bd-curs8-ppt bun 2

7/25/2019 bd-curs8-ppt bun 2

1/62

Tehnici de separare si caracterizare

a proteinelor

Studiul proteinelor -obiective:

1. Purificarea proteinei

prepararea extractului

precipitarea

centrifugarea

separarea cromatografica

verificarea puritatii

dializa

ultrafiltrarea


2/62

2. Caracteizarea

proteinei

M

compozitia/ str. primara

str. secundara/tertiara

str. cuaternara

stabilirea mecanismuluide actiune

Studiul proteinelor -obiective:


3/62


1.1. Preparareaextractului

ultrasonicare

utilizarea presei franceze

cicli inghetare-dezghetare

Rupereamembranelor

celulare

distrugerea enzimatica

a membranei celulare


4/62

1.1. Prepararea extractului

ultrasonicare presa franceza



5/62

cicli inghetare-dezghetare distrugerea membranei celulare

1.1. Prepararea extractului

joy-of-bioprocess.blogspot.com

- Utilizarea lizozimei

- Utilizarea detergentilor

www.plospathogens.org



6/62

1.2. Precipitarea proteinelor

A. Precipitarea la pH = pI

Papaina (papaia) pI = 8,85

Ureaza (fasole) pI = 5 - 5,1

B. Precipitarea cu (NH4)2SO4

precipitat

Precipitarea fractiunilor care contin HSA

a) Inainte de adaugarea sarii;

b) Suspensie de precipitat proteic in solutie 85% de sulfat de amoniu;

c) Precipitat proteic rezultat in urma centrifugarii (60 min la 5000 rpm).



7/62

1.2. Precipitarea proteinelor

C. Precipitarea cu PEG

D. Precipitarea cu solventi organiciAcetona EtOH

1.3. DializaAmestec

supusdializei

Sac dedializa

A B

Solutie

Proteina

Molecule mici

difuzie



8/62

1.4. Ultrafiltrarea


N2 (presiune)

Sticlasinterizata

Ultrafiltrat

Membrana

Magnetpentruagitare

Solutia de proteinasupusa concentrarii

Agitator magnetic

Membrane semipermeabile-Acetat de celuloza- Nylon-polivinilidena

Mai rapida decat dializa


9/62

1.5. Centrifugarea


rPrecede operatiisonicareprecipitare

SeparareaMformadensitatenatura solventului

Viteze mici < 6000 rpm

Particule mai mari

nucleu celule

rosii


10/62

1.5. Ultracentrifugarea


Viteze mari > 20000 rpm

Organite celulare

mitocondrii reticululendoplasmatic

1 Svedberg = 1S = 1 x 10-13s

Hemoglobina 4,5 S

Mioglobina 1,8 S


11/62

1.6. Separarea cromatografica


1.6.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

Coloanacromatografica

Amestecsupus

separarii

GelA B


12/62


1.6.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

Tipul gelulului Intervalul de

separare

(M, KDa)

Sephadex G-10 < 0.7

Sephadex G-25 1-5

Bio-Gel P-60 3-60

Sephadex G-75 3-70

Sephadex G-100 4-100

Bio-Gel P-100 5-100Sephadex G-200 30-200

Sephacryl S-300 10-1.500

Sepharose 2B 70-40.000

10

100

1000

0 20 40 60 80 100 120

Volume/ml

MW/kDa


13/62



1.6.2. Cromatografie de schimb ionic

Proteina

SchimbatoranionicIoni din

tampon

A B


14/62

Schimbatori anionici Gruparea functionala Taria

schimbatoruluiDieti l-amino-etil (DEAE) -O-CH2-CH2-N

+( CH2CH3)2 slaba

Cuaternara aminoetil

(QAE)

-O-CH2-CH2-N+( C2H5)2- CH2-CH2OH-CH3 puternica

Cuaternara amoniu (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 puternica

Schimbatori cationici Gruparea functionala Taria

schimbatorului

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO- slaba

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CH2- CH2-SO3- puternica

Sulfonat de metil -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CHOH- CH2-SO3- puternica

Grupe functionale ale schimbatorilor de ioni





15/62




M: 14,3 KDa

129 de AA

pH optim9,2

(261,5 nm, 1%)= 26,4

pI = 11.0

StabilitateapH 4-5

Inhibitori

imidazol

SDS

alcooli

acizigrasi

Caractersticilelizozimei

(albusul de ou)


16/62



1.6.3. Cromatografie prin interactii hidrofobe

www.pall.com


17/62



1.6.4. Cromatografie de afinitate

ADN cu secventa suplimentara

Insertie inbacterii (E coli)

Distrugerea membranelor

proteina cusecventaadiacenta

alteproteine

legare

Matricedeafinitate

SpalareElutie

Indepataresecventa

suplimentara

= ligand


18/62



1.6.4. Cromatografie de afinitate

Denumirea

secventei

adiacente

Lungimea

secventei

adiacente

Caracteristici

His-tag scurta Leaga cationii imobilizati (Co2+, Ni2+, Cu2+)

Elutia se face cu imidazol 250 mM

Flag-tag scurta Secventa adiacenta DYKDDD-DK complexeaza

Ca2+permitand imobilizarea anticorpilor M1, M2 si

M5; ultimii 5 aminoacizi pot fi clivati de

enterokinazaS-tag medie Secventa KETAAKFERQHMDS se leaga de

fragmentul S din ARNaza A

Elutia se face cu citrat 0,2 M

GST-tag mare GST= glutation S-transferaza (26 KDa) se leaga

specific de o matrice pe care este imobilizat

glutationul; proteinele fuzionate cu GST sunt in

general stabile si solubile

Secvente adiacente - cromatografia de afini tate


19/62

10

100

1000

0 10 20 30

distance/mm

MW/kDa

97 kDa

45 kDa

30 kDa

20 kDa

66 kDa

14 kDa

1.6. Verificarea puritatii - electroforeza



20/62

Avantajele SDS electroforezei

1.6. Verificarea puritatii SDS electroforeza

1. Purificarea proteinelor

SDS (detergent) solubilizeaza aproapetoate proteinele;

Izoproteinele nu apar sub forma unorbenzi diferite;

Micelele de SDS-proteina, fiind puternic incarcate

negativ, poseda o mobilitate electroforetica;Lanturile polipeptidice sunt despachetatesepararea = f(dimensiune a porilor, M);

www.pnas.org

Dezavantaje

Proteinele separate prin SDS-electroforeza -leaga bine colorantul.


21/62

Tris-Tricine SDS PAGE (Schaegger)

16.5% 2-25 kDa

Sisteme de electroforeza folosite


1. Purificarea enzimei

Tris-glycine SDS PAGE (Laemmli)

7.5% 40-400 kDa

12.5% 20-100 kDa

20% 3-25 kDa


22/62

Sisteme de electroforeza folosite




23/62

Mecanism de polimerizare

1.6. Verificarea puritatii SDS - electroforeza



24/62

Acr il-

amida

(%)

Intervalul

de separare

(KDa)15 15-45

12,5 15-60

10 18-75

7,5 30-120

5 60-210

Mecanism de polimerizare




25/62

Reducerea puntilor disulfidice




26/62

1.6. Verificarea puritatii HPLC


elte.prompt.hu

dionex.com


27/62

1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (MALDI-TOF)


www.atdbio.com

http://www.kcl.ac.uk/


28/62

1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (ESI-MS)



29/62




30/62

Aplicatiile MS

Identificarea proteinelor(2D gel)

Caracterizarea proteinelorrecombinate

Modificarile postranslationaleale proteinelor


1. Purificarea enzimei

Expert Protein Analysis SystemExPASy

1- si -globine ( 12 KDa); 2- -actine ( 12 KDa)

3- acetil colin esteraza; 4- spectrine cu lant -actine

Proba din ficatul uman

Determinarea masei moleculare


31/62

Structura primara

Structura primara a insulinei din porc(hormon) a fost decoperita de Frederick

Sanger (premiul Nobel in 1958).

Structura primara este descrisa de secventa

aminoacizilor care formeaza lantul polipeptidic

Secventa aminoacizilor in insulina (porc). Fiecare molecula contine 2 lanturi po lipeptid ic


32/62

Cunoasterea structurii

primare

Mw

Localizare AA

Identificarea de partifunctionale

Stabilirea relatii

de evolutie


33/62

ProteineReactii

de

clivare

Etapa 1 Amestec

de

fragmenteSepararea

fragmentelor

Etapa 2 Fragmente

purificate

Etapa 3secventarea

Secvente

individuale

Set de

secvente

individuale

Al inierea

secventelor

individuale

-clivarea

alternativa;-separarea si

secventierea

Al inierea

secventelor

individuale

Secventa

completa

Determinarea structurii primare


34/62

Determinarea structurii primare

Pehr Edman

1972-secventafibrinogenului


35/62

Structura secundara

Structura secundara descrie modalitatile de impachetare

ale lantului polipeptidic

Structura -Helix

L. Pauling in 1951

(Premiu Nobel) 3,6 aa / rotatie


36/62

Linus Pauling

singurul detinator a 2 premii Nobel

(1954-Chimie, 1962-Pace)

A fost angajat al Institututului de

Stiinta si Medicina in Palo Alto,California.

pr ieten cu Albert Einstein.

s-a dedicat chimiei cu scopul

de a ajuta umanitatea

Profesorul a fost considerat

campionul vitaminei C.


37/62

Reprezentarea schematica

a helixului prin 3 modele:A) Modelul cu bile si bete;

B) Modelul pangl ica;

C) Modelul cilindric

Moment de dipolin

helix

Structura -Helix


38/62

Diagrama Ramachandran pentru helixuri


39/62

Structura -pliata

1951 Pauling si Corey

Structura -pliata antiparalela Structura -pliata paralela

Structura -pliata mixta


40/62

Structura -pliata paralela Structura -pliata antiparalela

Structura -pliata


41/62

Structura

-pliata rasucita

A) Modelul cu bile si bete;

B) Modelul cu sageti;

C) Modelul cu sageti rotit cu 90

Structura -pliata


42/62

Keratina

Proteina stabila (punti disulfidice)

localizare

par

coarne

unghii

pene

Difractie cu raze X

2 lanturi polipeptidice

Structura superhelix ( eratina din par)


43/62

Colagenul

Proteina frecventa la vertebrate

localizare

oase

dinti

tendoane

matrici fibroase(piele)

continut

15-30% proline

3 lanturi -helix

Poli-L-prolina


44/62

Stanga - Fibre de colagen din

tendoanele aflate in gatul

unei pasari

Colagenul (2)

Dreapta-fibre de colagen din

coada unui soarece


45/62

Structuri supersecundare

Motivul

Michael Rossmann

Structura butoi TIM


46/62

Structura butoi TIM (rotatie 90 de grade)



47/62

N

C

b1 b2 b3 b4

a1,2 a2,3 a3,4

N

C

b1 b2b4 b3

a

1,2

a

3,4

Structura butoi Structura deschisa



48/62

N C

b1 b2b3b4

N C

b1 b2b3 b4

Motivul cheii grecesti


49/62

Motivul ruladei

Motivul

Structura proteinei umane

care leaga retinolul


50/62

Motivul


51/62

Determinarea structurii tertiare

Functiaproteinelor

Specificitateaenzimelor

Structuratertiara

Structuraprimara

Structura

3DDifractieraze X

RMN


52/62

Difractia cu raze X


53/62

Determinarea structurii proteinelor prin difractie cu raze X:1. Cristalizarea proteinei2. Imprestierea radiatiei X de catre planurile cristalului

3. Din diagrama de difractie este modelata harta densitatii electronice4. Contruirea unui model de proteina pe baza densitatii electronice

Difractia cu raze X


54/62

Harta densitatii electronice a complexuluiProteina talomera-ADN

Cristalografie cu raze XHarta tridimensionalade densitate electronica


55/62

Harta de densitate electronica a moleculelor

unghi de refractie mic Rezolutie modesta (5-6 )Forma

generala

Spoturi cu unghi

de refractie mai mare

Rezolutie medie (3,5 ) Traseu lantpolipetidic

Spoturi cu unghide refractie mai mare

Rezolutie medie (3 ) Catenalaterala

Spoturi cu unghide refractie mai mare

Rezolutie buna (2,5 ) Determinareapozitiei atomilor

0,4 Spoturi cu unghide refractie mai mare

cristal omogen

Rezolutie mare (1,9 ) Pozitia atomilor0,2


56/62

Harta densitatii electronice

Structura primara

Legaturiamidice

Resturi dincatena laterala

Structura tridimensionala

Structura quasistatica

rotatii vibratii

Harta de densitate electronica a moleculelor


57/62

Determinarea structuri i in solutie

Stingerea fluorescentei

Schimb izotopic (H-D)

RMN

Structuriflexibile

Dicroism circular

in solutie


58/62

Structura 3D

a proteinelor

Modele teoretice

Mecanisme de reactie

Similaritati structurale

Motivul Rossman Caseta de legarea nucleotidelor

alcool dehidrogenazalactate dehidrogenaza

MotivRossman


59/62

Structura cuaternara


60/62

Interactiuni dintre monomeri

NeuramidazatetramerAldolaza KDPGtrimer


61/62

Insulina hexamer Kinaza-octamer

Structura cuaternara


62/62

Nivele de organizare a proteinelor

Primara

Super-secundara

Secundara

Tertiara Cuaternara

Documents

bd-curs8-ppt bun 2