Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos

Kauno technologijos universitetas Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

Cheminės technologijos fakultetas Farmacijos fakultetas

Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos

vystymas

Baigiamasis magistro projektas

Skirmantas Bieris

Projekto autorius

Prof. dr. Valdas Jakštas

Vadovas

Kaunas, 2019




vystymas

Baigiamasis magistro projektas

Medicininė chemija (6281CX001)

Skirmantas Bieris

Projekto autorius

Prof. dr. Valdas Jakštas

Vadovas

Dr. Mindaugas Liaudanskas

Recenzentas

Kaunas, 2019




vystymas

Akademinio sąžiningumo deklaracija

Patvirtinu, kad mano, Skirmanto Bierio, baigiamasis projektas tema „Benzalkonio chlorido nustatymo

ašarų skystyje metodikos vystymas“ yra parašytas visiškai savarankiškai ir visi pateikti duomenys ar

tyrimų rezultatai yra teisingi ir gauti sąžiningai. Šiame darbe nei viena dalis nėra plagijuota nuo jokių

spausdintinių ar internetinių šaltinių, visos kitų šaltinių tiesioginės ir netiesioginės citatos nurodytos

literatūros nuorodose. Įstatymų nenumatytų piniginių sumų už šį darbą niekam nesu mokėjęs.

Aš suprantu, kad išaiškėjus nesąžiningumo faktui, man bus taikomos nuobaudos, remiantis Kauno

technologijos universitete galiojančia tvarka.

Bieris, Skirmantas. Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos vystymas. Baigiamasis

magistro projektas / vadovas prof. dr. Valdas Jakštas; Kauno technologijos universitetas, Cheminės

technologijos fakultetas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas.

Studijų kryptis bei sritis: chemija, fiziniai mokslai.

Reikšminiai žodžiai: benzalkonio chloridas, ašarų skystis, Širmerio testo juostelės, sausų akių

sindromas, glaukoma, metodo validavimas, ultraefektyvioji skysčių chromatografija, tandeminė masių

spektrometrija.

Kaunas, 2019. 42 p.

Santrauka

Benzalkonio chloridas kaip biocidinis konservantas įeina į daugelio daugiadozių akių lašų sudėtį,

dėl savo detergentinės prigimties dažnai sąlygodamas neigiamus padarinius akies audiniams, įskaitant

sausų akių sindromą bei glaukomos pablogėjimą. Sunkiai prognozuojama farmakokinetika ir

toksikologija, kartu su kitais veiksniais, lemia visuotinai bei rutiniškai taikomo šio junginio nustatymo

akyje metodo nebuvimą. Šiuo darbu siekta sukurti validavimo kriterijus tenkinantį benzalkonio

chlorido nustatymo gyvų subjektų ašarų skystyje metodą, apimantį ėminio surinkimą Širmerio testo

juostelėmis, analitės perkėlimą į mėginius naudojant ekstrakciją organiniais tirpikliais ir mėginių

analizę ultraefektyviąja skysčių chromatografija – tandemine masių spektrometrija. Gautieji metodikos

tobulinimo rezultatai liudijo patikimą analitės ekstrakcijos efektyvumą, trumpą analizės trukmę,

tinkamą glaudumą bei tiesiškumą kliniškai reikšmingų koncentracijų intervale. Tarp metodo trūkumų

pažymėtinas aptiktas pašalinis analitę imituojantis signalas, dėl kurio sunkiai apibrėžiamos aptikimo

bei nustatymo ribos, klinikinį pritaikymą taip pat komplikuoja nepatvirtintas ryšys tarp žinomos

benzalkonio chlorido koncentracijos paciento vartojamuose akių lašuose ir nustatomos paciento ašarų

skystyje. Apibendrinant, sukurtajam metodui reikalingas nuodugnesnis validavimas bei tolimesni

klinikinio pritaikomumo tyrimai.

Bieris, Skirmantas. Development of Methodology to Determine Benzalkonium Chloride in Tear Fluid.

Master‘s Final Degree Project / Supervisor prof. dr. Valdas Jakštas; Faculty of Chemical Technology,

Kaunas University of Technology; Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences.

Study Field and Area: Chemistry, Physical Sciences.

Keywords: Benzalkonium Chloride, Tear Fluid, Schirmer‘s Test Strips, Dry Eye Syndrome,

Glaucoma, Method Validation, Ultra-High Performance Liquid Chromatography, Tandem Mass

Spectrometry.

Kaunas, 2019. 42 p.

Summary

Benzalkonium chloride is used as a biocide preservative in majority of multidose eye drop

formulations. Due to its detergent nature this compound can have deleterious consequences to eye

tissues, including conditions such as dry eye syndrome or worsening of glaucoma. Complex and

unpredictable pharmacokinetics and toxicology among other factors lead to absence of universally and

routinely applied method to determine this substance in the eye. In this study we seeked to create the

validation criteria meeting method to determine benzalkonium chloride in live subjects‘ tear fluid,

comprising specimen collection by Schirmer‘s test strips, transfer of analyte to sample using extraction

with organic solvents, and ultra-high performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry

sample analysis. Methodology development results indicated reliable analyte extraction efficiency,

rapidness of analysis, good precision, and suitable linearity for clinically relevant concentration range.

However, some drawbacks were highlighted as well, such as analyte overlapping signal generation

which in turn compromises the identification of analyte detection and quantification limits. In addition,

clinical benefits of the method are elusive as no significant relationship between known concentrations

of benzalkonium chloride in eye drops taken by patients and those determined in respective tear fluid

samples was found. In conclusion, the developed method needs more thorough validation and further

research for clinical applicability.

Turinys

Lentelių sąrašas................................................................................................................6

Paveikslų sąrašas.............................................................................................................7

Santrumpų sąrašas..........................................................................................................8

Įvadas................................................................................................................................9

1. Literatūros apžvalga..................................................................................................10

1.1. Benzalkonio chlorido baktericidinio veikimo kinetika..................................................................10

1.2. Ašarų plėvelės ypatybės bei Širmerio juostelių naudojimas..........................................................12

1.3. Benzalkonijaus chlorido vartojimo oftalmologijoje problematika.................................................12

1.3.1. Sąryšis su glaukoma..................................................................................................................14

1.3.2. Prevencinės priemonės..............................................................................................................15

1.4. Metodo parametrų validavimas......................................................................................................16

1.4.1. Validaciniai parametrai.............................................................................................................16

1.4.2. Validuoti benzalkonio chlorido nustatymo metodai.................................................................17

2. Medžiagos ir tyrimų metodai....................................................................................20

2.1. Tyrimo organizavimas....................................................................................................................20

2.2. Tyrimo medžiagos..........................................................................................................................20

2.3. Tyrimo metodai..............................................................................................................................20

2.3.1. Ėminių surinkimas.....................................................................................................................20

2.3.2. Benzalkonio chlorido ekstrakcija iš ėminių į tiriamuosius mėginius........................................21

2.3.3. Mėginių chromatografinė-masių spektrometrinė analizė..........................................................22

2.4. Duomenų analizė............................................................................................................................25

3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas............................................................................26

3.1. Ėminio surinkimo problematika.....................................................................................................26

3.2. Optimalios terpės mėginių analizei parinkimas.............................................................................26

3.3. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas.....................................................................................28

3.4. Poekstrakcinės kalibracinės kreivės parametrai.............................................................................29

3.5. Aptikimo bei nustatymo riba ir benzalkonio chloridas Širmerio juostelėse..................................30

3.6. Benzalkonio chlorido kiekis pacientų ašarų skysčio ėminiuose....................................................32

3.6.1. Priklausomybė nuo surenkamo ėminio tūrio.............................................................................32

3.6.2. Konservuotų akių lašų vartojimo įtaka......................................................................................33

3.6.3. Ryšys su ašarų plėvelės stabilumu............................................................................................34

3.6.4. Skirtumai tarp 12C ir 14C homologų kiekių tapačiuose ėminiuose..........................................34

Išvados............................................................................................................................36

Literatūros sąrašas........................................................................................................37

6

Lentelių sąrašas

1 lentelė. 12C BAC homologo ekstrakcijos rezultatų glaudumo palyginimas tarp skirtingų tirpiklių

(n=7-26)

2 lentelė. Tiriamųjų pacientų ašarų skysčio ėminių duomenys

7

Paveikslų sąrašas

1 pav. Benzalkonio chlorido molekulės struktūra

2 pav. Širmerio testo juostelės

3 pav. Elmasonic P ultragarso vonelė

4 pav. Acquity UPLC H-Class skysčių chromatografas (kairėje) ir Xevo TQD masių spektrometras

(dešinėje)

5 pav. Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm chromatografinė kolonėlė

6 pav. UESC-MS/MS MRM režimu gaunamos atskirų BAC homologų chromatogramos

7 pav. UESC-MS/MS 12C BAC homologo koncentracijos - detektoriaus signalo intensyvumo tiesinės

priklausomybės kalibracinės kreivės, tirpikliais naudojant metanolį, acetonitrilą ir acetoną

8 pav. 12C BAC homologo ekstrakcijos efektyvumo palyginimas tarp skirtingų tirpiklių

9 pav. 12C BAC homologo mėginių, gautų po pritaikytos ekstrakcijos metodikos, UESC-MS/MS

kalibracinė kreivė

10 pav. 12C BAC homologo mėginių, kurių koncentracijų vertės artimos nustatymo ribai, UESC-

MS/MS kalibracinė kreivė

11 pav. 14C BAC homologo kiekio tiesinė priklausomybė nuo ašarų skysčio nueito kelio Širmerio

juostelėje

12 pav. Ryšys tarp vartojamuose akių lašuose esančios BAC koncentracijos ir ašarų skystyje

aptinkamo 14C BAC homologo kiekio

13 pav. BAC 12C ir 14C homologų kiekių palyginimas tarp skirtingų tiriamųjų objektų ašarų skysčio

ėminių

8

Santrumpų sąrašas

AcN - acetonitrilas

BAC – benzalkonio chloridas

ESI – elektropurkštuvinė jonizacija

MS/MS – tandeminė masių spektrometrija

EtAc – etilacetatas

MeOH - metanolis

MRM – daugialypių reakcijų stebėjimas

ONP - orto-nitrofenolis

ONPG - orto-nitrofenil-β-galaktozidas

SSN – santykinis standartinis nuokrypis

UESC – ultraefektyvioji skysčių chromatografija

9

Įvadas

Konservantai yra svarbi daugiadozių oftalmologinių akių lašų preparatų pagalbinių medžiagų grupė

[1;2]. Nuo XX a. 5-ojo dešimtmečio dažniausiai šiam tikslui naudojamas benzalkonio chloridas,

įeinantis į 70 % šiandien rinkoje esančių daugkartinio vartojimo akių lašų sudėtį [3]. Paskutinius keletą

dešimtmečių daugėja duomenų apie tokių konservuotų preparatų klinikinę žalą akims [4], o dažnas

reguliaraus jų vartojimo rezultatas – akies paviršiaus sutrikimas, apimantis akies paviršiaus sausumą

bei glaukomą – siejamas su neigiamu benzalkonio chlorido poveikiu [5]. Klinikinės oftalmologijos

požiūriu šis detergentinės cheminės prigimties biocidas yra vertingas kaip užkertantis kelią akies

infekcijoms plisti [6]. Vis dėlto, pakartotinai vartojamas ir besikaupdamas ašarų skystyje, rageną

dengiančioje ašarų plėvelėje bei giliuosiuose akies audiniuose ilgalaikėje perspektyvoje lemia

neigiamus histologinius, fiziologinius ir molekulinius šių akies struktūrų pokyčius [6].

Bioanalitinio metodo tobulinimas yra sudėtingas ir daugiapakopis procesas, iš analitiko neretai

reikalaujantis griežto atidumo detalėms bei inovatyvių sprendimų. Dažniausiai pagrindiniu iššūkiu

šioje srityje tampa optimalių validacinių parametrų, atitinkančių normatyvinius teisinius kriterijus,

parinkimas [7]. Nepaisant neginčijamų benzalkonio chlorido neigiamo poveikio akims įrodymų,

tikslus bei kliniškai reikšmingas šio junginio kiekio gyvų subjektų akyse įvertinimas yra sudėtinga

užduotis dėl jo paviršinio aktyvumo savybių, sunkiai prognozuojamo pasiskirstymo tarp minėtų akies

anatominių skyrių bei prasiskiedimo ašarose po preparato įlašinimo [6;8]. Todėl iki šiol nėra sukurta

vieningo rutininiams tyrimams pritaikyto šio akių lašų konservanto nustatymo ašarų skystyje metodo.

Šio projekto tikslas buvo sukurti akių ligų pacientų gydymo stebėsenai tinkamą ultraefektyviosios

skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos metodiką benzalkonio chloridui

nustatyti ašarų skystyje.

Darbo uždaviniai:

1) parinkti akių ligų pacientų gydymo stebėsenai tinkamas tyrimo sąlygas patikimam benzalkonio

chlorido perkėlimui iš pacientų ašarų skysčio į tiriamuosius mėginius;

2) patikrinti kuriamos ultraefektyviosios skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos

metodikos pagrindinių validacinių parametrų atitikimą normatyviniams kriterijams;

3) nustatyti benzalkonio chlorido kiekį ir jo varijavimą akių ligų pacientų ašarų skysčiuose ir susieti jį

su vartotuose akių lašuose esančia šio junginio koncentracija.

10

1. Literatūros apžvalga

1.1. Benzalkonio chlorido baktericidinio veikimo kinetika

Ketvirtinio amonio junginiai yra katijoniniai surfaktantai, dažniausiai naudojami kaip vietiniai

baktericidiniai preparatai [9]. Jų veikimo principas pagrįstas bakterijų membranų pažeidimu ir

suardymu, kas ilgainiui sąlygoja Gram teigiamų bei Gram neigiamų ląstelių lizę [10]. Nors ketvirtinio

amonio dariniai paplitę jau nuo praėjusio amžiaus 4-ojo dešimtmečio, paskutiniu metu jų plačiu

naudojimu buvo susirūpinta dėl galimo jų indėlio į patogenų atsparumo antibiotikams didėjimą [11].

Žinomiausias šios klasės atstovas – benzalkonio chloridas (BAC), aromatinį žiedą α-padėtyje

ketvirtinio azoto atomo atžvilgiu turintis junginys, kurio skirtingų atmainų struktūra skiriasi tik

alkilinio pakaito metilo grupių skaičiumi (n=8,10,12,14,16,18) (1 pav.). BAC antibakterinį aktyvumą,

manoma, lemia jo molekulės cheminė struktūra: teigiamo krūvio ketvirtinis azotas asocijuojasi su

membranos fosfolipidų „galvutės“ neigiama grupe, o nepolinė dalis įsiterpia tarp hidrofobinių

„uodegėlių“, sudarydama laikinas micelines struktūras bei sukeldama membranos integraliųjų baltymų

disociaciją ir denatūraciją – visa tai hipotetiškai sąlygoja membranų permeabilizavimą [12;13].

1 pav. Benzalkonio chlorido molekulės struktūra

Monrealio universiteto tyrėjų grupė detaliai kiekybiškai nustatė minimalios slopinančios arba

mažesnės koncentracijos BAC ilgalaikį poveikį gyvų Gram neigiamų bakterijų membranų laidumui,

siekdami patikrinti prielaidą apie BAC sukeliamą bakterijų rezistentiškumo antibiotikams atsiradimą ir

atskleisti jo mechanizmus [14]. Escherichia coli membranų permeabilizavimo kinetikai apibrėžti buvo

pasitelktas spektrofotometrinis metodas. Jo principas remiasi konstitutyviai išreikšto citoplazmos

11

fermento β-galaktozidazės (LacZ) bei periplazminės ertmės fermento β-laktamazės aktyvumo

nustatymu optiškai matuojant eksperimentiškai pridėto jų substrato orto-nitrofenil-β-galaktozido

(ONPG) ir produkto orto-nitrofenolio (ONP) koncentracijas bei jų santykio kitimą mėginyje. Visa tai

buvo vykdoma esant trims skirtingoms sąlygoms: kontrolinėms (tik ląstelės ir ONPG), pridėjus BAC ir

lizavus ląsteles. Šios atitinkamai reiškia 0 %, X % (naudotos skirtingos BAC koncentracijos) bei 100

% memebranų pralaidumą. Išmatuotas LacZ katalizuojamos reakcijos (ONPG hidrolizės į ONP) greitis

visose trijose būsenose bei apskaičiuojamas jų santykis tiesiogiai atspindi membranų

permeabilizavimo lygį [14].

Remiantis šios fermentinės reakcijos kinetikos rezultatais, pirmiausiai buvo nustatyta, jog E.coli

membranų laidumas žymiai išauga dar esant mažesnei negu minimali slopinanti BAC koncentracijai

[14]. Tai gali turėti įtakos atsparesnių antibiotikams bakterijų klonų atrankai. Taip pat svarbus

atradimas buvo tai, kad membranų laidumo priklausomybės nuo BAC koncentracijos grafike išryškėja

dvi lenktos kreivės su dviem aiškiai išreikštomis pusinėmis efektyviomis koncentracijomis (EC50). Tai

rodo dvifazę dozės-atsako ryšio funkciją, kas liudija esant dviejų atskirų žingsnių procesą. Pirmoji

EC50 reikšmė lygi apie 30 µg/ml, yra mažesnė negu žinoma minimali slopinanti koncentracija (45

µg/ml) ir atitinka minimalią BAC kocentraciją, reikalingą sukelti reikšmingą ONPG hidrolizę –

reakcijos greičių santykis didėja nuo 20 µg/ml BAC koncentracijos iki šiai pasiekiant apytikslę 40

µg/ml ribą, nuo kurios prasideda plato fazė [14]. Koncentracijai didėjant nuo 50 µg/ml, prasideda

antroji membranų permeabilizavimo fazė su antrosiomis EC50 reikšmėmis, kurios, skirtingai nuo

pirmosios fazės, reikšmingai tiesiogiai proporcingai varijuoja priklausomai nuo bakterijų populiacijos

tankio, tačiau visais atvejais reakcijos greičių santykis pasiekia arba beveik pasiekia 100 % [14]. Tai

atspindi visišką išorinės bei vidinės membranų vientisumo praradimą ir neribojamą substrato patekimą

ant citoplazmos LacZ aktyviojo centro.

Siekiant patikrinti hipotezę, jog pirmoji membranų permeabilizavimo fazė ir pirmoji EC50 reikšmė

yra susijusi su bakterijų išorinės membranos laidumo didėjimu, buvo taikytas hidrofobinis

fluorescuojantis zondas 1-N-fenilnaftilaminas (NPN) [14]. Šis junginys fluorescuoja tik hidrofobinėje

aplinkoje, pvz., įsiterpęs į fosfolipidų dvisluoksnio vidų, todėl šiame tyrime yra tinkamas išorinės

membranos integralumo indikatorius. Matuotas fluorescencijos intensyvumas esant skirtingoms BAC

koncentracijoms bei skirtingam bakterijų tankiui mėginyje, pridėjus NPN. Gauti rezultatai rodo

tiesioginę fluorescencijos intensyvumo priklausomybę nuo BAC koncentracijos, o fluorescencijos

didėjimo pradžia sutampa su pirmąja EC50 (~30 µg/ml). Taip pat svarbu paminėti tai, jog neaptiktas

bakterijų tankio ir fluorescencijos ryšys, t. y. ši priklausė tik nuo BAC koncentracijos, kaip ir

pirmosios permeabilizavimo fazės metu [14]. Išanalizavus šiuos duomenis peršasi išvada, kad pirmoji

fazė bei pirmoji EC50 atitinka išorinės membranos struktūrinį pažeidimą ir padidėjusį jos laidumą.

12

Norint įvertinti įvairių subletalių BAC koncentracijų poveikį plazminių membranų laidumui, taip pat

buvo nepertraukiamu principu matuojama LacZ vykdomos reakcijos produkto ONP koncentracija

esant skirtingoms BAC koncentracijoms ir vienodai ląstelių populiacijai. Gautos fermentinės katalizės

kreivės rodo, kad net ir labai mažos BAC koncentracijos gali visiškai panaikinti membranų vientisumą

– skiriasi tik laikas, per kurį tai įvyksta [14].

Apibendrinant, galima padaryti kelias kliniškai reikšmingas išvadas. Pirma, gyvų ląstelių

membraninis laidumas pasireiškia jas paveikus ir mažesnėmis už minimalią slopinančiąją BAC

koncentracijomis. Antra, E.Coli membranų permeabilizavimo procesui būdinga dviejų fazių kinetika

su dviejomis aiškiai išreikštomis EC50 reikšmėmis, atitinkančiomis išorinės ir vidinės membranų

vientisumo pažeidimus. Trečia, mažesnės už minimalią slopinančią BAC koncentracijos, veikdamos

ląstelių membranas, ilgainiui sąlygoja visišką jų permeabilizavimą.

1.2. Ašarų plėvelės ypatybės bei Širmerio juostelių naudojimas

Ašarų plėvelė yra labai svarbus akies dengiamasis darinys, saugantis rageną ir junginę nuo

išsausėjimo bei pažeidimo. Ją apima trys sluoksniai: apatinis mukozinis, sudarytas daugiausiai iš

epitelinių ląstelių išskiriamų glikoproteinų; vidurinis vandens, palaikomas ašarų liaukų išskiriamo

vandeningo skysčio; išorinis lipofilinis, sudarytas iš vidinėje voko dalyje išsidėsčiusių Meibomo liaukų

gaminamo riebalinio sekreto [6]. Manoma, kad būtent išorinio sluoksnio vientisumo pažeidimas

sukelia sausų akių sindromą [15].

Širmerio testo juostelių panaudojimas jau yra išbandytas ašarų skysčio ėminių surinkimui iš akių, o

šiuo metodu iš juostelių gauti ekstraktai buvo naudojami tirti akies proteomo pokyčius esant sausų akių

sindromui. Minėtame darbe buvo sėkmingai vykdoma dvikryptė elektroforezė ir nustatomi atskiri

baltymai skysčių chromatografijos – elektropurkštuvinės jonizacijos tandeminės masių spektrometrijos

analize [16]. Analogiška ašarų skysčio ėminio gavimo technika buvo taikyta kitame darbe, kurio metu

iš Širmerio juostelių ekstrakcijos polisorbato 20 PBS tirpalu būdu buvo gaunami akies skysčio

mėginiai imunofermentiniams baltymo mucino 5AC tyrimams esant sausų akių sindromui [17].

1.3. Benzalkonio chlorido vartojimo oftalmologijoje problematika

Akių lašų konservantai yra būtina priemonė neleisti plisti bakterinei, grybelinei ar amebinei

infekcijai akyje. Nepaisant to, egzistuoja ir neigiamas šalutinis tokių konservantų poveikis akies

paviršiaus audiniams. Viena dažniausiai naudojamų šios klasės medžiagų – detergentas BAC,

pasižymėdamas plataus spektro antimikrobinėmis savybėmis, ne tik greitai bei efektyviai naikina

bakterijas ar kitas svetimas organizmui ląsteles, tačiau yra linkęs kauptis ragenos epitelyje

13

citotoksiškai veikdamas ir jį sudarančias eukariotines ląsteles. Dėl tų pačių savybių jis kaupiasi

daugelyje akies audinių, pažeidžia lipofilinio ašarų plėvelės sluoksnio vientisumą sukeldamas sausų

akių sindromą, o ilgalaikis akių lašų su BAC vartojimas ilgainiui sąlygoja lėtinį uždegimo procesą

[18]. Vaistuose nuo glaukomos BAC koncentracija svyruoja tarp 0,004 ir 0,05 %, proapoptotinis

poveikis paviršiniams akies audiniams pastebėtas jau nuo 0,01 %, o nekrozę galimai sukelia didesnė

kaip 0,05 % BAC koncentracija [18].

Triušių akis veikiant hiperosmosiniu BAC tirpalu vieną mėnesį, jų trabekuliniame tinkle, rainelėje

bei lęšiuko kapsulėje po ekstrakcijos acetonitrilu skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos

metodu buvo aptikti reikšmingi BAC kiekiai. Tai įrodo BAC kaip surfaktanto didelės skvarbos ir

kumuliacines savybes [19]. Tyrimais patvirtinta, kad kasdien vietiškai vartojamas 0,1 % koncentracijos

BAC tirpalas lemia stabilų sausų akių sindromą, kuris užsilaiko dar kelias savaites nutraukus akių lašų

vartojimą, o genų pašalinimo studijos su triušiais įrodė apsauginę mucino svarbą – šiam nesant,

minėtas sindromas išsilaiko kelis mėnesius [20].

Rath su bendradarbiais visai neseniai siekė patikrinti, ar egzistuoja koks nors sinergistinis ar

antagonistinis vietinio vartojimo akių lašų aktyviųjų medžiagų, vartojamų kartu su BAC, neigiamas

poveikis labiausiai pažeidžiamų tokiais atvejais akies dengiamųjų audinių ląstelėms [21]. Šiam tikslui

jie panaudojo in vitro žmogaus Meibomo liaukos epitelio ląstelių kultūrą, veikdami šią BAC

konservuotais prostaglandino analogais bimatoprostu, travoprostu bei latanoprostu, arba tik šiais

priešglaukominiais preparatais, arba tik BAC, ir matuodami ląstelių gyvybingumą, morfologiją bei

proliferaciją. Remiantis tyrimo rezultatais, ląstelių proliferacija mažėja jau nuo 0,1 µg/ml ir didesnės

BAC koncentracijos, o šiai pasiekus 50 µg/ml ribą, prasideda staigūs ląstelių morfologijos pokyčiai bei

gyvybingumo kritimas, tuo tarpu kartu su BAC esančios minėtos aktyviosios vaistų medžiagos

sustiprina šį kenksmingą poveikį, pačios neturėdamos jokio reikšmingo efekto. Taigi, galima teigti, jog

BAC pasižymi citotoksiniu poveikiu Meibomo liaukos epiteliui, o prostaglandino analogai

sinergistiniu principu prisideda prie BAC toksiškumo [21].

Tyrimų su laboratorinėmis pelėmis in vivo duomenys rodo, jog pakartotinai į akis lašinamas BAC

tirpalas tiesiogiai sutrikdo ragenos epitelio vientisumą, sukelia ragenos edemą ir drumstumą, kaip

apsauginę reakciją iššaukia naujų kapiliarų tinklų susidarymą bei reikšmingai padidėjusį citokinų

skaičių ragenoje [22]. Šie padariniai tiesiogiai priklauso nuo BAC koncentracijos.

Nors BAC vartojimas oftalmologijos praktikoje siejamas su daugeliu kliniškai reikšmingų

pasekmių, įskaitant sausų akių sindromą, trabekulinio tinklo degeneraciją ir glaukomą, tikslus

biocheminis šio akių lašų konservanto poveikis nėra tiksliai žinomas. Siekdami tai išsiaiškinti,

prancūzų mokslininkai pasitelkė mitochondrijų kvėpavimo bei ATP sintezės greičio ir ląstelių

gyvybingumo matavimo priemones žmogaus ragenos epitelio pirminių ląstelių bei žmogaus

14

trabekulinio tinklo ląstelių kultūroms prieš ir po tiesioginio poveikio skirtingų koncentracijų BAC

tirpalais [23]. Gauti rezultatai liudija akivaizdų BAC toksiškumą akies audinių ląstelių mitochondrijų

funkcijoms: priklausomai nuo koncentracijos sumažėja O2 suvartojimo ir ATP sintezės greitis

tiesiogiai slopinant I elektronų pernašos grandinės kompleksą NADH-ubikvinono oksidoreduktazę,

taip pat reikšmingai padaugėja apoptozės atvejų, o visa tai vyksta ląstelių kultūras veikiant nuo

keliskart iki keliasdešimtkart mažesnėmis BAC koncentracijomis negu randamomis farmakologiniuose

akių lašuose [23]. Šis tyrimas pakloja naujus pamatus BAC klinikinio kenksmingumo akims tikslių

molekulinių mechanizmų atskleidimui.

1.3.1. Sąryšis su glaukoma

Glaukomos terminas apima grupę progresuojančių degeneracinių optinių neuropatijų, kurios kartu

sudėjus užima antrą vietą tarp aklumą sukeliančių veiksnių pasaulyje, o šios ligos diagnozuotumas net

ir išsivysčiusiose šalyse išlieka sąlyginai mažas (~50 %). Pagrindinis glaukomos gydymo strateginis

uždavinys – akies priekinės kameros skysčio spaudimo (akispūdžio) mažinimas vartojant akių lašus su

prostaglandino analogais, gerinančiais skysčio ištekėjimą iš kameros, arba beta-adrenerginių

receptorių antagonistais, slopinančiais paties skysčio gamybą krumplyno epitelyje [24].

BAC poveikis akiai siejamas su uždegiminių ląstelių skaičiaus junginėje didėjimu (konjunktyvitu),

tačiau taip pat šis junginys pasižymi savybe ardyti ragenos epitelio tarpląstelines jungtis bei taip

pagerinti vaistų prasiskverbimą į priekinę akies kamerą [24]. Yra pakankamai klinikinių duomenų,

rodančių ekvivalentišką vaistų nuo glaukomos su BAC ir be BAC terapinį akispūdžio mažinimo

efektyvumą [25;26;27]. Eksperimentiniai duomenys pabrėžia ilgalaikį kumuliacinį BAC poveikio

pobūdį ir šio sorbciją ant akies audinių paviršinio ląstelių sluoksnio, taip pat pastebima ir BAC

neigiamo poveikio priklausomybė nuo farmakologinio preparato, su kuriuo kartu jis vartojamas [28].

BAC molekulių sankaupos aptinkamos ragenoje, lęšyje, junginėje, rainelėje, krumplyno raumenų

epitelyje bei trabekuliniame tinkle [29;30;31]. Lygiai kaip glaukomos atveju žalojamas trabekulinis

tinklas kylant jo uždegimui, žmogaus junginės bei ragenos epitelio ląsteles veikiant BAC analogiškai

mažėja ląstelių gyvybingumas, pasireiškia oksidacinis stresas ir apoptozė [32;33]. Tas pats pasakytina

ir apie BAC poveikį trabekulinio tinklo ląstelėms, tuo tarpu poveikis krumplyno raumens epiteliui kur

kas mažiau išreikštas, tad galima daryti prielaidą, jog BAC blogina glaukomos simptomus ne

didindamas priekinės kameros skysčio gamybą, o sunkindamas jo nutekėjimą per trabekulinį tinklą

[24]. Nustačius, kad beta-blokatoriai vieni nesukelia apoptotinio atsako trabekulinio tinklo ląstelių

kultūrose, apoptozės žymenys aptikti tose pačiose kultūrose jas paveikus priešglaukominiais vaistais

[32].

15

BAC polinkis kauptis giliuosiuose akies audiniuose, ypač trabekuliniame tinkle, ir jo oksidacinis,

uždegimą bei apoptozę skatinantys poveikiai trabekulinio tinklo ląstelėms in vivo, o taip pat in vitro

ląstelių kultūroms, suponuoja paradoksalią prielaidą, kad BAC konservuotos akių lašų nuo glaukomos

formuluotės gali pabloginti skysčio nutekėjimą iš vidinės kameros ir pasunkinti atviro kampo

glaukomos simptomus [34].

Nagrinėjant naujos kartos tridimensį pirminių žmogaus trabekulinio tinklo ląstelių kultūros modelį

nustatyta, jog šiose ląstelėse, pridėjus 0,001 % koncentracijos BAC į kultūros terpę, padidėja

uždegimo žymenų interleukino-6 (IL-6) ir interleukino-8 (IL-8) genų raiška, taip pat pastebima

suaktyvėjanti galimai apoptozėje dalyvaujančio fermento matrikso metaloproteinazės (MMP-9)

biosintezė [35]. Tai patvirtina vis dažniau oftalmologijos akdeminiuose ir klinikiniuose sluoksniuose

keliamas hipotezes apie uždegimą skatinantį bei proapoptotinį BAC poveikį šiam akies audiniui,

laikomam kertiniu ilgalaikiame glaukomos gydyme.

1.3.2. Prevencinės priemonės

Šiuo metu jau yra apstu moksliniais tyrimais paremtų bei klinikinių įrodymų, kad ilgalaikis vietinis

chroninės glaukomos ir sausų akių sindromo gydymas BAC konservuotais akių lašais pasižymi

dvejopu poveikiu - greta aktyviosios medžiagos lemiamo terapinio taip pat sukelia mažesnį ar didesnį

BAC sąlygojamą ragenos ir junginės epitelį pažeidžiantį efektą. Dėl šios priežasties, o taip pat nuolat

didėjančių pasaulinių glaukomos epidemiologinių rodiklių, vis svarbesniais strateginiais vektoriais

oftalmologijoje tampa naujų konservantų įdiegimas, vaistų formų be konservantų kūrimas bei

alternatyvių ne lašų formos vaistinių aktyviųjų medžiagų pristatymo sistemų, išvengiant tiesioginio

BAC patekimo ant akies paviršių, vystymas [36].

Kadangi apie 70 % daugkartinio vartojimo akių lašų sudėtyje randamas BAC, dėl jo tyrimais

patvirtinto toksiškumo akims ieškoma sprendimo, kaip palaikyti sterilumą vaistų buteliukuose, tuo

pačiu metu užkertant kelią BAC patekimui į pacientų akių audinius. Floridos universiteto mokslininkai

šiam tikslui sukūrė specialų buteliukuose montuojamą iš 2-hidroksietil metakrilato polimero pagamintą

filtrą, selektyviai nepraleidžiantį beveik 100 % akių lašuose esančio BAC, tuo tarpu tik minimaliai

pakeičiantį aktyviųjų vaistų medžiagų koncentracijas į akį patenkančiame laše [37]. Tai ilgainiui gali

tapti perspektyvia technologija, padėsiančia daugybei vaistus nuo glaukomos ar sausų akių sindromo

vartojančių žmonių.

2015 m. buvo atliktas tyrimas, kurio rezultatai formuoja neginčijamą išvadą, kad manitolis iš dalies

apsaugo akies ragenos epitelį nuo kenksmingo BAC poveikio [38]. Jo metu parodyta, jog žmogaus

ragenos epitelio ląstelių liniją (HCE-T) paveikus 0,005 % BAC tirpalu su 0,5 % manitolio, ląstelių

16

gyvybingumas ilgainiui išlieka didesnis negu tas pačias ląsteles veikiant tik analogišku BAC tirpalu.

Naudojant E.Coli ląstelių kultūrą nustatyta, kad antimikrobinis BAC aktyvumas pridėjus manitolio

nesikeičia. Taip pat verta pažymėti, jog pasitelkus žiurkių ir triušių akis in vivo, nebuvo aptiktas

reikšmingas manitolio poveikis priešglaukominio preparato timololio maleato skvarbai per rageną bei

jo sukeliamam akispūdžio mažėjimui [38]. Visi šie duomenys leidžia kurti prielaidą apie galimą

glaukomos ir kitų ilgalaikio gydymo akių lašais reikalaujančių ligų terapinę strategiją – kartu su

konservantu naudojant manitolį išvengti BAC sąlygojamo akies audinių pažeidimo bei efektyvinti

gydymo procesą.

1.4. Metodo parametrų validavimas

1.4.1. Validaciniai parametrai

Pagrindiniai bioanalitinio kiekybinio metodo validavimo parametrai yra šie: specifiškumas,

tikslumas, glaudumas (atsikartojamumas, tarpinis glaudumas, atkuriamumas), aptikimo riba,

nustatymo riba, tiesiškumas, kiekybinio aptikimo diapazonas ir tvirtumas [39].

Specifiškumas – metodo savybė vienareikšmiškai atskirti tiriamą analitę nuo aplinkinių giminingų

junginių mėginyje. Su specifiškumu yra glaudžiai susijęs vadinamasis matricos efektas (tirpiklio ar

mėginio priemaišų poveikis tyrimo rezultatui, jo kiekybinės vertės iškraipymas).

Tikslumas (tikrumas) – tiriamos analitės rezultato vertės artumas referentinei standarto vertei.

Glaudumas apibūdina to paties mėginio eilės matavimų vienodomis sąlygomis rezultatų verčių

artumą viena kitai, t.y. rezultatų išsibarstymą, standartinį nuokrypį arba variacijos koeficientą.

Glaudumas skirstomas į pasikartojamumą (rezultatų pasikartojimas toje pačioje laboratorijoje per

trumpą laiko intervalą), tarpinis preciziškumas (rezultatų išsibarstymas vienoje laboratorijoje

skirtingomis dienomis, naudojant skirtingą įrangą, dirbant skirtingiems analitikams) bei atkuriamumą

(rezutatų panašumas tarp skirtingų laboratorijų).

Aptikimo riba – mažiausias analitės kiekis mėginyje, kurį galima kokybiškai aptikti naudojant tam

tikrą metodą ir tam tikrus parametrus.

Nustatymo riba – mažiausias analitės kiekis mėginyje, kurį galima pakankamu tikslumu ir glaudumu

įvertinti kiekybiškai.

Tiesiškumas – metodo geba išgauti tokius rezutatus, kurie yra tiesiškai proporcingi analitės

koncentracijai mėginyje.

Tvirtumas – metodo savybė likti nepakitusių rodiklių mažų pokyčių parametrų nustatymuose

(eliuentų koncentracijų, slėgio ir kt.) kontekste.

17

Metodo validavimas yra kritinis procesas bioanalizėje, būtinas norint pritaikyti konkretų metodą

rutininiams tyrimams. Nepaisant sudarytų bendrų validavimo parametrų gairių, jų taikymo kriterijai

išlieka dviprasmiški bei migloti. Tarp labiausiai problematiškų ir kontraversiškų parametrų priskiriami

nustatymo riba, tvirtumas bei matricos efektas [7;40]. Egzistuoja keletas nustatymo ribos

apskaičiavimo metodologijų, dėl ko pastebimas sukurtų metodų heterogeniškumas. Tvirtumas

validavimo darbuose dažnai apskritai praleidžiamas dėl daugybės nevienodų jo nustatymo būdų.

Matricos efektas, būdamas itin svarbus kriterijus skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos

metodų vystyme, paprastai taip pat nesulaukia pelnyto bioanalitikų dėmesio [40].

1.4.2. Validuoti benzalkonio chlorido nustatymo metodai

Prancūzų mokslininkų grupė yra sukūrusi benzalkonio chlorido (BAC) ir kitų ketvirtinių amonio

junginių kiekybinio nustatymo pieno produktuose metodą, paremtą atvirkštinių fazių skysčių

chromatografija bei elektropurkštuvinės jonizacijos tandemine masių spektrometrija [41]. BAC

ekstrakcija šiuo atveju vykdoma acetonitrilo ir etilacetato mišiniu, pritaikoma silikagelio

chromatografinė kolonėlė su prijungtomis C18 alkilo grupėmis, kaip eliuentai naudojami acetonitrilas

bei vanduo, abu parūgštinti 0,3 % koncentracijos metano rūgšties tirpalu, o gradientiniam eliuavimui

papildomai pasitelkiamas metanolis. Metodas išvystytas patikrinus visus validavimo kriterijus,

įskaitant pakankamą tikslumą, glaudumą, pasikartojamumą 5-150 µg/kg koncentracijų diapazone.

Matricos efekto neaptikta, o aptikimo ir nustatymo ribos tenkina validavimo reikalavimus (<1,9 µg/kg

ir 5-35 µg/kg atitinkamai) [41].

2015 m. atliktas atvirkštinių fazių ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodo BAC

koncentracijos nustatymui konservuotose vaistų formuluotėse optimizavimas ir validavimas [42]. Jo

rezultatai parodė, kad geriausiai BAC koncentracijai nustatyti tinka gradientinis eliuavimas, naudojant

10 mM amonio fosfato buferį (pH=3,3) kaip vandeninę judančią fazę bei metanolį/acetonitrilą tūriniu

santykiu 85/15 kaip organinę judančią fazę, detekciją vykdant 214 nm ilgio UV bangomis. Naudojant

šias sąlygas, pagrindiniai BAC homologai (C12 ir C14) buvo patikimai atskirti per mažiau kaip 2

minutes, su pakankamu tikslumu, glaudumu, tvirtumu bei tiesiškumu BAC koncentracijoms tarp 0,025

ir 0,075 mg/ml [42].

Taip pat jau yra sukurtas modernus popieriaus purkštuvinės jonizacijos masių spektrometrinis

metodas greitai ir patikimai nustatyti BAC kiekį akių lašuose ir kūno skysčiuose [43]. Šiuo atveju

naudojamas filtrinis popierius, kuris mirkomas į mėginį, o naudojama aukšta įtampa (3,5 kV) jonizuoja

BAC molekules į jonus – taip per kelias sekundes apeinamos ekstrakcijos bei chromatografinio

18

atskyrimo fazės, o tai savo ruožtu sumažina reikalingų validavimo parametrų skaičių. Pagrindinių

BAC homologų (C12, C14, C16) kiekybinis nustatymas šiuo metodu įvykdomas tiksliai, glaudžiai ir

tiesiškai 1-100 µg/ml koncentracijos ribose, nustatyta aptikimo riba - 0,1 µg/ml, nustatymo riba < 1

µg/ml. Lyginant su anksčiau kurtais skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodais, šis

nepasižymi dideliais kiekybinio nustatymo validavimo parametrų skirtumais, tik mažesne trukme (apie

2 min) [43].

Tiriant vieną mirtino apsinuodijimo BAC atvejį Japonijoje, buvo atliktas teisminės ekspertizės

skrodimas, po kurio buvo išvystytas skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos

(LC-MS/MS) metodas BAC kiekybinei analizei kraujyje [44]. Trijų BAC homologų – C12, C14 ir C16

- ekstrakcijai buvo pasitelkiama pakoreguota „QuEChERS“ metodika, pagrįsta centrifugavimu bei

kietafaziu ekstrahavimu. Metodo validacijos metu buvo pasiektas analitinius kriterijus atitinkantis

rezultatų tikslumas ir glaudumas BAC koncentracijoms nuo 10 iki 200 ng/ml. Naudojant šį metodą

minėto mirusio asmens širdies bei šlauninės venos kraujyje buvo aptikti reikšmingi konservanto

kiekiai net praėjus 18 dienų nuo jo suvartojimo, todėl galima darsyk pabrėžti rimtas prielaidas apie šio

detergento sudėtingą ekskreciją ir ypatingas kumuliacines savybes daugelyje organizmo audinių bei

skysčių [44].

Lenkų mokslininkai savo ruožtu sukūrė BAC kiekybinio nustatymo aplinkos vandens mėginiuose

metodą, kuris apima kietafazę ekstrakciją, jonų chromatografinį atskyrimą ir konduktometrinę

detekciją [45]. Naudojant šią procedūrą buvo pasiektas tarp 79 ir 93 % analitės atkūrimas bei

nustatymo intervalas tarp 0,0018 ir 0,038 µg/ml [45]. Tokia metodologija apeina toksiškų tirpiklių

naudojimą bei pasižymi paprastumu, greitumu ir pigumu lyginant su skysčių-skysčių ekstrakcijos -

skysčių chromatografijos - masių spektrometrijos metodais.

BAC kaip priedas taip pat įeina ir į kitų formų vaistinių ir kosmetikos produktų sudėtį – pavyzdžiui,

drėgnose servetėlėse jo koncentracija svyruoja 0,005-0,5 % ribose [46]. Kadangi pasiekęs didesnę

koncentraciją šis detergentas dirgina odą, jo kiekis turi būti tiksliai įvertinamas ir tokiose odos

priežiūros priemonėse. Šiam tikslui yra sukurtas kapiliarinės elektroforezės metodas kiekybiniam BAC

nustatymui drėgnose servetėlėse, susidedantis iš šios veiksmų sekos: tiriamos servetėlės išgręžiamos

nenaudojant ekstrakcijos, mėginiai injekuojami į kapiliarą hidrodinaminiu principu į kamerą, pripildytą

75mM fosfatinio buferio (pH=6,0) su 30 % elektrolito acetonitrilo, elektroforetinis separavimas

vykdomas pritaikant 10 kV įtampą [46]. Palyginti su ESC ir SC-MS metodų validavimo rezultatais,

šiuo būdu gaunamas toks pat geras tiesiškumas, tačiau šio metodo jautrumas nusileidžia minėtųjų

ribinėms koncentracijų vertėms (aptikimo riba siekia 0,3 µg/ml, o nustatymo – net apie 1 µg/ml C10

bei C12 analogams) [46].

19

Atvirkštinių fazių ultraefektyvioji skysčių chromatografija atskiria BAC homologus pagal jų

giminingumą nepolinei kolonėlei, t.y. pagal homologų poliškumą. Naudojant eliuavimo mišinį,

sudarytą iš 60 % acetonitrilo ir 40 % 0,1 M natrio acetato buferio (pH~5), 4,6 x 250 mm kolonėlę su 5

µm dydžio poromis, gaunamas geras tiesiškumo rodiklis (r2=0,99) visiems BAC homologams (n=8-

18) 0,025 ir 0,8 mg/ml koncentracijų ribose [47]. Toks UESC metodas pasižymi geru homologų

smailių atsiskyrimu chromatogramose, jautrumu bei glaudumu [47].

20

2. Medžiagos ir tyrimų metodai

2.1. Tyrimo organizavimas

Tyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Farmacijos fakulteto

biofarmacinių tyrimų laboratorijoje 2019 m. sausio-gegužės mėnesiais. Tiriamieji ašarų skysčio

ėminiai buvo renkami LSMU ligoninės Kauno klinikų Akių ligų klinikoje. Šiam tikslui pasitelkti

anoniminiai pacientai, kuriems skirtingais intervalais prieš ėminio surinkimą į akis buvo lašinami

skirtingi farmakologiniai akių lašų preparatai, į kurių sudėtį įeina arba neįeina tiriamasis junginys

benzalkonio chloridas. Šiam darbui vykdyti 2018 m. rugpjūčio 2 d. buvo išduotas Kauno regioninio

biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas Nr. BE-2-52.

2.2. Tyrimo medžiagos ir prietaisai

MEDŽIAGA GAMINTOJAS

Acetonas, grynumas >99 % Sigma-Aldrich (JAV)

Metanolis, grynumas >99 % Sigma-Aldrich (JAV)

Acetonitrilas, grynumas >99 % Sigma-Aldrich (JAV)

Etilacetatas, grynumas >99 % Sigma-Aldrich (JAV)

Širmerio testo juostelės OptiTech Eyecare (Indija)

Metano rūgštis, grynumas >99,9 % Sigma-Aldrich (JAV)

Benzalkonio chlorido standartas, grynumas >99,9

%

Sigma-Aldrich (JAV)

Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm chromatografinė

kolonėlė

Waters Corporation (JAV)

Acquity UPLC H-Class skysčių chromatografas Waters Corporation (JAV)

Xevo TQD masių spektrometras Waters Corporation (JAV)

Elmasonic P ultragarso vonelė Elma Schmidbauer (Vokietija)

2.3. Tyrimų metodai

2.3.1. Ėminių surinkimas

Ašarų skystis buvo surenkamas oftalmologiniam ašarojimo testui skirtomis Širmerio juostelėmis (2

pav.), šias laikant apatiniu voku primerktas paciento apatiniame junginės skliaute 5 min. Juostelėse jas

21

ištraukus tiksliai pažymimas ašarų skysčio nueitas kelias (mm), vėliau lyginamas su tikslaus žinomo

tūrio etaloninio BAC tirpalo nueitu keliu. Tokios juostelės su sugertais anoniminių pacientų ašarų

skysčių ėminiais buvo renkamos viso tyrimo metu ir patalpintos Eppendorf mėgintuvėliuose laikomos

šaldiklyje –80 °C temperatūroje neribotą laiką iki ekstrakcijos stadijos.

2 pav. Širmerio testo juostelės

2.3.2. Benzalkonio chlorido ekstrakcija iš ėminių į tiriamuosius mėginius

BAC ekstrakcija buvo vykdoma juosteles su tiksliai žinomu ašarų skysčio nueitu keliu (mm) pilnai

įmerkiant į 1 ml metanolio ir acetonitrilo mišinio (50/50) Eppendorf mėgintuvėliuose bei šiuos

inkubuojant ultragarso vonelėje (3 pav.) 40 °C temperatūroje 30 min. Po to juostelės išimamos, o

mėgintuvėliuose esantis tirpiklis išgarinamas azoto dujomis. Sausas išgauto BAC likutis naujai

tirpinamas 100 µl acetonitrilo – gaunamas mėginys, paruoštas skysčių chromatografinei - masių

spektrometrinei analizei.

22

3 pav. Elmasonic P ultragarso vonelė

BAC koncentracijos kiekybiniam nustatymui naudojamas išorinio standarto metodas. Lygiagrečiai

tiriamiesiems ruošiami etaloniniai mėginiai kalibracinei kreivei: nuo 0 iki 100,0 µg/ml koncentracijų

BAC tirpalai. Šie tirpalai gaunami iš gryno BAC standarto. Ant juostelės lašinama 10 µl metanolinio

BAC tirpalo, užrašomas skysčio nueitas kelias (mm) bei juostelė džiovinama 15 min traukos spintoje.

Po to iš juostelės analogiškai 30 min ultragarso vonelėje vykdoma BAC ekstrakcija į 1 ml metanolio

bei acetonitrilo mišinio (50/50), tirpiklis išgarinamas ir sausas BAC likutis tirpdomas 100 µl

acetonitrilo, gaunant 10 kartų mažesnes kalibracinių tirpalų koncentracijas.

2.3.3. Mėginių chromatografinė - masių spektrometrinė analizė

Paruošti mėginiai perkeliami į ultraefektyviosios skysčių chromatografijos analizei skirtus 2 ml

talpos buteliukus ir injekuojami į Acquity UPLC H-Class skysčių chromatografo (4 pav.) atvirkštinių

fazių sistemą. Naudojama 50 mm ilgio bei 2,1 mm pločio kolonėlė 1,7 µm dalelių dydžio silikageliniu

pagrindu su prijungtų C18 etileno hibridinių tiltelių (BEH) technologija (5 pav.). Eliuentu naudotas

metanolinis 0,1 % metano rūgšties tirpalas, taikytas izokratinis eliucijos režimas, vieno mėginio

analizės trukmė – 1 min.

23

4 pav. Acquity UPLC H-Class skysčių chromatografas (kairėje) ir Xevo TQD masių spektrometras

(dešinėje)

5 pav. Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm chromatografinė kolonėlė

Skirtinga sulaikymo trukme chromatografijos stadijoje pasižymintys BAC C8-C18 homologai

atskiriami, atpažįstami bei kiekybiškai nustatomi pritaikant tandeminės masių spektrometrijos

technologiją daugialypių reakcijų stebėjimo (MRM, angl. Multiple reaction monitoring) režimu.

Kolonėlėje atskirtos analitės patenka į elektropurkštuvinį jonizatorių, kuriame veikiant mėginio terpėje

esančiai metano rūgščiai susidaro skirtingų dydžių molekuliniai katijonai. Šie toliau keliauja į pirmąjį

trigubo kvadrupolinio jonų masių filtro analizatorių, kur yra atskiriami pagal masę, o prieš patekdami į

antrąjį analogišką analizatorių pereina argono dujomis užpildytą ardymo kamerą, kurioje skyla į kelių

24

kombinacijų neutralius molekulės fragmentus bei fragmentinius jonus. Pastarieji paeiliui atpažįstami ir

fiksuojami diodinio elektronų daugintuvo detektoriumi (4 pav.). MRM principas šiuo atveju reiškia,

kad kiekybiškai įvertinami visi galimi BAC homologai (6 pav.).

6 pav. UESC-MS/MS MRM režimu gaunamos atskirų BAC homologų chromatogramos

Atskirų BAC homologų koncentracijos mėginiuose nustatomos pagal MRM gaunamą precizišką

chromatografinių smailių plotą, pritaikius kalibraciniais mėginiais paremtą tiesinės regresijos modelį.

Ekstrakcijos efektyvumas įvertinamas pagal tapačios koncentracijos mėginių, gautų po ekstrakcijos ir

25

nevykdant jos, santykį. BAC kiekis pacientų ašarų skysčio ėminiuose sužinomas perskaičiuojant

gautąsias mėginiuose: atsižvelgiama į ekstrakcijai naudoto tirpiklio tūrį, koncentravimą bei skiedimą,

tad galutinis kiekis (µg) tiriamajame ėminyje apibrėžiamas kaip lygus 10 % gautos koncentracijos

(µg/ml) skaitinės vertės. Analizei reikšmingi laikomi 12C bei 14C homologų koncentracijos ir kiekiai.

2.4. Duomenų analizė

Eksperimentiškai gauti duomenys statistiškai apdorojami SPSS programiniu paketu. Statistiniam

patikimumui nustatyti ir skirtumų tarp skirstinių įvertinimui buvo atliekamas Mann-Whitney U testas.

Tiesiškumas įvertintas taikant tiesinės regresijos modelį ir apskaičiuojant determinacijos koeficientą

(r2). Rezultatų glaudumą lemia apskaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis (SSN, %). Taikomas

reikšmingumo lygmuo α lygus 0,05.

26

3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas

3.1. Ėminio surinkimo problematika

Širmerio testas klinikinėje oftalmologijoje sausų akių sindromui įvertinti plačiai taikomas dar nuo

XX a. pradžios [48;49]. Vis dėlto, ašarų skysčio surinkimas Širmerio testo juostelėmis turi privalumų

ir trūkumų. Tarp pastarųjų svarbu paminėti gaunamas netikslias, t. y. dirbtinai padidintas ar

sumažintas, tam tikrų junginių koncentracijas. Pavyzdžiui, serumo kilmės baltymų – albumino,

transferino, imunoglobulino G - koncentracijos šia procedūra surinktuose ėminiuose gaunamos

reikšmingai didesnės negu alternatyviais metodais surenkamame ašarų skystyje [49;50]. Taip pat lieka

nepaneigta hipotezė, jog tyrimo rezultatai šiuo atveju tampa nepatikimi dėl refleksinio ašarojimo

sukėlimo [50]. Šio tyrimo metu, atsižvelgiant į gausius duomenis apie BAC paviršinio aktyvumo

savybes ir polinkį kauptis paviršinėse akies struktūrose [19;22], prie privalumų priskirtina tyrimais

įrodyta sąlyginai geresnė Širmerio juostelių geba sugerti junginės bei ragenos epitelį dengiančioje

ašarų plėvelėje aptinkamus vadinamuosius surfaktantinius baltymus [48;49]. Tarp kitų pabrėžtinų šio

metodo pranašumų yra net ir be refleksinio dirginimo surenkamas didelis ašarų skysčio tūris bei

didesnis rezultatų glaudumas, o analičių stabilumas užtikrinamas juosteles laikant – 80°C

temperatūroje [49].

Laiko intervalo tarp akių lašų vartojimo ir ašarų skysčio paėmimo aktualumą pabrėžia klinikinių

tyrimų duomenys apie greitą (įvykstantį per kelias minutes) BAC koncentracijos mažėjimą ašarų

plėvelėje iš karto po konservuoto vaisto dozės patekimo ant akies paviršiaus [8].

Tačiau pagrindine tokio ėminių surinkimo būdo kliūtimi šio tyrimo metu tapo atradimas, kad

Širmerio juostelės po ekstrakcijos į analizei tinkamus mėginius generuoja šalutinį UESC-ESI-MS/MS

signalą, visiškai atitinkantį BAC lemiamą signalą (žr. 3.5 skyrių). Tai galime laikyti arba BAC

pėdsakų juostelėse buvimo prielaida, arba juostelių struktūrinių komponentų (pvz. celiuliozės arba

gradavimo linijų dažų molekulių) gebėjimu panašiais sulaikymo chromatografinėje kolonėlėje,

jonizacijos bei fragmentacijos dėsningumais detektoriuje sukurti persidengiantį signalą su BAC

generuojamuoju.

3.2. Optimalios terpės mėginių analizei parinkimas

Siekiant išsiaiškinti optimalią terpę tiksliam BAC UESC-MS/MS kiekybiniam nustatymui, iš BAC

standarto buvo ruošiami kalibraciniai tirpalai (0; 0,001; 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 25,0;

50,0; 100,0; 500,0; 1000,0; 2000,0 µg/ml koncentracijų) naudojant skirtingus tirpiklius: metanolį,

27

acetonitrilą ir acetoną. Reprezentaciniu BAC junginių grupės nariu dėl sąlyginai didžiausio aptinkamo

jo kiekio pasirinktas 12C homologas. Išmatavus kiekvieno mėginio penkių dozavimų sukuriamų

signalų dydžius (chromatografinės smailės plotą), buvo daromos prielaidos apie tiriamų tirpiklių

lemiamą koncentracijos-signalo intensyvumo tiesinį priklausomybės ryšį ar galimą matricos efektą.

Tiesiškumo matu laikytinas determinacijos koeficientas (r2). Didžiausia jo vertė, kurią galima laikyti

pakankama bioanalizėje (>0,99), gauta koncentracijoms nuo 0,05 iki 10 µg/ml mėginius skiedžiant

metanoliu (r2=0,9941), mažai atsiliko acetonitrilas (r

2=0,9914), mažiausia tame pačiame koncentracijų

diapazone – acetonu (r2=0,9837) (7 pav.). Tokiu būdu visose tirtose terpėse BAC kiekybinio

nustatymo riba lygi 0,005 µg/ml, o aptikimo riba – 10-4

µg/ml. Remiantis SSN rodikliais, geriausias

glaudumas aptiktas tarp mėginių, ruoštų su acetonitrilu (SSN<2,0 %), metanoliniuose tirpaluose šis

rodiklis tarp visų koncentracijų siekė daugiausiai 2,5 %, o acetonu skiestuose mėginiuose rezultatų

išsibarstymas buvo sąlyginai didžiausias (SSN<10,5 %). Svarbu pažymėti, jog acetonitrile ištirpusių

mėginių sukuriamų smailių plotai buvo reikšmingai didesni negu kitų tirpiklių visame kiekybinio

nustatymo 0,05-10,0 µg/ml koncentracijų intervale (p<0,03175). Šis atradimas, kartu su geresniais

glaudumo rodikliais, galimai paaiškinamas efektyvesne analitės jonizacija masių spektrometro ESI

fazėje bei mažesniais pašaliniais “triukšmo” signalais, kadangi analogiškas efektas jau yra pastebėtas

ESI-MS/MS proteomikos analizės darbuose [51]. Remiantis šiais duomenimis, tolimesniam tiriamųjų

mėginių tirpinimui ar skiedimui pasirinktas acetonitrilas.

7 pav. UESC-MS/MS 12C BAC homologo koncentracijos - sąlyginio signalo intensyvumo tiesinės

priklausomybės kalibracinės kreivės, tirpikliais naudojant metanolį, acetonitrilą ir acetoną (n=5)

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

Metanolis

Acetonitrilas

Acetonas

C, µg/ml

Sąlyginis signalo

intensyvumas

28

3.3. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Dauguma ankstesnių BAC kiekybinio nustatymo validavimui skirtų mokslinių darbų rėmėsi

patikimu analitės išgavimu tiesiogiai iš skysčių, išvengiant ekstrakcijos stadijos [46;52], arba

pasitelkiant kietafazės ekstrakcijos metodiką [44;53;54;55;56;57]. Nepaisant to, taip pat galima rasti

duomenų apie validuotą BAC išskyrimą iš kietų tiriamųjų ėminių naudojant ekstrakciją organiniais

tirpikliais acetonitrilu [19] arba acetonitrilo ir etilacetato mišiniu [41]. Atsižvelgiant į tai bei žinomas

geras BAC tirpumo savybes alkoholiuose ir acetone, analitės ekstrakcijos iš ėminių efektyvumui tirti

kandidatais pasirinkti šie tirpikliai: acetonas, acetonitrilas, etilacetatas, metanolis, acetonitrilo ir

metanolio mišinys (santykiu 1/1), acetonitrilo ir etilacetato mišinys (1/1) bei metanolio ir etilacetato

mišinys (1/1). Šiam tikslui buvo ruošiami į tiesiškumo intervalą patenkančios 5 µg/ml koncentracijos

(žr. 3.2 skyrių) standartiniai etaloniniai BAC tirpalai kiekviename iš minėtų tirpiklių, o taip pat

lygiagrečiai šiais skirtingais tirpikliais (1 ml) bandyta iš Širmerio juostelių ekstrahuoti 5 µg BAC.

Tikslus jo kiekis buvo absorbuojamas ant juostelės užlašinant 10 µl 500 µg/ml koncentracijos

standartinio metanolinio tirpalo ir išdžiovinant traukos spintoje. (Metanolis pasirinktas dėl artimiausios

dielektrinės konstantos reikšmės iš turimų tirpiklių ašarų terpėje pagrindą sudarančiam vandeniui, o

distiliuoto bei dejonizuoto vandens naudojimas šiame tyrime buvo atmestas dėl jame aptiktų BAC

pėdsakų.) Šios identiškos juostelės po to buvo įmerkiamos į skirtingus tirpiklius Eppendorf

mėgintuvėliuose ir inkubuojamos ultragarso vonelėje 40 °C temperatūroje 30 min. Ekstrakcijos

efektyvumas įvertintas apskaičiavus kiekvieno tirpiklio ekstrakto 12C BAC homologo UESC-MS/MS

signalo intensyvumo (chromatogramos smailės integralo) santykį su atitinkamo tirpiklio etaloninio

mėginio analogišku dydžiu bei išreikštas procentais (8 pav.). Kaip matyti iš diagramos, efektyviausiai

BAC ekstrahavo acetonitrilo ir metanolio mišinys (92,5 %), statistiškai reikšmingai pranokęs

etilacetatą (p=0,0159), acetonitrilo ir etilacetato mišinį (p=0,0174) bei etilacetato ir metanolio mišinį

(p=0,0342). Acetono, acetonitrilo bei metanolio ekstrakcijos efektyvumai nuo favorito reikšmingai

nesiskyrė, tačiau jų glaudumo rodikliai buvo prastesni (1 lentelė; atitinkamos SSN reikšmės 4,26 %,

1,94 % ir 2,30 %, lyginant su 1,30 %). Apibendrinus visus duomenis, tolesnei analitės ekstrakcijai iš

ėminių pasirinktas metanolio ir acetonitrilo mišinys.

1 lentelė. 12C BAC homologo ekstrakcijos rezultatų glaudumo palyginimas tarp skirtingų tirpiklių (n=7-

26)

Tirpiklis Acetonas Acetonitrilas Etilacetatas Metanolis AcN+

EtAc

AcN+

MeOH

EtAc+

MeOH

SSN, % 4,26 1,94 1,06 2,30 0,62 1,30 0,59

29

8 pav. 12C BAC homologo ekstrakcijos efektyvumo palyginimas tarp skirtingų tirpiklių (%, n=5-7)

3.4. Poekstrakcinės kalibracinės kreivės parametrai

Pasitelkus metanolyje ištirpintus tiesiškumo intervalą apimančių koncentracijų (0,05-10 µg/ml; žr.

3.2 skyrių) BAC standarto etaloninius tirpalus ir atsižvelgus į ekstrakcijos efektyvumo rezultatus (3.3

skyrius) toliau buvo tikrinama, ar analogiški tiesiškumo bei glaudumo rodikliai išlieka parinktomis

sąlygomis generuojant kalibracinę kreivę mėginiams, išgaunamiems po BAC ekstrakcijos iš Širmerio

juostelių. Kitaip negu 3.3 skyriuje aprašytoje ekstrakcijos procedūroje, šiuo atveju koncentravimo ir

labiau išreikšto signalo labui (žr. 3.2 skyrių) pabaigoje iš mėgintuvėlių su ekstraktais azoto dujomis

išgarinamas metanolio/acetonitrilo mišinys, o sausas likutis naujai tirpinamas 100 µl acetonitrilo.

Tiriant 12C homologą (9 pav.), gautas kiek mažesnis determinacijos koeficientas (r2=0,9857),

indikuojantis švelnų rezultatų patikimumo sumažėjimą pritaikius parinktas analitės ekstrakcijos iš

imitacinių ėminių sąlygas. Šią prielaidą patvirtina ir didesnis rezultatų išsibarstymas (SSN siekė 7,6

%). Mažai skiriasi ir antro pagal dažnį 14C homologo analogiški dydžiai (r2=0,9883; SSN iki 12,8 %).

Šie rezultatai aiškintini tuo, jog prie savaime UESC-MS/MS signalui būdingo standartinio nuokrypio

prisideda ir ekstrakcijos iš juostelių į mėginius proceso heterogeniškumas, todėl abu šiuos veiksnius

sujungus į vientisą metodiką ir gaunami mažesni tiesiškumo ir glaudumo rodikliai.

88,3

84,1

52,6

89,7

56,4

92,5

77,1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Acetonas, %

Acetonitrilas, %

Etilacetatas, %

Metanolis. %

Acetonitrilas+etilacetatas, %

Acetonitrilas+metanolis, %

Etilacetatas+metanolis, %

30

9 pav. 12C BAC homologo mėginių, gautų po pritaikytos ekstrakcijos metodikos, UESC-MS/MS

kalibracinė kreivė (r2=0,986; n=5)

3.5. Aptikimo bei nustatymo riba ir benzalkonio chloridas Širmerio juostelėse

Pakartotinai tikrinant mėginių, gaunamų po ekstrakcijos iš Širmerio juostelių, tiesiškumą su

mažesnių koncentracijų BAC kalibraciniais tirpalais (nuo 0,005 iki 1,0 µg/ml), buvo pastebėtas dar

labiau sumažėjęs determinacijos koeficientas r2 (0,973 ir 0,962 atitinkamai 12C bei 14C homologams).

Ne mažiau dėmesio verta aplinkybė buvo tai, jog žemiausios tirtos koncentracijos (0,005 µg/ml)

mėginio rezultatų glaudumas buvo akivaizdžiai mažesnis, lyginant su didesnių koncentracijų tirpalais

(SSN=11,2 %, lyginant su 0,7-2,9 % 12C homologo; SSN=11,1 %, lyginant su 0,35-3,0 % 14C

homologo). Visa tai suponavo mintį, kad galimai esama rezultatus iškreipiančio ir jautrumą

mažesnėms BAC kocentracijoms mažinančio šalutinio UESC-MS/MS signalo, o mažesnės už 0,005

µg/ml koncentracijos gali apskritai pakliūti už kiekybinio nustatymo ribos. Todėl eksperimentas buvo

pakartotas naudojant dar labiau praskiestus kalibracinius tirpalus (nuo 0,0005 iki 1,0 µg/ml). Šiame

etape nauja buvo tai, jog taip pat naudotas nulinis etaloninis mėginys, gautas tokiomis pat sąlygomis

kaip kiti mėginiai, ant Širmerio juostelės prieš ekstrakciją lašinant gryno metanolio (žr. 3.3 skyrių).

Nulinės koncentracijos mėginys generavo ryškų interferuojantį MRM signalą, šiuo atveju reikšmingai

nesiskiriantį nuo 0,005 µg/ml (p=0,3095) ir mažesnių koncentracijų BAC kalibracinių tirpalų kuriamų

signalų. Mažiausia koncentracija, laiduojanti statistiškai reikšmingą signalo intensyvumo skirtumą nuo

nulinio mėginio generuojamo signalo, buvo 0,01 µg/ml. Kadangi signalo intensyvumo rezultatų

glaudumo rodikliai visoms koncentracijoms tenkino normatyvinius reikalavimus (mažiausias būdingas

nuliniam mėginiui, SSN lygus 6,15 ir 5,08 atitinkamai 12C bei 14C homologams), 0,01 µg/ml

koncentracija buvo apibrėžta kaip metodo aptikimo bei kiekybinio nustatymo riba remiantis tik BAC

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

Sąlyginis signalo

intensyvumas

C, µg/ ml

31

UESC-MS/MS signalo intensyvumo skirtumu nuo bazinės linijos, kuri buvo nustatyta kaip nulinio

mėginio generuojamas signalas. Validavimo kriterijus atitinkantis tiesiškumas šiuo atveju buvo gautas

tik 0,01-0,25 µg/ml koncentracijų intervale, signalo intensyvumo reikšmės gautos atėmus nulinio

mėginio signalą (r2=0,964 ir r

2=0,963 atitinkamai 12C bei 14C homologui; 10 pav.). Patikrinti, ar

signalo generavimas priklauso tik nuo Širmerio juostelių, lygiagrečiai buvo ruošiamas nulinės

koncentracijos mėginys nenaudojant juostelės, atkartojant visas kitas metodo sąlygas. Pastarojo

mėginio MRM signalas buvo apie 20 kartų mažiau intensyvus (p=0,0079; SSN=7,9 %), todėl teko

patvirtinti hipotezę apie Širmerio juostelių esminį neigiamą poveikį metodo validavimui.

Tokio BAC imituojančio signalo aptikimas “tuščiuose” mėginiuose kenkia metodo jautrumui

(didina aptikimo bei nustatymo ribas), iškelia jo specifiškumo problemą ir komplikuoja jo

panaudojimo rutininiams klinikiniams tyrimams perspektyvas. Nėra visiškai aišku, kas nulemia šio

rezultatus iškreipiančio signalo atsiradimą, tačiau prielaida apie BAC panaudojimą konservuoti

Širmerio juosteles gamybos proceso metu yra labiausiai tikėtina. Taip pat neatmestina šio reiškinio

priežastis yra į tiriamąjį mėginį kartu su BAC molekulėmis patenkančių Širmerio juostelės struktūrinių

medžiagų (pvz. celiuliozės mikroatplaišų arba gradavimo linijų dažų) sąlygojamas matricos efektas

arba šių junginių panaši sulaikymo trukmė chromatografinėje kolonėlėje bei BAC giminingų jonų

susidarymas jonizacijos ir/arba fragmentacijos stadijose. Vis dėlto, pastarojo sutapimo tikimybę galime

laikyti minimalia dėl metodikoje pritaikyto jautraus MRM režimo.

10 pav. 12C BAC homologo mėginių, kurių koncentracijų vertės artimos nustatymo ribai, UESC-MS/MS

kalibracinė kreivė (r2=0,964; n=5)

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3C, µg/ml

Sąlyginis signalo

intensyvumas

32

3.6. Benzalkonio chlorido kiekis pacientų ašarų skysčio ėminiuose

BAC kiekis glaukoma sergančių pacientų ašarų skysčio ėminiuose nustatytas kalibracine kreive,

gauta lygiagrečiai su tiriamaisiais mėginiais per UESC-MS/MS sistemą perleidžiant etaloninius BAC

tirpalus (žr. 2.3.3 poskyrį). Daugiafaktorinei lyginamajai analizei pasirinkti šešių tiriamųjų objektų, iš

kurių trys vartoja BAC konservuotus akių lašus, o trys tokių preparatų nesilašina, ašarų skysčio

ėminiai (2 lentelė). Šie buvo surinkti praėjus mažiausiai trims valandoms po paskutinės dozės

sulašinimo, todėl neabsorbuoto ant akies paviršių arba nepasiskirsčiusio ašarų skystyje BAC tiesioginį

surinkimą iš lašų galime atmesti. Reprezentaciniais homologais dėl didžiausio ir stabiliausiai

aptinkamo kiekio pasirinkti 12C bei 14C homologai. Visuose ėminiuose nustatytas 12C homologo

kiekis svyravo tarp 9,3 ir 17,7 ng, 14C – tarp 9,1 bei 25 ng (2 lentelė).

2 lentelė. Tiriamųjų pacientų ašarų skysčio ėminių duomenys (S – skysčio nueitas kelias Širmerio

juostelėje, arba sąlyginis ėminio tūris; C – paciento vartojamų akių lašų BAC koncentracija;

TBUT – paciento ašarų plėvelės trūkimo laikas, arba ašarų plėvelės vientisumo ir akių sausumo

matas)

Ėminio nr. S, mm C, % TBUT, s 12C kiekis, ng 14C kiekis, ng

039 10 0,05 5 13,28 21,35

040 15 - 3 9,38 9,1

041 15 - 15 10,26 11,31

042 10 - 14 12,23 14,27

043 12 0,02 14 17,66 25,05

044 5 0,02 3 10,82 11,25

3.6.1. Priklausomybė nuo surenkamo ėminio tūrio

Visi tiriamieji ašarų skysčio ėminiai buvo suskirstyti į dvi pagrindines grupes: pacientų, kuriems į

akis reguliariai lašinami BAC konservuoti akių lašai, ir pacientų, kurie tokių preparatų nevartoja.

Atmetus BAC lašinimo įtaką, abiejose grupėse atskirai buvo vertinamas ryšys tarp Širmerio juostelėje

skysčio nueito kelio, tiesiogiai rodančio surinktą ašarų tūrį, bei nustatomo BAC kiekio. Pirmojoje

grupėje, tarpusavyje lyginant ėminius su 10 ir 15 mm ašarų skysčio nueitu keliu, nebuvo pastebėtas

reikšmingas BAC kiekio skirtumas (p=0,2865). Antrojoje grupėje analogiška 14C homologo tiesinė

priklausomybė buvo nustatyta (r2=0,9953; 11 pav.), tačiau 12C homologui buvo gerokai mažesnė

(r2=0,8381). Galbūt tai galima paaiškinti didesne 14C homologo kumuliacija akies paviršiuose dėl

33

didesnio nepolinio šios molekulės fragmento, kadangi jo kiekis kai kuriuose ėminiuose buvo aptiktas

didesnis negu 12C homologo.

11 pav. 14C BAC homologo kiekio tiesinė priklausomybė nuo ašarų skysčio nueito kelio Širmerio

juostelėje (r2=0,995; n=5)

3.6.2. Konservuotų akių lašų vartojimo įtaka

Lyginant vartojančių akių lašus pacientų grupę su nevartojančių, nebuvo nustatytas reikšmingas

skirtumas tarp ėminiuose aptinkamų BAC kiekių (p=0,2 12C homologui ir p=0,4 14C homologui).

Tiriant BAC kiekio ašarų skystyje priklausomybę nuo vartojamuose vaistuose randamos BAC

koncentracijos, patikimo ryšio taip pat nebuvo aptikta (r2=0,19 C12 homologui; r

2=0,42 14C

homologui; 12 pav.). Sunku pasakyti, kodėl net ir atėmus Širmerio juostelėse aptinkamų BAC pėdsakų

poveikį (žr. 3.5 skyrių), nevartojančių jokių preparatų pacientų ašarų skysčiuose randami panašūs BAC

kiekiai. Tam įtakos gali turėti ir anksčiau vartoti oftalmologiniai ar ėminio rinkimo metu sistemiškai

vartoti vaistai, ir ėminio surinkimo arba mėginio paruošimo klaidos, ir mažos imties sąlygojamos

atsitiktinės paklaidos. Galutinai išsiaiškinti, ar egzistuoja tiesinė priklausomybė tarp vartojamuose akių

lašuose randamos BAC koncentracijos bei nustatomo BAC kiekio ašarų skystyje, reikia papildomų

tyrimų su didesne imtimi.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

22,0

24,0

26,0

0 2 4 6 8 10 12

m, ng

S, mm

34

12 pav. Ryšys tarp vartojamuose akių lašuose esančios BAC koncentracijos ir ašarų skystyje aptinkamo

14C BAC homologo kiekio (r2=0,42; n=5)

3.6.3. Ryšys su ašarų plėvelės stabilumu

Kadangi ašarų plėvelės vientisumo pažeidimas yra kliniškai bei moksliškai patvirtinta ilgalaikio

BAC poveikio pasekmė [6;18;19;20;24], taip pat buvo tikrinama, ar esama tiesioginio ryšio tarp

paciento ašarų plėvelės trūkimo laiko TBUT (angl. Tear film break-up time) rodiklio ir atitinkamame

ėminyje nustatomo BAC kiekio. Reikšmingos koreliacijos tarp šių dydžių apibrėžti nepavyko (r2=0,17

C12 homologui; r2=0,09 14C homologui). Šiam atvejui galime priskirti panašias prielaidas į jau

išsakytas 3.6.2 poskyryje, pridedant tik tai, kad galimai BAC vartojimas šiems pacientams dar nėra

pakankamai chroniškas, jog sukeltų negrįžtamus ašarų plėvelės riebalinio sluoksnio pažeidimus.

3.6.4. Skirtumai tarp 12C ir 14C homologų tapačiuose ėminiuose

Nors statistiškai vertinant šešių tirtų pacientų ėminių visumą nėra reikšmingo skirtumo tarp

nustatomų 12C ir 14C homologų kiekių (p=0,485), kiekvieno iš ėminių kelis UESC-MS/MS

matavimus vertinant atskirai, keturiuose iš šešių buvo rastas reikšmingai didesnis 14C homologo

kiekis lyginant su 12C homologu (13 pav.). 14C homologo molekulė yra labiau hidrofobinė, todėl

įmanoma, jog šis BAC šeimos atstovas ilgiau išsilaiko prisijungęs prie akies paviršinių struktūrų –

ašarų plėvelės išorinio lipidų sluoksnio, ragenos epitelio ir kt. – ilgainiui lemdamas jų degeneraciją.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

22,0

24,0

26,0

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

m, ng

C, %

35

13 pav. BAC 12C ir 14C homologų kiekių palyginimas tarp skirtingų tiriamųjų objektų ašarų skysčio

ėminių (*statistiškai reikšmingas skirtumas tarp 12C ir 14C homologų; n=5)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

39 40 41 42 43 44

12C

14C

*

*

*

*

m, ng

Ėminio

kodas

36

Išvados

1. Ištobulinta benzalkonio chlorido perkėlimo iš ašarų skysčio į tiriamuosius mėginius procedūra

vertintina kaip pakankamai efektyvi mėginius laikyti reprezentaciniais atitinkamiems ašarų skysčio

ėminiams;

2. Sukurtasis ultraefektyviosios skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos metodas

benzalkonio chloridui nustatyti pasižymi didele sparta, geba atskirti skirtingus šio junginio homologus,

pakankamu glaudumu, tinkamu tiesiškumu kliniškai reikšmingame koncentracijų intervale, tačiau

patikimai neapibrėžia aptikimo bei nustatymo ribų, nepaneigia specifiškumo stokos ir galimo matricos

efekto buvimo;

3. Sukurtasis benzalkonio chlorido kiekybinio nustatymo ašarų skystyje metodas geba aptikti tikslius

bei pasikartojančius šio akių lašų konservanto skirtingų homologų kiekius akių ligų pacientų ašarų

skysčiuose ir atskleidžia logišką tiesinę priklausomybę tarp surenkamo ašarų skysčio tūrio bei jame

aptinkamo benzalkonio chlorido kiekio.

37

Literatūros sąrašas

1. MCNALLY, R. The United States Pharmacopoeia, 24th revision. Easton: Taunton, 2000.

2. EUROPEAN PHARMACOPOEIA COMMISSION; EUROPEAN DIRECTORATE FOR THE

QUALITY OF MEDICINES & HEALTHCARE. European pharmacopoeia. Council of Europe,

2010.

3. FREEMAN, P. David; KAHOOK, Malik Y. Preservatives in topical ophthalmic medications:

historical and clinical perspectives. Expert Review of Ophthalmology, 2009, 4.1: 59-64.Leung, E.

W., Medeiros, F. A., & Weinreb, R. N. (2008). Prevalence of ocular surface disease in glaucoma

patients. Journal of glaucoma, 17(5), 350-355.

4. LEUNG, Eamon W.; MEDEIROS, Felipe A.; WEINREB, Robert N. Prevalence of ocular surface

disease in glaucoma patients. Journal of glaucoma, 2008, 17.5: 350-355.

5. ROSSI, Gemma Caterina Maria, et al. Risk factors to develop ocular surface disease in treated

glaucoma or ocular hypertension patients. European Journal of Ophthalmology, 2013, 23.3: 296-

302.

6. WILSON, W. S.; DUNCAN, A. J.; JAY, J. L. Effect of benzalkonium chloride on the stability of

the precorneal tear film in rabbit and man. British Journal of Ophthalmology, 1975, 59.11: 667-

669.

7. MOEIN, Mohammad Mahdi; EL BEQQALI, Aziza; ABDEL-REHIM, Mohamed. Bioanalytical

method development and validation: Critical concepts and strategies. Journal of Chromatography

B, 2017, 1043: 3-11.

8. FRIEDLAENDER, Mitchell H., et al. The dilution of benzalkonium chloride (BAK) in the tear

film. Advances in therapy, 2006, 23.6: 835-841.

9. IOANNOU, Christopher J.; HANLON, Geoff W.; DENYER, Stephen P. Action of disinfectant

quaternary ammonium compounds against Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents and

chemotherapy, 2007, 51.1: 296-306.

10. LEHRER, R. I., et al. Interaction of human defensins with Escherichia coli. Mechanism of

bactericidal activity. The Journal of clinical investigation, 1989, 84.2: 553-561.

11. GILBERT, Peter; MCBAIN, Andrew J. Potential impact of increased use of biocides in consumer

products on prevalence of antibiotic resistance. Clinical microbiology reviews, 2003, 16.2: 189-

208.

12. DELCOUR, Anne H. Outer membrane permeability and antibiotic resistance. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2009, 1794.5: 808-816.

13. BRAOUDAKI, M.; HILTON, A. C. Adaptive resistance to biocides in Salmonella enterica and

Escherichia coli O157 and cross-resistance to antimicrobial agents. Journal of clinical

microbiology, 2004, 42.1: 73-78.

14. GRAVEL, Julien; PARADIS-BLEAU, Catherine; SCHMITZER, Andreea R. Adaptation of a

bacterial membrane permeabilization assay for quantitative evaluation of benzalkonium chloride as

a membrane-disrupting agent. MedChemComm, 2017, 8.7: 1408-1413.

15. CWIKLIK, Lukasz. Tear film lipid layer: a molecular level view. Biochimica et Biophysica Acta

(BBA)-Biomembranes, 2016, 1858.10: 2421-2430.

16. ALURU, Saijyothi Venkata, et al. Tear fluid protein changes in dry eye syndrome associated with

rheumatoid arthritis: a proteomic approach. The ocular surface, 2017, 15.1: 112-129.

38

17. MIYAKE, Hideki, et al. Development of a highly sensitive and reliable enzyme-linked

immunosorbent assay for MUC5aC in human tears extracted from schirmer strips. Clinical

ophthalmology (Auckland, NZ), 2018, 12: 1571.

18. PUODŽIUVIENĖ, Edita. (2006). Akių lašų konservantų problema oftalmologijoje. Lietuvos

oftalmologija, 4, 15-41.

19. DESBENOIT, Nicolas, et al. Localisation and quantification of benzalkonium chloride in eye

tissue by TOF-SIMS imaging and liquid chromatography mass spectrometry. Analytical and

bioanalytical chemistry, 2013, 405.12: 4039-4049.

20. LI, Chaoyang, et al. Research on the stability of a rabbit dry eye model induced by topical

application of the preservative benzalkonium chloride. PLoS One, 2012, 7.3: e33688.

21. Rath, A., Eichhorn, M., Trager, K., Paulsen, F., Hampel, U. (2019). In vitro effects of

benzalkonium chloride and prostaglandins on human meibomian gland epithelial cells. Annals of

Annatomy, 222, 129-138.

22. YANG, Qian, et al. A Comparison of the Effects of Benzalkonium Chloride on Ocular Surfaces

between C57BL/6 and BALB/c Mice. International journal of molecular sciences, 2017, 18.3:

509.

23. DATTA, Sandipan, et al. The eye drop preservative benzalkonium chloride potently induces

mitochondrial dysfunction and preferentially affects LHON mutant cells. Investigative

ophthalmology & visual science, 2017, 58.4: 2406-2412.

24. RASMUSSEN, Carol A.; KAUFMAN, Paul L.; KILAND, Julie A. Benzalkonium chloride and

glaucoma. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 2014, 30.2-3: 163-169.

25. BRIGNOLE-BAUDOUIN, Françoise, et al. In vitro comparative toxicology of polyquad-preserved

and benzalkonium chloride-preserved travoprost/timolol fixed combination and latanoprost/timolol

fixed combination. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 2011, 27.3: 273-280.

26. AIHARA, Makoto, et al. Effects of SofZia‐preserved travoprost and benzalkonium chloride‐

preserved latanoprost on the ocular surface–a multicentre randomized single‐masked study. Acta

ophthalmologica, 2013, 91.1: e7-e14.

27. ROULAND, Jean-François, et al. Efficacy and safety of preservative-free latanoprost eyedrops,

compared with BAK-preserved latanoprost in patients with ocular hypertension or

glaucoma. British journal of ophthalmology, 2013, 97.2: 196-200.

28. TRAVOPROST BAK-FREE CLINICAL STUDY GROUP. Comparison of a travoprost BAK-free

formulation preserved with polyquaternium-1 with BAK-preserved travoprost in ocular

hypertension or open-angle glaucoma. European journal of ophthalmology, 2012, 22.1: 34-44.

29. TRESSLER, Charles S.; BEATTY, Richard; LEMP, Michael A. Preservative use in topical

glaucoma medications. The ocular surface, 2011, 9.3: 140-158.

30. JANULEVIČIENĖ, Ingrida, et al. Effects of preservative-free tafluprost on tear film osmolarity,

tolerability, and intraocular pressure in previously treated patients with open-angle

glaucoma. Clinical ophthalmology (Auckland, NZ), 2012, 6: 103.

31. AMMAR, David A.; KAHOOK, Malik Y. Effects of benzalkonium chloride-or polyquad-

preserved fixed combination glaucoma medications on human trabecular meshwork

cells. Molecular vision, 2011, 17: 1806.

32. BAUDOUIN, Christophe, et al. In vitro and in vivo experimental studies on trabecular meshwork

degeneration induced by benzalkonium chloride (an American Ophthalmological Society

thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society, 2012, 110: 40.

39

33. STEVENS, Anna M., et al. Benzalkonium chloride induces anterior chamber inflammation in

previously untreated patients with ocular hypertension as measured by flare meter: a randomized

clinical trial. Acta ophthalmologica, 2012, 90.3: e221-e224.

34. BRIGNOLE-BAUDOUIN, Françoise, et al. A new safety concern for glaucoma treatment

demonstrated by mass spectrometry imaging of benzalkonium chloride distribution in the eye, an

experimental study in rabbits. PLoS One, 2012, 7.11: e50180.

35. BOUCHEMI, Meryem, et al. Effect of benzalkonium chloride on trabecular meshwork cells in a

new in vitro 3D trabecular meshwork model for glaucoma. Toxicology in Vitro, 2017, 41: 21-29.

36. AGUAYO BONNIARD, Alberto, et al. Ocular surface toxicity from glaucoma topical medications

and associated preservatives such as benzalkonium chloride (BAK). Expert opinion on drug

metabolism & toxicology, 2016, 12.11: 1279-1289.

37. HSU, Kuan-Hui, et al. Multidose Preservative Free Eyedrops by Selective Removal of

Benzalkonium Chloride from Ocular Formulations. Pharmaceutical research, 2017, 34.12: 2862-

2872.

38. NAGAI, Noriaki, et al. Decrease in Corneal Damage due to Benzalkonium Chloride by the

Addition of Mannitol into Timolol Maleate Eye Drops. Journal of oleo science, 2015, 64.7: 743-

750.

39. GUIDELINE, ICH Harmonised Tripartite. Validation of analytical procedures: text and

methodology Q2 (R1). In: International conference on harmonization, Geneva, Switzerland. 2005.

p. 11-12.

40. GONZÁLEZ, Oskar, et al. Bioanalytical chromatographic method validation according to current

regulations, with a special focus on the non-well defined parameters limit of quantification,

robustness and matrix effect. Journal of Chromatography A, 2014, 1353: 10-27.

41. SLIMANI, Kahina, et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry multiresidue method

for the analysis of quaternary ammonium compounds in cheese and milk products: Development

and validation using the total error approach. Journal of Chromatography A, 2017, 1517: 86-96.

42. MALLIK, Rangan, et al. Development and validation of a rapid ultra-high performance liquid

chromatography method for the assay of benzalkonium chloride using a quality-by-design

approach. Journal of Chromatography A, 2015, 1413: 22-32.

43. LIU, Jingjing, et al. Rapid analysis of benzalkonium chloride using paper spray mass

spectrometry. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 2017, 145: 151-157.

44. MISHIMA-KIMURA, Satoko, et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection

of benzalkonium chloride (BZK) in a forensic autopsy case with survival for 18 days post BZK

ingestion. Legal Medicine, 2018, 32: 48-51.

45. OLKOWSKA, Ewa; POLKOWSKA, Żaneta; NAMIEŚNIK, Jacek. A solid phase extraction–ion

chromatography with conductivity detection procedure for determining cationic surfactants in

surface water samples. Talanta, 2013, 116: 210-216.

46. YILDIRIM, Güneș; TÜRKÖZ, E. Acar. Determination of benzalkonium chloride in wet wipes by

using a validated capillary electrophoresis method. Journal of cosmetic science, 2017, 68.1: 1-10.

47. PRINCE, Shelly J., et al. Analysis of benzalkonium chloride and its homologs: HPLC versus

HPCE. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 1999, 19.6: 877-882.

48. ZHOU, Lei; BEUERMAN, Roger W. Tear analysis in ocular surface diseases. Progress in retinal

and eye research, 2012, 31.6: 527-550.

40

49. POSA, Andreas, et al. Schirmer strip vs. capillary tube method: non-invasive methods of obtaining

proteins from tear fluid. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger, 2013, 195.2: 137-142.

50. UND HOHENSTEIN-BLAUL, Nadine von Thun; FUNKE, Sebastian; GRUS, Franz H. Tears as a

source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Experimental eye research, 2013, 117: 126-

137.

51. CHEN, Jin, et al. Electrospray ionization in concentrated acetonitrile vapor improves the

performance of mass spectrometry for proteomic analyses. Journal of Chromatography A, 2017,

1483: 101-109.

52. KOVACS-HADADY, K.; FABIAN, I. The determination of benzalkonium chloride in eye-drops

by difference spectrophotometry. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 1998, 16.5:

733-740.

53. PRIETO-BLANCO, M. C.; MOLINER-MARTINEZ, Y.; CAMPÍNS-FALCÓ, P. Combining poly

(dimethyldiphenylsiloxane) and nitrile phases for improving the separation and quantitation of

benzalkonium chloride homologues: In-tube solid phase microextraction–capillary liquid

chromatography–diode array detection-mass spectrometry for analyzing industrial

samples. Journal of Chromatography A, 2013, 1297: 226-230.

54. FAN, Tony Y.; WALL, G. Michael. Determination of benzalkonium chloride in ophthalmic

solutions containing tyloxapol by solid-phase extraction and reversed-phase high-performance

liquid chromatography. Journal of pharmaceutical sciences, 1993, 82.11: 1172-1174.

55. KÜMMERER, Klaus, et al. Analysis of benzalkonium chloride in the effluent from European

hospitals by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography with post-column

ion-pairing and fluorescence detection. Journal of chromatography A, 1997, 774.1-2: 281-286.

56. MIYAUCHI, Teruhisa; MORI, Mitsunori; ITO, Katsuhiko. Quantitative determination of

benzalkonium chloride in treated wood by solid-phase extraction followed by liquid

chromatography with ultraviolet detection. Journal of Chromatography A, 2005, 1095.1-2: 74-80.

57. XUE, Yuying, et al. Sensitive determination of benzalkonium chloride in blood and tissues using

high-performance liquid chromatography with solid-phase extraction. Legal Medicine, 2002, 4.4:

232-238.

Interesų konfliktas

Autorius deklaruoja neturįs jokio intereso konflikto.

Padėka

Autorius dėkoja projekto mokslinei konsultantei Giedrei Pakulienei, vadovui prof. dr. Valdui Jakštui ir

doktorantui Vaidotui Žvikui.

Documents

Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos