18

BAB III. METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan selama enam bulan, dari bulan Januari hingga

bulan Juni 2018 di Laboratorium Bioteknologi UMM, Laboratorium Biomed

Fakultas Kedokteran UMM, dan screenhouse yang terletak di Dusun Kasin, Desa

Ampeldento, Kecamatan Karangploso, Kabupaten Malang.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf, UV LAF, cawan

petri diameter 9 cm, gelas beaker, object glass dan cover glass, mortar-martil,

aluminium foil, plastik wrapping, hand sprayer, hand counter, pisau dan cutter,

pinset, cellspreader, jarum ose, hemositometer, vortex homogenizer, gelas ukur,

erlenmeyer, pipet mikro, botol kultur, tabung reaksi, kertas tisu, dan kertas label.

Bahan yang digunakan adalah media PDA, PDB, NA, dan LB, alkohol 70%,

MgCl2, methanol, kapas, akuades steril, pupuk organik cair (POC), serbuk

carborundum, pupuk kandang, dan top soil. Sampel tanaman yang dieksplorasi

adalah tanaman kedelai sehat yang diambil secara acak di kebun percobaan Balai

Penelitian Tanaman Aneka Kacang dan Umbi (Balitkabi) Malang. Jumlah sampel

tanaman kedelai sehat yang diambil berjumlah lima tanaman berumur 65 hari.

Adapun ekstraksi virus mosaik diambil dari tanaman kedelai umur 65 hari yang

menunjukkan gejala infeksi SMV di kebun percobaan Balitkabi Malang.

3.3 Variabel Penelitian

Variabel penelitian ini terdiri dari dua jenis, yaitu variabel bebas dan

variabel terikat. Variabel bebas yakni keanekaragaman mikroba endofit

19

indigenous pada bagian akar, batang, daun, polong, dan tanah sekitar perakaran.

Sedangkan variabel terikat terbagi atas intensitas serangan dan ketahanan

tanaman.

3.4 Rancangan Percobaan

Penelitian ini menggunakan metode eksplorasi. Adapun uji efektivitas

aplikasinya di screenhouse menggunakan rancangan acak kelompok (RAK)

sederhana. Perlakuan dengan cendawan endofit berjumlah 33 perlakuan ditambah

dengan dua perlakuan kontrol. Perlakuan yang ada diulang sebanyak dua kali

sehingga terdapat 70 unit percobaan. Perlakuan yang diberikan adalah kontrol

positif dengan pemberian POC (P1), kontrol negatif dengan tanpa perlakuan (P2)

dan perlakuan cendawan pada tiga tingkatan pengenceran (P3 s/d P35) yang

disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Kode Perlakuan Cendawan Endofit Indigenous

No. Kode Isolat

Kode Perlakuan-

Pada Tingkat Pengenceran

100 10

-1 10

-2

1 CKA1 P3 P14 P25

2 CKA2 P4 P15 P26

3 CKA3 P5 P16 P27

4 CKA4 P6 P17 P28

5 CKB1 P7 P18 P29

6 CKB2 P8 P19 P30

7 CKB3 P9 P20 P31

8 CKB4 P10 P21 P32

9 CKD1 P11 P22 P33

10 CKD2 P12 P23 P34

11 CKT P13 P24 P35

Keterangan : CKA1-4 = Isolat cendawan asal akar, CKB1-4 = Isolat cendawan asal Batang,

CKD1-2 = Isolat cendawan asal daun, CKT = Isolat cendawan asal tanah.

20

Denah penelitian untuk perlakuan dengan cendawan endofit digambarkan pada

skema berikut ini:

I II

P4 P1 P13 P2 P18 P4 P1 P13 P2 P18

P16 P22 P10 P29 P3 P16 P22 P10 P29 P3

P9 P24 P15 P25 P32 P9 P24 P15 P25 P32

P35 P5 P23 P11 P21 P35 P5 P23 P11 P21

P34 P28 P7 P20 P30 P34 P28 P7 P20 P30

P27 P19 P17 P26 P14 P27 P19 P17 P26 P14

P33 P6 P31 P8 P12 P33 P6 P31 P8 P12

Gambar 1. Denah Sampel Penelitian Dengan Perlakuan Cendawan Endofit

Perlakuan dengan bakteri endofit berjumlah sembilan perlakuan ditambah

dengan dua perlakuan kontrol. Perlakuan yang ada diulang sebanyak tiga kali

sehingga terdapat 11 unit percobaan. Kontrol positif adalah dengan pemberian

pupuk organik cair (POC) (P1), kontrol negatif dengan tanpa perlakuan (P2), dan

perlakuan bakteri pada tiga tingkatan pengenceran (P3 s/d P11). Kode perlakuan

bakteri dan denah penelitian berturut-turut disajikan pada Tabel 2 dan Gambar 5.

Tabel 2. Kode Perlakuan Bakteri Endofit Indigenous

No. Kode Isolat

Kode Perlakuan-

Pada Tingkat Pengenceran

10-1

10-2

10-3

1 BKP P3 P6 P9

2 BKA P4 P7 P10

3 BKT P5 P8 P11

Keterangan : BK P = Isolat bakteri asal polong, BK A = Isolat bakteri asal akar, BK T = Isolat

bakteri asal tanah

21

Denah penelitian untuk perlakuan dengan bakteri endofit digambarkan pada

skema berikut ini:

I II III

P1 P2 P1 P2 P1 P2

P3 P6 P3 P6 P3 P6

P9 P8 P9 P8 P9 P8

P11 P10 P11 P10 P11 P10

P4 P5 P4 P5 P4 P5

P7 P7 P7

Gambar 2. Denah Sampel Penelitian Dengan Perlakuan Bakteri Endofit

Keterangan :

1. Jarak antar baris adalah 20 cm,

2. Jarak antar ulangan adalah 40 cm,

3. I dan II merupakan ulangan perlakuan.

3.5 Metode Analisis Data

Hasil eksplorasi terhadap mikroba endofit indigenous dianalisis secara

deskriptif. Data pengujian di lapangan dianalisis dengan analisis varian (ANOVA)

menggunakan program Microsoft Office Excel 2010, kemudian uji lanjut Duncan

Multiple Range Test (DMRT) 5% untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap

variabel yang diukur.

3.6 Pelaksanaan Penelitian

3.6.1 Pembuatan Media

1. Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar). Kegiatan diawali dengan

menimbang 18 gram bubuk agar, 20 gram dextrose, dan 200 gram kentang

22

yang telah dipotong dadu. Kentang direbus dalam akuades 400 ml hingga

mendidih kemudian diangkat dan disaring untuk diambil sarinya. Setelah itu,

menambahkan 20 gram dextrose ke dalam sari kentang dan mengaduknya

hingga rata. Selanjutnya menambahkan akuades hingga 1000 ml dan

memanaskannya dengan api kecil, sambil memasukkan bubuk agar secara

perlahan lalu mengaduknya hingga homogen. Kemudian menambahkan 2

kapsul chloramphenicol sebagai antibakteri. Menuangkan larutan media PDA

ke dalam tabung Erlenmeyer untuk disterilkan pada autoklaf (suhu 121 ºC

selama 15 menit).

2. Pembuatan media PDB (Potato Dextrose Broth). Pertama, menimbang 20 gram

dextrose dan 200 gram kentang yang telah dipotong dadu. Kentang direbus

dalam akuades 400 ml hingga mendidih, kemudian diangkat dan disaring untuk

pengambilan sarinya. Selanjutnya, menambahkan 20 gram dextrose ke dalam

sari kentang dan mengaduknya hingga rata dan menambahkan akuades hingga

1000 ml. Kemudian menambahkan 2 kapsul chloramphenicol sebagai

antibakteri dan menuangkan larutan media PDB ke dalam tabung Erlenmeyer

untuk disterilkan di autoklaf (suhu 121 ºC selama 15 menit).

3. Pembuatan Media NA (Nutrient Agar). Bubuk NA sebanyak 28 gram yang

telah tersedia ditambahi akuades 1 liter, diaduk, dan dipanaskan. Pemanasan

dilakukan hingga semua serbuk terlarut dan tidak ada sisa kristal. Setelah itu,

menuangkan larutan media NA ke dalam tabung Erlenmeyer untuk disterilkan

pada autoklaf (suhu 121 ºC selama 15 menit).

4. Pembuatan media LB (Lysogeny Broth). Diawali dengan menimbang 10 gram

tripton, 10 gram NaCl, dan 5 gram yeast extract. Selanjutnya bahan ditambahi

23

akuades 1 liter, diaduk, dan dipanaskan. Pemanasan dilakukan hingga semua

serbuk terlarut dan tidak ada sisa kristal. Setelah itu, menuangkan larutan

media LB ke dalam tabung Erlenmeyer untuk disterilkan di autoklaf (suhu 121

ºC selama 15 menit).

3.6.2 Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi alat dan bahan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC dengan

tekanan 1.5 atm. Sterilisasi alat berlangsung selama 60 menit, sedangkan

sterilisasi bahan berlangsung selama 15 menit.

3.6.3 Isolasi, Purifikasi, dan Identifikasi Cendawan Endofit Indigenous

Isolasi diawali dengan sterilisasi bagian tanaman kedelai yaitu akar, batang,

daun, polong, serta tanah sekitar perakaran. Bagian tanaman yang telah diambil

dibersihkan dari kotoran dengan cara diuci pada air mengalir. Bagian tanaman

dipotong-potong 1 cm dan direndam dengan alkohol 70% selama satu menit.

Potongan bagian tanaman direndam kembali dengan larutan MgCl2 selama satu

menit, masing-masing pencucian dilakukan dengan dua kali ulangan. Kemudian

mencucinya dengan akuades steril selama satu menit dengan dua kali ulangan, dan

mengeringkannya dengan tisu steril. Bagian jaringan tanaman tersebut ditanam di

media PDA yang telah disiapkan sebelumnya. Adapun proses inkubasi dilakukan

selama tujuh hari hingga muncul koloni. Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan

biakan murni dengan memindahkan miselium yang tumbuh ke cawan petri yang

telah berisi media PDA. Adapun identifikasi cendawan dilakukan berdasarkan

penampakan mikroskopis. Identifikasi mikroskopis cendawan disesuaikan dengan

buku identifikasi Barnett dan Hunter (1999).

24

3.6.4 Isolasi, Purifikasi, dan Identifikasi Bakteri Endofit Indigenous

Isolasi diawali dengan melakukan sterilisasi bagian jaringan tanaman

terlebih dahulu. Setiap bagian tanaman dicuci dengan air mengalir, kemudian

direndam dengan alkohol 70% dan dengan larutan MgCl2, masing-masing selama

satu menit. Perendaman dilakukan dengan dua kali ulangan. Selanjutnya

mencucinya dengan akuades steril selama satu menit dengan dua kali ulangan, dan

mengeringkannya dengan tisu steril. Setiap bagian tanaman kedelai dihaluskan

dengan larutan methanol 70% dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm

selama 10 menit untuk memisahkan natan dan supernatan. Selanjutnya,

supernatan sebanyak 10 µl dipindahkan ke dalam cawan petri yang telah berisi

media NA. Purifikasi bakteri dilakukan dengan memindahkan koloni bakteri yang

telah tumbuh ke dalam cawan petri berisi media NA dengan metode zig-zag.

Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan penampakan makroskopis dan

mikroskopis. Identifikasi makroskopis bakteri disesuaikan dengan metode

pewarnaan Gramm, sedangkan identifikasi mikroskopis berdasarkan morfologi

bakteri.

Tahapan pewarnaan Gramm adalah sebagai berikut:

1. Menyiapkan object glass yang telah diberi isolat bakteri.

2. Meneteskan larutan kristal violet ke atas isolat bakteri, mendiamkannya

selama satu menit, dan membilasnya dengan air mengalir.

3. Meneteskan lugol ke atas isolat bakteri dan mendiamkannya selama satu

menit, kemudian membilasnya dengan air mengalir.

4. Meneteskan alkohol 96% selama 5-10 detik atau sampai dengan warna luntur,

kemudian membilasnya dengan air mengalir.

25

5. Meneteskan safranin ke atas isolat bakteri dan mendiamkannya selama 30

detik, kemudian membilasnya dengan air mengalir.

6. Mengeringkan object glass dengan kertas penghisap.

7. Mengamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x.

3.6.5 Uji Hipovirulensi

Uji hipovirulensi dilakukan dengan menggunakan tanaman mentimun, hal

ini dikarenakan tanaman mentimun dapat memberikan respon yang cepat terhadap

serangan patogen. Metode yang digunakan pada uji ini adalah menurut

Ichielevich-Auster et.al dalam Worosuryani et.al (2006) dengan modifikasi.

Permukaan benih mentimun disterilkan dengan alkohol 70% selama satu menit,

dilanjutkan dengan Clorox 2% selama 30 detik, lalu dibilas Akuades sebanyak

tiga kali, setelah itu dikering anginkan. Isolat murni cendawan ditanam pada

media PDA dalam botol kultur dan diinkubasi selama tiga hari. Selanjutnya, tiga

benih mentimun ditanam pada tiap-tiap biakan cendawan tersebut dan diinkubasi

selama 14 hari. Sedangkan untuk bakteri, tiga benih mentimun direndam dalam

suspensi tiap bakteri selama 2 jam lalu ditanam pada media NA dalam botol kultur

dan diinkubasi selama 14 hari. Kontrol dibuat dengan menaman benih pada media

tanpa penambahan cendawan dan bakteri. Pertumbuhan benih mentimun diamati

setiap hari. Indeks keparahan penyakit pada hasil perkecambahan mentimun

dideterminasikan dengan skor individual hasil modifikasi Worosuryani et.al

(2006) sebagai berikut:

DSI =

Keterangan :

26

DSI = Disease Severity Index (Indeks Keparahan Penyakit)

N = Nilai tingkat keparahan penyakit masing-masing individu

Z = Jumlah individu yang digunakan

Nilai Tingkat keparahan penyakit:

0 = Sehat dan tidak ada infeksi pada hipokotil,

1 = Satu atau dua bercak coklat muda <0,25 cm,

2 = Bercak coklat muda <0,5 cm dan area kebasahan <10% pada hipokotil,

3 = Bercak coklat muda sampai tua >1,0 cm dan kemudian bergabung

dengan bercak lainnya dan daerah kebasahan 10%<x<100% pada

hipokotil (daun belum layu dan hipokotil masih tegar dan putih,

4 = Hipokotil bercak hitam, daun layu, dan bibit mati.

Worosuryani et.al (2006) menyatakan bahwa isolat yang tidak

menyebabkan gejala penyakit atau menunjukkan gejala yang hanya sedikit

(DSI<2,0) pada perkecambahan mentimun dikategorikan sebagai isolat yang

bersifat hipovirulen. Sneh et.al (2004) juga telah mengklasifikasikan virulensi

isolat cendawan atas lima kategori berdasarkan nilai DSI dan gejalanya. Isolat

dengan nilai DSI 0-0.3 dikategorikan sebagai isolat tidak virulen atau bersifat

hipovirulen. Nilai DSI 0.4-0.9 dengan kategori virulensi rendah, 1-1.9 dengan

kategori moderat, 2-2.9 dengan kategori virulen, dan 3-4 dengan kategori sangat

virulen.

3.6.6 Penanaman dan Pemeliharaan Tanaman Uji

Pengujian ketahanan tanaman dilakukan pada tanaman kedelai varietas

Gepak Kuning. Balitkabi Malang (2016) melaporkan bahwa varietas ini tidak

27

memiliki ketahanan terhadap penyakit, sehingga cocok digunakan sebagai

tanaman uji. Gepak Kuning memiliki tipe percabangan agak tegak dengan tinggi

tanaman 55 cm dengan umur berbunga relatif cepat yakni 28 hari, sedangkan

umur polong masak adalah 73 hari. Benih kedelai ditanam dengan kedalaman 2

cm pada media semai. Bibit kedelai yang telah berumur 1 minggu setelah tanam

(MST) kemudian dipindahkan ke dalam polybag berukuran 30 cm x 30 cm. Media

tanam yang digunakan adalah berupa campuran tanah dan pupuk kandang dengan

perbandingan 1:3 (b/b). Tanaman dipelihara di screenhouse dan disusun sesuai

dengan denah percobaan dengan jarak 20 cm x 20 cm antar polybag.

Pemeliharaan tanaman meliputi penyiraman rutin setiap sore hari, pengendalian

gulma secara manual, dan pengendalian hama dengan pestisida jika ditemukan

ulat dan serangga.

3.6.7 Pembuatan Sari Perasan (sap) Virus Mosaik

Pembuatan sari perasan daun (sap) tanaman kedelai yang sakit bertujuan

mendapatkan virus mosaik. Sap digunakan untuk menginfeksi tanaman sehat yang

sebelumnya telah diinduksi mikroba endofit indigenous. Pembuatan sap dilakukan

dengan mengambil bagian tanaman yang mengandung konsentrasi virus yang

tinggi kemudian digerus menggunakan mortar-martil steril. Hancurnya sel-sel

tanaman tersebut menyebabkan lepasnya virus pada sap. Larutan buffer phosphate

digunakan untuk menstabilkan virus (Sastrahidayat, 2011). Larutan buffer

phosphate sebagai larutan inokulasi 0.01 M (pH 7) ditambahkan dengan

perbandingan 1 g daun terinfeksi virus tiap 5 ml larutan buffer phosphate

(1:5 b/v). Kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama

10 menit (Subekti et.al., 2006).

28

3.6.8 Perbanyakan Mikroba Endofit Indigenous

Perbanyakan mikroba endofit indigenous dilakukan dengan metode

suspensi. Suspensi dibuat dengan cara memanen spora cendawan yang diawali

dengan menuangkan media cair PDB steril sebanyak 10 ml ke dalam cawan petri

berisi biakan cendawan, menggeseknya dengan cellspreader, dan

memasukkannya ke dalam tabung reaksi. Suspensi cendawan dihomogenkan

menggunakan Vortex Homogenizer. Setelah itu, suspensi cendawan diinkubasi

selama tujuh hari pada shaker dengan kecepatan 150 rpm. Suspensi cendawan

awal diencerkan dengan tingkat pengenceran 100, 10

-1, dan 10

-2. Penghitungan

jumlah kerapatan spora cendawan menggunakan alat hemositometer dengan

bantuan fotomikroskop optilab. Pembuatan suspensi bakteri dilakukan dengan

mengambil biakan menggunakan jarum ose sebanyak 1-2 kali dan disuspensikan

ke dalam 10 ml media cair LB, lalu diinkubasi selama 24 jam. Suspensi bakteri

diencerkan dengan tingkat pengenceran 10-1

, 10-2

, dan 10-3

.

3.6.9 Penghitungan Kerapatan Populasi Spora Cendawan dan Sel Bakteri

Penghitungan kerapatan populasi spora cendawan dan sel bakteri per ml

larutan dilakukan menggunakan hemositometer dibantu dengan mikroskop

cahaya. Tahapan penghitungan dilakukan sebagai berikut:

1. Membersihkan hemositometer dengan alkohol 70% dan mengeringkannya

dengan kertas tisu.

2. Meletakkan cover glass di atas alat hitung.

3. Menambahkan ± 50 μ l suspensi sel mikroba (kira-kira 1 tetes) dengan cara

meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar

karena daya kapilaritas.

29

4. Memastikan bahwa ruangan penuh terisi dengan suspensi mikroba, ditambah

beberapa kelebihan dalam saluran di sampingnya. Membiarkan sejenak

sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).

5. Meletakkan alat hitung pada meja objek mikroskop, kemudian mencari

fokusnya pada perbesaran 40 x10.

6. Menghitung jumlah spora cendawan atau sel bakteri pada 5 kotak hitung.

Hasil perhitungan kemudian dimasukkan ke dalam rumus sebagai berikut

(Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya, 2009):

x 10

3

Keterangan:

A = Luas Kotak Hitung = 0.04 mm2 x 5 = 0.2 mm

2

B = Kedalaman Bidang Hitung = 0.1 mm

Faktor Pengenceran =

1.6.10 Inokulasi Mikroba Endofit Indigenous pada Tanaman Kedelai

Inokulasi mikroba endofit indigenous pada tanaman kedelai dilakukan

sebanyak tiga kali. Inokulasi cendawan pertama kali dilakukan dengan merendam

benih yang telah disterilisasi pada suspensi cendawan endofit selama 24 jam.

Inokulasi kedua dilakukan dengan menyiramkan suspensi cendawan endofit ke

sekitar perakaran bibit kedelai pada pertengahan fase vegetatifnya, yaitu pada 2

minggu setelah tanam (MST). Inokulasi ke tiga dilakukan dengan menyemprotkan

suspensi cendawan tersebut ke permukaan daun kedelai bagian bawah di akhir

masa pertumbuhan vegetatifnya, yaitu pada umur 4 MST. Kontrol pada masing-

30

masing inokulasi menggunakan akuades steril untuk perendaman dan penyiraman.

Adapun inokulasi bakteri endofit indigenous juga dilakukan sebanyak tiga kali,

yakni dengan merendam benih kedelai menggunakan suspensi bakteri selama dua

jam, menyiram bibit kedelai umur 2 MST dengan suspensi bakteri, dan

menyemprotkan suspensi bakteri ke permukaan daun bagian bawah pada bibit

kedelai umur 4 MST.

3.6.11 Infeksi Virus Mosaik dengan Metode Sap

Sari perasaan daun terserang virus (cairan sap) yang telah diperoleh

kemudian dioleskan pada daun muda yang sebelumnya sudah ditaburi atau dilukai

dengan serbuk karborundum. Aplikasi cairan sap dilakukan dengan cara

mengoleskannya pada permukaan daun bagian atas menggunakan kapas steril.

Subekti et.al (2006) menyatakan bahwa setelah pengolesan sap, segera dilakukan

pembilasan sisa-sisa cairan perasan yang masih melekat pada permukaan daun

tanaman uji menggunakan air mengalir.

1.6.12 Pengamatan Intensitas Serangan Virus dan Ketahanan Tanaman

Intensitas serangan atau infeksi virus pada tanaman kedelai ditentukan dengan

menggunakan rumus kerusakan mutlak sebagai berikut (Untung, 2010):

I =

x 100%

Keterangan:

I = Intensitas serangan (%)

A = Banyaknya daun yang rusak mutlak atau dianggap rusak mutlak.

B = Banyaknya daun yang tidak terserang (tidak menunjukkkan gejala

serangan).

31

1.6.13 Pengamatan Badan Inklusi Virus

Tanggap histologi pada tanaman yang terinfeksi virus adalah berupa

pembentukan badan inklusi di dalam sel. Adapun metode diagnosis virus

penyebab penyakit tanaman salah satunya adalah melalui pengamatan badan

inklusi virus. Pengamatan badan inklusi virus dilakukan berdasarkan metode yang

dijelaskan oleh Balai Karantina Pertanian (2009). Pengamatan badan inklusi virus

dilakukan dengan cara mengambil daun yang terinfeksi virus. Sampel daun

kemudian dipotong/diiris melintang setipis mungkin menggunakan silet. Irisan

tersebut kemudian diletakkan pada kaca objek dan diberi setetes metilen biru, lalu

ditutup dengan cover glass. Pengamatan badan inklusi virus dilakukan dengan

mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 kali.