ANEXO II

Microbiologa General

Facultad de Ciencias Exactas

ANEXO: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS

Funciones del oxgeno en la nutricin

Como elemento constituyente del agua y componentes orgnicos, el oxgeno es un componente universal de las clulas y se proporciona en grandes cantidades en el agua.

Sin embargo, muchos organismos requieren adems oxgeno molecular.

Se trata de organismos que dependen de la respiracin aerbica para cubrir sus necesidades energticas y en los que el oxgeno molecular funciona como agente oxidante terminal. Tales microorganismos se denominan aerobios obligados.En el otro extremo fisiolgico estn aquellos microorganismos que obtienen su energa mediante reacciones que no implican la utilizacin de oxgeno molecular y para los cuales esta forma qumica del elemento no acta como nutriente. Para muchos de estos grupos fisiolgicos el oxgeno molecular acta como txico celular o como inhibidor del crecimiento. Tales microorganismos son anaerobios obligados.

Han sido usados varios trminos, entre ellos aerobio obligado, anaerobio obligado, anaerobio aerotolerante, anaerobio facultativo y microaerfilo con el fin de subdividir las bacterias en base a su relacin con el oxgeno.

Estos trminos reflejan un espectro continuo de bacterias que no pueden tolerar el oxgeno hasta aquellas que lo necesitan para su crecimiento.

Los microorganismos anaerobios pueden ser clasificados en dos grupos principales:

l- Anaerobios obligados

ll-Anaerobios aerotolerantesCon fines prcticos consideremos las bacterias anaerobias obligadas como aquellas que no se multiplican en la superficie de un medio slido nutricionalmente adecuado, incubado en aire ambiental o en una incubadora de CO2 (que contenga 5-10% de CO2 en el aire).

Dentro de este grupo se establecen dos categoras:

l.a- Anaerobios obligados estrictos

Estos microorganismos desarrollan en superficies de agar expuestas a niveles de O2 de 0.03% como mximo.

l.b- Anaerobios obligados moderadamenteSon bacterias que desarrollan cuando se exponen a niveles de O2 de 2-8%.

El trmino anaerobio aerotolerante (grupo ll), es usado por algunos microbilogos para describir bacterias anaerobias que tendrn un crecimiento limitado o escaso en agar expuesto al aire ambiente o en incubacin con 5-10% de CO2, pero muestran buen crecimiento bajo condiciones anaerobias.

Los anaerobios facultativos crecen bajo condiciones anaerobias o aerobias determinadas.

Los microaerfilos requieren oxgeno como aceptor terminal, pero no desarrollan en la superficie de medios slidos con aire (21% de O2) y crecen con escaso desarrollo, si lo hacen, en condiciones anaerobias.

En el desarrollo de medios y sistemas para el cultivo de anaerobios deben ser considerados dos factores fundamentales que pueden afectar el crecimiento de los anaerobios en el laboratorio.

El ms importante es el efecto inhibidor del oxgeno atmosfrico y sus derivados txicos.

El segundo factor limitante es el potencial de oxidorreduccin (Eh) del medio de cultivo.

Resumiendo:

Aerobios obligados

Microaerfilo

Anaerobios facultativo

Anaerobio ObligadoEstricto

Moderadamente

Aerotolerante

Tolerancia al oxgeno

Probablemente sean mltiples las razones por las cuales los anaerobios varan en su tolerancia al oxgeno.

Una de las razones es que la tolerancia al O2 de muchos anaerobios obligados moderados depende de su produccin de enzimas superxido dismutasa, catalasas y peroxidasas, que son protectoras contra la toxicidad de los productos de oxidorreduccin.

Una teora muy difundida es que la exposicin al O2 produce una serie de reacciones, mediada por flavoprotenas, que llevan a la produccin del radical superxido (O2-), perxido de hidrgeno (H2O2) y otros productos de oxidorreduccin txicos:

Sustrato + O2( O2- + H2O2 + productos txicos

O2- + H2O2 ( OH- radical hidroxilo, potente oxidante biolgico

OH- + O2 ( 1O2 singlete

Ciertos microorganismos producen enzimas capaces de contrarrestar estos productos txicos, como la SUPERXIDO DISMUTASA y las CATALASAS.

Mediante la superxido dismutasa (SOD) se transforman los radicales superxido en oxgeno molecular y perxido de hidrgeno.

O2- + O2- +2H+ SOD H2O2 + O2

El perxido de hidrgeno se convierte inmediatamente en oxgeno y agua, mediante las catalasas.

2H2O2 Catalasa 2 H2O + O2

Otra enzima que destruye el perxido de hidrgeno es la PEROXIDASA, se diferencia de la catalasa en que no libera oxgeno en la reaccin.

H2O2 + 2H+ Peroxidasa 2 H2O

Potencial de oxidorreduccin (Eh)En la naturaleza el lmite superior de Eh es + 820 mv, que podra encontrarse en algunos ambientes con oxigenacin considerable.

En los tejidos humanos sanos con suministro sanguneo intacto prevalecen condiciones de oxigenacin y el potencial redox es de alrededor de + 150 mv.

En contraste, el lmite inferior de Eh en la naturaleza vara alrededor de 420 mv.

Un ambiente anaerobio o un medio de cultivo rico en hidrgeno podra tener ese Eh bajo. El intestino grueso de los humanos, que contiene enormes cantidades de anaerobios estrictos obligados, posee un Eh de alrededor de 250 mv.

Por lo tanto, para el cultivo de microorganismos anaerobios es esencial el mantenimiento de un bajo potencial redox.

Para tal objetivo se incorporan agentes reductores tales como tioglicolato y L-cistena.

Con el fin de analizar la relacin que existe entre Eh y el O2 sobre la supervivencia y crecimiento de las bacterias anaerobias fueron realizados numerosos estudios de los cuales pudieron extraerse importantes conclusiones.

Ha sido ampliamente demostrado que la extraccin del O2 de los medios de cultivo, para evitar su toxicidad, es ms importante que establecer un bajo Eh.

Por lo tanto, el rpido logro y mantenimiento de una baja tensin de O2 o la ausencia es un requerimiento esencial para el cultivo de anaerobios en sistemas anaerobios moderados, como la jarra de anaerobios o la cmara de guantes.

Medios de cultivos para bacterias anaerobias

El metabolismo anaerbico es menos eficiente que el aerbico para la obtencin de energa, por lo tanto los medios de cultivo deben ser ms ricos que los de uso comn para aerobios o anaerobios facultativos, adems requieren una incubacin ms prolongada.

Los medios empleados para la recuperacin de anaerobios deben incluir tipos no selectivos y enriquecidos.

Medios de cultivo no selectivos

Por lo general los anaerobios son bacterias muy exigentes. Se emplean medios complejos que llevan: hidrolizados de carne, peptonas, extracto de levadura, hemina, vitaminas, etc.

El medio requiere sustancias reductoras como tioglicolato, glucosa, cido ascrbico, cistena, hierro, etc.

Como ejemplos:

Medio de Schaedler

Caldo de soja triptona 10 gr

Peptona 5 gr

Extracto de levadura 5 gr

Dextrosa 5 gr

Cistena 0.4 gr

Hemina 0.1 gr

Tris Buffer 0.7 gr

Agar 15.5 gr

Agua destilada c.s.p.1000 ml

Ph7.6

Luego se suplementa con sangre desfibrinada al 5% y vitamina K 10 (g/ml.

Medio Tioglicolato enriquecido (MTE)Triptona 17 gr

Peptona de soja 3 gr

Dextrosa 6 gr

ClNa 0.5 gr

Tioglicolato de Na 0.5 gr

Agar 0.7 gr

L-cistena 0.25 gr

Sulfito de Na 0,1 gr

Hemina 5 gr

Solucin de resarzurina (0.01%) 4 ml

Agua c.s.p1000ml

PH 7.0

Luego de esterilizardo y enfriado se suplementa con 0.1 (g/ml de vitamina K y 10 mg/ml de NaHCO3.

Medios de cultivo selectivosPor lo general las muestras a procesar para el aislamiento de microorganismos anaerobios contienen mezclas de anaerobios obligados, facultativos y/o aerobios.

Las especies presentes en pequeas cantidades pueden pasar inadvertidas si se usan medios no selectivos.

Incorporando distintas sustancias a los medios mencionados anteriormente se obtienen diferentes medios selectivos. Agentes selectivos:

Violeta de genciana: elimina bacilos esporulados aerbicos.

Azida sdica: inhibe el crecimiento de bacilos Gram positivos esporulados aerbicos.

Fenil etil alcohol: inhibe bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos.

Neomicina: inhibe Gram negativas facultativas.

Vancomicina+Kanamicina: selecciona bacilos Gram negativos anaerobios.

Sistemas anaerobios para el cultivo de bacterias anaerobias

Estudios comparativos han demostrado que los siguientes sistemas son satisfactorios para el cultivo e incubacin de bacterias anaerobias.

1- Tcnica en jarra anaerobia

Con catalizador: a-Evacuacin-reemplazo

b-Mtodo del sobre generador de gas descartable

Sin catalizador: Fijacin del O2 por limaduras de Fe

2- Tcnica de la cmara anaerobia de guante

3- Tubos con pelcula de agar con siembra por estras en medios PRAS.

1- Tcnica en jarra anaerobia

Existen diferentes marcas en el mercado por ejemplo: Brewer, GasPak, Oxoid, Mclntosh, entre otras.

La jarra Oxoid, utilizada en el TP, es de policarbonato, tiene una capacidad de 3.5 lt, cerrada con una tapa de metal pesado y una abrazadera de metal.

El centro de la tapa tiene dos vlvulas Schrader y un manmetro.

Las vlvulas se utilizan en la tcnica de evacuacin-reemplzo (E/R).

En la parte interna de la tapa se ubica el catalizador.

La remocin del oxgeno ocurre por reaccin con el hidrgeno agregado al sistema en presencia del catalizador.

H2 + O2 catalizador H2El uso de un catalizador activo en cada sistema es importante.

La jarra de Brewer, ms antigua, utilizaba un catalizador de paladio en la tapa que tena que ser calentado con una corriente elctrica para ser activo.

La jarra GasPak usa un catalizador en fro compuesto de bolitas de almina cubiertas de paladio, que no requieren calentamiento.

El catalizador en fro es ms conveniente para usar y no tiene riesgo de explosin.

El catalizador en fro de paladio puede ser inactivado en la jarra por la produccin de SH2 u otros productos voltiles de las bacterias.

Se recomienda reemplazarlo por uno nuevo o uno reactivado cada vez que se utiliza la jarra.

Puede reactivarse mediante el calentamiento en estufa a 160-170C durante 2 horas. Luego se guarda en un secador.

En estos sistemas las condiciones anaerbicas se producen o bien utilizando un sobre generador de gases o mediante la tcnica de evacuacin-reemplazo.

En la tcnica de anaerobiosis por evacuacin-reeplazo se extrae el aire de la jarra hasta 51-61 mm Hg, luego se lava con corriente de N2. Este procedimiento se repite dos veces.

Por ltimo se llena la jarra con una mezcla anaerbica de N2:85%, CO2:5% e H2:10%.

En la tcnica del sobre generador de gases se emplean sobres conteniendo, por ejemplo, cido ctrico o tartrico, bicarbonato de sodio y borohidruro de sodio.

En el momento de utilizarse se corta el extremo del sobre y se hidrata con un volumen de agua, luego se cierra inmediatamente la jarra.

En el sistema se producen las siguientes reacciones:

C6H8O7 + NaHCO3 Na3(C6H5O7) + 3 H2O + 3 CO2

NaH4 B + 2 H2O NaBO2 + 4 H2El H2 generado reacciona con el O2 del aire, en presencia del catalizador produciendo H2O.

Dentro de la jarra se colocar un indicador de Eh, independientemente de la tcnica empleada. Para lo cual se encuentra en el comercio tiras de azul de metileno que en condiciones de anaerobiosis vira del azul al blanco.

Una alternativa consiste en colocar dentro de la jarra un tubo de ensayo con unos mililitros de una mezcla de azul de metileno + NaCO3 + glucosa.

El indicador es azul cuando est oxidado e incoloro cuando est reducido. El cambio de color ocurre alrededor de los +11 mv.

Conjuntamente con el viraje del indicador de Eh ocurre un calentamiento de la tapa de la jarra luego de los 40 minutos y se observa condensacin en la superficie interna dentro de los 25minutos.

La tcnica E/R resulta ms econmica que el generador de gas y permite que las condiciones de anaerobiosis se establezcan ms rpidamente.

En los sistemas sin catalizador la anaerobiosis se logra mediante Fe finamente dividido, cido ctrico, CO3Na2 y tierra silcea como soporte (Kit comercial Merck). En el momento de usar se humedece con un volumen de agua, el O2 del aire es fijado con avidez por el Fe dando los siguientes productos:

Fe(OH)2 + Fe(OH)3 + Fe2O3 + FeO + H2 + CO2

En breve tiempo se registra el descenso del O2, creando una atmsfera anaerbica rica en CO2.

La tcnica empleada en el TP es una adaptacin del Kit comercial.

Se utiliza lana de Fe embebida con una solucin cprica (CuSO4.5H2O al 0.5%, tween 80 0.25%, pH 2).

Como generador de CO2 se coloca un tubo conteniendo una solucin acuosa de KHCO3 y cido ctrico.

2-Cmara anaerobia de guante

Una cmara anaerobia de guante es un sistema anaerobio autoabastecido que permite procesar muestras y realizar la mayor parte de las tcnicas bacteriolgicas para aislamiento e identificacin de bacterias anaerobias sin exposicin al aire.

Pueden construirse de diferentes materiales, incluyendo acero, acrlico o fibra de vidrio. La ms ampliamente usada es la de plstico vinlico flexible.

Una vez adquiridas el funcionamiento de estas cmaras es econmico porque permiten el uso de medios convencionales y el costo de los gases es mnimo.

Los materiales se colocan y se retiran de una pre-cmara flexible. Las condiciones anaerobias se mantienen por una constante recirculacin de la atmsfera dentro de la cmara plstica (85%de N2. 10% de H2 y 5% de CO2) a travs de un catalizador de paladio en fro.

3-Medios PRAS en tubos arrolladosEsta tcnica utiliza medios PRAS: medios previamente reducidos y anaerbicamente esterilizados.

El medio se envasa en tubos con tapn de caucho butlico bajo gas libre de O2 y se esterilizan y mantienen en ambiente anaerbico.

Luego de esterilizados se enfran en una mquina giratoria lo que resulta en una capa fina de agar en la superficie interna de los tubos.

El sistema requiere el agregado de un agente reductor, como L-cistena en la frmula del medio de cultivo.

Todas las inoculaciones de estos medios sean lquidos o slidos se realizan bajo corriente de CO2.

Cada tubo con PRAS se convierte as en su propia cmara de cultivo anaerbico y puede ser colocado en un incubador de aire ambiental para su incubacin. Permiten la inspeccin de las colonias en cualquier momento sin la exposicin al O2.

Distribucin en la naturaleza de las bacterias anaerbicas.Las bacterias anaerbias estn ampliamente distribuidas en la tierra, pantanos, sedimentos de lagos y ros, ocanos, aguas residuales, alimentos y animales.

La mayor parte de estas hbitat tienen una tensin de oxgeno baja y un Eh reducido, resultantes de la actividad metablica de los microorganismos que consumen oxgeno a travs de la respiracin. Si el oxgeno no es reemplazado, se mantienen las condiciones anaerobias en el ambiente.

Importancia de las bacterias anaerobias

a- En bacteriologa clnica: los microorganismos anaerobios pueden dar cualquier tipo de infeccin, muchas de alta gravedad. Estos microorganismos pueden pasar inadvertidos, ya que lo ms comn es encontrarlos en cultivos mixtos.

b- En el control sanitario de alimentos: como ejemplos Clostridium perfringens y Clostridium Botulinun causan el deterioro de alimentos e intoxicaciones graves. En estos casos es necesario demostrar la presencia de la toxina, el aislamiento y la tipificacin del germen.

c- En la industria:

Fermentacin de hidratos de carbono, distintas especies del gnero Clostridium producen acetona, butanol e isopropanol. Actualmente, la sntesis qumica ha desplazado en parte al proceso microbiolgico.

Procesos fermentativos en los que se utilizan bacterias fermentativas y bacterias anaerobias estrictas.

B. metanognicas

An. estrictos

Hidratos de carbonos An. facultativas Ac. Grasos + alcoholes + CO2 + H2 CH4

Procesamiento y examen de una muestra para el aislamiento de bacterias anaerobias

El procesamiento mnimo debe incluir:

1- La observacin directa-Caractersticas microscpicas. Los frotis de las muestras deben ser examinadas previamente coloreados por la tcnica de Gram. Este paso es muy importante porque puede sugerir la presencia de bacterias anaerobias que se caracterizan por su coloracin irregular y pleomorfismo. Adems orientar sobre los medios selectivos a utilizar y servir como control de calidad, debiendo recuperarse todos los tipos morfolgicos en proporcin aproximada a la que se observ.

2- Siembra en medios slidos-Relacin con el O2.Se siembra: una placa de agar sangre en aerobiosis, otra en anaerobiosis una tercera placa en microaerofilia. La microaerofilia se logra colocando en un recipiente hermtico una vela encendida que al extinguirse dar una atmsfera con 4% de O2 y 5-10% de CO2 aproximadamente.

3- Siembra en medios lquidos. Los medios lquidos, como el tioglicolato, deben ser purgados antes de la siembra y suplementarse con vitamina K y CO3HNa.

Se inoculan con pipeta Pasteur llegando al fondo y sin introducir aire. Los medios de cultivo lquidos son considerados el respaldo de los medios slidos.

Los cultivos de bacterias anaerobias son de desarrollo lento, por lo tanto deben incubarse 48 hs. antes de la primera observacin.

Los cultivos negativos se mantienen en incubacin durante dos semanas con observaciones peridicas.

4- Aislamiento de las colonias desarrolladas. Deben verificarse la anaerobiosis y observar las caractersticas macroscpicas.

Realizar la observacin microscpica previa coloracin de Gram. Siembra en medios selectivos

5- Pruebas bioqumicas destinadas a la identificacin del microorganismo. Se recurre en primer lugar a un conjunto de pruebas bioqumicas que permiten la identificacin en grupos preliminares. Luego, dentro de cada grupo se procede a la identificacin definitiva. Existen en el comercio microsistemas completos para la identificacin de los anaerobios por ejemplo: API-20 y Minitek.

La identificacin de los anaerobios tambin puede llevarse a cabo mediante el anlisis de los productos metablicos de la fermentacin, cidos voltiles y no voltiles, por cromatografa lquido-gas.

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