Białka II – 29 marca 2010Elektroforeza w warunkach natywnych

Proteinogram-Coomassie (surowica), Zymogram (fosfataza kwaśna)

Elektroforeza w warunkach denaturujących

1/2 żelu–barwienie Coomassie, 1/2 żelu–na elektrotransfer

Elektrotransfer białek

Barwienie Ponceau S

Oznaczenie stężenia białka metodą biuretową, zadanie indywidualne

Sporządzenie krzywej standardowej, Ekstrakcja białka z materiału roślinnego i oznaczenie stężenia białka metodą

biuretową

Elektroforeza - technika (głównie) analityczna stosowana w celu rozdziału mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym. Najczęściej w elektroforezie rozdzielamy białka oraz kwasy nukleinowe.

Elektroforeza może być przeprowadzana w różnych żelach, białka najczęściej rozdzielamy w żelach poliakrylamidowych.

Uwaga: monomer akrylamidu jest toksyczny (neurotoksyna i karcynogen)

http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci111a/protein-electro/supplemental.htm

Cząsteczki, które rozdzielamy muszą być naładowane elektrycznie, wówczas będą wędrować w polu elektrycznym.

O szybkości wędrowania będą decydować wielkość cząsteczki oraz ładunek elektryczny.

Elektroforeza białek może być prowadzona w warunkach „natywnych” albo „zdenaturowanych”.

W warunkach natywnych białka posiadają ładunek zależny od pH, w którym się znajdują.

W warunkach zdenaturowanych ładunek białka pochodzi od SDS i jest ujemny.

W warunkach natywnych białka zachowują swoje struktury, także

czwartorzędowe, mogą wędrować w kompleksach.

W celu redukcji mostków siarczkowych dodajemy 2-

merkaptoetanol lub ditiotreitiol - DTT, następnie próbki gotujemy

SDS

Przygotowanie próbek:

Do elektroforezy w warunkach natywnych:Do próbek dodajemy 4x stężony płyn do obciążania próbek (glicerol + barwnik). Musimy pamiętać, że mieszając dwie substancje, rozcieńczamy każdą z nich. Próbki powinny mieć końcową objętość 20 µl.

Do elektroforezy w warunkach zdenaturowanych:Do próbek dodajemy 4x stężony bufor Laemmliego (1). Musimy pamiętać, że mieszając dwie substancje, rozcieńczamy każdą z nich. Próbki powinny mieć końcową objętość 20 µl. Próbki gotujemy 5 minut i nakładamy do ścieżek na żelu.

(1) Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685, (1970)

Żele będą przygotowane, ale obowiązuje znajomość procedury przygotowania

żeli !!!

http://www.bio.miami.edu/~cmallery/255/255tech/mcb3.32.SDS.elect.jpg

Początkowo rozdział prowadzi się przy małym napięciu (60-80 V), aby białka jak najlepiej weszły w pory żelu. Gdy białka „ustawią się” na granicy żelu zagęszczającego i rozdzielającego zwiększa się napięcie (do 120-140 V).

Białka w żelach można barwić, najbardziej rozpowszechnionym barwnikiem jest Coomassie briliant blue (błękit Coomassie), można barwić

też odczynnikiem Ponceau red (szybka i odwracalna, lecz mało czuła) lub tzw. metodą srebrową (ok. 50x wyższa czułość niż błękit

Coomassie)

Dzięki wykorzystaniu wzorców masy cząsteczkowej białek można szacować masę

badanego białka.

Procedura barwienia błękitem Coomassie:

Roztwór barwiący (100 ml)50 ml metanolu10 ml lodowatego kwasu octowego0.25 g Coomassie blue R-25040 ml wody

Zalewamy żel roztworem i barwimy na kołysce przez 30-60 minut. Potem płuczemy wodą destylowaną.

Roztwór odbarwiający (100 ml)30 ml metanolu10 ml lodowatego kwasu octowego60 ml wody

W takim roztworze odbarwiamy żel przez kilkanaście godzin. Dlatego zastosujemy metodę przyspieszoną (nieco nieformalną): zagotujemy żel w wodzie destylowanej. Efekt odbarwienia widać już po 15-20 minutach.

W przypadku elektroforezy w warunkach natywnych musimy być świadomi faktu, że

niektóre białka będą mieć wypadkowy ładunek dodatni……………

Natomiast wielkim plusem elektroforezy w warunkach natywnych jest to, że białka

pozostają w kompleksach oraz, że zachowują swoją aktywność, np.

aktywność enzymatyczną.

Zymogram:

Przykład: degradacja żelatyny przez metaloproteazy, miejsca gdzie żelatyna została strawiona nie barwią się

błękitem Coomassie.[Frontiers in Bioscience 11, 3100 -3120, September 1,

2006]

Procedura przygotowania zymogramu:

W elektroforezie prowadzonej w warunkach natywnych rozdzielamy próbki, które zawierają fosfatazę kwaśną.

Żel delikatnie przenosimy do kuwety i inkubujemy 3x po 20 minut w buforze octanowym (0,2M, pH 5.0).

Żel inkubujemy w roztworze substratu dla fosfatazy kwaśnej.

Gdy pojawią się czerwono-brunatne pasma, przerywamy reakcję 7% kwasem octowym.

Substrat: α-naftylofosforan sodu i sól Fast blue B w buforze octanowym.

fosfataza kwaśna

Fosforan α-naftolu + H2O α-naftol + H3PO4

α-naftol + Fast Blue B czerwono-brunatny nierozpuszczalny

produkt

Żele są bardzo kruche, dlatego chcemy przenieść nasze białka na jakiś bardziej wytrzymały materiał. Takim materiałem może być membrana nitrocelulozowa, lub jeszcze lepiej poliwinylowa.

http://biotech.matcmadison.edu/resources/proteins/labManual/chapter_5/procedure5_4.htm

Najczęściej pH 8-9Najczęściej bufor bez SDS.W takich warunkach białka mogą przyjąć konformację

natywną.

Procedura elektroblottingu:

Delikatnie rozmontować aparat do elektroforezy i usunąć z niego żel.

Wyciąć z membrany poliwinylowej oraz z bibuły (2x) prostokąty odpowiadające wielkości żelu.

Uwaga: membrana jest bardzo hydrofobowa, musimy na 10 sekund zanurzyć ją w metanolu.

Żel, membranę i bibuły wymoczyć przez 10 minut w buforze do elektrotransferu o pH ok. 8.3.

Zmontować „kanapkę” wg kolejności podanej przed chwilą.

Elektrotransfer prowadzić przez ok. 1h, przy natężeniu prądu ok. 2 mA na cm2 powierzchni „kanapki”.

PNAS May 6, 2008 vol. 105 no. 18 6554-6559

Membranę także możemy

barwić na zawartość

białka

Detection Reagent

Approximate Sensitivity (protein per spot)

Reference

Reversible Ponceau-S 5μgDunn et al., 1999

IrreversibleAmino black 10B

1μgDunn et al., 1999

Coomassie Brilliant Blue 250

500ngDunn et al., 1999

Colloidal gold 4ngDunn et al., 1999

Barwienie Ponceau S:

Bardzo proste:Membranę wysuszyć (na powietrzu, lub delikatnie pomóc sobie suszarką do włosów) i zalać gotowym roztworem Ponceau S.Inkubować ok. 10 minut.Przemyć wodą destylowaną.

Jeśli dodamy detergentu barwnik się odpłucze.

W międzyczasie……………Odczyn barwny wiązania peptydowego – reakcja biuretowa

Uwaga: reakcja biuretowa nie jest bardzo specyficzna, także inne substancje dają wynik pozytywny. Wszystkie substancje, które posiadają co najmniej dwie poniższe grupy, dadzą wynik pozytywny.

Najprostszą z takich substancji jest biuret.

Procedura:

Zakres liniowy metody: 1-10 mg białka/ml

Do 1 ml roztworu białka dodać 4 ml odczynnika miedziowego.

Wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 30 minut.

Odczytać absorbancję przy 540 lub 650 nm.

Zerować aparat na próbie odczynnikowej, czyli 1 ml 0.9% NaCl + 4 ml odczynnika miedziowego.

A540

Wykonać wspólną dla grupy krzywą standardową

Ekstrakcja białka z materiału biologicznego i ilościowe oznaczenie

białka w ekstraktach metodą biuretową:

Otrzymane nasiona i kiełki zalać buforem octanowym w proporcji 1:5 (1g/5ml) i mieszać na mieszadle magnetycznym 30 minut. Odwirować i odsączyć. W przesączu oznaczać białko metodą biuretową. Stężenie odczytać z krzywej standardowej.