s t r y , a so p p o s e d t o g l y c i n e w h i c h l a c k s a c h i r a l c e n t e r , w e r e p r e -f e r r e d . R e p l a c e m e n t o f t h e t h i r d r e s i d u e i n ( A l a ) 3 w i t hg l y c i n e r e s u l t e d i n s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d c o m p e t i t i o n . A d d i -t i o n a l s u b s t i t u t i o n o f g l y c i n e f o r a l a n i n e i n t h e s e c o n dp o s i t i o n f u r t h e r d e c r e a s e d t h e a b i l i t y o f t h e p e p t i d e t oc o m p e t e f o r b i n d i n g c o m p a r e d w i t h ( A l a ) 3 . T h u s , s t e r e o -c h e m i s t r y o f t h e p e p t i d e c o n t r i b u t e s s i g n i f i c a n t l y t o i t sb i n d i n g p r o p e r t i e s w i t h t h e p r o t e i n s h o w i n g a s t r o n g p r e f e r -e n c e f o r p e p t i d e s c o m p o s e d o f L - a m i n o a c i d s .E f f e c t o f p e p t i d e c h a i n l e n g t h . I n h i b i t i o n o f A l a - P h e -[ 3 H ] G l y b y a s e r i e s o f a l a n y l p e p t i d e h o m o l o g s w as i n v e s t i -g a t e d a s a f u n c t i o n o f c o n c e n t r a t i o n t o d e t e r m i n e t h e e f f e c to f c h a i n l e n g t h o n p e p t i d e b i n d i n g ( F i g . 1 ) . ( A l a ) 3 a n d ( A l a ) 4d i s p l a y s i m i l a r c o m p e t i t i o n c u r v e s , b o t h e f f e c t i v e l y i n h i b i t -i n g A l a - P h e - [ 3 H ] G l y b i n d i n g a t c o n c e n t r a t i o n s b e l o w 1 0 , u M .H o w e v e r , a c o n c e n t r a t i o n o f ( A l a ) 5 a p p r o x i m a t e l y 2 o r d e r so f m a g n i t u d e g r e a t e r w a s r e q u i r e d t o a c h i e v e t h e samed e g r e e o f c o m p e t i t i o n o b s e r v e d f o r ( A l a ) 3 . ( A l a ) 2 e x h i b i t e da l m o s t n o a b i l i t y t o c o m p e t e f o r b i n d i n g , e v e n a t c o n c e n t r a -t i o n s u p t o 1 mM. T h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e c o n c l u s i o n t h a tt h e b i n d i n g p r o t e i n p r e f e r s o l i g o p e p t i d e s t o d i p e p t i d e s a n d

T A B L E 2 . E f f e c t o f t e r m i n i a n d s t e r e o c h e m i s t r y on b i n d i n g% A l a - P h e - [ 3 HGly r e m a i n i n g b o u n d w i t h

C o m p e t i n g p e p t i d e a t h e f o l l o w i n g c o n c n o f c o m p e t i t o r b :1 0 M . m 1 0 0 , u M 1 mMNone ( 1 0 0 ) ( 1 0 0 ) ( 1 0 0 )( A l a ) 3 4 0 NDc NDN - A c e t y l - ( A l a ) 3 1 0 0 0 9 8 3 9 6 2( A l a ) 3 - O - m e t h y l e s t e r 9 6 2 4 0 1 5 2 1( D - A l a ) 3 9 9 3 9 6 1 3 9 1 1 0L - A l a - D - A l a - L - A l a 9 6 3 9 6 3 9 8 6A l a - A l a - G l y 3 2 2 4 1 o dA l a - G l y - G l y 9 0 5 7 2 6 3 1 0

a A l l p e p t i d e s a r e c o m p o s e d o f L - a m i n o a c i d s u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d .b T h e a b i l i t y o f a p e p t i d e t o c o m p e t e f o r b i n d i n g w a s d e t e r m i n e d a sd e s c r i b e d i n T a b l e 1 , f o o t n o t e a .c N D , N o t d e t e r m i n e d .d B i n d i n g o f A l a - P h e - [ 3 H J G l y wa s b e l o w t h e l e v e l o f d e t e c t i o n .

J . B A C T E R I O L .


3/5

PERIPLASMIC OLIGOPEPTIDE-BINDING PROTEIN SPECIFICITYs u g g e s t s t h a t a d e c r e a s e i n a f f i n i t y f o r b i nd i ng o c c u r s w i t hi n c r e a s i n g c h a i n l e n g t h b e y o n d t r i p e p t i d e .E f f e c t o f a m i n o a c y l s i d e c h a i n s . A n u m b e r o f t r i p e p t i d eh o m o l o g s w e r e u s e d t o s t u d y t h e e f f e c t o f a m i n o a c y l s i d ec h a i n s o n p e p t i d e b i n d i n g ( T a b l e 3 ) . W h i l e c e r t a i n p e p t i d e sc o m p o s e d o f h y d r o p h o b i c o r n o n p o l a r a m i n o a c i d s w e r ee x c e l l e n t i n h i b i t o r s , o t h e r p e p t i d e s i n t h i s s a m e c l a s s i f i c a t i o nw e r e v e r y p o o r c o m p e t i t o r s o f A l a - P h e - [ 3 H ] G l y b i n d i n g . I ng e n e r a l , p e p t i d e s c o n s i s t i n g o f p o l a r a m i n o a c i d s s u c h a s( S e r ) 3 o r ( G l n ) 3 c o m p e t e d a s w e l l o r b e t t e r t h a n h y d r o p h o b i cp e p t i d e s . P e p t i d e s c o m p o s e d o f a m i n o a c i d s w i t h i o n i c s i d ec h a i n s w e r e a s a c l a s s c o n s i s t e n t l y p o o r i n h i b i t o r s o f A l a -P h e - [ 3 H ] G l y b i n d i n g . S i m i l a r l y , r e s u l t s f r o m a s s a y s i n w h i c hp e p t i d e s c o m p e t e d w i t h A l a - L y s - [ " 4 C ] G l y f o r b i n d i n g ( d a t an o t s h o w n ) i n d i c a t e d t h a t p e p t i d e s w i t h h y d r o p h o b i c o rp o l a r s i d e c h a i n s e f f e c t i v e l y i n h i b i t e d b i n d i n g o f l a b e l e dp e p t i d e b u t t h a t p e p t i d e s p o s s e s s i n g i o n i c a m i n o a c y l g r o u p ss h o w e d v e r y l i t t l e c o m p e t i t i o n .T h e e f f e c t o f a m i n o a c y l s i d e c h a i n s w a s a l s o i n v e s t i g a t e db y f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s p e c t r os c o p y . T h e o l i g o p e p t i d e -b i n d i n g p r o t e i n e x h i b i t e d n a t i v e t r y p t o p h a n f l u o r e s c e n c ew h e n e x c i t e d a t 2 9 0 nm ( F i g . 2 ) w i t h a n e m i s s i o n maximuma t 3 4 9 n m . U pon a d d i t i o n o f 1 0 0 , u M ( A l a ) 3 , a n e x c e l l e n tc o m p e t i t o r f o r t h e A l a - P h e - G l y b i n d i n g s i t e , n o c h a n g e i n t h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r u m w a s o b s e r v e d . S i m i l a r r e s u l t s w e r ea l s o o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 0 , u M A l a - P h e - G l y ( d a t an o t s h o w n ) . H o w e v e r , t h e a d d i t i o n o f 1 0 0 , u M ( L y s ) 3 , ap e p t i d e w h i c h d i s p l a y e d n o c o m p e t i t i o n f o r b i n d i n g t o t h eA l a - P h e - G l y s i t e , r e s u l t e d i n a s u b s t a n t i a l i n c r e a s e i nt r y p t o p h a n f l u o r e s c e n c e w i t h a s h i f t t o l o n g e r w a v e l e n g t h s .T h u s , ( L y s ) 3 a f f e c t s t h e f l u o r e s c e n c e s p e c t r u m o f t h e p e r i -p l a s m i c p r o t e i n d i f f e r e n t l y f r o m ( A l a ) 3 o r A l a - P h e - G l y .

DISCUSSIONE q u i l i b r i u m d i a l y s i s h a s b e e n u s e d e x t e n s i v e l y f o r t h ep u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p e r i p l a s m i c b i n d i n gc o m p o n e n t f r o m a v a r i e t y o f t r a n s p o r t s y s t e m s , i n c l u d i n gt h o s e f o r l e u c i n e ( 9 , 1 0 , 4 1 ) , g l u t a m i n e ( 3 9 ) , c y s t i n e ( 4 ) ,g a l a c t o s e ( 5 ) , r i b o s e ( 4 0 ) , a n d o l i g o p e p t i d e s ( 1 4 ) . I n t h ep r e s e n t s t u d y , a m i c r o v o l u m e e q u i l i b r i u m d i a l y s i s t e c h n i q u ew a s u s e d t o m i n i m i z e t h e a m o u n t o f p u r i f i e d o l i g o p e p t i d e -b i n d i n g p r o t e i n a n d l a b e l e d p e p t i d e s u b s t r a t e n e e d e d f o r

Z~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~IiZ~ 1 010-10[ P E P T I D E ] ( " M )

F I G . 1 . E f f e c t o f p e p t i d e c h a i n l e n g t h on b i n d i n g . C o m p e t i t i o nw i t h A l a - P h e - [ 3 H ] G l y ( 1 . 5 , u M ) f o r b i n d i n g t o p u r i f i e d o l i g o p e p t i d e -b i n d i n g p r o t e i n ( 1 . 7 , u M ) w as d e t e r m i n e d b y e q u i l i b r i u m d i a l y s i s f o ra s e r i e s o f a l a n y l p e p t i d e h o m o l o g s . T h e p e r c e n t a g e o f A l a - P h e -[ 3 H ] G l y r e m a i n i n g b o u n d w as p l o t t e d v e r s u s t h e l o g o f t h e i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n o f c o m p e t i n g p e p t i d e . U n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h noc o m p e t i t o r was p r e s e n t , b i n d i n g o f A l a - P h e - [ 3 H ] G l y w as c o n s i d e r e dt o b e 1 0 0 % . E a c h c u r v e r e p r e s e n t s t h e c o m b i n e d r e s u l t s f r o m tw o t ot h r e e i n d e p e n d e n t a s s a y s .

T A B L E 3 . E f f e c t o f a m i n o a c y l s i d e c h a i n s o n p e p t i d e b i n d i n g% A l a - P h e - [ 3 H ] G l y r e m a i n i n g b o u n d w i t h

C o m p e t i n g p e p t i d e a t h e f o l l o w i n g c o n c n o f c o m p e t i t o r :5 05LM 1 0 0,l M 1 mM

N o n p o l a r , h y d r o p h o b i c( A l a ) 3 O c N Dd ND( G l y ) 3 9 9 0 9 6 4 6 8 8( L e u ) 3 9 3 3 8 8 2 ND( M e t ) 3 0 0 ND( P r o ) 3 1 0 4 3 1 0 4 1 ND( P h e ) 3 3 1 1 1 9 1 ND( T y r ) 3 5 6 2 4 4 0 ND( V a l ) 3 1 5 1 8 1 ND

P o l a r( G l n ) 3 3 1 0 ND( S e r ) 3 7 2 5 1 ND( T h r ) 3 7 6 2 6 4 1 NDI o n i c( G l u ) 3 1 0 2 5 9 2 1 8 4 4 1 4( L y s ) 3 1 0 0 6 1 0 0 8 7 4 1 0( O r n ) 3 1 0 5 0 1 0 6 1 0 9 9 3

a A l l p e p t i d e s a r e c o m p o s e d o f L - a m i n o a c i d s .b T h e a b i l i t y o f a p e p t i d e t o c o m p e t e f o r b i n d i n g w a s d e t e r m i n e d a sd e s c r i b e d i n T a b l e 1 , f o o t n o t e a .c B i n d i n g o f A l a - P h e - [ 3 H ] G l y w a s b e l o w t h e l e v e l o f d e t e c t i o n .d ND, N o t d e t e r m i n e d .e a c h a s s a y . I n c a s e s i n w h i c h p e r i p l a s m i c b i n d i n g p r o t e i n sh a v e b e e n p u r i f i e d c o n t a i n i n g a s t o i c h i o m e t r i c a m o u n t o ft i g h t l y b o u n d e n d o g e n o u s l i g a n d ( 1 , 3 4 ) , m i c r o v o l u m e a s s a y sh a v e y i e l d e d n o n l i n e a r b i n d i n g c u r v e s o w i n g t o t h e i s o t o p i cd i l u t i o n o f t h e r a d i o a c t i v e s u b s t r a t e b y t h e b o u n d l i g a n d .H o w e v e r , l i n e a r d o u b l e - r e c i p r o c a l b i n d i n g p l o t s w e r e o b -t a i n e d f o r t h e o l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n ( 1 4 ) , s u g g e s t i n gt h a t n o e n d o g e n o u s l y b o u n d l i g a n d i s a s s o c i a t e d w i t h t h i sp r o t e i n a n d t h a t m i c r o v o l u m e e q u i l i b r i u m d i a l y s i s s h o u l d b ea n a c c u r a t e m e t h o d f o r m e a s u r i n g b i n d i n g . C o m p e t i t i o n w i t hA l a - P h e - [ 3 H ] G l y f o r b i n d i n g t o t h e p u r i f i e d o l i g o p e p t i d e -b i n d i n g p r o t e i n w a s u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e s t r u c t u r a l p r o p -e r t i e s o f p e p t i d e s u b s t r a t e s t h a t a r e r e q u i r e d f o r p e p t i d e -p r o t e i n i n t e r a c t i o n s . A l t h o u g h d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s w e r en o t d e t e r m i n e d , t h e a b i l i t y o f a g i v e n p e p t i d e t o c o m p e t e f o rb i n d i n g w a s t a k e n a s a r e l a t i v e m e a s u r e o f t h e a f f i n i t y o f t h eb i n d i n g p r o t e i n f o r t h e p e p t i d e a t t h a t s i t e .T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t t h e b i n d i n g p r o t e i n p o s s e s s e sl i t t l e o r n o a f f i n i t y f o r f r e e a m i n o a c i d s a n d d i p e p t i d e s . T h ep r o t e i n r e c o g n i z e d f e a t u r e s c h a r a c t e r i s t i c o f t w o - p e p t i d ea m i d e b o n d s s i n c e c o m b i n a t i o n s o f i n d i v i d u a l a m i n o a c i d s o ro f a n a m i n o a c i d a n d a d i p e p t i d e d i d n o t p r o d u c e c o m p e t i t i o nc o m p a r a b l e t o t h a t e x h i b i t e d b y a n i n t a c t t r i p e p t i d e . T h e s er e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e t r a n s p o r t a n d g e n e t i c e v i -d e n c e w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e u p t a k e o f a m i n o a c i d s ( 1 9 ,2 0 ) , d i p e p t i d e s ( 7 , 2 4 , 3 8 ) , a n d o l i g o p e p t i d e s ( 2 , 7 , 1 7 , 2 4 ) i sm e d i a t e d b y s e p a r a t e s y s t e m s . Th e b i n d i n g p r o t e i n t h u sa p p e a r s t o b e r e s p o n s i b l e f o r c o n f e r r i n g on t h e p e r m e a s e t h es p e c i f i c i t i e s t h a t d i s t i n g u i s h t h e o l i g o p e p t i d e s y s t e m f r o m t h ed i p e p t i d e s y s t e m .T h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e a b s o l u t e l y r e q u i r e s i t s p e p t i d es u b s t r a t e s t o p o s s e s s a n i o n i z a b l e p r i m a r y o r s e c o n d a r yN - t e r m i n a l a m i n o g r o u p ( 3 , 1 1 , 2 5 , 2 8 ) . H o w e v e r , p e p t i d e sl a c k i n g a C - t e r m i n a l a - c a r b o x y l g r o u p ( 2 7 , 3 1 ) o r h a v i n g t h ef u n c t i o n a l i t y v a r i o u s l y r e p l a c e d o r d e r i v a t i z e d ( 8 ) a r e s t i l lt r a n s p o r t e d , a l b e i t w i t h r e d u c e d a f f i n i t i e s c o m p a r e d w i t h t h ep a r e n t p e p t i d e s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , a c e t y l a t i o n o f t h e

7 7 7O L . 1 6 8 , 1 9 8 6


4/5

7 7 8 GUYER ET A L .

06-o0 4 )

0.2

* I I , , I3 0 0 3 5 0 4 0 0W a v e l e n g t h ( n m )F I G . 2 . E f f e c t o f p e p t i d e s u b s t r a t e s o n t h e f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n

s p e c t r u m o f t h e o l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n . Th e r e l a t i v e f l u o r e s -c e n c e o f t h e o l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 7I 1 M ( 0 . 1 m g / m l ) i n 1 0 mM i m i d a z o l e a c e t a t e ( p H 7 . 3 ) - 1 0 0 mM NaClwas d e t e r m i n e d as a f u n c t i o n o f w a v e l e n g t h w i t h e x c i t a t i o n a t 2 9 0n m . S y m b o l s : -,l u o r e s c e n c e o f t h e p r o t e i n i n b u f f e r a l o n e ;- - - -, f l u o r e s c e n c e o f t h e p r o t e i n i n t h e presence o f 1 0 0 , u M ( A l a ) 3 ;- - . - . - , f l u o r e s c e n c e o f t h e p r o t e i n i n t h e presence o f 1 0 0 , u M( L y s ) 3 . A l l s p e c t r a w e r e o b t a i n e d 1 0 m i n a f t e r m i x i n g t h e p e p t i d ew i t h t h e b i n d i n g p r o t e i n .a m i n o t e r m i n u s o f ( A l a ) 3 s e v e r e l y d i m i n i s h e d t h e i n h i b i t i o nb y t h i s p e p t i d e o f A l a - P h e - [ 3 H ] G l y b i n d i n g , w h i l e e s t e r i f i c a -t i o n o f t h e c a r b o x y l t e r m i n u s o f ( A l a ) 3 r e s u l t e d i n a p r o -n o u n c e d , b u t l e s s s e r i o u s d e c r e a s e i n i n h i b i t i o n . T h e s eb i n d i n g r e s u l t s p a r a l l e l t h e c h a r a c t e r i s t i c s o b s e r v e d f o rt r a n s p o r t ( 2 1 , 2 5 , 2 8 ) ; t h e p r e f e r e n c e s o f t h e t r a n s p o r ts y s t e m p r o b a b l y r e f l e c t t h e p r e f e r e n c e s o f t h e b i n d i n g p r o -t e i n f o r p e p t i d e s w i t h u n m o d i f i e d t e r m i n i .A n o t h e r f a c t o r i n f l u e n c i n g s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y i s t h el e n g t h o f t h e p e p t i d e c h a i n . A n a l y s i s o f t h e b i n d i n g d a t ao b t a i n e d f o r a s e r i e s o f a l a n y l p e p t i d e h o m o l o g s i n d i c a t e st h a t t h e a f f i n i t y o f t h e p e r i p l a s m i c p r o t e i n f o r t h e s e p e p t i d e sd e c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g c h a i n l e n g t h f r o m n = 3 t o 5 . I ts h o u l d b e n o t e d t h a t t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e l o n g e s th o m o l o g , ( A l a ) 5 , i s w e l l b e l o w t h e c u t o f f a l l o w e d b y t h ep o r i n s i n t h e o u t e r membrane ( 3 2 ) .T h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e d i s p l a y s a w i d e t o l e r a n c et o w a r d t h e a m i n o a c y l s i d e c h a i n s o f p e p t i d e s u b s t r a t e s ( 2 , 7 ,8 , 1 2 , 2 4 , 3 0 ) , w i t h t h e s i d e c h a i n s p r i m a r i l y e x e r t i n g ane f f e c t o n t h e a f f i n i t i e s ( 3 3 ) a n d r a t e s o f u p t a k e ( 3 0 ) . T h e r e -f o r e , t h e i n f l u e n c e o f a m i n o a c y l s i d e c h a i n s o n b i n d i n gs p e c i f i c i t y was m e a s u r e d w i t h a v a r i e t y o f t r i p e p t i d eh o m o l o g s . T h e a b i l i t y t o compete f o r b i n d i n g w i t h A l a- P h e -[ 3 H ] G l y v a r i e d w i d e l y w i t h i n t h e c l a s s e s o f p e p t i d e s com-p o s e d o f n o n p o l a r , p o l a r , a n d h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s , b u tg e n e r a l l y p a r a l l e l e d t h e c o m p e t i t i v e a b i l i t i e s r e p o r t e d f o rt r a n s p o r t ( 3 0 ) w i t h t h e r a n k i n g as f o l l o w s : ( A l a ) 3 > ( S e r ) 3>> ( G l y ) 3 .P e p t i d e s c o m p o s e d p r e d o m i n a n t l y o f g l y c i n e ar e p o o r e rs u b s t r a t e s f o r t r a n s p o r t t h a n s i m i l a r p e p t i d e s c o n s i s t i n g o fa l a n i n e ( 3 0 , 3 3 ) . T h e s e r e s u l t s may b e a c c o u n t e d f o r on t h eb a s i s o f p e p t i d e b i n d i n g . E a c h s u b s e q u e nt r e p l a c e m e n t o f

g l y c i n e f o r a l a n i n e i n ( A l a ) 3 ( T a b l e 2 ) r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n tr e d u c t i o n i n t h e a b i l i t y o f t h e p e p t i d e t o c o m p e t e f o r b i n d i n g .T h e a p p a r e n t l o w a f f i n i t i e s f o r ( G l y ) 3 a n d f o r ( P r o ) 3 may b ee x p l a i n e d o n t h e b a s i s o f p e p t i d e c o n f o r m a t i o n . I n ( P r o ) 3 ,t h e s e r i e s o f r i g i d p y r r o l i d i n e r i n g s p l a c e s s e v e r e c o n s t r a i n t so n t h e p e p t i d e b a c k b o n e a n d may p r e v e n t a d o p t i o n o f t h ec o n f o r m a t i o n n e c e s s a r y f o r b i n d i n g . I n ( G l y ) 3 , i t h a s b e e ns u g g e s t e d t h a t a f a i r l y u n r e s t r i c t e d r a n g e o f r o t a t i o n a l a n g l e sc a n b e a c c o m m o d a t e d b y t h e p e p t i d e b o n d s a n d may r e d u c et h e e f f e c t i v e c o n ce n t r a t i o n o f t h e p a r t i c u l a r c o n f o r m a t i o nr e c o g n i z e d b y t h e b i n d i n g p r o t e i n ( 3 3 ) . M o r e o v e r , a d o p t i o no f a p a r t i c u l a r b a c k b o n e c o n f o r m a t i o n u p o n b i n d i n g mayr e s u l t i n a s i g n i f i c a n t l o s s o f e n t r o p y . T h i s n e g a t i v e c o n t r i -b u t i o n t o t h e o v e r a l l f r e e e n e r g y o f a s s o c i a t i o n c o u l d b em a n i f e s t e d a s a l o w a p p a r e n t b i n d i n g a f f i n i t y .P e p t i d e s c o m p o s e d e x c l u s i v e l y o f a m i n o a c i d s w i t h i o n i cs i d e c h a i n s f a i l e d t o c o m p e t e f o r b i n d i n g t o t h e p u r i f i e dp r o t e i n . ( L y s ) 3 a n d ( OM ) 3 c o m p et e d f o r u p t a k e w i t h e a c ho t h e r , a s w e l l a s w i t h a v a r i e t y o f o t h e r o l i g o p e p t i d e sc o n t a i n i n g h y d r o p h o b i c o r n o n p o l a r s i d e c h a i n s , i m p l y i n gt h a t t h e s e p e p t i d e s s h a r e a c o m m o n t r a n s p o r t s y s t e m ( 2 4 ,3 7 ) . M o r e i m p o r t a n t l y , m u t a t i o n s i n t h e g e n e t i c l o c u s c o d i n gf o r t h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e p r e v e n t u p t a k e o f a w i d e r a n g eo f o l i g o p e p t i d e s , i n c l u d i n g ( L y s ) 3 a n d ( O r n ) 3 ( 1 8 ) . T h e s er e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e p e r m e a s e i s c a p a b l e o f t r a n s p o r t i n gp e p t i d e s c o m p o s e d o f i o n i c a m i n o a c y l s i d e c h a i n s .Tw o h y p o t h e s e s r a t i o n a l i z i n g t h e d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h et r a n s p o r t a n d b i n d i n g d a t a c a n b e s u g g e s t e d . F i r s t , one ( o rm o r e ) s e p a r a t e a n d d i s t i n c t b i n d i n g s i t e ( s ) f o r p e p t i d e sc o n s i s t i n g p r i m a r i l y o f a m i n o a c i d s w i t h c h a r g e d s i d e c h a i n smay e x i s t o n t h e p e r i p l a s m i c p r o t e i n . S e c o n d , t h e u p t a k e o fp e p t i d e s s u c h a s ( L y s ) 3 a n d ( O M ) 3 may b y p a s s t h e p e r i p l a s -m i c b i n d i n g p r o t e i n a n d may r e l y d i r e c t l y on t h e m e m b r a n e -a s s o c i a t e d p r o t e i n s . A m u t a t i o n i n t h e t r a n s p o r t s y s t e m f o rm a l t o s e h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d w h i c h a l l o w s t r a n s p o r t d i -r e c t l y t h r o u g h t h e m e m b r a n e c o m p o n e n t s , c i r c u m v e n t i n gt h e i n v o l v e m e n t o f t h e b i n d i n g p r o t e i n ( 3 6 ) .T h e f i r s t o f t h e s e h y p o t h e s e s w as i n v e s t i g a t e d i n a p r e l i m -i n a r y e x p e r i m e n t b y f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s p e c t r o s c o p y .T h e p e r i p l a s m i c p r o t e i n s i n v o l v e d i n h i s t i d i n e ( 3 5 ) ,a r a b i n o s e ( 2 3 ) , g a l a c t o s e ( 2 2 ) , a n d g l u t a m i n e ( 3 9 ) t r a n s p o r tu n d e r g o a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e u p o n b i n d i n g s u b s t r a t et h a t r e s u l t s i n a n a l t e r a t i o n i n t h e i r f l u o r e s c e n c e e m i s s i o ns p e c t r u m . A s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e f l u o r e s c e n c e e m i t t e db y t h e o l i g o p e p t i d e - b i n d i n g p r o t e i n w as o b s e r v e d u p o n t h ea d d i t i o n o f ( L y s ) 3 , s u g g e s t i n g t h a t p e p t i d e s c o m p o s e d o fi o n i c a m i n o a c i d s d o i n t e r a c t w i t h t h e p r o t e i n a n d i n d u c e ac h a n g e i n c o n f o r m a t i o n . Th e f a c t t h a t ( A l a ) 3 a n d A l a - P h e -G l y f a i l t o p r o d u c e s i m i l a r c h a n g e s i n t h e f l u o r e s c e n c es p e c t r u m b u t d o c o m p e t e f o r b i n d i n g i n t h e r a d i o a c t i v ea s s a y s s u g g e s t s t h a t t h e b i n d i n g p r o t e i n p o s s e s s e s more t h a no n e b i n d i n g s i t e c a p a b l e o f d i s t i n g u i s h i n g p e p t i d e s on t h eb a s i s o f t h e i r a m i n o a c y l s i d e c h a i n s .

ACKNOWLEDGMENTST h i s w o r k was s u p p o r t e d b y P u b l i c H e a l t h S e r v i c e g r a n tA M 2 5 4 8 9 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , a g r a n t f r o m t h eV a n d e r b i l t U n i v e r s i t y R e s e a r c h C o u n c i l , a n d b y p r e d o c t o r a l f e l l o w -s h i p s t o C . A . G. a n d D . G . M . f r o m t h e S a m u e l R o b e r t s N o b l eF o u n d a t i o n .We t h a n k N e i l O s h e r o f f a n d D a v i d O n g f o r many v a l u a b l ed i s c u s s i o n s . T h e a s s i s t a n c e o f P a u l M a c D o n a l d was a p p r e c i a t e d i np e r f o r m i n g t h e f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s p e c t r o s c o p y . We a l s o t h a n kD . S w i n g l e f o r e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d S . H e a v e r a n d D .S u l l i n s f o r p r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t .

J . B A C T E R I O L .


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PERIPLASMIC OLIGOPEPTIDE-BINDING PROTEIN SPECIFICITYLITERATURE CITED

1 . A m a n u m a , H . , J . I t o h , a n d Y . A n r a k u . 1 9 7 6 . T r a n s p o r t o fs u g a r s a n d a m i n o a c i d s i n b a c t e r i a . J . B i o c h e m . 7 9 : 1 1 6 7 - 1 1 8 2 .2 . B a r a k , Z . , a n d C . G i l v a r g . 1 9 7 4 . T r i o r n i t h i n e - r e s i s t a n t s t r a i n s o fE s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 4 9 : 1 4 3 - 1 4 8 .3 . B e c k e r , J . M . , a n d F . N a i d e r . 1 9 7 4 . S t e r e o s p e c i f i c i t y o ft r i p e p t i d e u t i l i z a t i o n i n a m e t h i o n i ne a u x o t r o p h o f E s c h e r i c h i ac o l i K - 1 2 . J . B a c t e r i o l . 1 2 0 : 1 9 1 - 1 9 6 .4 . B e r g er , E . A . , a n d L . A . H e p p e l . 1 9 7 2 . A b i n d i n g p r o t e i ni n v o l v e d i n t h e t r a n s p o r t o f c y s t i n e a n d d i a m i n o p i m e l i c a c i d i nE s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 7 6 8 4 - 7 6 9 4 .5 . B o o s , W . , A . S . G o r d o n , R . E . H a l l , a n d D . H . P r i c e . 1 9 7 2 .T r a n s p o r t p r o p e r t i e s o f t h e g a l a c t o s e - b i n d i n g p r o t e i n o f E s c h e -r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 9 1 7 - 9 2 4 .6 . C o w e l l , J . L . 1 9 7 4 . E ne r g e t i cs o f g l y c y l g l y c i n e t r a n s p o r t i nE s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 2 0 : 1 3 9 - 1 4 6 .7 . D e F e l i c e , M . , L . G ua r di o la , A . L a m b e r t i , a n d M. l a c c a r i n o .1 9 7 3 . E s c h e r i c h i a c o l i K - 1 2 m u t a n t s a l t e r e d i n t h e t r a n s p o r ts y s t e m f o r o l i g o - a n d d i p e p t i d e s . J . B a c t e r i o l . 1 1 6 : 7 5 1 - 7 5 6 .8 . F i c k e l , T . E . , a n d C . G i l v a r g . 1 9 7 3 . T r a n s p o r t o f i m p e r m e a n ts u b s t a n c e s i n E . c o l i b y way o f o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e . N a t u r e( L o n d o n ) N e w B i o l . 2 4 1 : 1 6 1 - 1 6 3 .9 . F u r l on g , C . E . , R . G . M o r r i s , M. K a nd r a c h , a n d B . P . R o s e n .1 9 7 2 . A m u l t i c h a m b e r e q u i l i b r i u m d i a l y s i s a p p a r a t u s . A n a l .B i o c h e m . 4 7 : 5 1 4 - 5 2 6 .1 0 . F ur l o n g, C . E . , a n d J . H . W e i n e r . 1 9 7 0 . P u r i f i c a t i o n o f al e u c i n e - s p e c i f i c b i n d i n g p r o t e i n f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . Commun. 3 8 : 1 0 7 6 - 1 0 8 3 .1 1 . G i l v a r g , C . , a n d E . K a t c h a l s k i . 1 9 6 5 . P e p t i d e u t i l i z a t i o n i nE s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 4 0 : 3 0 9 3 - 3 0 9 8 .1 2 . G i l v a r g , C . , a n d Y . L e v i n . 1 9 7 2 . R e s p o n s e o f E s c h e r i c h i a c o l i t oo r n i t h y l p e p t i d e s . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 5 4 3 - 5 4 9 .1 3 . G u t n i c k , D . , J . M. C a l v o , P . K l o p o t o w s k i , a n d B . N . A m e s . 1 9 6 9 .C o m p o u n d s w h i c h s e r v e a s t h e s o l e s o u r c e o f c a r b o n o rn i t r o g e n f o r S a l m on e l l a t y p h i m u r i u m L T - 2 . J . B a c t e r i o l .1 0 0 : 2 1 5 - 2 1 9 .1 4 . G u y e r , C . A . , D . G . M o r g a n , N . O s h e r o f f , a n d J . V . S t a r o s .1 9 8 5 . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a p e r i p l a s m i c o l i g o -p e p t i d e b i n d i n g p r o t e i n f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m .2 6 0 : 1 0 8 1 2 - 1 0 8 1 8 .1 5 . H e p p e l , L . A . 1 9 7 1 . T h e c o n c e p t o f p e r i p l a s m i c e n z y m e s , p .2 2 3 - 2 4 7 . I n L . I . R o t h f i e l d ( e d . ) , S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o fb i o l o g i c a l m e m b r a n e s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Y o r k .

1 6 . H i g g i n s , C . F . , a n d M. M. H a r d i e . 1 9 8 3 . P e r i p l a s m i c p r o t e i na s s o c i a t e d w i t h t h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e s o f S a l m o n e l l at y p h i m u r i u m a n d E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 5 5 : 1 4 3 4 - 1 4 3 8 .1 7 . H i g g i n s , C . F . , M. M. H a r d ie , D . J a m i e s o n , a n d L . M. P o w e l l .1 9 8 3 . G e n e t i c map o f t h e o p p ( o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e ) l o c u s o fS a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m . J . B a c t e r i o l . 1 5 3 : 8 3 0 - 8 3 6 .1 7 a . H i l e s , I . D . , a n d C . F . H i g g i n s . 1 9 8 6 . P e p t i d e u p t a k e b yS a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m : t h e p e r i p l a s m i c o l i g o p e p t i d e - b i n d i n gp r o t e i n . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 8 : 5 6 1 - 5 6 7 .1 8 . H o g a r t h , B . G . , a n d C . F . H i g g i n s . 1 9 8 3 . G e n e t i c o r g a n i z a t i o n o ft h e o l i g o p e p t i d e p e r m e a s e ( o p p ) l o c u s o f S a l m o n e l l a t y p h i m u r -i u m a n d E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 5 3 : 1 5 4 8 - 1 5 5 1 .1 9 . K e s s a l , D . , a n d M. L u b i n . 1 9 6 2 . T r a n s p o r t o f p r o l i n e i n E s c h e -r i c h i a c o l i . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 7 : 3 2 - 3 8 .2 0 . L e v i n e , E . M . , a n d S . S i m m o n d s . 1 9 6 2 . F u r t h e r s t u d i e s o nm e t a b o l i t e u p t a k e b y S e r - G l y a u x o t r o p h s o f E s c h e r i c h i a c o l i . J .B i o l . C h e m . 2 3 7 : 3 7 1 8 - 3 7 2 4 .

2 1 . M a t t h e w s , D . M . , a n d J . W. P a y n e . 1 9 8 0 . T r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t o f s m a l l p e p t i d e s . C u r r . T o p . Membr. T r a n s p .1 4 : 3 3 1 - 4 2 5 .2 2 . M i l l e r , D . M . , I I I , J . S . O l s o n , a n d F . A . Q u i o c h o . 1 9 8 0 . T h et h i o l g r o u p o f t h e L - a r a b i n o s e - b i n d i n g p r o t e i n . J . B i o l . C h e m .2 5 5 : 2 4 6 5 - 2 4 7 1 .2 3 . P a r s o n s , R . G . , a n d R . W. H o g g . 1 9 7 4 . C r y s t a l l i z a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e L - a r a b i n o s e - b i n d i n g p r o t e i n o f E s c h e -r i c h i a c o l i B / r . J . B i o l . C h e m . 2 4 9 : 3 6 0 2 - 3 6 0 7 .2 4 . P a y n e , J . W. 1 9 6 8 . O l i g o p e p t i d e t r a n s p o r t i n E s c h e r i c h i a c o l i . J .B i o l . C h e m . 2 4 3 : 3 3 9 5 - 3 4 0 3 .2 5 . P a y n e , J . W. 1 9 7 1 . T h e r e q u i r e m e n t f o r t h e p r o t o n a t e d a - a m i n og r o u p f o r t h e t r a n s p o r t o f p e p t i d e s i n E s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m .J . 1 2 3 : 2 4 5 - 2 5 3 .2 6 . P a y n e , J . W. 1 9 7 2 . E f f e c t s o f N - m e t h y l p e p t i d e b o n d s o np e p t i d e u t i l i z a t i o n b y E s c h e r i c h i a c o l i . J . G e n . M i c r o b i o l .7 1 : 2 5 9 - 2 6 5 .2 7 . P a y n e , J . W. 1 9 7 3 . P e p t i d e u t i l i z a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i :s t u d i e s w i t h p e p t i d e s c o n t a i n i n g P - a l a n y l r e s i d u e s . B i o c h i m .B i o p h y s . A c t a 2 9 8 : 4 6 9 - 4 7 8 .2 8 . P a y n e , J . W. 1 9 7 4 . P e p t i d e t r a n s p o r t i n E s c h e r i c h i a c o l i :p e r m e a s e s p e c i f i c i t y t o w a r d s t e r m i n a l a m i n o g r o u p s u b s t i t u -e n t s . J . G e n . M i c r o b i o l . 8 0 : 2 6 9 - 2 7 6 .2 9 . P a y n e , J . W. 1 9 7 6 . P e p t i d e s a n d m i c r o - o r g a n i s m s . A d v . M i c r o b .P h y s i o l . 1 3 : 5 5 - 1 1 3 .3 0 . P a y n e , J . W . , a n d G . B e l l . 1 9 7 9 . D i r e c t d e t er m i n a t i o n o f t h ep r o p e r t i e s o f p e p t i d e t r a n s p o r t s y s t e m s i n E s c h e r i c h i a c o l i u s i n ga f l u o r e s c e n t l a b e l i n g p r o c e d u r e . J . B a c t e r i o l . 1 3 7 : 4 4 7 - 4 5 5 .3 1 . P a y n e , J . W . , a n d C . G i l v a r g . 1 9 6 8 . T h e r o l e o f t h e t e r m i n a lc a r b o x y l g r o u p i n p e p t i d e t r a n s p o r t i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l .C h e m . 2 4 3 : 3 3 5 - 3 4 0 .3 2 . P a y n e , J . W . , a n d C . G i l v a r g . 1 9 6 8 . S i z e r e s t r i c t i o n o n p e p t i d eu t i l i z a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 4 3 : 6 2 9 1 - 6 2 9 9 .3 3 . P e r r y , D . , a n d C . G i l v a r g . 1 9 8 4 . M e t a b o l i s m o f a l a n y l a l a n y l - S -[ 4 - [ N - ( 2 - t h i o e t h y l ) ] a m i n o p y r i d i n e - 2 , 6 - d i c a r b o x y l i c a c i d ] c y s t e -i n e b y s u s p e n s i o n s o f E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 6 0 :9 4 3 - 9 4 8 .3 4 . R i c h a r m e , G . , a n d A . K e p e s . 1 9 7 4 . R e l e a s e o f g l u c o s e f r o mp u r i f i e d g a l a c t o s e - b i n d i n g p r o t e i n o f E s ch e r i c h i a c o l i u p o n a d -d i t i o n o f g a l a c t o s e . E u r . J . B i o c h e m . 4 5 : 1 2 7 - 1 3 3 .3 5 . R ob e r t so n, D . E . , P . A . K r o o n , a n d C . H o . 1 9 7 7 . N u c l e a rm a g n e t i c r e s o n a n c e a n d f l u o r e s c e n c e s t u d i e s o f s u b s t r a t e -i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s o f h i s t i d i n e b i n d i n g p r o t e i n J o fS a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m . J . B i o l . C h e m . 2 4 9 : 3 6 0 2 - 3 6 0 7 .

3 6 . S h u m a n , H . A . 1 9 8 2 . T h e m a l t o s e - m a l t o d e x t r i n t r a n s p o r t s y s -t e m o f E s c h e r i c h i a c o l i . A n n . M i c r o b i o l . ( P a r i s ) 1 3 3 A : 1 5 3 - 1 5 9 .3 7 . S m i t h , R . L . , E . G . A r c h e r , a n d F . W. D u n n . 1 9 7 0 . U p t a k e o f[ " 4 C ] - l a b e l e d t r i - , t e t r a - , a n d p e n t a p e p t i d e s o f p h e n y l a l a n i n e a n dg l y c i n e b y E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 4 5 : 2 9 6 7 - 2 9 7 1 .3 8 . V o n d e r H a a r , R . A . , a n d H . E . U m b a r g e r . 1 9 7 2 . I s o l e u c i n e a n dv a l i n e m e t a b o l i s m i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 1 2 : 1 4 2 - 1 4 7 .3 9 . W e i n e r , J . H . , a n d L . A . H e p p e l . 1 9 7 1 . A b i n d i n g p r o t e i n f o rg l u t a m i n e a n d i t s r e l a t i o n t o a c t i v e t r a n s p o r t i n E s c h e r i c h i a c o l i .J . B i o l . C h e m . 2 4 6 : 6 9 3 3 - 6 9 4 4 .4 0 . W i l l i s , R . C . , a n d C . E . F u r l o n g . 1 9 7 4 . P u r i f i c a t i o n a n d p r o p e r -t i e s o f a r i b o s e - b i n d i n g p r o t e i n f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l .C h e m . 2 4 9 : 6 9 2 6 - 6 9 2 9 .4 1 . W i l l i s , R . C . , R . G . M o r r i s , C . C i r a k o g l u , G . D . S c h e l l e n b e r g ,N . H . G e r b e r , a n d C . E . F u r l o n g . 1 9 7 4 . P r e p a r a t i o n o f t h ep e r i p l a s m i c b i n d i n g p r o t e i n s f r o m S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m a n dE s c h e r i c h i a c o l i . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 6 1 : 6 4 - 7 5 .

7 7 9O L . 1 6 8 , 1 9 8 6

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Binding Specificity of the Periplasmic Oligopeptide