ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİTIP FAKÜLTESİ

TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

3. SINIF3.DOLAŞIM VE SOLUNUM SİSTEMİ HASTALIKLARI

DERS KURULU MİKROBİYOLOJİ UYGULAMA REHBERİ

2016

STERİL SIVILARIN MİKROBİYOLOJİK OLARAK İNCELENMESİSteril Sıvılar:

Kan Beyin omurilik sıvısı (BOS) Eklem sıvısı Plevral sıvı Peritoneal sıvı Perikardiyal sıvı Cul-de-sac sıvısı Amnion sıvısı Vitreus Safra

Örnek alımı: Perkutanaspirasyon

o Deri antisepsisi; %70 etanolveiyotçözeltisi(%10 povidon-iyodin, %1-2 serbestiyot)

o Steril olarak örneğin alınması

Örnek kabı: Örneğin enjektör ile laboratuara gönderilmesi uygun değil Kontaminasyon olasılığı İğne yaralanması riski Aktarılan kap sızdırmaz olmalı. Mümkünse antikoagülan içermeyen kap Zorunluysa heparin veya SPS EDTA ve sitrat önerilmiyor Kan kültür şişeleri

1

Örneklerin nakli Uygun şekilde etiketlenmeli ve istem yapılmalı. Hasta bilgileri

o Kimlik bilgilerio Tanıo Örnek bölgeleri: Vücut bölgesi önemli!

Sol diz eklem sıvısı, sağ torasentez örneği vb.o Tarih ve saat

En kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalı. Transport ve bekleme oda sıcaklığında olmalı(buzdolabına konmamalı)

İşlemler Yayma:

o Örnek ne kadar taze ise o kadar iyio Mikroorganizma çok az, örnek santrifüj edilmeli(3000 g, 15 dk)o Santrifüj sonrası dipteki çözeltiden preparat hazırlanmalı.o Alkolle temizlenmiş lam üzerine yaymadan 1-2 damlao Artefaktların azaltılması için:Metanol fiksasyonu, Metilen mavisi ile boyamao Değerlendirme:

Neler görülebilir; İnflamasyonhücreleri; PMNL, MNL, Eritrositler, Epitel hücreleri, Mikroorganizmalar

2

3

4

Kültür Mikroorganizma çok az. Örnek hacminin artırılması, Anaerobik ekim, birden fazla örnek ekimi izolasyon şansını artırır. En kısa sürede ekim Örnek hacmi not alınmalı. Makroskopik özellikler not alınmalı:Kanlı, pürülan, bulanık,visköz, pıhtılı... Olası etkene göre besiyeri seçimi;

o Bakteri; Pnömokok, meningokok,Haemophilus, anaeroplar,Legionella,o Mycobacteriao Mantaro Gerekirse diğer testlereyönlendirme; Mycobacteria, Virus, Parazit

Besiyeri; o Çikolata agar, o Kanlı agar,o Kan kültürü şişesi,o Tiyoglukolatlıbuyyon, o Beyin-kalp infüzyonbuyyonuo Seçici olmayan bir anaerobik kanlı agaro Seçici besiyerleri: MacConkey, Columbia nalidiksik asit agar...

5

o Aranan mikroorganizmaya özel besiyeri; LegionellaBCYE (Bufferedcharcoalyeastextract) agar

İnkübasyono 35-37 °C, %5 CO2,o Sıvı besiyerleri için normal atmosfero İnvaziv örnekler için 4 gün, o drenaj örnekleri için 2güno Özel bakteriler için uygun inkübasyonsüresi:Nocardia, Brucella...o Kan kültürü şişeleri ilgili sistemde

Kültür Değerlendirme;

Uygulamada görülecek konular1. Kan kültür şişesi2. Üreme olan şişeden hazırlanan direkt preparat3. Üreme olan şişeden katı besiyerine yapılmış pasajlar4. Steril sıvı örneğinin makroskopik incelemesi5. Steril sıvılarda Giemsa boyalı preparatta PNL/MNL oranının belirlenmesi

6

BOĞAZ KÜLTÜRÜ VE SOLUNUM YOLU BAKTERİYEL ETKENLERİN DEMOSTRASYONU

ÜST SOLUNUM YOLU ÖRNEKLERİNİN BAKTERİYOLOJİK AÇIDAN İNCELENMESİBOĞAZ ÖRNEKLERİNAZOFARİNKS ÖRNEKLERİKULAK ÖRNEKLERİSİNÜS ASPİRASYON/BİYOPSİ ÖRNEKLERİBURUN ÖRNEKLERİDİĞER ÖRNEKLER (GİNGİVİT, STOMATİT, OROFARİNKS LEZYONU SÜRÜNÜTÜ SÜÖRNEKLERİ; FARİNKS-PERİTONSİLLER APSE ASPİRASYONLARI)

ALT SOLUNUM YOLU ÖRNEKLERİNİN BAKTERİYOLOJİK AÇIDAN İNCELENMESİBALGAMBALGAM DIŞI ALT SOLUNUM YOLU ÖRNEKLERİ

BOĞAZ SÜRÜNTÜ ÖRNEĞİ: Örnek alımı: Yanlış alınan boğaz sürüntüsü, etkenin saptanamamasına ve tedavi başarısızlığına neden olur. Bu nedenle boğaz kültürü alınırken eküvyon dikkatlice tonsillere ve farinks arka duvarına kuvvetli bir şekilde bastırılır, bu sırada dudak, yanak mukozası, uvula, dil ve dişetlerine dokunulmamasına dikkat edilmelidir.Hızlı antijen testi ile boğaz kültürü eş zamanlı çalışılacaksa mutlaka çift eküvyon kullanılmalıdır. Bu amaçla aşağıda foğrafı görülen çift uçlu eküvyonlar kullanılabilir.

Boğaz sürüntüsü örneği akut epiglottitli hastalarda solunum yollarının tıkanmasına neden olacağı için kontrendikedir. Membran oluşumu ve/veya membranöz tonsillit durumunda difteri hastalığı akılda bulundurulmalıdır.A,C, G grubu beta hemolitik Streptococ aranır. En sıkbakteriyel tonsillit etkeni Streptococcus pyogenes ’tir.

Boğaz kültüründe Streptococcus pyogenes kolonileriBALGAM ÖRNEĞİ:

7

Örnek alımı: Ekspektore balgam alımından önce ağız steril su veya SF ile çalkalanır. Spontan balgam çıkaramayan hastadan %10 NaCl solutularak indüklenmiş balgam örneği alınır. İndüklenmiş balgam alımından önce diş fıçası ve steril su veya tuzlu su ile mukoza, dil, dişetleri, diş macunu kullanmadan fıçalanır. Kabın içine tükürük veya postnazal akıntı gelmemesi için hasta bilgilendirilir. Sulu olduğundan tükürük sanılarak rededilmemesi için indüklenmiş balgam olduğu belirtilmelidir.

Örnek kalitesinin değerlendirilmesi: Öncelikle makroskobik olarak değerlendirme yapılır. Tamamen tükrük vasfındaki örnekler reddedilir.Mikroskobik olarak Gram boyalı preparat ile değerlendirilir. Balgamın Gram boyalı yaymasının mikroskobik incelemesinde yassı epitel ve PNL hücrelerinin değerlendirilmesi için; 10X büyütmede en az 10 alan, bakterilerin değerlendirilmesi için ise 100X büyütmede en az 20-40 immersiyon alanı incelenerek değerlendirilir.• Fazla sayıda yassı epitel hücresi varlığı üst solunum yolu florası ile kontaminasyonu gösterir.• Örnek kalitesini değerlendirmek için Gram boyasının kullanıldığı çeşitli ölçütler vardır.Laboratuvarlarda bu ölçütler arasında en fazla kabul göreni, Bartlet’in 1974 yılında ortaya koyduğu skorlama yöntemidir. Bartlett sorlama yöntemi aşağıda özetlenmektedir.

Bartlett skorlama yöntemiHücre _p_ ve sayısı/10x büyütme SkorPNL <10 0 10-25 +1 >25 +2

Mukus varlığı +1

Epitel hücreleri 10-25 -1 >25 -2Toplam skor >0 olması halinde balgam incelemeye alınır.

Örnek kabul ve red kriterleri:

8

Aynı gün içerisinde gönderilen ikinci örnek Eğer ilk örnek değerlendirme için yeterli ise 48 saaten daha kısa aralıklarla gönderilen örnekler24 saat toplanmış örneklerUzun süre oda ısısnda bekletilmiş balgam örnekleriGram boyama değerlendirme kriterlerine göre kontamine olarak değerlendirilen örneklerMakroskobik olarak tükürük görünümündeki örneklerMakroskobik olarak diş macunu veya diğer maddelerle kontamine olan örnekler

Örnek taşıma ve saklama koşulları: Taşıma sırasında örneğin kaptan sızıntıya yol açarak kontaminasyonu engellenmelidir.Alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede laboratuara ulaştırılmalıdır.Steril kap, < 2 saat oda ısısında laboratuvara ulaştırılmalıdır. 2 saati aşacak durumlarda + 2-8°C'de 24 saate kadar saklanabilir.

KültürKültür için balgam örneklerinin en pürülan kısmı seçilir.Besiyeri• Rutin kültüdeo Koyun kanlı besiyerio Çikolata besiyerio Mac Conkey ya da Eozin metilen mavisi (EMB) besiyeri• Haemophilus influenzae izolasyonunu arttırmak ve normal flora üyelerini baskılamak için basitrasin içeren çikolata besiyeri tercih edilebilir.Ekim teknikleri• Balgam örnekleri kalitatif olarak tek koloni ekim tekniği (azaltma yöntemi) ile ekilmelidir.• Tek koloni ekimi, koloni morfolojilerinin incelenmesi ve tanımlama, antibiyogram çalışmalarınındoğru yapılabilmesi için önemlidir.İnkübasyon• Plaklar 18-24 saat 35 C’da %5-10 CO ‘li ortamda inkübe edilir.

• Üreme olmadıysa veya zayıf üreme varsa inkübasyon 48 saate uzatılır.

Alt solunum yolunun balgam dışındaki diğer örneklerinde kantitatif ekim yapılır.

TRAKEAL ASPİRAT ÖRNEĞİ: Örnek alımı: Trakeostomili ve entübe hastalardan alınır. Tanıda duyarlılığı yüksek, özgüllüğü düşüktür.Aspirasyonla alınan örneği steril burgulu kapaklı balgam kabına (Luken kabı) konur. Yeni doğanlar, süt çocukları ve küçük çocuklar için aspirat örneği üst solunum yolundan “auger” kullanılarak toplanır.

9

Örnek kabul ve red kriterleri: Aynı gün içerisinde gönderilen ikinci örnek Eğer ilk örnek değerlendirme için yeterli ise 48 saaten daha kısa aralıklarla gönderilen örnekler24 saat toplanmış örneklerUzun süre oda ısısnda bekletilmiş balgam örnekleriGram boyama değerlendirme kriterlerine göre kontamine olarak değerlendirilen örneklerMakroskobik olarak tükürük görünümündeki örneklerBurun deliklerinden alınan aspirasyon ve sürüntü örnekleri

Örnek taşıma ve saklama koşulları: Taşıma sırasında örneğin kaptan sızıntıya yol açarak kontaminasyonu engellenmelidir.Alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede laboratuara ulaştırılmalıdır.Steril kap, < 2 saat oda ısısında laboratuvara ulaştırılmalıdır. 2 saati aşacak durumlarda + 2-8°C'de 24 saate kadar saklanabilir.

BRONKOALVEOLAR LAVAJ ÖRNEĞİ:Kateter yardımı ile steril serum fizyolojik verilip sonrasında tekrar alınarak alt solunum yollarının örneklemesi yapılır. Bu yöntemle 1mL akciğer sekresyonu ile yaklaşık >1 milyon alveolun örneklemesi yapılabilir.

Örnek taşıma ve saklama koşulları: Taşıma sırasında örneğin kaptan sızıntıya yol açarak kontaminasyonu engellenmelidir.Alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede laboratuara ulaştırılmalıdır.Steril kap, < 2 saat oda ısısında laboratuvara ulaştırılmalıdır. 2 saati aşacak durumlarda + 2-8°C'de 24 saate kadar saklanabilir.

BRONŞ LAVAJ ÖRNEĞİ: Akciğer segmentinin feksibl bronkoskop yardımı ile steril serum fizyolojik ile yıkanması ile örnek alınır. Örnek taşıma ve saklama koşulları: Taşıma sırasında örneğin kaptan sızıntıya yol açarak kontaminasyonu engellenmelidir.Alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede laboratuara ulaştırılmalıdır.Steril kap, < 2 saat oda ısısında laboratuvara ulaştırılmalıdır. 2 saati aşacak durumlarda + 2-8°C'de 24 saate kadar saklanabilir. Alt solunum yolu infeksiyon etkeni olabilecek bakterilere örnekler:

10

Streptococcus pneumoniae tanısı: Optokin testi:

11

Safrada erime testi:

Strain 2 safrada erimiş : Streptococcus pneumoniae

Heamophilus influenzae tanısı:

Kanlı ve EMB agarda üreyemez. Çukulatamsı agarda üreyebilir.

12

X,V faktör ihtiyacı:

13

Moraxella catarhalis tanısı:

Oksidaz testi:

Kayan koloni oluşturur.

14

15

MANTARLARMAYA MANTARLARI

1. Candida albicans

Sabouraud dekstroz agar(SDA) besiyerindemakroskopik görünüm

Gram boyalı preparatta mikroskobik görünümA.Örnekten. Epitel hücreleri üzerinde yalancı hifler ve sporlar

B) Kültür besiyerinden- Sporlar

Jerm tüp testi (pozitif)---serum içinde 37 derecede 2-4 saatte

Mısır unu-Tween 80 agarda mikroskobik görünüm- 48 saat sonra

http://www.hayatisaglik.com/laboratuvar/cimlenme-borusu-testi.html

16

Blastosporlar, yalancı hifler ve klamidospor

2. Cryptococcus neoformans

Staib agarda makroskopik görünümü (kahverengi koloniler)

Çini mürekkebi ile hazırlanmış preparatta mikroskobik görünüm

17

3. Pneumocystisjirovecii (Giemsa ile boyalı preparatta kist yapılarının incelenmesi)

18

KÜF MANTARLARIA) Saprofit Türler1) Aspergillus türleri

Direkt örneklerden hazırlanan Gram boyalı preparatların incelenmesi (Solunum yolu örneğinde küf mantarına ait dar açı ile dallanan bölmeli hifler)

SDA besiyerindemakroskopik görünümAspergillusfumigatus

Aspergillusflavus

19

Aspergillus niger

Kültürde üremiş Aspergillus sp’den laktofenol pamuk mavisi ile hazırlanmış selofan bant preparatında mikroskopik görünüm: Fiyalokonidyumlar, bölmeli hifler

20

2) Rhizopus sp.SDA besiyerindemakroskopik görünüm

Laktofenol pamuk mavisi ile hazırlanmış selofan bant preparatında mikroskopik görünüm

B) Esmer mantarlar. Örnek Alternaria sp.SDAbesiyerindemakroskopik görünüm

Boya kullanılmadan hazırlanmış selofan bant preparatında mikroskopik görünüm

21