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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
VALÉRIA ALVES FERNANDES
Avaliação do efeito do ácido úsnico sobre o perfil redox no
coração de mamíferos e em parâmetros da função cardíaca
SÃO CRISTÓVÃO
2013
ii
VALÉRIA ALVES FERNANDES
Avaliação do efeito do ácido úsnico sobre o perfil redox no coração de mamíferos e em parâmetros da função cardíaca
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal de Sergipe como requisito
para a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Fisiológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Lauton Santos
SÃO CRISTÓVÃO
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
F363a
Fernandes, Valéria Alves Avaliação do efeito do ácido úsnico sobre o perfil redox no
coração de mamíferos e em parâmetros da função cardíaca / Valéria Alves Fernandes ; orientadora Sandra Lauton Santos. – São Cristovão, 2013.
92 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) – Universidade Federal de Sergipe, 2013.
1. Coração. 2. Chagas, Doença de. 3. Antioxidantes. 4. Ácido úsnico. I. Santos, Sandra Lauton, orient. II. Título.
CDU 612.17:615.32
iv
___________________________________________________ Profa. Dra. Sandra Lauton Santos
(Presidente da banca)
___________________________________________________ Prof. Dra. Carla Maria Lins de Vasconcelos
(Membro externo)
___________________________________________________ Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo
(Membro interno - PROASA)
v
Dedico essa dissertação a todos os professores que
participaram, direta ou indiretamente, da minha formação.
Especialmente, à minha primeira professora, Fátima, da escola
infantil Carrossel. Certamente, ela jamais lerá essa dissertação,
mas foi essa professora a responsável pelo meu primeiro
contato com a educação.
vi
AGRADECIMENTOS
Acredito que agradecer é mais que um ato de humildade e reconhecimento à ajuda
prestada, é uma forma de expressar, em palavras e ações, o quanto a ajuda foi importante.
Pequenas ajudas prestadas, por pessoas bem intencionadas, podem passar despercebidas e o
agradecimento nunca é feito. Acontece todo o tempo e, muitas vezes, nos esquecemos de
simplesmente dizer ‘obrigado’. No meu caso, muitas pessoas contribuíram de forma direta e
indireta para que esta dissertação ficasse pronta e eu anseio conseguir me lembrar de todos e
expressar minha sincera gratidão.
A ajuda de alguns foi tão importante que em muitos momentos se tornou essencial e
indispensável. Sem muitos dos meus amigos e colaboradores essa dissertação jamais ficaria
pronta e eu jamais estaria escrevendo tais agradecimentos. Assim sendo, gostaria de agradecer
enormemente a todas as pessoas listadas abaixo, ansiando sempre, não deixar sequer uma
pequena ajuda passar despercebida.
Aprendi desde criança que as ações ensinam mais do que palavras, por causa disso
agradeço, primeiramente, a minha mãe, que sempre enfrentou os problemas com coragem,
sem se omitir ou fugir, e com isso me ensinou a ser forte e corajosa. Sempre a vi trabalhar
muito, sendo sempre preocupada com a qualidade do seu trabalho e, por isso, agradeço muito
por me ensinar a ser um pouquinho parecida com você nesse aspecto. Muito obrigada também
pelo seu apoio incondicional e por sempre acreditar em mim. Obrigada por me incentivar e
por confiar nas minhas decisões e julgamentos sem interferir, mesmo quando se sente ansiosa
e preocupada com as minhas escolhas.
Agradeço, principal e especialmente, a minha amiga e orientadora Sandra Lauton
Santos pela oportunidade de trabalho em conjunto ao longo desses anos, pela paciência e por
tanto me ensinar. Agradeço pelos conselhos, pelas conversas, pela amizade e por todas as
oportunidades de discutir não só sobre esse trabalho, mas também as discussões sobre ciência,
sobre as decisões futuras e a carreira acadêmica. Certamente sempre vou me lembrar de todos
os conselhos, mas principalmente me lembrarei de tudo que não foi dito e sim observado por
mim no dia a dia do laboratório, durante a realização dos experimentos e principalmente na
forma como fui orientada. Não tenho dúvidas de que sua orientação me guiou a fazer o
melhor mestrado possível e com certeza tudo que aprendi me auxiliará nas minhas próximas
escolhas no meio acadêmico. Muito Obrigada.
vii
Agradeço enormemente aos professores e pesquisadores Dr. Jader dos Santos Cruz,
Dr. Paulo Sérgio Lacerda Beirão, Dr. Steiner Côrtez, Dra. Virgínia Lemos Dr. Jorge Luís
Pesquero e Dra. Silvia Guatimosim do ICB – UFMG (Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais), por me acolherem em seus laboratórios e permitirem
a realização dos experimentos descritos nessa dissertação. Agradeço pela ajuda nos
experimentos, pela presteza, pelos conselhos, pelas conversas e pela oportunidade de discutir
meus resultados em seus grupos de pesquisa.
Agradeço muito ao professor Dr. Luciano Capettini, pela imensa ajuda durante a
realização de boa parte dos experimentos, pelas conversas, por todas as perguntas respondidas
prontamente, pela presteza, pela amizade e pela ajuda durante a análise e discussão de muitos
dos meus resultados.
Agradeço ao professor e pesquisador Dr. Adriano Antunes da Universidade Federal de
Sergipe pela preparação do complexo de inclusão de ácido úsnico/ -ciclodextrina utilizado
nessa pesquisa.
Agradeço ao professor e pesquisador Dr. André Talvani da Universidade Federal de
Ouro Preto pela concessão dos animais utilizados nessa pesquisa, pela paciência, pelos
conselhos, pela presteza e disponibilidade de ajudar e me socorrer todas as vezes que liguei
desesperada pedindo mais animais para um experimento extra.
Agradeço aos professores Dr. Thales Nicolau Prímola e Dr. José Antônio Natali da
Universidade Federal de Viçosa por permitir a realização dos experimentos de contratilidade
celular em seu laboratório.
Agradeço muitíssimo a aluna de doutorado Aline Lara, por todas as noites de
experimentos no confocal, pelos finais de semana no ICB, pela presteza, pelos conselhos, pela
oportunidade de discutir meus resultados e pela amizade. Certamente sem sua ajuda, em todos
os momentos que precisei essa dissertação não estaria pronta. Muito obrigada.
Agradeço a todos os queridos colegas do Eletrocel, LAMEX e Farmacologia que
sempre me ajudaram e me ensinaram durante os meses que realizei os experimentos no ICB -
UFMG
Agradeço ao Centro de Aquisição e Processamento de Imagens – CAPI – ICB/UFMG.
Agradeço aos professores e queridos colegas do Laboratório de Biofísica do Coração,
no Departamento de Fisiologia – UFS, pela receptividade, pela amizade, por me acolherem no
laboratório e pelo apoio.
Agradeço aos meus colegas de mestrado Thássio Ricardo Ribeiro Mesquita e José
Evaldo Meneses Filho e ao aluno de Iniciação Científica Michel Santana pela ajuda no início
viii
dos experimentos em Belo Horizonte, pelas conversas, pela amizade e principalmente pela
paciência durante quase todas as minhas crises de TPM.
Agradeço ao meu amigo Lucas Ferreira da Silva pela amizade de tantos anos, pelas
conversas intermináveis, pelos conselhos, por sempre me ouvir e principalmente pela criação
do programa de análise de imagem, sem o qual as análises dos experimentos no confocal
teriam sido imensamente penosas e complicadas.
Agradeço aos amigos de longa data: Camila, Carolina, Tamires, Leandro e Michelle
que tanto auxiliaram com sua amizade e companheirismo ao longo de minha formação
pessoal e acadêmica. Obrigada por sempre se fazerem presentes, mesmo com a distância, a
minha falta de tempo e às vezes a minha falta de bom humor e assuntos interessantes.
Agradeço ao meu padrasto Romério Ferreira de Assis, que sempre me socorre, não
importa a que hora do dia ou da noite. Obrigada por estar sempre presente e sempre disposto a
me ouvir, mesmo sem entender bem do que se trata.
Agradeço aos meus professores e colegas de mestrado do PROCFIS pelo apoio, pela
hospitalidade em Aracaju e pelos ensinamentos. Aprendi muito com todos e só tenho a
agradecer.
Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas (PROCFIS) da
Universidade Federal de Sergipe (UFS) por permitir e me auxiliar na realização deste projeto.
Agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação do
Amparo à Pesquisa do Estado de Sergipe (FAPITEC) por terem financiado este trabalho.
ix
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original. ”
Albert Einstein
x
RESUMO
Avaliação do efeito do ácido úsnico sobre o perfil redox no coração de mamíferos e em parâmetros da função cardíaca. Valéria Alves Fernandes. São Cristovão, Sergipe. 2013
O ácido úsnico (AU) é um metabólito secundário de liquens, descrito na literatura como um componente com efeito antibiótico, antifúngico, antiviral, anti-inflamatório, antiproliferativo e antiparasitário. Sendo essa substância apontada na literatura como um composto capaz de ter atividade anti Tripanosoma cruzi. Neste trabalho o AU foi utilizado com o objetivo de estudar o potencial efeito antioxidante bem como potenciais efeitos sobre a contratilidade cardíaca e dinâmica do cálcio intracelular. Para isso, após exposição, in vitro, ao AU, foram realizados experimentos para avaliar a viabilidade celular via MTT em células endoteliais humanas. Em células cardíacas isoladas foram analisados o transiente intracelular de cálcio, a contratilidade celular, a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), ânion superóxido e óxido nítrico (NO). O efeito do tratamento oral com AU em camundongos C57Bl6J foi avaliado pela mensuração da peroxidação lipídica, experimentos para a análise da função cardíaca (utilizando-se a técnica de Langendorff), cinética enzimática a fim de avaliar a atividade total da superóxido dismutase (SOD) e catalase. Para avaliar a expressão das enzimas: óxido nítrico sintase (NOS), superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase (GPx) e NADPH oxidase foi utilizada a técnica de western blot. Para avaliar se o tratamento oral com AU alteraria os parâmetros da função cardíaca e o perfil redox em camundongos infectados com Tripanosoma cruzi, foram utilizadas a técnica de Langendorff, a mensuração da atividade total da SOD e a peroxidação lipídica. Os resultados de viabilidade celular mostraram que o AU não foi citotóxico nas concentrações estudadas (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1
, após 24 horas de exposição. A contratilidade celular e o transiente celular de cálcio não foram alterados após exposição, in vitro, ao AU. Por outro lado, o AU em cardiomiócitos isolados promoveu a diminuição dos níveis de H2O2 (CTR = 564.3 ± 72, n=88 e AU = 514,3 ± 60, n=87), ânion superóxido (citoplasma: CTR = 231,7 ± 42 e AU = 144,2 ± 56,3, n=67; ***P<0,001; núcleo: CTR = 675,8 ± 101,5 e AU = 614,2 ± 133,4, n=60; *P<0,05) e NO (CTR = 591,8 ± 63,7, n=85 e AU = 514,3 ±72,3, n=94). O tratamento oral não influenciou os parâmetros cardíacos avaliados dos camundongos hígidos e chagásicos. Entretanto, o tratamento com AU se mostrou antioxidante, induzindo a diminuição da peroxidação lipídica (No coração: CTR 0,0438 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=9 e AU = 0,0180 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=8. e no fígado CTR= 0,0145 ± 0,021 nmol MDA min-1.mg proteína1, n=8 e AU = 0,004 ± 0,022 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=9) e foi também detectado aumento da atividade da SOD (CTR = 7,98 ± 2,5 unidades/mg de proteína e AU =25, 02 ± 4,5 unidades/mg de proteína) aumento da expressão da SOD e GPx e diminuição da expressão da eNOS e NADPH oxidase no coração. A atividade da catalase (CTR = 1,37 ± 0,77 AE. min-1.mg proteína-1 e AU = 0,45 ± 0,22 AE. min-1.mg proteína-1) se mostrou diminuída e sua expressão não foi alterada no coração. A expressão da nNOS também não foi alterada no coração. Em conclusão nossos resultados sugerem que o AU é uma substância capaz de promover a redução do perfil oxidativo, tanto em células isoladas expostas a ele, in vitro, bem como, após o tratamento por via oral. E, do ponto de vista cardíaco, o AU não promove alterações nos parâmetros contráteis analisados (tensões sistólica e diastólica), bem como, na frequência cardíaca e na mobilidade do cálcio, o que indica que o essa substância pode ter potencial terapêutico como substância antioxidante no coração e potencial terapêutico na doença de Chagas.
xi
Palavras chave: ácido úsnico, coração, antioxidante, doença de Chagas.
xii
ABSTRACT
Evaluation of usnic acid effects on redox profile and cardiac function parameters in the mammalian heart. Valéria Alves Fernandes. São Cristovão, Sergipe. 2013
The usnic acid AU is a secondary metabolite of lichens described as a component with antibiotic, antifungal, antiviral, anti-inflamattory, antiproliferative and antiparasitic effects. Previous studies reported that this substance has anti Tripanosoma cruzi activity. Therefore, the aim of this study was evaluate the antioxidant potential on heart, intracellular calcium dynamic and cardiac contractility effects of the usnic acid. After exposure, in vitro, to the AU, experiments were performed to assess cell viability in human endothelial cells In isolated cardiomyocytes of rats were analyzed the intracellular calcium transient, cell contractility and the production of hydrogen peroxide (H2O2), superoxide and nitric oxide (NO). After oral treatment in C57Bl6J mice with AU, were performed lipid peroxidation tests, contractility experiments (Langendorff technique), western blot to nitric oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) e NADPH expressions. Enzyme kinetics was used to measure total activity of superoxide dismutase and catalase. Oral treatment with AU was performed in infected mice with Trypanosoma cruzi. The results of cell viability showed that AU was not cytotoxic, after 24 hours exposure. The cellular contractility and intracellular calcium transient were not altered after exposure in vitro to AU. Moreover, usnic acid in isolated cardiomyocytes promoted decrease in the levels of H2O2 (CTR = 564.3 ± 72, n=88 e AU = 514,3 ± 60, n=87), superoxide and NO superóxido (citoplasm: CTR = 231,7 ± 42 e AU = 144,2 ± 56,3, n=67; ***P<0,001; nuclei: CTR = 675,8 ± 101,5 e AU = 614,2 ± 133,4, n=60; *P<0,05) e NO (CTR = 591,8 ± 63,7, n=85 e AU = 514,3 ±72,3, n=94). Oral treatment had no effect on cardiac contractility of healthy and chagasic mice. However, treatment with AU showed antioxidant, inducing decrease in lipid peroxidation (heart: CTR 0,0438 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=9 and AU = 0,0180 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=8. In liver CTR= 0,0145 ± 0,021 nmol MDA min-1.mg protein1, n=8 and AU = 0,004 ± 0,022 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=9) and increased SOD activity in the heart and liver (CTR = 7,98 ± 2,5 unity/mg protein and AU =25, 02 ± 4,5 unity/mg protein), increased SOD and GPx expression and decreased eNOS and NADPH oxidase expression in a heart. The catalase activity showed decreased (CTR = 1,37 ± 0,77 AE. min-1.mg protein-1 and AU = 0,45 ± 0,22 AE. min-1.mg protein-1) and has no change in expression in a heart. The nNOS expression was not altered in a heart. In conclusion data showed suggest the AU was able to promote antioxidant effects in both experiments (in vitro and in vivo). In cardiac parameters, the AU have no changes in contract values (systolic and diastolic tension), hear rate and calcium mobility. Therefore, the AU have an antioxidant action in a heart and therapeutic potential in a Chagas disease.
Keywords: usnic acid, heart, antioxidant, Chagas disease.
xiii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Acoplamento Excitação Contração 3
Figura 2. Esquema da geração de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio
5
Figura 3. Reação de Fenton e interação Haber-Weiss 7
Figura 4. Representação esquemática de uma célula cardíaca sobre ação de
ROS
8
Figura 5. Ciclo natural do T. Cruzi 15
Figura 6. Estrutura química do ácido úsnico (C18H16O7) 19
Figura 7. Representação esquemática da difusão do ácido úsnico (AU)
através da matriz mitocondrial e a formação de ânion usniato (AU-)
21
Figura 08. Viabilidade Celular 37
Figura 09. Contratilidade celular 38
Figura 10. Transiente intracelular de cálcio em cardiomiócitos isolados de
ratos
39
Figura 11. Transiente intracelular de cálcio em cardiomiócitos isolados de
camundongos
40
Figura 12. Medida da produção de óxido nítrico 41
Figura 13. Produção de espécies reativas de oxigênio 42
Figura 14. Produção de ânion superóxido 43
xiv
Figura 15. Níveis peroxidação lipídica medida por TBARS em Fígado de
camundongo
44
Figura 16. Expressão de Oxido Nítrico sintases (NOS). 45
Figura 17. Atividade e expressão da superóxido Dismutase (SOD). 46
Figura 18. Expressão da NADPH oxidase no miocárdio de camundongos
controle (CTR) e tratados com ácido úsnico (AU) e abaixo as imagens
representativas de western blot.
46
Figura 19. (A) Atividade total da enzima catalase, (B) expressão da
enzima catalase e (C) expressão da Glutationa peroxidase (GPx) no coração
de camundongos controles e tratados com AU.
47
Figura 20. Avaliação da função cardíaca em coração isolado de
camundongos. (A) Variação da tensão diastólica, (B) Variação da tensão
sistólica, (C) Avaliação da frequência cardíaca e (D) Avaliação da pressão
de perfusão.
49
Figura 21. Avaliação da função cardíaca em coração isolado de
camundongos chagásicos. (A) Variação da tensão diastólica, (B) Variação
da tensão sistólica, (C) Avaliação da frequência cardíaca e (D) Avaliação
da pressão de perfusão.
50
Figura 22. Níveis de peroxidação lipídica. (A) C oração de camundongos
chagásicos tratados com ácido úsnico (AU) e (B) fígado de camundongos
chagásicos tratados com AU.
51
Figura 23. Atividade da enzima superóxido dismutase total (A) no coração
de camundongos chagásicos e tratados com AU (n=6) e (B) no fígado de
camundongos controles e tratados com AU
52
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
[Ca]i: concentração de cálcio intracelular
Acetil-CoA: acetil-coenzima A
Acil-CoA: acil-coenzima A
AEC: acoplamento excitação contração
ATP: adenosina trifosfato
AU: ácido úsnico
BG-250: Coomassie brilliant blue
Cai: cálcio intracelular
CaMII: calmodulina cinase II
CAT: catalase
Cav-3: caveolina-3
CTR: controle
DAF-AM: 3-Amino, 4-aminomethyl-2′,7′-difluorofluoresceina
DCF: 2,7-diclorofluoresceina
DCFH: 2,7-Dichlorofluoresceina diacetato
DHE: dihidroetidio
DMSO: dimetil sulfoxido
DNA: ácido desoxiribonucleico
DNP: 2,4-dinitrofenol
ECG: ecocardiograma
eNOS: óxido nítrico sintase endotelial
ET-1: endotelina 1
GPx: glutationa peroxidase
GR: glutationa redutase
GSS: s-glutationilação
GSSH: glutationa dissulfeto
H2DCFH-DA: 2,7-diclorodihidrofluoresceína-diacetato
IC50: Concentração inibitória de 50%
iNOS: óxido nítrico sintase induzida (i-NOS).
xvi
LPS: lipopolissacarídeo
MMP: metaloproteinase
MMP-2: metalloproteinase 2
MTT: [3-(4,5-dimethyl thiazol-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide]
NADPH: Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina
Nai: sódio intracelular
NCX: trocador sódio-cálcio
nNOS: óxido nítrico sintase neuronal
NOS: óxido nítrico sintase
NOX 1: isoforma 1 da Nadph oxidase
NOX 2: isoforma 2 da Nadph oxidase
NOX 4: isoformas 4 da Nadph oxidase
OMS: organização mundial de saúde
PA: potencial de ação
PBN: fosfolamban
PBS: solução salina tamponada com fosfato
PKA: proteína cinase A
PLB: fosfolambam
PMSF: fluoreto de fenilmetilsilfonila
RNS: espécies reativas de nitrogênio
ROS: espécies reativas de oxigênio
RPM: rotações por minuto
RS: retículo sarcoplasmático
RyR 2: receptor de rianodina
SDS: dodecil sulfato de sódio
SERCA2A: cálcio-ATPase do subtipo 2A
SNO: s-nitrosilação
SOD: superóxido dismutase
T. cruzi: Trypanosoma cruzi
TBA: ácido tiobarbitúrico
TBARS: substâncias reativa ao ácido tiobarbitúrico
TBS: solução tampão tris
TTH: tampão Tyrode-HEPES
XOR: xantina oxidorredutase
xvii
xviii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1 O coração e seu funcionamento ................................................................................ 1
1.2 Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio ............................................................... 4
1.3 Estresse oxidativo e modulação redox no coração .................................................. 7
1.4 Modulação Redox em Modelos de Doenças Cardíacas. ....................................... 12
1.5 A doença de Chagas e no coração ........................................................................... 13
1.6 O estresse oxidativo na doença de Chagas ............................................................. 16
1.7 Ácido Úsnico ............................................................................................................. 18
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 24
2.1 Objetivo geral ................................................................................................................ 24
2.1 Delineamento Experimental ........................................................................................ 24
3. MÉTODOS .......................................................................................................................... 26
3.1 Hidrossolubilização do ácido úsnico ...................................................................... 26
3.2 Cultura de células e viabilidade celular ................................................................. 26
3.3 Animais utilizados .................................................................................................... 27
3.4 Grupos experimentais .................................................................................................. 27
3.5 Obtenção do coração isolado .................................................................................. 28
3.6 Obtenção das células ventriculares cardíacas ....................................................... 28
3.7 Contratilidade celular .............................................................................................. 29
3.8 Medidas do transiente de cálcio intracelular ........................................................ 30
3.9 Medida dos níveis intracelulares do óxido nítrico ................................................ 30
3.10 Medida dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio .................. 31
3.11 Medida dos níveis intracelulares do radical ânion superóxido ........................ 31
3.12 Contratilidade cardíaca (órgão isolado) ............................................................. 32
3.13 Preparação do tecido para as análises enzimáticas ........................................... 32
3.14 Determinação da concentração total de proteínas ............................................ 33
3.15 Determinação da atividade da catalase .............................................................. 33
3.16 Determinação de peroxidação lipídica pelos níveis de TBARS ....................... 34
3.17 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD) ........................... 34
3.18 Determinação da expressão proteica por western blot ..................................... 35
3.19 Análise estatística ................................................................................................. 36
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 37
4.1 Avaliação da toxicidade do ácido úsnico ................................................................ 37
xix
4.2 Contratilidade celular e transiente intracelular de cálcio .................................... 38
4.2 Medidas das espécies reativas de nitrogênio e oxigênio ....................................... 41
4.3 Peroxidação lipídica ................................................................................................. 43
4.4 Expressão das NOS totais no tecido cardíaco ....................................................... 44
4.5 Medida do perfil redox no tecido cardíaco ............................................................ 45
4.6 Experimentos com camundongos chagásicos ........................................................ 47
4.6.1 Avaliação de parâmetros cardíacos em sistema de Langendorff ........................ 47
4.6.2 Peroxidação lipídica ........................................................................................... 51
4.6.3 Atividade total da SOD ...................................................................................... 51
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 53
7. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 62
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 63
ANEXOS ................................................................................................................................. 73
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 O coração e seu funcionamento
O coração pode ser definido como uma bomba muscular oca, provida de válvulas
dinâmicas, que move o sangue através de um circuito contínuo. Este é dividido em duas
partes: o ápice, que contém as paredes ventriculares e a base, a qual contém a maioria das
artérias e veias que permitem a entrada e saída de sangue (BERNE e LEVY, 2000).
A função contrátil cardíaca é regulada e mantida graças à geração e condução do
estímulo elétrico, o qual permite regular a força e a frequência dos batimentos cardíacos
(BERS, 1991). O sistema excitocondutor cardíaco é composto pelo nodo sinoatrial, pelas vias
atriais internodais, pelo nodo atrioventricular, pelo feixe de His e suas ramificações, e pelo
sistema de Purkinje. O nodo sinoatrial é responsável pelo início do sinal elétrico, e os demais
componentes são responsáveis por conduzir tal sinal pelo coração (KATZ, 1992; FUSTER et
al., 1998; BERNE e LEVY, 2000).
A contração cardíaca permite impulsionar o sangue através do corpo, promovendo o
transporte e a distribuição de nutrientes e outras substâncias para todos os tecidos e o
direcionamento de resíduos do metabolismo para os sistemas excretores (BERNE e LEVY,
2000). O fenômeno da contração cardíaca pode ser mais bem compreendido a partir do
conhecimento da fisiologia contrátil dos cardiomiócitos e dos componentes estruturais
envolvidos neste processo.
A alteração brusca na permeabilidade de íons através da membrana plasmática permite
que ocorram mudanças significativas no potencial de repouso da célula cardíaca, gerando o
potencial de ação (PA) e consequente contração celular (BERS, 1991). A contratilidade
celular cardíaca é regida por um rígido controle da concentração de cálcio intracelular ([Ca]i).
O mecanismo básico de ativação da maquinaria contrátil celular pelo PA ocorre, inicialmente,
pela ativação dos canais iônicos sensíveis à voltagem presentes na membrana plasmática
celular, sendo que a abertura de canais para cálcio de tipo L permite o influxo de cálcio (Ca2+)
no miócito cardíaco (BERS, 1991).
2
A principal organela que estoca o cálcio intracelular (Cai) é o retículo sarcoplasmático
(RS). No RS são encontrados receptores, canais e proteínas, que regulam a entrada e a saída
de Ca2+ desse compartimento. O efluxo de Ca2+ do RS durante a contração celular ocorre
através do canal para cálcio denominado receptor de rianodina (RyR), presente na membrana
da organela (BERS, 1991).
Na membrana do RS também é encontrada uma bomba, denominada cálcio-ATPase
do retículo sarcoplasmático, conhecida como SERCA, sendo, nas células do coração, do
subtipo 2A (SERCA2A). Esta promove, com gasto de ATP, a recaptação de Ca2+ para dentro
do RS durante o processo de diástole. A SERCA possui 10 domínios transmembrana e um
sítio que é alvo de uma fosfoproteína denominada fosfolamban (PLB), que regula a sua
atividade (BERS, 1991). O PLB é um inibidor endógeno da SERCA. Essa fosfoproteína pode
ser fosforilada pela proteína cinase A (PKA) ou pela calmodulina cinase II (CaMII). A
fosforilação da PLB promove a sua dissociação da SERCA, tornando a atividade da bomba e
a recaptação de Ca+2 aceleradas, enquanto a desfosforilação da PLB é capaz de inibir a
SERCA (JONES e FIELD, 1993).
Na membrana da célula cardíaca existe também um transportador iônico, que trabalha
sem gasto de ATP, denominado trocador sódio-cálcio (NCX). O trocador Na+/Ca2+ é um
transportador que pode ser regulado, tanto pelo [Ca]i quanto pela [Na]i, em sítios específicos.
Em situações fisiológicas, este trocador transporta Ca2+ para o lado de fora da célula e Na+
para o interior da membrana da célula cardíaca. (BERS, 1991; BOUCHARD, 1993).
O fenômeno em que o PA é capaz de induzir a célula cardíaca à contração é
denominado de acoplamento excitação contração (AEC). Este acoplamento eletromecânico é
um dos principais mecanismos responsáveis pelo funcionamento adequado da contratilidade
celular (BERS, 2002). (figura 1).
3
Figura 1. Acoplamento Excitação Contração. O esquema mostrado representa uma célula ventricular cardíaca, onde vemos representados componentes moleculares e organelas envolvidos no processo de contração celular. O cálcio (Ca+2) que entra pelos canais de cálcio do tipo L (ICA) sensibiliza os receptores de rianodina (RyR) presentes no retículo sarcoplasmático (SR). Esse Ca+2 se liga a proteínas presentes nos miofilamentos (Myofilaments) e promove a contração celular. Após os miofilamentos perderem a sensibilidade o cálcio, este é recaptado pela cálcio-ATPase, denominada SERCA, representada pelas duas subunidades (ATP + PLB). O fosfolamban (PLB) é subunidade que regula a atividade da SERCA. Vemos também representados o trocador sódio-cálcio (NCX) e as ATPases de membrana (bomba de sódio e potássio), bem como a mitocôndria, essas três estruturas também auxiliam na do cálcio citoplasmático após a contração. Observa-se também o gráfico do decurso temporal do potencial de ação cardíaco (AP (Em)), representado em traçado preto, o aumento da concentração intracelular de cálcio ([Ca]i), representado em traçado azul e a contração cardíaca (Contraction), representado pelo traçado pontilhado vermelho. (adaptado de BERS, 2002).
O AEC é o processo onde, durante o potencial de ação cardíaco, ocorre o influxo de
Ca2+ pelos canais iônicos para Ca2+ tipo L, sensíveis à voltagem. O Ca2+ que entra na célula
sensibiliza os RYRs, liberando os estoques de Ca2+ do RS. A combinação do influxo e a
liberação de Ca2+ faz aumentar a [Ca2+]i. Esse Ca2+ livre se liga aos miofilamentos (troponina
C) ativando a maquinaria contrátil da célula (BERS, 2002).
Para que o relaxamento ocorra é necessário que o Ca2+ se desligue da troponina C e
que a [Ca2+]i decline. O que ocorre é uma dessensibilização natural da troponina C ao Ca2+ e à
4
medida que esse íon passa a estar novamente livre no citoplasma, ele é recaptado pela SERCA
e removido pelo NCX e sistemas lentos (ATPase do sarcolema) e mitocôndrias. A quantidade
de Ca2+ removido do citosol celular durante o relaxamento deve ser a mesma que a quantidade
de Ca2+ que entra na célula a cada batimento cardíaco, caso contrário, a célula teria um ganho
ou uma perda de Ca2+ a cada contração celular (BASSANI, 1994; BERS, 2002).
A atividade da SERCA é maior no ventrículo de rato que no ventrículo do coelho
(devido a uma maior concentração de moléculas da bomba no coração do coelho), o que
resulta no fato que, em corações de ratos, a SERCA é responsável por recaptar 92% do cálcio,
sendo o NCX responsável por remover 7% do cálcio e o 1% restante é removido do citosol
pelos sistemas lentos (BASSANI, 1994; BERS, 2002).
É bem conhecido na literatura que todos os componentes do AEC, bem como o
metabolismo celular cardíaco podem ser modulados por espécies reativas de oxigênio (ROS)
e nitrogênio (RNS) (ZENG et al., 2008; AKKI et al., 2009; SANTOS et al., 2011). O
aumento ou diminuição do perfil oxidativo, bem como a diminuição das espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio podem induzir efeitos deletérios, protetores ou efeitos de
remodelamento cardíaco pós-injúria (WANG et al., 2005; SANTOS et al., 2011). Assim
sendo, é interessante compreender como o estresse oxidativo e a modulação redox
influenciam os componentes celulares no coração.
1.2 Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio
Em condições fisiológicas, as espécies reativas de oxigênio (ROS) e as espécies
reativas de nitrogênio (RNS) são produzidas através das reações de transferência de elétrons
no metabolismo aeróbico e atuam nas mais diversas funções das células eucarióticas (CLARK
e LAMBERTSEN, 1971; CRYSTAL, 1991; KOWALTOWSKI, 2009).
Dentre os principais metabólitos do oxigênio estão o radical ânion superóxido (•O2-), o
peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical hidroxila (OH), o oxigênio singlet (1O2) e o ácido
hipocloroso (HOCl). As RNS são derivadas diretamente do óxido nítrico (NO) e as mais
significantes em sistemas biológicos são o peroxinitrito (ONOO-) e o ácido peroxinitroso
(ONOOH) (PRYOR, 1986; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; GRIENDLING E
FITZGERALD, 2003).
5
A produção de ROS e RNS no coração, bem como, em qualquer outro tecido, pode ser
relacionada à atividade de diversas enzimas, dentre estas, podem ser afetadas enzimas tanto
pró-oxidantes quanto as antioxidantes. Podemos observar na figura 2, um esquema mostrando
a geração de ROS E RNS, bem como as enzimas antioxidantes e pró-oxidantes envolvidas na
produção dessas espécies reativas (GRIENDLING e FITZGERALD, 2003).
Figura 2. Esquema da geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Podemos observar a conversão do oxigênio (O2) em ânion superóxido (•O2
-) pelas enzimas NADPH oxidase (processo que ocorre principalmente na mitocôndria). O •O2
- é dismutado pela superóxido dismutase (SOD), formando peróxido de hidrogênio (H2O2), que pode ser convertido em uma molécula de água (H2O) + O2 pela catalase (CAT) e/ou glutationa peroxidase (GPx). O H2O2 pode formar radical hidroxila (•OH) após reação reagir com o ferro (Fe+2) na reação de Fenton. A glutationa peroxidase (GPx) reduz todos os hidroperóxidos utilizando glutationa reduzida (GSH), um doador de hidrogênio. Outra enzima, a glutationa redutase (GR), mantêm o equilíbrio entre GSH e glutationa oxidada (GSSG). O óxido nítrico (NO) é formado por ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS), a partir do aminoácido L-arginina que produz NO e L-citrulina. O •O2
- também pode reagir com o NO para formar peroxinitrito (OONO-) (Adaptado de GRIENDLING e FITZGERALD, 2003).
Como exemplo de enzimas pró-oxidantes, pode-se citar a nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH oxidase), e as enzimas óxido nítrico sintase (NOS). A
NADPH oxidase participa da cascata respiratória celular e durante o processo oxidativo do
NADPH catalisa a redução de um elétron do oxigênio molecular e origina o •O2-. Já as
enzimas NOS, como o nome sugere, catalisam a formação de NO. Existem três isoformas da
6
enzima NOS, a isoforma endotelial (eNOS), a neuronal (nNOS) e a induzida (i-NOS). A
eNOS e a nNOS são constitutivas e suas atividades são reguladas por aumentos nas
concentrações intracelulares de cálcio. Todavia, a iNOS independe das variações de cálcio
celular (GRIENDLING e FITZGERALD, 2003).
São exemplos de enzimas antioxidantes, a superóxido dismutase (SOD), a enzima
glutationa peroxidase (GPx) e a enzima catalase. A SOD catalisa a conversão (dismutação) de
dois moles de •O2- a um mol de O2 e um mol de H2O2, sendo que esta enzima possui três
isoformas: a cobre-zinco SOD (SOD-Cu/Zn), que tem caráter constitutivo presente no citosol
celular. A isoforma manganês SOD (SOD-Mn), é comumente expressa nas mitocôndrias, em
caráter induzido, geralmente em resposta a situações de estresse celular ou inflamação. Já a
isoforma SOD extracelular (EC-SOD) se localiza constitutivamente na matriz extracelular
(GRIENDLING e FITZGERALD, 2003).
A GPx é responsável pela degradação do H2O2 em uma reação em que utiliza,
especificamente, a glutationa reduzida (GSH) como doadora de elétrons. Nesse processo, há a
formação de glutationa dissulfeto (GSSH) que é, consequentemente, reduzido à GSH
utilizando o NADPH como doador de elétrons. A catalase também é responsável pela
degradação do H2O2, e, também, pode atuar na degradação de pequenas quantidades de
hidroperóxidos (GRIENDLING E FITZGERALD, 2003).
As ROS também podem ser geradas sem o auxílio de enzimas como, por exemplo, nas
reações de Fenton e Haber Weiss (figura 3). Na reação de Fenton, através da adição de um
elétron ao H2O2 são formados dois radicais HO, a reação pode ser catalisada pelo sistema
Fe+2/Fe+3 ou Cu+2/Cu+3. Na reação de Haber Weiss ocorre a interação do H2O2 com o •O2- e
também são formados dois radicais •OH (HALLIWELL, 1991).
Figura 3. Reação de Fenton: interação do peróxido de hidrogênio (H2O2) com o ferro (Fe2) e reação de Haber-Weiss: interação de H2O2 com o ânion superóxido •O2
-.
7
O radical OH é extremamente reativo e pode causar, dentre outros efeitos, danos à
membrana celular (GARDNER, 1995). As reações de Fenton e Haber-Weiss não são as
únicas que ocorrem sem a interferência de enzimas. Várias outras reações, principalmente
entre as espécies reativas livres ocorrem, frequentemente, sem auxílio de catalisação
enzimática. O O2 livre precisa ser removido rapidamente, quando isso não ocorre, ele pode
reagir com o NO formando ONOO-. Outro exemplo é a reação do •O2- com o NO livre
formando ONOO- (SANTOS et al., 2011).
Fatores como o aumento de hormônios também podem induzir a produção de ROS e
RNS pelas células eucarióticas. A angiotensina II (Angio II), por exemplo, pode gerar
alterações na mobilidade de Ca2+ e quadros inflamatórios, e com isso, induzir estresse
oxidativo (RODRIGUES-MACHADO, 2008).
A própria disponibilidade de O2 livre pode induzir a formação de ROS e RNS, pois, o
O2 exerce um papel central na célula, atuando diretamente sobre enzimas e estruturas ligadas a
produção de espécies reativas (AKKI et al., 2009). O coração, dentre todos os outros órgãos,
tem o maior consumo de O2 do corpo e em condições de carga máxima pode aumentar esse
consumo em até oito vezes ou mais (KEITH et al., 1998). Assim sendo, no coração existem
diversos mecanismos de balanço redox modulando o aporte e o consumo de O2. Mecanismos
complexos de sinalização intracelular estão centralmente envolvidos no balanço entre a
geração e a neutralização das espécies oxidativas (AKKI et al., 2009; SANTOS et al., 2011).
1.3 Estresse oxidativo e modulação redox no coração
Neste tópico, veremos algumas vias de sinalização que, no cardiomiócito, podem
conduzir a uma oxidação branda ou a uma oxidação severa (SANTOS et al., 2011). As ROS e
RNS podem atuar como segundo mensageiros para efeitos deletérios como alterações
patológicas dos níveis de cálcio, hipertrofia cardíaca severa, morte celular programada e
falência cardíaca. Entretanto, em um processo de oxidação brando, podem ocorrer efeitos não
deletérios, como por exemplo, a modulação do AEC e respostas adaptativas a hipóxia que
podem contribuir para o bom funcionamento do coração (SANTOS et al., 2011). Podemos
8
visualizar de forma esquemática, na figura 4, como as ROS atuam sobre estruturas
importantes do cardiomiócito.
Figura 4. Representação esquemática de uma célula cardíaca sobre ação de espécies reativas de oxigênio (ROS). Na membrana celular as ROS podem atuar sobre os canais de Ca2+, canais de K+ e canais de Cl-, bem como, sobre a metaloproteinases de membrana (MMPs). Intracelularmente, as ROS podem atuar no retículo sarcoplasmático (RS) e também modular a liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR). As ROS também geram disfunções mitocondriais e contráteis. E a atuação de ROS sobre ASK1 (kinase reguladora de sinal de apoptose), Ras (pequenas GTPases), MAPks (proteínas Kinase ativadas por mitógeno) e PKA/B/C/G (proteínas kinase A, B, C e G) induz a transcrição de NF-kB (fator nuclear kB), AP-1 (ativador de proteína-1), HIF-1 (fator induzível por hipóxia-1) STAT (sinal transdutor e ativador de transcrição), o que pode induzir crescimento, hipertrofia, fibrose e apoptose (Adaptado de AKKI et al., 2009).
O AEC, e consequentemente a contratilidade celular, pode ser regulado por alterações
na modulação redox celular. Na membrana celular, as ROS podem atuar sobre os canais de
Ca2+. Um dos mecanismos pelo qual os canais de Ca2+ do tipo L podem ser modulados é pela
via de ativação da endotelina-1 (ET-1). Esta via pode ser ativada, dentre outros mecanismos,
pelo aumento de •O2- produzido pela enzima NADPH oxidase. A ET-1, por sua vez, induz a
ativação dos canais de Ca2+ do tipo L, aumentando assim, o influxo de Ca2+ para o interior do
cardiomiócito (ZENG et al., 2008).
9
Ainda na membrana celular cardíaca as ROS podem atuar sobre o NCX, os canais para
K+, os canais para Cl- e as metaloproteinases de membrana (MMPs) (AKKI et al., 2009). A
atividade do NXC diminui significativamente quando há estresse oxidativo (LEHOTSKÝ et
al., 1999). A diminuição da atividade do NCX pode levar ao desequilíbrio na remoção do
Ca2+ presente no citosol da célula cardíaca após a contração celular. Por consequência os
níveis de Ca2+ citoplasmáticos aumentam devido à deficiência da atividade do NCX, o que
pode levar a arritmias cardíacas, principal causa de morte dentre as doenças cardiovasculares
(HILGE, 2012).
A corrente dos canais para K+ também diminui quando há aumento no estresse
oxidativo no cardiomiócito. A diminuição da entrada de K+ na célula pode ser associada ao
aumento da produção de •O2- via NADPH oxidase. Nesse sentido, tanto a inibição da NADPH
oxidase quanto o aumento da atividade da SOD, diminuem os níveis de •O2-, o que leva a
ativação dos canais para K+ e consequentemente um aumento da corrente de K+ (SHIMONI et
al., 2005).
Quanto aos canais para Cl-, a literatura mostra que, as ROS são capazes de modular
seu funcionamento via receptor de angiotensina tipo I (AT1) (SANTOS et al., 2011). A
modulação dos canais para Cl- ocorre a partir do momento que o aumento de ROS ativa o
receptor AT1, e, este induz a ativação dos canais para Cl-. A ativação ou inativação dos canais
para Cl- está relacionada ao equilíbrio iso-osmótico celular. Em modelos de cardiomiopatia
dilatada, os canais para Cl- encontram-se permanentemente ativados. A ativação persistente da
corrente Cl- também ocorre na hipertrofia ventricular, falência cardíaca, diabetes e hipertensão
(REN et al. 2007).
A inibição das enzimas NADPH oxidase (NOX) pode levar a diminuição das correntes
de Cl-. Nesse sentido, a diminuição de •O2
- via atividade da SOD deveria induzir o aumento
das correntes de Cl-, entretanto, durante a dismutação do superóxido é gerado H2O2, que é
considerado um potente agonista dos canais para Cl- cardíacos (REN, et al., 2007). A
presença do H2O2 gerado durante a dismutação do superóxido ativa os canais Cl-. Outro
mecanismo que pode levar à diminuição na ativação dos canais para Cl- é a presença da
enzima catalase. A catalase é considerada uma potente sequestradora de H2O2, e a diminuição
desta molécula pode induzir a diminuição das correntes de Cl- (REN, et al., 2007).
10
A metaloproteinase-2 (MMP-2) está presente na membrana do cardiomiócito e é
responsável por degradar substratos como o colágeno tipo IV, a elastina e a endotelina, dentre
outros substratos da matriz extracelular. Alterações na expressão ou ativação da MMP-2 estão
relacionadas a patologias, como a falência cardíaca. Em modelos de isquemia e reperfusão é
possível visualizar um aumento na ativação da MMP-2, sugerindo que esta proteína estaria
agindo beneficamente no remodelamento cardíaco pós-injúria (WANG et al., 2005).
A MMP-2 tem sua atividade regulada pela geração de ROS (SANTOS et al., 2011). É
interessante notar que a literatura demonstra que as ROS geradas pelas NOX (exceto NOX2)
são responsáveis pela ativação da MMP e o estímulo provocado pelo aumento de ROS
derivado da NADPH oxidase pode aumentar a expressão da MMP-2 (CAVE et al., 2006).
Nesse sentido a ativação da MMP-2 seria benéfico para a célula, sendo provavelmente um
mecanismo pelo qual o cardiomiócito poderia minimizar os efeitos deletérios gerados pelo
aumento de ROS.
Intracelularmente, as ROS podem atuar no RS (AKKI et al., 2009). É bem descrito na
literatura que o RyR e também a liberação de Ca2+ induzida por cálcio (CICR) são inibidos
pela atividade endógena da NADPH oxidase no RS (HOOL et al., 2007; AKKI et al., 2009).
A inibição da NADH induz a liberação de Ca2+ pelo RS e, consequentemente, o aumento de
NADH induz a diminuição da atividade do RYR e a diminuição da liberação de Ca2+ pelo RS
(CHEREDNICHENKO et al., 2004).
A SERCA, também pode sofrer a ação das ROS e RNS. É bem estabelecido que
pequenas quantidades de ROS possam atuar aumentando a atividade da SERCA, e grandes
quantidades de ROS podem causar a inativação desta ATPase de forma irreversível
(SHAROV et al., 2006; SANTOS et al., 2011). A recaptação de Ca2+ pela SERCA é
importante, não somente para o relaxamento muscular, mas também na regulação de
processos como apoptose e proliferação celular (MISQUITTA, MACK e GROVER, 1999). A
diminuição de NO intracelular pode influenciar na atividade da SERCA, acelerando a
recaptação de Ca2+, entretanto, o NO é considerado um oxidante fraco. Contudo, essa espécie
reativa pode reagir com proteínas e sofrer s-nitrosilação (SNO) ou s-glutationilação (GSS) de
tióis reativos, essas reações podem ocorrer por meio da geração secundária de RNS, incluindo
NO2, N2O3, NO- ou ONOO- (SAMIE et al., 2009).
11
A influência da modulação redox na mitocôndria e nos mecanismos contráteis é de
fundamental importância, pois se relaciona com a função celular e, a depender do aumento
das ROS, também pode se relacionar com a vida ou a morte celular. (AKKI et al., 2009). As
mitocôndrias ocupam 30% do volume total do cardiomiócito e está localizada,
intracelularmente, de forma a ocupar espaços regulares entre os miofilamentos e o RS (PIZZO
e POZZAN, 2007, SANTOS et al., 2011).
A literatura propõe que existe uma relação entre o NADH e o Ca2+ na regulação do
perfil energético do cardiomiócito. Essa relação foi estabelecida pois o aumento de Ca2+ ativa
as desidrogenases mitocondriais que são essenciais para o aumento dos níveis de NADH e,
portanto, uma das responsáveis pela demanda de energia na célula cardíaca
(CHEREDNICHENKO et al., 2004).
Ao atuar sobre a mitocôndria, o O2 pode induzir a formação de •O2-. Esse radical livre
pode reagir com o NO (produzido pelas NOS) e formar o ONOO- (SANTOS et al., 2011). O
ONOO- é gerado, principalmente, quando há um aumento de NO intracelular e é produto de
uma reação rápida entre NO e •O2-, sendo considerado um potente oxidante que é capaz de
oxidar e nitrosilar várias biomoléculas. Danos como, por exemplo, a nitrosilação da enzima
polimerase poli-ADP-ribose (PARP), podem contribuir para disfunção endotelial e falência
cardíaca (FLOREA e ANAND, 2012).
Já a ação do O2 sobre as NOX pode induzir a geração do H2O2, que também pode ser
gerado pelas NOX que atuam no metabolismo celular (por exemplo, a NOX4). O radical OH
que pode ser gerado a partir do H2O2, juntamente com o •NO2 (gerado a partir do ONOO-)
causa danos ao DNA celular, bem como, oxida proteínas metabólicas, o que contribui para a
geração de déficit energético no miócito cardíaco (AKKI et al., 2009; SANTOS et al., 2011).
O estresse oxidativo causado pelo excesso de produção de ROS e RNS está envolvido
em diversos processos fisiopatológicos. Geralmente a geração de espécies reativas não é a
causa da doença e sim parte do processo patológico já instalado. Em pequenas quantidades,
tanto as ROS como as RNS são parte do metabolismo celular cardíaco. Contudo em grandes
quantidades, estão relacionadas a doenças cardíacas como a hipertrofia ventricular, doenças
cardiometabólicas como o diabetes mellitus, dentre outras patologias (GREIENDLING e
FITZGERALD, 2003; ANSLEY e WANG, 2013).
12
1.4 Modulação Redox em Modelos de Doenças Cardíacas.
O estresse oxidativo cardíaco pode resultar, resumidamente, em três processos:
adaptação (aumento das defesas antioxidantes), lesão tecidual (dano ao DNA, peroxidação
lipídica e oxidação de proteínas) e morte celular (necrose ou apoptose). No caso da adaptação
do sistema de defesa, diferentes respostas são geradas como proteção completa contra o dano,
ou proteção incompleta contra a lesão, ou seja, as células resistem aos oxidantes
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
A lesão tecidual ocorre quando a célula não consegue contrabalancear a produção
excessiva de ROS e estruturas celulares importantes são oxidadas (HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 1999). A morte celular, que ocorre através da necrose ou apoptose, gera
estresse oxidativo e consequentemente dano tecidual. Na necrose a célula incha se rompe,
liberando seu conteúdo, o que afeta as células adjacentes, já que o produto liberado contem
oxidantes, impondo agressão às células vizinhas e amplificando a lesão tecidual. No processo
de apoptose, comumente o dano tecidual para as células vizinhas é menor, pois o
cardiomiócito, por exemplo, libera mediadores que promovem a morte celular programada
internamente, sem liberar seu conteúdo citoplasmático para as células vizinhas, o que diminui
o dano adjacente (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; HALLIWELL, 2000).
A alteração do equilíbrio redox celular está presente na instalação e desenvolvimento
de muitas doenças cardíacas, ou doenças que afetam o coração, como por exemplo, a
hipertrofia cardíaca ventricular, o diabetes, a aterosclerose e a doença de Chagas, dentre
outras (WANG et al., 2005; AKKI et al., 2009 GUTIERRES et al., 2009; SANTOS et al.,
2011).
A hipertrofia ventricular é caracterizada por um aumento de fibrose intersticial que
está relacionado à produção de •O2- pelas NOX. A literatura demonstra que principalmente a
NOX-2 está centralmente envolvida na indução de fibrose no cardiomiócito (SANTOS et al.,
2011; BURGOYNE et al., 2012). O remodelamento que ocorre durante o aumento de fibrose
intersticial envolve interação entre os cardiomiócitos, células endoteliais e células
inflamatórias (BURGOYNE et al., 2012).
Uma vez que tanto o diabetes quanto a aterosclerose são fortemente prevalentes em
indivíduos também portadores de síndrome metabólica, e seria plausível conceber que o
13
estresse oxidativo também atue como uma variável biológica relacionada a esse distúrbio. O
diabetes está associado ao estresse oxidativo mitocondrial, que apresenta mudanças pró-
oxidativas no estado redox sistêmico.
A aterosclerose pode ser caracterizada como uma doença inflamatória sistêmica, onde
a deposição de placa ocorre, essencialmente, por meio de um desbalanço entre a resposta
imune e a deposição lipídica na camada subendotelial e a alterações nas vias de síntese ou
metabolismo do NO. Os monócitos são os principais agentes efetores na formação do
ateroma, e são excessivamente estimulados pela atividade da NADPH oxidase.
A literatura relaciona a doença de Chagas com o estresse oxidativo, onde as ROS e
RNS são geradas pelas células de defesa do hospedeiro, como agente microbicida (SAEFTEL
et al., 2001). Na doença de Chagas o processo inflamatório é complexo e extensamente
estudado e este processo está diretamente relacionado à produção de ROS e RNS.
É interessante entender, primeiramente, que a doença de Chagas é uma doença
sistêmica e não afeta só o coração, entretanto, abordaremos como essa patologia afeta o
coração e como o estresse oxidativo se relaciona com o desenvolvimento da doença.
1.5 A doença de Chagas e no coração
A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase, é uma zoonose
causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Programas de controle profiláticos
tem diminuído substancialmente o número de pessoas infectadas com T. cruzi. Eram entre 16
e 18 milhões de infectados no início de 1990 e em uma estimativa recente o número de
doentes está em 10 a 12 milhões, entretanto, aproximadamente 100 milhões de pessoas ainda
continuam a estar em risco de adquirir a infecção. Essa doença, atualmente, acomete
principalmente residentes da Americana Latina, onde a doença é endêmica (ACQUATELLA,
2007; RAMÍREZ et al., 2012).
O agente etiológico (T. cruzi) é transmitido ao homem, principalmente por seu
hospedeiro invertebrado hematófago, conhecido popularmente como barbeiro. As principais
espécies associadas à transmissão de T. cruzi, são Triatoma infestans, Panstrongylus
megistus, Rhodnius prolixus, Triatoma brasiliensis, Triatoma rubrosfasciata e Triatoma
14
sordida, sendo que o primeiro é considerado o mais importante e de maior incidência no
Brasil (BRENER et al., 2000; RASSI et al., 2012).
No ciclo natural do T. cruzi (figura 5) estão evolvidos o inseto infectado e o homem. O
inseto, membro da subfamília Triatominae, se alimenta do sangue do hospedeiro vertebrado,
eliminando durante o repasto, fezes próximas ao local da picada. As fezes que contêm T.
cruzi, na forma epimastigota e tripomastigota metacíclica alcançam o tecido conjuntivo e a
corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado através da ferida aberta durante a picada do
inseto (RASSI et al., 2012).
Dentro do hospedeiro, o T. cruzi em sua forma tripomastigota é capaz de parasitar
diferentes células, inicialmente infecta os macrófagos. (RASSI et al., 2012). No interior das
células, os parasitos se diferenciam em amastigotas, iniciando o processo de replicação. Em
seguida, após determinado número de ciclos de crescimento, de forma sincronizada, as formas
amastigotas se transformam em tripomastigotas, causando a lise da célula infectada e
liberando, no interstício ou na circulação sanguínea, o T. cruzi em sua forma tripomastigota
(BRENER et al., 2000; RASSI et al., 2012)
As formas tripomastigotas são capazes de infectar outras células, ou reiniciar o ciclo
quando um inseto Triatominae não infectado pica o hospedeiro vertebrado infectado
(ANDRADE e ANDREWS, 2005; BRENER et al., 2000; RASSI et al., 2012).
15
Figura 5. Ciclo natural do T. Cruzi. O vetor reduviidae elimina o T. cruzi, na forma epimastigota e tripomastigota metacíclica que dentro do hospedeiro se transforma na forma tripomastigota, que é capaz de parasitar diferentes células. No interior das células, os parasitos se diferenciam em amastigotas, iniciando o processo de replicação, após determinado número de ciclos de crescimento as formas amastigotas se transformam em tripomastigotas, causando a lise da célula infectada e liberando, na circulação sanguínea, o T.
cruzi em sua forma tripomastigota. As formas tripomastigotas são capazes de infectar outras células, ou reiniciar o ciclo quando um vetor não infectado pica o hospedeiro vertebrado infectado (Adaptado de Andrade e Andrews, 2005).
A doença de Chagas é uma doença sistêmica, entretanto abordaremos as fases aguda e
crônica no coração. Na fase aguda, ocorre uma grande expansão do número de parasitos na
circulação sanguínea, bem como um aumento do número de ninhos de amastigotas
observados no tecido cardíaco (RUBIN e SCHENKMAN, 2012). A fase crônica da doença se
inicia após o controle da parasitemia, que ocorre devido aos processos de imunidade inata e
adaptativa, onde pode ser observada uma redução significativa do número de parasitos
circulantes, sendo difícil sua detecção na circulação sanguínea (RASSI et al., 2010).
Considerando os aspectos cardíacos durante a fase aguda da doença de Chagas, pode-
se observar a ocorrência de um infiltrado inflamatório mononuclear (DOS SANTOS et al.,
2001). A principal consequência do intenso infiltrado inflamatório é a indução de uma intensa
miocardite difusa, que pode originar danos aos cardiomiócitos, bem como, danos ao sistema
de vasos e inervação do coração (TALVANI e TEIXEIRA, 2011). A literatura demonstra que,
na fase aguda, pode ser observada uma desenervação do sistema autonômico cardíaco, que
está relacionada à destruição dos neurônios parassimpáticos e simpáticos no coração
(MACHADO e RIBEIRO, 1989).
A correlação entre o número de parasitos e a miocardite pode parecer óbvia,
entretanto, diferentes dados da literatura demonstram que não existe uma relação clara nesse
aspecto. Essa falta de correlação pode ser atribuída às diferenças existentes durante a resposta
imune no hospedeiro. O tropismo do T. cruzi por tecidos específicos e as diferenças entres as
cepas de T. cruzi também podem ser responsáveis pela variabilidade na resposta imune e
consequentemente à falta de correlação entre o número de parasitos e a miocardite (SOUZA
et al., 1996).
As manifestações clínicas características da doença de Chagas, na fase aguda, são a
taquicardia, a ligeira hipertrofia ventricular, alternância de onda P, distúrbios de
repolarização, arritmias diversas, dentre outras. Entretanto, a mortalidade associada à fase
16
aguda é reduzida (BRENER et al., 2000). As manifestações cardíacas observadas durante a
fase crônica da doença de Chagas podem ocorrer anos ou décadas após a infecção com o T.
cruzi. Contudo, essas manifestações são consideradas os principais problemas decorrentes da
infecção por T. cruzi. Cerca de 30 a 40% das pessoas infectadas irão desenvolver, ao longo
dos anos, o quadro sintomático e fisiopatológico da fase crônica. Nessa fase da doença, a
detecção do parasito no hospedeiro se torna difícil, sendo realizada principalmente com o
auxílio de técnicas de biologia molecular (BRENER et al., 2000; RASSI et al., 2010).
As alterações cardíacas durante a fase crônica da doença de Chagas são a hipertrofia
cardíaca em função da dilatação de ambas as câmaras cardíacas, mas principalmente a
dilatação do ventrículo direito, com hipertrofia do músculo cardíaco. A presença de infiltrado
inflamatório é predominantemente mononuclear difuso, e é observado tanto na interface
quanto nos cardiomiócitos e sistema condutor, a presença de fibrose, que compromete a
função das células cardíacas (SCANAVACCA e SOSA, 1994; POSTAN et al., 1986;
ANDRADE et al. 1978; MACHADO e RIBEIRO, 1989; MACHADO et al., 1987).
Na fase crônica também são observadas alterações no sistema condutor do coração,
bem como alterações das propriedades elétricas no miócito cardíaco, que contribuem de forma
conjunta para a taquicardia ventricular sustentada e as arritmias. Além disso, o infiltrado
inflamatório encontrado ao longo de todo o tecido excitocondutor cardíaco pode contribuir
para as constantes alterações elétricas encontradas nessa fase da patologia, como bloqueio
total/parcial de ramo direito e parcial do ramo esquerdo, bem como atrofia do nodo sinusal e
destruição difusa do nodo átrio-ventricular (BRENER et al., 2000; ANDRADE et al., 1978).
Durante o desenvolvimento da resposta inflamatória ocorre o aumento da produção de
ROS e RNS. Além disso, as espécies reativas são consideradas essenciais na resposta imune,
gerada contra diversos patógenos intracelulares, como os vírus, bactérias, fungos e
protozoários (FUKAI, 2009). Durante a infecção por T. cruzi, ocorre um aumento
generalizado de ROS e RNS com o objetivo de eliminar o parasito (ALVAREZ et al. 2004).
1.6 O estresse oxidativo na doença de Chagas
A literatura descreve o NO, o •O2-, e o H2O2 como as espécies reativas que participam
ativamente na defesa do hospedeiro contra o T. cruzi, e por isso se encontram aumentadas
durante a infecção pelo parasita (BENDALL et al., 2002; FUKAI, 2009; GUTIERRRES, et
17
al., 2009). Entretanto, o aumento exagerado das espécies reativas pode desempenhar efeitos
deletérios nas células do próprio hospedeiro (FUKAI, 2009).
Durante a infecção por T. cruzi a NOS2 é expressa pelos macrófagos e a produção de
NO aumentada pode modular a atividade destas células de defesa que são fagócitos ativos no
controle e morte de parasitas por mecanismos oxidativos e não oxidativos. Entretanto, o
excesso de produção de NO pelas células de defesa pode gerar dano tecidual ao coração
(GAZZINELLI et al., 1992).
Durante a evolução da doença de Chagas a produção de ROS se encontra aumentada,
tanto nas células de defesa, como por exemplo, células Natural Killer (NK) e macrófagos
quanto nas células cardíacas com o objetivo de eliminar o parasita (VYATKINA et al., 2004;
FISHER, 2009). A literatura demonstra que, com a evolução da infecção por T. cruzi, ocorre
um remodelamento na matriz mitocondrial nas células cardíacas e com isso, uma redução nos
níveis de ATP, atribuída principalmente a um escape de elétrons da cadeia transportadora de
elétrons, que são transferidos para o O2 molecular, contribuindo para uma produção constante
de •O2- (VYATKINA et al., 2004).
A ação do •O2- e do H2O2 é modulada pela presença de diferentes proteínas
antioxidantes, como a SOD, catalase e a GPx. Entretanto, além de ser observado um aumento
na produção das ROS na infecção por T. cruzi, também é observado uma redução das enzimas
antioxidantes, como a GSH e a MnSOD, indicando a ocorrência de um desbalanço entre
produção e neutralização das ROS (VYATKINA et al., 2004; GUPTA et al., 2009).
A importância de se controlar o estresse oxidativo durante a infecção por T. cruzi é
demonstrada em estudos, onde o tratamento com antioxidante ou a privação de antioxidantes
promoveu respectivamente a melhora ou a piora dos danos cardíacos (CARVALHO et al.,
2006; WEN et al., 2006; MACAO et al., 2007). Um exemplo de aumento de danos cardíacos
causados por estresse oxidativo foi demonstrado por Carvalho et al. (2006), onde, utilizando
ratos chagásicos, a privação de vitamina-E agravou o dano cardíaco e a inervação cardíaca
durante a fase aguda da doença de Chagas.
Wen et al. (2006) demonstraram que, camundongos infectados com T. cruzi e tratados
com Fenil-N-tert-butilnitrona (PBN), uma substância antioxidante, apresentaram melhora na
atividade da cadeia respiratória, contribuindo para melhora dos danos cardíacos observados na
fase aguda da doença de Chagas. Nesse sentido, Macao et al. (2007), em um estudo com
18
humanos, também observaram redução no estresse oxidativo de indivíduos tratados com
vitamina A.
Somadas às informações já apresentadas, é interessante acrescentar que os tratamentos
disponíveis para a fase aguda da doença de Chagas, como o Benzonidazol e o Nifurtimox
provocam aumento de estresse oxidativo, pois o mecanismo de ação destes dois fármacos é
via geração de ROS, capaz de matar o T. cruzi (MONCADA et al., 1989; PEDROSA et al.,
2001).
Neste contexto, o ácido úsnico é descrito na literatura como uma molécula capaz de
produzir efeito anti T. cruzi, pois ele atua promovendo a redução da proliferação de formas
epimastigotas do T. cruzi (DE CARVALHO et al., 2005). O interessante dessa molécula é que
vários estudos recentes têm demonstrado que o ácido úsnico tem potencial antioxidante
(ODABASOGLU et al., 2006; RABELO et al., 2012).
1.7 Ácido Úsnico
O ácido úsnico [2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3-(2H, 9H)-dibenzofurano]
(figura 6) é um metabólito secundário de líquens, sendo descrito na literatura como um
componente com efeito antibiótico (FRANCOLINI et al., 2004; SAFAK et al., 2009; GUPTA
et al., 2012), antifúngico (CONOVER et al. 1992; CARDARELLI et al., 1997;
COCCHIETTO et al., 2002) antiviral (COCCHIETTO et al., 2002; SOKOLOV et al., 2012),
anti-inflamatório (COCCHIETTO et al., 2002; HUANG, 2011), antiproliferativo
(COCCHIETTO et al., 2002; DA SILVA, 2006) e antiparasitário (COCCHIETTO et al.,
2002; DE CARVALHO et al., 2005). O ácido úsnico (AU) é uma substância de fácil obtenção
e a sua extração envolve baixos custos financeiros. Desde o seu isolamento, em 1844, tornou-
se o metabólito de líquen mais extensamente estudado e um dos poucos comercialmente
disponíveis (INGÓLFSDÓTTIR, 2002).
19
Figura 6. Estrutura química do ácido úsnico (C18H16O7)
Alguns artigos apresentam o AU como um potente agente hepatotóxico
(PRAMYOTHIN et al., 2004; KRISHNA et al., 2011), entretanto, a toxicidade dessa
substância tem sido questionada em vários estudos (ODABASOGLU et al., 2006; JU-QING,
CUI-QIN e LANG-CHONG, 2008; RABELO et al., 2012). O AU é utilizado em vários
países na formulação de cosméticos como cremes, produtos com fator de proteção contra
raios ultravioletas, perfumes, desodorantes, creme dental e antisséptico bucal (RANCAN et
al., 2002; ENGEL et al., 2007; NUNES et al., 2011). Também tem sido relatada a utilização
do AU em suplementos alimentares com a finalidade de ajudar na perda de peso, embora a
literatura aponte que a utilização do AU como emagrecedor pode causar hepatotoxicidade, os
dados indicam que essa substância é utilizada, mesmo sem orientação médica, com essa
finalidade (HSU et al., 2005; BUNCHORNTAVAKUL e REDDY, 2013).
Vários estudos relatam que o AU, em altas doses, induz o desacoplamento da cadeia
transportadora de elétrons (ABO-KHATWA, AL-ROBAI E AL-JAWHARI, 1999; HAN, et
al., 2004; JOSEPH et al., 2009). Joseph et al. (2009), demonstraram ainda que o AU pode
modular a expressão de vários genes, dentre eles, os genes que regulam a expressão dos
complexos que constituem a cadeia transportadora de elétrons. A fosforilação oxidativa é
produzida pelo gradiente de prótons em toda a membrana interna da mitocôndria, e é crucial
para a geração de ATP. A cadeia transportadora de elétrons é constituída por quatro
complexos nomeados complexos I, II, III e IV. O complexo V é responsável pela síntese de
ATP. Todos os cinco complexos possuem várias subunidades de proteínas que são codificadas
pelos genomas mitocondriais e nucleares, exceto as proteínas do complexo II, que são
codificadas apenas pelo DNA nuclear (LEHNINGER, NELSON e COX, 2007).
20
No estudo realizado por Joseph, et al. (2009) foi mostrado que o AU apresentou efeito
sobre a expressão genética dos quatro complexos da cadeia de transportadora de elétrons
(complexos I - IV), enquanto a expressão de genes relacionados ao complexo V foi menos
afetada pelo tratamento com AU. Dos 82 genes associados com a fosforilação oxidativa
mitocondrial foram analisados neste estudo 30 genes, dentre esses, a maioria foi regulada
positivamente pelo AU.
Devido ao seu caráter lipofílico o AU, atravessa facilmente a membrana celular e
mitocondrial. Entretanto, para atravessar estas membranas na matriz da mitocôndria, o AU
libera um próton H+ e se transforma em um ânion usniato (AU-). O AU- pode difundir de
volta para espaço intramembranar, onde pode se ligar a um próton H+ para se transformar
novamente em AU (figura 7).
O ciclo resultante da constante entrada e saída do AU provoca uma fuga de prótons
que, eventualmente, pode dissipar o gradiente de prótons através da membrana, o que explica
o motivo pelo qual não há prótons suficientes para ativar o complexo V e, portanto, pode
resultar no desacoplamento da cadeia transportadora de elétrons (JOSEPH et al., 2009).
21
Figura 7. Representação esquemática da difusão do ácido úsnico (AU) através da matriz mitocondrial e a formação de ânion usniato (AU-). O AU atravessa facilmente a membrana mitocondrial externa, entretanto, ao atravessar a membrana interna o AU libera um próton H+ e se transforma AU-. Alcançando a matriz mitocondrial o AU- se liga a um próton H+ e se transforma novamente em AU. Quando esse processo ocorre ciclicamente, o gradiente de prótons H+ no espaço intermembranoso é dissipado, o que culmina no bloqueio do complexo V da cadeia transportadora de elétrons. Os complexos I, II, II e IV também estão representados no esquema (Adaptado de JOSEPH et al., 2009).
Joseph et al. (2009) demonstraram que, em camundongos, após tratamento oral com
200 mg/kg de AU, os complexos I – IV da cadeia transportadora de elétrons podem ser
induzidos pelo AU para criar um gradiente de prótons na membrana mitocondrial interna
suficiente para ativar o complexo V. Além disso, a atividade dos complexos I – IV pode
aumentar a produção de acil-coenzima A (acil-CoA) a partir dos ácidos graxos, seguido por
seu aumento na matriz mitocondrial. Os autores ainda apontam que, dentro da matriz
mitocondrial, os níveis mais elevados de acil-CoA podem induzir a β-oxidação de ácidos
graxos, resultando em um produto final, a acetil-coenzima A (acetil-CoA), a qual, em seguida,
pode entrar no ciclo de Krebs. Assim, a ingestão de AU implica em um aumento da atividade
de oxidação dos ácidos graxos, o que pode explicar a grande utilização desta substância como
um suplemento dietético de perda de peso sem orientação médica e de forma indiscriminada
(DURAZO et al., 2004).
A literatura mostra que o AU pode ter efeitos contrários quando se trata de atividade
antioxidante. Neste contexto, Han et al. (2004) demonstraram que o AU pode induzir estresse
oxidativo em hepatócitos por alterar o transporte de elétrons na mitocôndria. Entretanto,
Odabasoglu et al. (2006) descreveram que o AU tem significante efeito protetor na úlcera
gástrica induzida por indometacina em ratos, pois o tratamento com esta substância reduziu a
formação de espécies reativas e consequentemente danos oxidativos. Em um estudo recente,
Rabelo et al. (2012) mostraram que AU produz tanto efeitos antioxidantes, como efeitos pró-
oxidantes. Nesse estudo, foi evidenciado que o AU apresenta efeito antioxidante contra o OH,
previne danos na membrana lipídica por peroxidação e reduz a formação de NO. Entretanto, o
AU não foi capaz de prevenir danos oxidativos mediados por H2O2.
Além dos efeitos biológicos já citados (como os efeitos antiproliferativo, antibiótico e
anti-inflamatório), podemos associar o AU ao efeito antiparasitário descrito por De Carvalho
et al. (2005), onde os autores demonstraram que o esta substância atua promovendo a redução
da proliferação de formas epimastigotas dos parasitas. Neste estudo, foi evidenciado que a
exposição in vitro ao AU, nas doses de 20, 40 e 80 mg/mL foi capaz de promover uma intensa
22
vacuolização citoplasmática em formas amastigotas de Trypanosoma cruzi intracelulares,
desorganizando os cinetoplastos e mitocôndrias, sem danos significativos à ultraestrutura dos
macrófagos hospedeiros. Os resultados obtidos foram de maneira dose-dependente e indicam
que esta substância pode ter potencial para eliminar o parasita intracelular que se aloja em
miócitos cardíacos.
Os efeitos cardíacos do AU ainda não bem são conhecidos, uma vez que, quase não se
encontram estudos sobre efeito desse composto no coração. O único artigo que relaciona o
AU ao coração demonstra que, o AU apresenta baixa citotoxidade em fibroblastos cardíacos
de camundongos (CHENG et al., 2009).
Outro estudo que pode nos ajudar a compreender os efeitos do AU no coração está
descrito no trabalho de Mendonça (2009). A autora utilizou esta substância em banho de
órgão isolado e após incubar átrios de cobaias, observou em cortes histológicos, que o AU não
causava danos estruturais ao tecido atrial, mesmo na concentração mais alta utilizada (800
Foi ainda descrito que o AU, é capaz de diminuir a contratilidade atrial, aumentar a
tensão diastólica e aumentar também os tempos de contração e relaxamento.
Os experimentos realizados por Mendonça (2009) demonstraram que a concentração
em concentrações próxi
músculo cardíaco atrial.
Após nos depararmos com esta gama de informações, vimos à necessidade do
esclarecimento de possíveis efeitos do AU sobre as células cardíacas. Justificamos a execução
desse trabalho apoiados nos seguintes fatos: (1) não foi descrito na literatura se existem doses
de AU não tóxicas para as células cardíacas e, ainda, o possível efeito desta substância sob o
perfil redox celular no coração, (2) não existe, na literatura, qualquer descrição sobre a relação
entre o tratamento com AU e a, função cardíaca e (3) não se conhecer se tratamento com AU
de animais com cardiomiopatia chagásica teria algum efeito sobre o sistema redox celular,
uma vez que esta é uma patologia cuja progressão da doença está intimamente relacionada
com este desequilíbrio.
Assim, entendemos que é importante esclarecer se o AU pode ajudar a prevenir danos
oxidativos no coração, e qual a sua relação com a contratilidade cardíaca e a homeostase do
23
cálcio, e ainda sua ação sobre as vias de produção e neutralização das espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio.
24
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho foi avaliar os efeitos do ácido úsnico (AU) sobre a
contratilidade e o perfil redox do coração de mamíferos, bem como seus efeitos sobre
parâmetros da função cardíaca de animais chagásicos.
2.1 Delineamento Experimental
Para responder a hipótese acima levantada, propusemos o seguinte desenho
experimental:
· Avaliar a toxicidade do AU em cultura de células, investigando se o AU
interfere na viabilidade celular;
· Determinar se a exposição in vitro ao AU altera a contratilidade de
cardiomiócitos isolados;
· Medir o transiente de cálcio intracelular em miócitos cardíacos isolados após a
exposição in vitro ao AU;
· Mensurar o óxido nítrico em miócitos cardíacos isolados após a exposição in
vitro ao AU;
· Avaliar se a exposição in vitro ao AU altera a produção de espécies reativas de
oxigênio intracelular em cardiomiócitos isolados;
· Determinar se a exposição in vitro ao AU altera a produção de ânion
superóxido intracelular em cardiomiócitos isolados;
· Avaliar, pela medida da peroxidação lipídica, se o tratamento oral com AU
causa toxicidade ao fígado ou coração;
25
· Determinar se a atividade das enzimas catalase e superóxido dismutase (SOD),
no tecido cardíaco, são alteradas após tratamento oral com AU;
· Avaliar se o tratamento oral com AU altera a expressão das proteínas: eNOS,
nNOS, catalase, CuZn-SOD (SOD-1), Mn-SOD (SOD-2), glutationa
peroxidase e NADPH oxidase no tecido cardíaco.
· Avaliar os parâmetros da função cardíaca (tensões sistólica e diastólica,
frequência cardíaca e resistência coronariana) de camundongos saudáveis e
chagásicos após tratamento oral com AU;
· Avaliar, pela medida da peroxidação lipídica, se o tratamento oral com AU
causa toxicidade ao fígado ou coração de camundongos chagásicos;
· Mensurar a atividade da SOD, em animais chagásicos, após tratamento oral
com AU;
26
3. MÉTODOS
3.1 Hidrossolubilização do ácido úsnico
O AU utilizado nesse estudo foi obtido comercialmente (SIGMA-ALDRICH) e
complexado à -ciclodextrina, também obtida na mesma empresa. O AU é uma molécula
apolar, portanto possui baixa solubilidade em água. A formação do complexo AU/ -
ciclodextrina confere à molécula maior solubilidade em água. O complexo foi preparado
utilizando o método que consiste em misturar -ciclodextrina e o AU em metanol em seguida
a indução da evaporação do solvente. Após a completa evaporação do solvente a substância
obtida foi misturada a água e colocada sob agitação por 24 h. Após esse período a substância
foi liofilizada e armazenada para utilização futura.
3.2 Cultura de células e viabilidade celular
As células endoteliais humanas da linhagem EaHy.926 foram mantidas em meio de
cultura Dulbecco modificado contendo (em mM) 4 L-glutamina, 25 glicose, 1 piruvato de
sódio e 18 bicarbonato de sódio e soro fetal bovino a uma concentração final de 10%. Estas
células foram cultivadas em estufa com atmosfera mantida com oxigênio (O2) a 95% e
dióxido de carbono (CO2) a 5%, na temperatura de 37°C. Ao meio de cultura foi adicionado
AU nas concentrações finais de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM e 10 µM e 100 µM, afim de
avaliar se a exposição a esta substância poderia causar citotoxidade. Após 24h de exposição
ao AU, as células passaram pelo teste indireto de viabilidade celular pelo ensaio de
metabolização de sais de tetrazólio (MTT). Trata-se de um ensaio colorimétrico cujo princípio
se baseia na redução de sais de tetrazólio (MOSMAN, 1983; DIEL et al, 1999; VOHR et al,
2001).
Para o ensaio com MTT cultivou-se 1 x 106 células da linhagem Eary926, em placa
contendo meio Dulbecco modificado e 10% de soro fetal bovino, em presença ou ausência de
-se solução de MTT (1,25
27
mM), e após 4 horas a placa foi centrifugada a 6000 RPM por 10 minutos e os sobrenadantes
retirados. Os cristais de formazan foram dissolvidos em 100
realizada a 600 nm em espectrofotômetro de placa.
3.3 Animais utilizados
A primeira etapa deste trabalho foi conduzida em ratos Wistar, saudáveis, machos,
com idade de 12 a 14 semanas (peso entre 250 e 300 g) e camundongos C57Bl6J com idade
de 12 semanas (peso entre 20 e 28 g), respectivamente. Os animais foram obtidos após
aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade Federal de
Sergipe, sob os números de protocolo: CEPA 73/2010, CEPA 20/2012 e CEPA 55/2012
(Anexos: 1, 2 e 3, respectivamente).
Foram utilizadas duas espécies de mamíferos para o estudo, devido à disponibilidade
das mesmas nos diferentes locais onde foram executados os experimentos e a necessidade
experimental. Todos os animais foram submetidos a ciclo claro/escuro natural, criados em
número máximo de cinco por gaiola, e tendo livre acesso ao alimento e à água.
Para experimentos visando estudar o efeito da exposição aguda ao AU, os ratos Wistar
e camundongos C57Bl6 tiveram suas células cardíacas isoladas e expostas, in vitro, ao AU
(SIGMA-ALDRICH) diluído em solução Tyrode (em mM: 130 NaCl; 5,4 KCl; 0,33
NaH2PO4; 22 Glicose; 17 NaHCO3; 25 Hepes; 0,5 MgCl2; 1,8 CaCl2). Para o controle da
droga (CTR) foi utilizado o veículo -ciclodextrina (substância à qual o AU está conjugado
para este aumentar sua solubilidade), acrescido à solução Tyrode.
Foi avaliado, neste trabalho, o efeito da exposição aguda (15 minutos) ao AU, nas
concentrações
3.4 Grupos experimentais
A divisão em grupos experimentais para tratamento com AU, ocorreu apenas com os
camundongos C57Bl6. Estes foram divididos em quatro grupos:
Grupo 1: Camundongos CTR tratados com veículo ( -ciclodextrina + água)
28
Grupo 2: Camundongos CTR tratados com AU;
Grupo 3: Camundongos infectados com T. cruzi tratados com veículo ( -ciclodextrina
+ água);
Grupo 4: Camundongos infectados com T. cruzi tratados com AU;
A infecção com o T. cruzi foi realizada entre a 7ª e 8ª semanas de vida dos
camundongos. Cada camundongo foi infectado, por injeção intraperitoneal, com 50 formas da
cepa colombiana do parasita. No 15º dia pós-infecção os camundongos infectados com T.
cruzi receberam uma dose única de benzonidazol (300 mg/kg), por via oral. Com o objetivo
de avaliar os camundongos chagásicos no início da fase crônica da doença, os animais
aguardaram 45 dias pós-infecção, antes de ser iniciado o tratamento com AU. Os grupos 2 e 4
receberam 50 mg/kg/dia de AU, por via oral (gavagem), sendo que o tratamento foi realizado
de 12 em 12 h durante cinco dias. Os grupos 1 e 3 receberam apenas veículo durante os
mesmos cinco dias.
3.5 Obtenção do coração isolado
Os animais receberam injeção intraperitoneal de heparina (4000 UI/kg) diluída em de
solução salina (0,9%). Após 15 minutos, os animais foram sacrificados por decapitação e em
seguida foi realizada toracotomia e o coração era retirado em bloco. Posteriormente o coração
foi colocado em uma pequena placa de Petri que continha 50 mL de solução tampão, isenta de
cálcio, a aproximadamente 4ºC (em mM: 130 NaCl; 25 HEPES; 0,5 MgCl2; 0,33 NaH2PO4;
22 D-glicose e 5 L de solução estoque de insulina a 100 UI/mL , com pH em 7,4 ajustado
com NaOH). Na placa de petri, todos os tecidos, exceto o do coração, eram removidos,
deixando à mostra a artéria aorta, que foi cortada, abaixo do tronco braquiocefálico, deixando,
desta forma, um pequeno segmento da mesma. O coração era canulado pelo coto da aorta e
fixado a uma cânula por uma linha. Este sistema foi então colocado no sistema de
Langendorff para o início da perfusão retrógrada.
3.6 Obtenção das células ventriculares cardíacas
29
Para a obtenção dos cardiomiócitos isolados foi utilizado o procedimento para a
dissociação enzimática baseado no protocolo descrito por Mitra & Morad (1985). O coração
foi perfundido retrogadamente através da artéria aorta com a mesma solução tampão descrita
anteriormente durante 3 a 5 minutos ou até limpá-lo completamente. A essa solução tampão
foi adicionado 0,18 mM de Ca2+ e 1 mg/mL de collagenase tipo II (WORTHINGTON, EUA)
que foi perfundida em camundongos durante 4 a 5 minutos e em ratos durante 15 a 20
minutos ou até que o coração estivesse com aspecto amolecido. O tecido foi cortado em
fragmentos e prosseguido com agitação mecânica para facilitar o isolamento dos
cardiomiócitos. O Ca2+ extracelular foi restaurado para 1,8 mM gradativamente. As células
foram armazenadas em solução Tyrode.
3.7 Contratilidade celular
A contratilidade celular foi medida através da técnica de alteração do comprimento
diastólico dos cardiomiócitos usando o sistema de detecção de bordas (IONOPTIX
CORPORATION, Milton, MA, EUA) montado num microscópio invertido (NIKON
ECLIPSE – TS100, EUA) (Prímola-Gomes et al, 2009). As células cardíacas foram
acomodadas em uma câmara giratória com a base de vidro e banhadas por uma solução de
Tyrode, à 37ºC.
As células foram visualizadas em um microscópio em um aumento de 400x (objetiva
de imersão em óleo S Fluor, 40x, Nikon, EUA), ou no monitor do computador ao qual era
acoplado ao microscópio invertido e uma câmera (Myocam, Ionoptix, EUA). Foram
utilizadas, para as análises das contrações, somente as células que estavam em boas
condições, com as bordas (direita e esquerda) e as estrias sarcoméricas bem definidas, além de
imóveis quando não estimuladas eletricamente. O estímulo dado aos miócitos foi de 1 Hz (10
Volts, duração de 5 ms), utilizando um estimulador elétrico (Myopacer, Field Stimulator,
Ionoptix, EUA).
As bordas das células foram identificadas com o auxílio de um detector de borda
utilizado para aquisição das imagens e dos registros das contrações, onde duas janelas (direita
e esquerda) foram alinhadas ao longo do comprimento do cardiomiócito, delimitando as
bordas da célula. A definição das bordas foi ajustada através do contraste (preto e branco)
gerado pela qualidade da imagem projetada das células. Os movimentos das bordas dos
30
miócitos foram capturados pelo sistema de detecção de bordas e armazenados para análise
posterior. Foi analisado o parâmetro porcentagem de encurtamento.
3.8 Medidas do transiente de cálcio intracelular
Para mensurar o transiente intracelular de cálcio foi feita a incubação dos
cardiomiócitos com a sonda fluorescente sensível ao cálcio Fluo-4/AM (5 M) (Molecular
Probes, Eugene, OR, USA), durante 30 minutos a temperatura ambiente, após este tempo, as
células foram lavadas para retirar o excesso de sonda. Posteriormente, as células foram
incubadas com AU, durante 15 minutos, nas concentrações de 0,1 nM; 1 nM; 10 nM; 100 nM;
1 µM e 10 µM. Os cardiomiócitos marcados foram estimulados na frequência de 1 Hz, com
um pulso quadrado de corrente de duração de 5 ms e 30 V e a sonda foi excitada com laser de
argônio no comprimento de onda de 488 nm e a emissão se dava em 515 nm. Após a
aplicação de 8 pulsos elétricos, foi feita uma varredura repetitiva ao longo de uma linha no
eixo longitudinal das células, utilizando-se microscópio Confocal Zeiss 510 Meta
(GUATIMOSIM et al., 2001. LAUTON-SANTOS et al, 2007). As análises foram realizadas
no software Microsoft Excel.
3.9 Medida dos níveis intracelulares do óxido nítrico
Para detecção dos níveis intracelulares de NO, cardiomiócitos de camundongos foram
isolados conforme protocolo anteriormente descrito. As células foram carregadas por 30
minutos, a 37ºC, com 5 -2 FM (4-amino-5-metilamino-2’,7’-
difluorofluoresceina diacetato, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) em tampão Tyrode-
HEPES (TTH) contendo (em mM): 140 NaCl, 5 KCl, 0.5 MgCl2, 5 HEPES e 5 glicose (pH
ajustado para 7,4). Posteriormente, os cardiomiócitos foram lavados com solução TTH para
remover excesso da sonda. As células foram então divididas em dois grupos: o grupo
controle, no qual as células foram mantidas em solução TTH e no segundo grupo, as células
foram incubadas com 10 nM de AU diluído em solução TTH, durante 15 minutos.
Imediatamente após esse procedimento, as células foram estimuladas com laser de argônio no
comprimento de onda de 488 nm e a emissão se dava em 515 nm. As imagens capturadas em
microscópio confocal LSM 510 META (Zeiss GmbH, Jena, Alemanha) com uma objetiva de
imersão de 63x. O software Image J foi usado para processar e analisar as imagens.
31
3.10 Medida dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio
Para a detecção intracelular de peróxido de hidrogênio (H2O2), as células cardíacas de
camundongos foram isoladas e carregadas com 0,1 -
diclorodihidrofluoresceína-diacetato (H2DCFH-DA, Molecular Probes Invitrogen). Esta
sonda é desacetilada intracelularmente por esterases não específicas, e posteriormente
oxidadas pelo H2O2 e/ou radical OH intracelular, formando assim o composto 2,7-
diclorofluoresceína (DCF) cuja emissão de fluorescência em 488 nm pode ser correlacionada
à concentração de H2O2 intracelulares. As células foram incubadas com as sondas em solução
TTH, por 15 minutos, a 37°C, e então lavadas na mesma solução para remover o excesso da
sonda. As células foram então divididas em dois grupos, o grupo controle, no qual as células
foram mantidas em solução TTH e no segundo grupo, as células foram incubadas com AU
diluído em solução TTH, na concentração de 10 nM, durante 15 minutos. As células foram
estimuladas com laser de argônio no comprimento de onda de 488 nm e as imagens
capturadas em microscópio confocal Meta LSM 510 (Zeiss GmbH, Jena, Germany) com a
objetiva de imersão em óleo (63×) e o software Image J foi usado para processar e analisar as
imagens.
3.11 Medida dos níveis intracelulares do radical ânion superóxido
Com o objetivo de detectar o radical •O2-, os miócitos cardíacos isolados de
camundongos foram carregados com 10 M da sonda fluorescente dihidroetídio (DHE,
Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). Os cardiomiócitos foram incubados com a sonda
diluída em uma solução TTH, pelo tempo de 30 minutos, a 37°C, sendo posteriormente
lavados durante mais 30 minutos, também a 37°C, com a mesma solução, a fim de remover o
excesso da sonda. As células foram então divididas em dois grupos, o grupo controle no qual
as células foram mantidas em solução TTH e no segundo grupo, as células foram incubadas
com AU diluído em solução TTH, na concentração de 10 nM, durante 15 minutos. Em
seguida, as células foram estimuladas com laser de argônio no comprimento de onda de 488
nm e as imagens capturadas no microscópio confocal Meta LSM 510 (Zeiss GmbH, Jena,
Germany) com a objetiva de imersão em óleo (63×) e o software Image J foi usado para
processar e analisar as imagens.
32
3.12 Contratilidade cardíaca (órgão isolado)
O coração dos camundongos foi obtido conforme protocolo citado anteriormente e o
sistema de Langendorff com fluxo constante de perfusão (2,5 mL/min) foi utilizado para o
estudo dos parâmetros contráteis do coração isolado. Neste sistema, os corações foram
submetidos a uma perfusão retrógrada e os registros das medidas da força de contração e
pressão de perfusão foram obtidos por transdutores acoplados a uma placa conversora
conectada a um computador.
Para a transformação dos registros analógicos obtidos em sinais digitais e aquisição
dos mesmos utilizou-se o equipamento Biopac systems, modelo M100A-CE e o software
Acqknowledge 3.8.1
Para a perfusão do coração utilizou-se solução de Krebs-Ringer (em mM): 118,4
NaCl; 4,7 KCl; 26,5 NaHCO3; 1,8 CaCl2.2H2O; 11,7 glicose; 1,2 KH2PO4; 1,2
MgSO4.7H2O), oxigenada (95% de O2 e 5% de CO2) e aquecida a 37°C. A pressão de
perfusão foi captada por um transdutor de pressão (TP-200, Nihon Khoden). Para averiguação
das tensões sistólica e diastólica, foi colocado no ápice do coração, um anzol ligado a um fio
que passava por um sistema de roldanas e fixado a um transdutor de força (TSD 125C, Biopac
Systems, EUA). Foi imposta ao coração uma tensão diastólica de 0,5g durante o período de
estabilização (primeiros 30 minutos). Após este período as medidas foram coletadas por mais
25 minutos sem qualquer ajuste na tensão. As análises dos dados foram realizadas usando o
software Acqknowledge 3.8.1 e Prisma 4.0. (GraphPad, San Diego, CA, EUA).
3.13 Preparação do tecido para as análises enzimáticas
Os ventrículos foram retirados e imersos em solução salina tamponada com fosfato
(PBS) (em mM): 137 NaCl; 2.7 KCl; 4.3 Na2HPO4; 1.47 KH2PO4, pH 7,4 e em seguida
lavados na mesma solução para a retirada do sangue. Posteriormente, o tecido foi pesado e
colocado em PBS na proporção de 0,1 g de tecido por mL de tampão e, então, homogeneizado
(Euro Turrax T20b IKA LABORTECHNIK) por 2 minutos em banho de gelo. Depois deste
processo, o homogenato foi centrifugado por 30 minutos a 12.000 rotações por minuto (RPM)
e o sobrenadante retirado para uso nos ensaios bioquímicos.
33
3.14 Determinação da concentração total de proteínas
A quantidade total de proteínas foi determinada pelo método descrito por Bradford em
1976. O método de Bradford utiliza o corante de “Coomassie brilliant blue” (BG-250) para
determinar quantidade total de proteínas em uma amostra. Os tecidos foram preparados
conforme o protocolo de preparação do tecido para análises enzimáticas e, posteriormente,
parte do sobrenadante foi utilizado. As amostras foram diluídas 10x em água deionizada.
Também foram preparadas amostras padrão, com quantidades conhecidas de albumina, a fim
de confeccionar uma curva padrão de albumina. Tanto a amostra diluída, quanto diluições
crescentes do padrão de albumina foram colocadas em microplaca de 96 poços, em triplicata.
A pipetagem era realizada rapidamente em ambiente com meia luz e posteriormente a placa
era totalmente protegida da luz e levada para análise em leitor de Elisa, onde a placa era
agitada durante 30 segundos e a leitura realizada em seguida.
A curva padrão de albumina continha oito pontos (em mg/mL: 0,039; 0,078; 0,156;
0,312; 0,625; 1,125; 2,5 e 5) e foi calculada no Microsoft Excel com o uso do gráfico de
dispersão, sobre o qual aplicou-se regressão linear, cujo modelo é y = ax + b, utilizando como
parâmetro de qualidade R2 maior que 0,95. A quantidade total de proteínas em cada amostra
era calculada também com auxílio do Microsoft Excel tendo a curva padrão como parâmetro.
3.15 Determinação da atividade da catalase
O ensaio da atividade da catalase foi realizado conforme o método descrito por Nelson
& Kiesov (1972) e adaptado por Gioda et. al. (2010). As amostras foram preparadas conforme
protocolo descrito anteriormente e o sobrenadante foi utilizado. A atividade da enzima foi
determinada em tampão fosfato (50 mM, pH 7,0). Alíquotas do homogeneizado foram
adicionadas ao tampão fosfato e a reação foi iniciada com a adição de 0,3M H2O2. As leituras
foram realizadas em cubeta de quartzo, imediatamente após o início da reação, a 25ºC, em
espectrofotômetro (Hitachi, Japão), com o comprimento de onda de 240 nm. Foram realizadas
quatro medidas em intervalos de 20 segundos entre elas (0, 20, 40 e 60 segundos). A atividade
da catalase foi calculada no software Microsoft Excel utilizando a fórmula
34
3.16 Determinação de peroxidação lipídica
Esta técnica baseia-se na reação entre produtos indiretos de peroxidação lipídica
(principalmente o malondialdeído) com o ácido tiobarbitúrico (TBA). Consiste basicamente
na reação entre os produtos de peroxidação e o TBA sob condições ácidas e com elevadas
temperaturas. O produto da reação é um cromóforo rosado com coeficiente de extinção
1,56x105M-1cm-1 à 532 nm.
As amostras de fígado e coração foram preparadas conforme protocolo descrito
anteriormente e o sobrenadante foi utilizado. O sobrenadante foi colocado em tubos de ensaio
e acrescentado a ele TBA (0,67%) e ácido tricloroacético (20%). Após esta adição, os tubos
foram incubados a 100°C por 20 minutos. Posteriormente, os tubos foram centrifugados a
8000 RPM por 5 minutos, o sobrenadante retirado e pipetado em placa para a leitura realizada
em leitora de Elisa a 530 nm.
3.17 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD)
Este método é baseado para determinação da atividade da enzima SOD através da
redução do MTT pelo superóxido. O ensaio envolve a formação de íons superóxido pela auto-
oxidação do pirogalol e inibição da redução do tetrazólio MTT [3-(4,5-tiazol-dimetil) 2,5-
brometo-difenil-tetrazólio] por superóxido, medida à 570 nm. A reação é terminada pela
adição de dimetil-sufóxido (DMSO), que ajuda a solubilizar os cristais de formazan formados
durante a redução do MTT bem como estabiliza o cromóforo.
As amostras foram preparadas conforme protocolo descrito anteriormente e o
sobrenadante foi utilizado. O sobrenadante foi pipetado em placa de 96 poços juntamente com
PBS contendo 1 mM de EDTA (em mM): 137 NaCl; 10 Na2HPO4; 2 KH2PO4; 2,7 KCl, pH:
7,4. Posteriormente, foram adicionados MTT (1,25 mM) e pirogalol (100
com meia luz. Em seguida a placa foi totalmente protegida da luz. O DMSO foi adicionado
após 5 minutos de reação e a placa foi imediatamente levada para análise em
espectrofotômetro de placa onde foi agitada rapidamente e a leitura realizada a 570 nm. A
atividade da SOD foi calculada no software Microsoft Excel, levando em consideração o
princípio: 1 U de SOD é capaz de reduzir a leitura do padrão em 50%.
35
3.18 Determinação da expressão proteica por western blot
Tubos de ensaio contendo ventrículos cardíacos foram homogeneizados em banho de
gelo em tampão Tris-HCl (50 mM) contendo em (mM): 150 NaCl; 5 EDTA-Na; 1 MgCl2; 1%
Nonidet P40; 0,3 % triton X-100; 0,5 % deoxicolato de sódio; 100 DTT; 10 mg/mL
aprotinina; 15,7 mg/mL benzamidina; 1 mg/mL pepstatina A; 100 fluoreto de
fenilmetilsilfonila (PMSF). O homogenato foi centrifugado a 12.000 RPM por 30 minutos a
4°C e o sobrenadante distribuído em alíquotas e imediatamente mantido a -80°C. A
quantidade de proteínas foi mensurada conforme o método de Bradford já descrito.
Amostras contendo 60 e proteínas foram misturadas ao tampão de amostra
desnaturante e aquecidas a 99ºC durante 5 minutos. Após este processo, as amostras foram
aplicadas em gel de poliacrilamida com concentração específica para o tamanho da proteína a
ser identificada (utilizou-se géis de 10 e 12%). Após aplicação das amostras, os géis foram
colocados em tampão de corrida (em mM): Tris 25; Glicina 250; 1% SDS) e foi aplicado um
campo elétrico (utilizando 100 V durante 120 minutos, aproximadamente).
Após a corrida, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose,
utilizando um sistema de transferência semi-dry e coradas com solução de Ponceau (1%). A
membrana foi incubada durante 3 horas com solução de bloqueio (TBS-T + 4% de albumina,
onde a solução TBS-T contendo (em mM): 50 Tris, 150 NaCl, 0,05% Tween 20, pH ajustado
para 7,6 com HCl.) Após o bloqueio, a membrana foi incubada com anticorpo primário, “over
nigth”.
O anticorpo foi diluído em solução TBS-T com adição de 1% de albumina. Após essa
etapa a membrana foi lavada por 3 vezes com TBS-T. Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundário durante 2 horas e novamente lavada por mais 3 vezes.
Cada membrana foi incubada com o anticorpo específico para cada proteína
investigada, e consequentemente o anticorpo secundário específico para o primário. Anti-
nNOS (1:1000; policlonal), anti-eNOS (1:2000; policlonal), anti-tubulina (1:3000;
monoclonal), anti SOD-1 (1:2000; policlonal); anti SOD-2 (1:2000; policlonal); anti-GPx-1/2
sítio H-151(1:2000; policlonal; anti gp91-phox (NADPH oxidase) (1:1000; monoclonal)
todos acima foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology - EUA) e anti-catalase (1:3000;
Sigma Aldrish, St. Louis, MO).
36
As bandas proteicas foram detectadas por reação de quimiluminescência (Luminata
Forte Western HRP Substrate, Millipore). Posteriormente as membranas foram submetidas ao
processo de stripping, no qual é realizada a remoção dos anticorpos através da lavagem com
solução Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific), durante 5 minutos. As
membranas então foram novamente bloqueadas e incubadas com anticorpo primário utilizado
com normalizador e anticorpo secundário, seguindo o mesmo protocolo descrito
anteriormente. As bandas proteicas foram detectadas e a intensidade das mesmas foi avaliada
por análise densitométrica através do software Image J. A análise é feita utilizando-se o valor
obtido através da análise das bandas da proteína de interesse dividido pelo valor da proteína
normalizadora.
3.19 Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas no programa Graph Pad Prism 4.0. Todos os
resultados foram expressos como média ± EPM e considerados significativos os valores de
p<0,05. Foram realizados os testes T de STUDENT (para análises entre dois grupos) ou one
way ANOVA seguido do pós-teste de TUKEY (para análise entre mais de dois grupos). Os
gráficos de contratilidade em coração isolado foram analisados ponto a ponto através do
método two-way ANOVA para medidas repetidas, seguidas de testes de comparação do tipo
BONFERRONI.
37
4. RESULTADOS
4.1 Avaliação da toxicidade do ácido úsnico
Primeiramente, foi realizado um teste de viabilidade celular para avaliar a toxicidade
do AU. O resultado do teste de metabolização do MTT, obtido após 24 horas de exposição, in
vitro ao AU, das células endoteliais humanas da linhagem Eahy926 está representado na
figura 8. Foram testadas as concentrações de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 M, 10 M, 100 M de
AU.
CTR AU 1 nM AU 10 nM AU 100 nM AU 1 mM AU 10 mM AU 100 mM0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Via
bil
idad
e c
elu
lar
- M
eta
bo
lozação
do
MT
T
(Ab
so
rbân
cia
)
Figura 08. Viabilidade Celular. Avaliação da viabilidade das células endoteliais humanas da linhagem Eahy926 através do teste de metabolização do MTT (metiltetrazolium) após 24 horas de exposição, in vitro, ao ácido úsnico (AU) (1 nM = 0,345 ± 0,091; 10 nM = 0,374 ± 0,019; 100 nM = 0,353 ± 0,036; 1 mM = 0,360 ± 0,029; 10 mM = 0,381 ± 0,025; 100 mM = 0,4073 ± 0,018) , comparando com o controle (CTR) ( 0,371 ± 0,045). (n= 12).
Os resultados obtidos com a cultura de células Eahy926, na figura 8, sugerem que o
AU, nas concentrações testadas, não traria danos às células do sistema cardiovascular, pois
não há diferença entre a metabolização do MTT nas células controle e as células expostas ao
AU.
38
4.2 Contratilidade celular e transiente intracelular de cálcio
Para avaliar o possível efeito tóxico do AU sobre a contratilidade das células
cardíacas, bem como, sobre mecanismos que integram o acoplamento excitação-contração,
foram realizados experimentos in vitro, utilizando cardiomiócitos isolados enzimaticamente.
Primeiramente foi avaliado o efeito do AU na contratilidade celular de ratos. Os dados
obtidos mostraram que o AU não teve efeito sobre a porcentagem de encurtamento do miócito
cardíaco, nas concentrações: 0,1 nM, 1 nM, 5 nM e 10 nM (Figura 09).
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0
CTR
AU 0,1 nM
AU 1 nM
AU 5 nM
AU 10 nM
Encurtamento (%)
Figura 09. Contratilidade celular. O gráfico representa a porcentagem de encurtamento dos cardiomiócitos estimulados em frequência de 1Hz. Foram registradas as contrações de células controle (CTR: 9,3 ± 0,35 n=110) e após exposição das células ao AU (0,1 nM = 9,3 ± 0,31 n= 93; 1 nM = 9,4 ± 0,31 n= 80; 5 nM = 9,4 ± 0,35 n=86 e 10 nM = 9,4 ± 0,34 n=88).
Posteriormente foram realizados experimentos com microscopia confocal a fim de
verificar se a exposição, in vitro, ao AU alteraria o transiente intracelular de cálcio ([Ca2+]i)
nos cardiomiócitos isolados de ratos. Nesta etapa, também foi avaliado se a -ciclodextrina,
conjugada ao AU, poderia ter algum efeito sobre o [Ca2+]i. Na figura 10 observa-se que a
exposição das células cardíacas isoladas a -ciclodextrina não influenciou na [Ca2+]i, nas
concentrações testadas (10 nM e 10 ão dos cardiomiócitos ao AU,
nas concentrações de 0,1 nM, 1 nM, 5 nM e 10 nM também não alterou o [Ca2+]i.
39
Figura 10. Transiente intracelular de cálcio em cardiomiócitos isolados de ratos. (A) Imagem da fluorescência de cálcio intracelular em cardiomiócitos do grupo controle (CTR) e grupos expostos, in vitro
40
5 nM e 10 nM.) (B) Traçado representativo das médias dos registros. (C) Pico da fluorescência de Ca+2 intracelular dado em F/F0 (CTR= 3,14 ± 0,75, -ciclodextrina 10 nM = 3,10 ± 0,81, -ciclodextrina 10 ± 1,09, n= 49; AU = 0,1 nM = 3,17 ± 0,8, n=61; AU 1 nM = 3,16 ± 0,65, n= 54; 5 nM= 3,32 ± 0,71, n=53; AU 10 nM 3,33 ± 0,69 n= 52). (D) Tempo para o pico de fluorescência (CTR= 2041 ± 160,9, -ciclodextrina 10 nM = 1947 ± 175,4, - ± 180,5, n= 49; AU = 0,1 nM = 2081± 171,6, n=61; AU 1 nM = 2068 ± 180,7, n= 54; 5 nM= 2053 ± 160,6, n=53; AU 10 nM 2122 ± 130,7, n= 52). (E) Tempo para 50% da recaptação cálcio (CTR= 303,5 ± 8,7, n= 77 -ciclodextrina 10 nM = 293,5 ± 10,84, -ciclodextrina 10 ± 6,9, n= 49; AU = 0,1 nM = 299 ± 9,6, n=61; AU 1 nM = 297 ± 10,42, n= 54; 5 nM= 316,2 ± 7,4, n=53; AU 10 nM 319 ± 6,5, n= 52). Os cardiomiócitos foram estimulados a 1Hz e os dados estão representados em média ± E.P.M
Pode-se observar, também, (figura 10 – paneis B e D) que a cinética de receptação do
cálcio não está alterada, uma vez que os valores medidos ao tempo para o decaimento da
fluorescência em 50%. A medida indireta da recaptação de 50% do cálcio (T50) também não
foram alterados pela exposição à -ciclodextrina e ao AU. Esta medida nos permite afirmar
que a recaptação de cálcio pela SERCA não foi alterada pela exposição ao AU.
Posteriormente o transiente intracelular de cálcio também foi mensurado em
cardiomiócitos isolados de camundongos. Os resultados com a concentração de 10 nM de AU
também não se mostraram alterados (Figura 11).
Figura 11. Transiente intracelular de cálcio em cardiomiócitos isolados de camundongos. (A) Imagem da fluorescência de cálcio intracelular em cardiomiócitos do grupo controle (CTR) e
1000ms
CTR
1000ms
AU 10nM
A 4.0 1.0
F/F0
500ms
4.0 1.0
F/F0
500ms
B
C D E
41
do grupo exposto, in vitro, ao ácido úsnico na concentração de 10nM. (B) Traçado representativo das médias dos registros. (C) Pico da fluorescência de Ca+2 intracelular dado em F/F0 (CTR = 3,52 ± 0,08, n = 80; AU 10nM = 3.62 ± 0,16, n= 78). (D) Tempo para o pico de fluorescência (CTR = 2465 ± 168, n = 80; AU 10nM = 2547 ± 154, n= 78). (E) Tempo para 50% da recaptação cálcio (CTR = 136 ± 2,57, n = 80; AU 10nM = 137,3 ± 3,26, n= 78). Os cardiomiócitos foram estimulados a 1 Hz e os dados estão representados em média ± E.P.M
4.2 Medidas das espécies reativas de nitrogênio e oxigênio
A fim de avaliar se a exposição, in vitro, dos cardiomiócitos ao AU apresentaria efeito
antioxidante, mensuramos algumas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Foi avaliado se
a produção de NO, OH e H2O2 e •O2- seria alterada pela exposição dos miócitos cardíacos
isolados de camundongos à concentração de 10 nM de AU.
As medidas de NO intracelular foram realizadas com a sonda intracelular DAF-AM
após exposição, in vitro, dos cardiomiócitos isolados de camundongos ao AU (figura 12). Os
resultados demonstram que, na concentração de 10 nM, o AU foi capaz de promover a
diminuição da formação de NO intracelular.
Figura 12. Medida da produção de óxido nítrico. (A) Imagens representativas de fluorescência obtidas por microscopia confocal mostrando as células cardíacas previamente incubadas com a sonda DAF-AM e posteriormente expostas in vitro ao ácido úsnico (AU). (B) Medida da Fluorescência (CTR = 591,8 ± 63,7, n=85 e AU = 514,3 ±72,3, n=94). Os dados são representados como a média ± EPM, ***P<0,001.
Em seguida, foi mensurada a quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS), em
especial, os níveis de H2O2 e radical OH, utilizando-se a sonda intracelular (DCFH) nas
células cardíacas isoladas e expostas ou não ao AU, na concentração de 10 nM. Os resultados
CTR AU0
100
200
300
400
500
***
Flu
ore
scên
cia
(U
.A)
42
demonstram que, na concentração de 10 nM, o AU foi capaz de promover a diminuição da
formação de ROS intracelular (Figura 13).
Figura 13. Produção de espécies reativas de oxigênio. (A) Imagens representativas de fluorescência obtidas por microscopia confocal mostrando as células cardíacas previamente incubadas com a sonda DCFH e posteriormente expostas in vitro ao ácido úsnico (AU). (B) Variação da Fluorescência (CTR = 564.3 ± 72, n=88 e AU = 514,3 ± 60, n=87). Dados são representados como a média ± EPM, **P<0,01.
Quanto às medidas de •O2-, foi utilizada a sonda intracelular DHE nos cardiomiócitos
isolados e expostos ou não ao AU, na concentração de 10nM. Também foi observado uma
redução da produção desse radical livre nas células cardíacas tratadas, in vitro, com AU,
quando comparadas aos cardiomiócitos não tratados. Podemos observar na figura 14 que tanto
no citoplasma, como no núcleo dos miócitos cardíacos o •O2- estava diminuído em relação ao
controle.
CTR AU0
100
200
300
400
500
**
Flu
orescên
cia
(U
.A)
43
Figura 14. Produção de ânion superóxido. (A) Imagens representativas de fluorescência obtidas por microscopia confocal mostrando as células cardíacas previamente incubadas com a sonda DHE e posteriormente expostas in vitro ao ácido úsnico (AU). Imagens de microscopia confocal mostrando as células cardíacas incubadas com a sonda DCFH e posteriormente expostas ao AU. (B) Medida da Fluorescência no citoplasma do cardiomiócito (CTR = 231,7 ± 42 e AU = 144,2 ± 56,3, n=67; ***P<0,001) e (C) Medida da Fluorescência no núcleo do cardiomiócito (CTR = 675,8 ± 101,5 e AU = 614,2 ± 133,4, n=60; *P<0,05). Dados são representados como a média ± EPM.
4.3 Peroxidação lipídica
A fim de esclarecer se a administração oral de AU para animais produzia efeito tóxico
foi avaliada a peroxidação lipídica, em fígado e coração. Esta medida foi determinada pela
detecção de produtos indiretos da peroxidação lipídica, medindo substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) como, principalmente o malondialdeído. Nossos resultados indicam
que o tratamento oral com AU, além de não causar dano no coração, é capaz de diminuir os
níveis de peroxidação lipídica hepática (figura 15)
CTR AU0
100
200
300
***
Flu
ore
scên
cia
(U
.A)
CTR AU0
100
200
300
400
500
600
700
800
*
Flu
ore
scên
cia
(U
.A)
44
Figura 15. Níveis peroxidação lipídica medida por TBARS em Fígado de camundongo. (A) Corações de camundongos (0,0438 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=9) e tratados com AU (0,0180 ± 0,011 nmol MDA min-1.MG proteína-1, n=8). e (B) Fígados de camundongos (0,0145 ± 0,021 nmol MDA min-1.mg proteína1, n=8) e tratados com AU (0,004 ± 0,022 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=9). Tratamento com AU durante 5 dias, 50mg/kg/dia. Os dados são representados como a média ± EPM, Painel A: *P<0,05.
Tais resultados (figura 15, painel A), mostrando a diminuição dos níveis de TBARS
no fígado são um indicativo de que o AU não trouxe dano hepático para os camundongos
durante os cinco dias de tratamento oral.
4.4 Expressão das NOS totais no tecido cardíaco
Para avaliar se o tratamento com AU poderia alterar a expressão da enzima produtora
de NO. Foram realizados experimentos de western blot para avaliarmos a expressão das
isoformas eNOS e nNOS no coração de camundongos tratados com AU. Nossos resultados
demonstram que o tratamento não foi capaz de alterar a expressão da isoforma nNOS (figura
16 painel A). Entretanto, o tratamento com AU alterou a expressão da isoforma eNOS no
tecido cardíaco (figura 16 painel B).
45
Figura 16. Expressão de Oxido Nítrico sintases (NOS). Gráficos de barra mostrando a expressão proteica das isoformas enzimáticas (A) nNOS e (B) eNOS EM miocárdio camundongos controle (CTR) e tratados com ácido úsnico (AU) e abaixo as imagens representativas de western blot. Os valores da densitometria foram normalizados pelos níveis proteicos de tubulina nos camundongos dos grupos CTR e AU. Os dados são representados como a média ± EPM, Painel B:**P<0,01.
4.5 Medida do perfil redox no tecido cardíaco
A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), após o tratamento com AU, foi
avaliada, primeiramente, através das medidas da atividade total da SOD e da expressão das
isoformas CuZn-SOD (SOD-1) e Mn-SOD (SOD-2). Os resultados podem ser observados na
figura 17. Na figura 17- Painel A vemos que a atividade SOD total está aumentada após
tratamento com AU (CTR = 7,98 ± 2,5 unidades/mg de proteína e AU =25, 02 ± 4,5
unidades/mg de proteína). No painel B podemos observar que não há diferença entre os
camundongos controles e tratados em relação à expressão da CuZn-SOD (SOD-1) e no painel
C observamos que a expressão proteica da Mn-SOD (SOD-2) está aumentada nos
camundongos tratados com AU, em relação ao controle.
46
Figura 17. Atividade e expressão da superóxido Dismutase (SOD). Gráficos de barra mostrando (A) a atividade total da SOD, (B) expressão proteica da CuZn-SOD (SOD-1) e (C) expressão proteica da Mn-SOD (SOD-2) no miocárdio camundongos controle (CTR) e tratados com ácido úsnico (AU) e abaixo as imagens representativas de western blot. Os valores da densitometria foram normalizados pelos níveis proteicos de tubulina nos camundongos CTR e AU. Os dados são representados como a média ± EPM, Painel A: **P<0,01; Painel C *P<0,05.
Conforme mostrado, na figura 18, foi avaliada a expressão da NADPH oxidase no
coração dos camundongos tratados com AU e pudemos observar uma diminuição na
expressão desta enzima.
Figura 18. Expressão da NADPH oxidase no miocárdio de camundongos controle (CTR) e tratados com ácido úsnico (AU) e abaixo as imagens representativas de western blot. Os valores da densitometria foram normalizados pelos níveis proteicos de tubulina nos camundongos CTR e em experimentos em AU. Os dados são representados como a média ± EPM, *P<0.05.
47
Posteriormente foram realizados experimentos para mensuração da atividade e
expressão da enzima catalase, bem como, experimentos de expressão da enzima glutationa
peroxidase (GPx) (Figura 19).
Figura 19. (A) Atividade total da enzima catalase, (B) expressão da enzima catalase e (C) expressão da Glutationa peroxidase (GPx) no coração de camundongos controles e tratados com AU. Tratamento com AU durante 5 dias, 50mg/kg/dia, n=5. Os dados são representados como a média ± EPM, *P<0.05.
Os resultados mostrados na figura 19 mostram que o tratamento com AU promoveu a
diminuição da atividade total da catalase (CTR = 1,37 ± 0,77 AE. min-1.mg proteína-1) e AU =
0,45 ± 0,22 AE. min-1.mg proteína-1) (Painel A), entretanto, a expressão da catalase não se
encontra alterada (Painel B) e a expressão da GPx se mostrou aumentada no coração dos
camundongos tratados com AU, em relação ao CTR (Painel C).
4.6 Experimentos com camundongos chagásicos
4.6.1 Avaliação de parâmetros cardíacos em sistema de Langendorff
Em seguida iniciamos experimentos com animais infectados com T. cruzi, a fim de
avaliar o efeito do AU sobre alguns parâmetros da função cardíaca o efeito redox no animal
chagásico. Primeiramente, foi avaliada a atividade mecânica do coração isolado em sistema
de Langendorff em camundongos não infectados (figura 20) e em seguida avaliamos os
mesmos parâmetros em camundongos infectados com T. cruzi (figura 21).
48
As medidas foram realizadas durante a contração em ritmo sinusal e fluxo de perfusão
constante e retrógrada do órgão isolado, em camundongos saudáveis, que receberam
tratamento oral com veículo ou AU (figura 20). A partir dos traçados obtidos durante o
registro, calculamos, primeiramente, a tensão mínima ou tensão diastólica e a tensão máxima
ou sistólica.
As medidas de tensão diastólica (figura 20 - painel A) não revelaram alterações
significativas (p>0,05) entre os animais do grupo controle (CTR) os animais do grupo AU.
Analisando a tensão sistólica, também não foram encontradas diferenças significativas entre
os dois grupos estudados (figura 20 - painel B). Estes resultados da medida das tensões
diastólica e sistólica, em conjunto, sugerem que o tratamento oral com o AU não interfere na
força de contração cardíaca.
Em seguida, passamos para a avaliação da frequência cardíaca e resistência
coronariana nos grupos experimentais (figura 20 – painéis C e D). As medidas da frequência
cardíaca realizadas no órgão isolado foram expressas em batimentos por minuto (bpm) e a
resistência coronariana foi avaliada por meio da pressão de perfusão em mmHg. A análise dos
resultados mostrou que a frequência cardíaca e a resistência coronariana não diferem
significativamente entre ambos os grupos estudados.
Ao verificarmos que o AU não alterou a contratilidade em camundongos saudáveis,
repetimos os experimentos de coração isolado em sistema de Langendorff, utilizando
camundongos infectados com T. cruzi e tratados (Chagas AU) e não tratados (Chagas veículo)
com AU. Os camundongos chagásicos se encontravam no início da fase crônica da infecção
por T. cruzi (aproximadamente 45 a 50 dias de infecção). Os resultados mostrados na figura
21 (painéis A, B, C e D) mostram que o AU não alterou a tensão diastólica, tensão sistólica,
frequência cardíaca e resistência coronariana nos camundongos chagásicos tratados com AU,
quando comparados com os camundongos chagásicos que receberam apenas veículo.
49
Figura 20. Avaliação da função cardíaca em coração isolado de camundongos. (A) Variação da tensão diastólica, (B) Variação da tensão sistólica, (C) Avaliação da frequência cardíaca e (D) Avaliação da pressão de perfusão. Camundongos do grupo controle receberam tratamento por via oral com veículo (CTR, n=6) e camundongos do grupo AU receberam tratamento por via oral com ácido úsnico (AU, n=6). Os resultados representam a média ± E.P.M.
50
Figura 21. Avaliação da função cardíaca em coração isolado de camundongos chagásicos. (A) Variação da tensão diastólica, (B) Variação da tensão sistólica, (C) Avaliação da frequência cardíaca e (D) Avaliação da pressão de perfusão. Camundongos do grupo Chagas receberam tratamento por via oral com veículo (CTR, n=8) e camundongos do grupo Chagas AU receberam tratamento por via oral com ácido úsnico (AU, n=8). Os resultados representam a média ± E.P.M.
51
Posteriormente, os níveis de peroxidação lipídica também foram avaliados no coração
e no fígado de camundongos chagásicos (figura 22). Os resultados mostram que nos
camundongos infectados com T. cruzi, o tratamento com AU diminui os níveis de TBARS.
CTR 0,1843 ± 0,053 nmol MDA min-1 . mg proteína -1 e tratados com AU 0,1164 ± 0,068
nmol MDA min-1 . MG proteína -1 nos corações Chagásicos e CTR 0,2340 ± 0,050 nmol
MDA min-1 . mg proteína -1 e tratados com AU 0,1513 ± 0,022 nmol MDA min-1 . MG
proteína -1 nos fígados chagásicos.
4.6.2 Peroxidação lipídica
Figura 22. Níveis de peroxidação lipidica. (A) C oração de camundongos chagásicos tratados com ácido úsnico (AU) e (B) fígado de camundongos chagásicos tratados com AU. (Chagásico n=7; Chagásico AU n=7). Tratamento com AU durante 5 dias, 50mg/kg/dia. Os dados são representados como a média ± EPM, *P<0,05.
A diminuição de peroxidação lipidica nos animais chagásicos sugere tanto que, esses
camundongos não sofreram dano cardíaco ou hepático em decorrência do tratamento com
AU, quanto, que o AU tem potencial antioxidante na doença de Chagas, pois reduz os níveis
de peroxidação lipídica.
Em camundongos infectados com T. cruzi, também foi avaliada a atividade total da
SOD (figura 23). Na comparação com os camundongos que receberam apenas veículo, pode-
se perceber que há um aumento da atividade da SOD, tanto no coração (figura 23 – painel A),
como no fígado (figura 23 - painel B) dos camundongos chagásicos tratados com o AU.
4.6.3 Atividade total da SOD
52
Figura 23. Atividade da enzima superóxido dismutase total (A) no coração de camundongos chagásicos e tratados com AU (n=6) e (B) no fígado de camundongos controles e tratados com AU (n=5). Tratamento com AU durante 5 dias, 50mg/kg/dia. Os dados são representados como a média ± EPM, *P<0,05.
Os resultados indicam que o tratamento com AU demonstra o mesmo potencial
antioxidante nos camundongos chagásicos e saudáveis, visto que a atividade SOD está
aumentada (figura 17 painel A e figura 23), tanto em animais controle como em animais
chagásicos após o tratamento com AU.
Tanto os resultados pós-exposição in vitro, quanto pós-tratamento oral com AU,
mostraram que o AU tem potencial antioxidante. O AU promoveu a diminuição intracelular
do NO, espécies reativas de oxigênio e •O2- (figuras 12, 13 e 14), bem como induziu o
aumento da expressão das enzimas eNOS, Mn-SOD e GPx e reduziu a expressão da enzima
pró-oxidante da NADPH oxidase, bem como, induziu o aumento da atividade total da SOD
(figuras 17, 18, 19 e 23). Assim sendo os resultados pós-exposição in vitro, são
complementados pelos resultados pós-tratamento oral com AU.
53
5. DISCUSSÃO
O AU é uma substância com caráter lipofílico, portanto apolar, e, devido aos seus
variados efeitos, apresenta-se com potencial para se tornar medicamento, pois possui
atividade antiparasitária, anti-inflamatória, antipirética, antifúngica, antitumoral, dentre
outras. Entretanto, a literatura aponta que a utilização indiscriminada do AU, como
suplemento alimentar, tem gerado relatos de intoxicação e falência hepática. A toxicidade
desta molécula tem sido discutida também em modelos de tratamento in vitro, demonstrando
que o AU pode ser tóxico para células hepáticas em cultura e outros tipos celulares. Pouco se
conhece sobre os efeitos do AU sobre o sistema cardiovascular. Em seu estudo, Mendonça
(2009) demonstrou que o AU apresentava elevada toxicidade para o tecido atrial cardíaco,
observando efeito inotrópico negativo sob o tecido atrial, de forma dose-dependente. Em
contrapartida, De Carvalho et al. (2005) demonstraram que esta molécula pode ser benéfica,
uma vez que interfere com a viabilidade do protozoário intracelular T. cruzi dentro
macrófagos. As observações destes autores, do nosso ponto de vista, tornam relevante o
conhecimento mais aprofundado dos efeitos biológicos desta molécula no coração, uma vez
que este parasita é o causador da cardiomiopatia chagásica, e a sua eliminação poderia ter
efeito indispensável aos pacientes acometidos por esta patologia.
A toxicidade do AU foi avaliada em vários trabalhos. Cheng et al. (2009) mostraram
no modelo de exposição, in vitro, de cultura celular, que a IC50 do
dado demonstrou que, em cultura de fibroblastos de ratos, a concentração para que 50% das
células tenham sua viabilidade comprometida
vezes maior que concentração máxima utilizada em nossos ensaios de metabolização do MTT
(figura 8).
Entretanto, Sahu et al (2011) mostraram que células hepáticas da linhagem HepG2
expostas ao AU durante 24 horas, apresentam um decréscimo de viabilidade, dependente de
concentração, e, por conseguinte, um aumento da citotoxicidade em intervalos de
concentração de 0, 5, 10, 20, 50 e 100mM. Nestas células a IC50 foi de 30 mM, ou seja, uma
54
concentração 300 vezes maior que a concentração máxima utilizada em nossos experimentos
(figura 8).
Pouco se sabe sobre os efeitos do AU sobre a contratilidade e a função cardíaca.
Entretanto, Mendonça (2009), estudou a contratilidade atrial de cobaias, em banho de órgão
isolado, incubando os átrios com concentrações de AU entre 1 e 800 Os resultados
mostraram que o AU foi capaz de diminuir a contratilidade atrial, aumentar a tensão diastólica
e aumentar também os tempos de contração e relaxamento. Os experimentos realizados neste
estudo demonstraram que a concentração mais baixa de AU (1 feito sobre a
contratilidade atrial. Entretanto as concentrações mais altas (próximas a 800
capazes de promover uma contratura diastólica irreversível do músculo atrial cardíaco.
Diante disto, para confirmamos, em concentrações mais baixas, a ausência de
toxicidade para células cardíacas e avaliarmos o possível efeito do AU sobre a contratilidade
das células cardíacas, bem como, sobre mecanismos que integram o acoplamento excitação-
contração, foram realizados experimentos in vitro utilizando-se células cardíacas isoladas.
A alteração da contratilidade cardíaca pode estar diretamente relacionada a alterações
na liberação de Ca +2 (BERS, 2002). Contudo, nossos resultados mostram que o AU não é
capaz de interferir na contratilidade das células ventriculares cardíacas isoladas nas
concentrações utilizadas (figura 9).
Em conjunto, os resultados mostrados nas figuras 09 e 10 contrastam com os
resultados obtidos por Mendonça (2009), cujos experimentos realizados com a mesma sonda
para cálcio (Fluo4-AM) mostraram que o AU foi capaz de aumentar a liberação de cálcio
intracelular de cálcio. Entretanto, a diferença observada em nosso estudo pode ter ocorrido
devido ao fato de que, nos experimentos realizados pela autora, as células cardíacas foram
expostas a duas concentrações de AU (100 , sendo que, nas células cardíacas
isoladas e de AU, durante 2 minutos, o aumento de fluorescência teve
intensidade fraca, permitindo apenas o delineamento das bordas do cardiomiócito, contudo,
apó
permitindo o delineamento das bordas e das estriações do cardiomiócito. E nos cardiomiócitos
de AU durante 30 minutos, ocorreu um aumento intenso da fluorescência
de cálcio, ofuscando a observação das estriações.
55
Assim, como existe ainda uma diferença grande na concentração de AU avaliada e,
também, difere a abordagem metodológica utilizada em ambos os trabalhos, podemos
justificar a dificuldade de esclarecimento de pontos específicos do nosso questionamento.
Em contrapartida, a ausência de alterações observadas nos parâmetros analisados da
contração celular e da homeostase do cálcio disponibilizado para a contração, aliada a
consonância com estudos nos quais não se detectaram efeitos tóxicos do AU (MENDONÇA,
2009; CHENG et al., 2009). Tais resultados nos impulsionam a acreditar no potencial desta
substância, e trazer mais questionamentos sobre o efeito desta substância sobre o coração.
Os resultados mostrados nas figuras 12 e 13 mostram que o AU pode ter efeito
antioxidante no coração, estes resultados corroboram dados presentes na literatura, que
apontam o AU como uma substância antioxidante. (RABELO et al. 2012).
Rabelo et al. (2012) observaram que a exposição ao AU diminuiu a produção de
radical OH a partir de concentrações de 2 (aproximadamente 6 a
formação de NO em concentrações a partir de 2 ng/mL (aproximadamente 6 nM). Em outro
estudo, Jin et al. (2008), avaliaram o efeito do AU sobre a produção de NO, induzida por
LPS, em cultura de macrófagos RAW 264,7. Os resultados mostram que, após incubação de
24 horas, o AU foi capaz de reduzir a produção de NO de maneira concentração dependente,
sendo que a redução da produção de NO começou a ser observada na concentração de 3
nas concentrações de 10 e 20
não estimuladas com LPS. Ambos os estudos mostraram que a exposição in vitro ao AU foi
capaz de promover a diminuição de óxido nítrico em cultura de células.
A literatura apresenta o AU como uma substância capaz de induzir, tanto estresse
oxidativo, como efeito antioxidante (HAN et al., 2004; SAHU et al., 2011; RABELO et al.,
2012). Utilizando a sonda intracelular DCFH, Han et al. (2004) observaram que hepatócitos,
incubados com AU na concentração de 5 , apresentavam aumento na produção de ROS.
No entanto, em uma concentração mais baixa (2 na produção
de ROS em comparação com o controle. De acordo com Sahu et al. (2011), a exposição, in
vitro, de células hepáticas HepG2 ao AU, durante 24 horas, foi capaz de induzir aumento
significativo no estresse oxidativo, em concentrações superiores de M. Estes resultados
contrastam com o observado na figura 13, onde a exposição ao AU foi capaz de reduzir a
quantidade de ROS intracelular. Entretanto, a diminuição da medida de ROS observada com a
56
sonda intracelular DCFH corrobora os resultados de Rabelo et al. (2012), onde foi observado
que o AU pode induzir a diminuição radical OH em cultura de células neuronais.
A diminuição de ânion superóxido observada em nossas medidas (figura 14) corrobora
et al. (2012), onde foi demonstrado que os componentes de liquens
isolados, incluindo o AU, apresentam forte atividade sequestradora de radicais livres, maior
do que os de extratos desses compostos. Os autores relataram que o AU foi capaz de
sequestrar ânion superóxido e radical DPPH e a IC50, ou seja, quantidade de AU para que seja
para radical DPPH.
Os resultados mostrados nas figuras 09, 10 e 11, e os relatos da literatura
anteriormente citados, sugerem que concentrações mais baixas de AU induzem efeitos
antioxidantes, enquanto concentrações mais altas desta substância claramente induzem efeito
oxidante.
O AU parece ter efeitos similares ao 2,4-dinitrofenol (DNP) (ABO-KHATWA et al.,
1996). A literatura mostra o DNP como um potente desacoplador da cadeia transportadora de
elétrons (KUMA e BONNER, 1967; JIN et al., 2004). Nossos resultados dos experimentos de
mensuração de ROS e RNS com as sondas DAF-AM, DCFH e DHE (Figuras 09, 10 e 11),
sugerem que o AU, em concentrações baixas, tem efeito antioxidante no coração.
Considerando os efeitos antioxidantes descritos com o uso de desacopladores da cadeia
transportadora de elétrons na mitocôndria, como o DNP (SILVA et al., 2008;
KOWALTOWSKI et al., 2009), pode-se sugerir que um leve desacoplamento da cadeia
transportadora de elétrons pode ser responsável pela diminuição de RNS e ROS observadas
com o uso do AU.
O desacoplamento mitocondrial é cada vez mais reconhecido como um mecanismo
pelo qual as células modulam o metabolismo de energia e seu estado redox (SILVA et al.,
2008; KOWALTOWSKI et al., 2009; CUNHA et al., 2011). Estudos mostram que o DNP
tem sido utilizado como um agente antiobesidade por causa de seus efeitos de dissipação de
energia, que imitam os efeitos de uma dieta com restrição calórica. (SILVA et al., 2008;
CERQUEIRA et al., 2011).
Segundo Abo-Khatwa et al., (1996), o efeito desacoplador do AU foi dependente da
dose, sendo que a concentração mínima requerida para causar o desacoplamento completo da
57
cadeia transportadora de elétrons em células hepáticas de camundongos foi de 1
Korshunov et al. (1997) mostraram que, em mitocôndria isolada de músculo cardíaco de
ratos, alterações nas taxas respiratórias foram capazes de promover a diminuição na produção
de H2O2. Este dado, juntamente com os resultados de Abo-Khatwa et al., (1996) corroboram
os nossos resultados observados na figura 10, onde foi mostrado uma diminuição de ROS
após exposição in vitro ao AU.
O desacoplamento mitocondrial brando tem sido associado com uma diminuição da
produção de ROS em preparações mitocondriais isoladas. Isto ocorre devido ao fato de que,
pequenas alterações nas taxas respiratórias são descritas como causadoras de reduções
substanciais na produção de ROS (SKULACHEV, 1998; BALABAN et al., 2005).
A literatura relata que o tratamento crônico, por via oral, com DNP, é capaz de
prevenir o ganho de peso ao longo da vida do camundongo e aumentar a longevidade (SILVA
et al., 2008). Em relação ao AU, existem relatos de utilização dessa substância por humanos
que mostram que o AU pode ser um potente agente hepatotóxico (HSU et al., 2005;
BUNCHORNTAVAKUL e REDDY, 2012). Entretanto outros dados na literatura apontam
que o tratamento por via oral em ratos não apresenta toxicidade e, ainda, teria efeito
antioxidante (ODABASOGLU et al., 2006).
A partir dessas informações, iniciamos o tratamento de camundongos com AU por via
oral (gavagem), a fim de avaliar os efeitos do AU sobre o coração. A dose escolhida
(50mg/kg) foi baseada no estudo de Odabasoglu et al. (2006), onde os autores trataram ratos
com doses de 25, 50, 100 e 200mg/kg e não foi observada toxicidade com a dose de 50mg/kg
e, nesta dose, o AU se mostrou gastroprotetor e antioxidante.
A peroxidação lipídica avaliada da detecção das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico, principalmente, o malondialdeído, mostrou que a diminuição dos níveis de
TBARS no fígado é um forte indicativo que o tratamento com AU não trouxe dano hepático
para os camundongos, pois a medida dos níveis de malondialdeído pode ser considerada uma
medida indireta dos níveis de dano celular (BRANCACCIO et al. 2010). Nossos resultados
mostraram ainda que, nos camundongos saudáveis, o tratamento com AU não promoveu
danos por peroxidação lipídica no coração (figura 15).
Odabasoglu et al. (2006) mostram que o tratamento oral com AU nas doses de 25, 50,
100 e 200mg/kg também foram capazes de promover diminuição da peroxidação lipídica
58
(avaliada através da medida nos níveis de TBARS) em estômago de ratos com ulcerações,
provocadas pela administração de indometacina. Neste mesmo estudo, foi mostrado que o
tratamento com a indometacina provocou dano oxidativo ao estômago dos ratos e o AU foi
capaz de reverter esses danos.
Além da peroxidação lipídica também foram avaliadas as expressões de proteínas
relacionadas à produção ou neutralização de espécies reativas. A literatura aponta que o
tratamento com AU é capaz de diminuir a expressão da iNOS induzida por LPS em cultura de
macrófagos RAW 264,7 (JIN et al., 2008). Entretanto o efeito deste tratamento sobre a
expressão da eNOS e nNOS não está relatado na literatura. A isoforma “endotelial” da NO
sintase (eNOS) localiza-se preferencialmente na caveola da membrana do sarcolema. Ela é
expressa em associação com a proteína caveolina-3 (Cav-3). No coração saudável, a isoforma
“neuronal” da NOS (nNOS) está predominantemente localizada no retículo sarcoplasmático, e
está associado com o RYR e xantina oxidorredutase (XOR) (FERON e BALLIGAND, 2005;
ZHANG et al., 2009).
Também está descrito que a nNOS pode modular vários componentes do AEC,
incluindo influxo Ca2+ através do tipo canal para cálcio tipo L e liberação de Ca2+ pelo RyR2 e
a recaptação de Ca2+ pela SERCA2a. A nNOS também pode ter um efeito inibidor sobre a
produção de ânion superóxido. Há evidências sugerindo que a estimulação dependente de
estiramento pode aumentar a síntese de NO pela eNOS no miocárdio e estimular a atividade
do receptor de RyR2. Entretanto aumentos na força de contração está muito mais relacionada
com alterações na expressão da nNOS do que com alterações de expressão da eNOS.
(ZHANG et al., 2009)
O efeito do AU sobre a atividade da SOD foi avaliado no trabalho de Rabelo et al.
(2012) e não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos controle e expostos ao
AU (RABELO et al., 2012). Quanto à expressão da SOD não foram encontrados trabalhos na
literatura que com tais resultados. É interessante notar que a Mn-SOD, é a principal enzima
antioxidante mitocondrial sendo essencial para a manutenção da função e desenvolvimento
normal da célula. O aumento da expressão do gene da Mn-SOD demonstrou ter efeito
benéfico em vários modelos de doenças cardíacas, como a cardiomiopatia diabética e a
insuficiência cardíaca. (SHEN et al. 2006; TSUTSUI et al., 2003).
59
O •O2- pode ser gerado, em grande parte pela NADPH oxidase, sendo que esta é
considerada uma enzima pró-oxidante e pode atuar também no aumento de H2O2 no tecido
cardíaco (TAKEYA e SUMIMOTO, 2006). Baseado no que foi descrito por Takeya e
Sumimoto (2006), podemos relacionar, de forma indireta, a diminuição da expressão da
NADPH oxidase cardíaca (figura 18) com a diminuição da medida apresentada •O2- (figura
14). Os resultados dos experimentos realizados após tratamento oral com AU corroboram os
resultados dos experimentos realizados após exposição in vitro ao AU, pois o aumento da
atividade total da SOD (figura 17) pode explicar a ocorrência da diminuição do •O2-
intracelular (figura 14).
Odabasoglu et al. (2006) mostram que o tratamento oral com AU nas doses de 25, 50,
100 e 200 mg/kg também é capaz de promover o aumento da atividade e expressão da
catalase no estômago de ratos, o que contrasta com os nossos resultados (figura 19 – painéis A
e B), onde, observamos que a atividade da catalase se mostrou diminuída após tratamento oral
com AU e a expressão desta enzima não se mostrou alterada com tratamento com AU.
Entretanto Odabasoglu et al. (2006) mostram que a expressão da enzima GPx se mostrou
aumentada após o tratamento com AU o que corrobora o resultado mostrado no painel C da
figura 19.
O aumento da expressão do gene Mn-SOD também pode elevar a expressão dos níveis
de GPx e catalase em miócitos. A GPx e a catalase podem atuar em conjunto com Mn-SOD
contra o estresse oxidativo (TSUTSUI et al., 2003). Conforme observado nas figuras 17 e 19,
a expressão das enzimas Mn-SOD e GPx encontram-se aumentadas após o tratamento com
AU, o que corrobora o que foi descrito por Tsutsui et al. (2003).
Tanto os resultados dos experimentos com células isoladas expostas in vitro, quanto os
resultados do tratamento oral com AU mostraram que esta substância tem potencial
antioxidante, podemos observar que, os resultados dos experimentos de exposição celular in
vitro, são complementados pelos resultados dos experimentos utilizando tratamento oral de
animais tratados com AU.
É interessante notar que o coração exibe um complexo sistema envolvido na propulsão
e circulação sanguínea. Assim, os processos mecânicos de contração-relaxamento e rítmicos
do coração têm importância fundamental. Alterações transitórias nos intervalos entre os
batimentos podem afetar profundamente a força de contração. Desta forma, ocorre regulação
60
intrínseca do desempenho do miocárdio induzida pela frequência. Distúrbios nestes
fenômenos podem ocasionar graves patologias como as insuficiências cardíacas (MARK et
al., 2002). Na doença de Chagas podem ocorrer alterações nos processos mecânicos de
contração-relaxamento e rítmicos do coração.
É importante ressaltar que na avaliação da contratilidade cardíaca não encontramos
diferença significativa entre os grupos de animais saudáveis e chagásicos (figuras 20 e 21). A
ausência de alterações nos parâmetros contráteis dos animais infectados com o parasita T.
cruzi quando comparados aos animais não infectados podem ser explicados pelo tempo de
infecção dos animais. Os camundongos utilizados neste estudo foram avaliados
aproximadamente com 45 a 50 dias após a infecção com o parasita, ou seja, eles se
encontravam no início da fase crônica da infecção. Nesta fase da doença pode não ser possível
identificar sinais claros de hipertrofia dilatada e alterações na força e frequência de contração
(ACQUATELLA, 2007).
É interessante o fato de que, em pacientes com miocardite chagásica aguda, é possível
encontrar alterações contráteis ou quadros de derrame pericárdico e tamponamento. Na fase
crônica, muitos pacientes são assintomáticos e apresentam ECG normal, função sistólica
global normal, mas anormalidades contráteis e diastólicas podem ser encontradas, embora o
significado destes achados, na progressão da doença, seja desconhecido (ACQUATELLA,
2007).
A literatura demonstra que o estresse oxidativo é comum nas fases aguda e crônica da
doença de Chagas e que a utilização da intervenção antioxidante pode atenuar a progressão da
doença (OLIVEIRA et al., 2007; MAÇAO et al., 2007; BUDNI et al., 2012).
A ação do •O2- e do H2O2 é modulada pela presença de diferentes proteínas
antioxidantes, como a SOD, catalase e a GPx. Entretanto, além de ser observado um aumento
na produção das ROS na infecção por T. cruzi, também é observado uma redução das enzimas
antioxidantes, como a GSH e a MnSOD, o que indica que ocorre um desbalanço entre
produção e neutralização das ROS (VYATKINA et al., 2004; GUPTA et al., 2009). Nesse
sentido nossos resultados mostram que o AU poderia ajudar na terapia anti T. cruzi, pois
observamos uma redução nos na atividade total da SOD e na peroxidação lipídica.
A importância de se controlar o estresse oxidativo durante a infecção por T. cruzi é
demonstrada em estudos, onde o tratamento com antioxidante ou a privação de antioxidantes
61
promove respectivamente a melhora ou a piora dos danos cardíacos (CARVALHO et al.,
2006; WEN et al., 2006; MACAO et al., 2007). Um exemplo de aumento de danos cardíacos
causados por estresse oxidativo foi demonstrado por Carvalho et al. (2006), onde, utilizando
ratos chagásicos, a privação de vitamina-E agravou o dano cardíaco e a inervação cardíaca
durante a fase aguda da doença de Chagas.
Wen et al. (2006) demonstraram que, camundongos infectados com T. cruzi e tratados
com Fenil-N-tert-butilnitrona (PBN), uma substância antioxidante, apresentaram melhora na
atividade da cadeia respiratória, contribuindo para melhora dos danos cardíacos observados na
fase aguda da doença de Chagas. Nesse sentido, Macao et al. (2007), em um estudo com
humanos, também observaram redução no estresse oxidativo de indivíduos tratados com
vitamina A.
Somada as informações já apresentadas, é interessante notar que os tratamentos
disponíveis para a fase aguda da doença de Chagas, como o Benzonidazol e o Nifurtimox
provocam aumento de estresse oxidativo, pois o mecanismo de ação destes dois fármacos é
via geração de ROS, capaz de matar o T. cruzi (MONCADA et al., 1989; PEDROSA et al.,
2001). Assim sendo, o AU pode ter potencial terapêutico na doença de Chagas, pois o
tratamento com AU não altera a contratilidade cardíaca (figuras 20 e 21) e tem efeito
antioxidante no animal chagásico (figuras 22 e 23).
62
7. CONCLUSÃO
Concluímos que o ácido úsnico, nas concentrações utilizadas neste estudo, foi capaz
de promover a redução do estresse oxidativo, tanto em células cardíacas isoladas e expostas in
vitro, a ele, bem como, após o tratamento de animais, por via oral. E do ponto de vista
cardíaco, esta substância não trouxe alterações nos parâmetros fisiológicos estudados, o que
nos indica que o AU tem potencial terapêutico tanto como substância antioxidante no coração
bem como, potencial terapêutico na doença de Chagas.
63
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abo-Khatwa AN, Al-Robai AA, Al-Jawhari DA (1999). Lichen acids as uncouplers of oxidative phosphorylation of mouse-liver mitochondria. Natural Toxins 4: 96–102
Acquatella H (2007). Echocardiography in Chagas heart disease Review. Circulation Research. 6 (9):1124-31
Akki A, Zhang M, Murdoch C et al. (2009) NADPH oxidase signaling and cardiac myocyte function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 47: 15-22
Alvarez MN, Piacenza L, Irigoín F et al. (2005) Macrophage-derived peroxynitrite diffusion and toxicity to Trypanosoma cruzi. Archives of Biochemistry and Biophysics. 432: 222–232
Andrade L, Andrews NW (2005) The Trypanosoma cruzi-host-cell interplay: location, invasion, retention. Nature Reviews Microbiology. 3:819-823
Andrade ZA, Andrade SG, Oliveira GB et al. (1978) Histopathology of the conducting tissue of heart on Chagas’ myocarditis. American Heart Journal. 95: 316-324
Ansley DM, Wang B. (2013) Oxidative stress and myocardial injury in the diabetic heart. Journal of Pathology. 229 (2):232-41
Bassani JW, Bassani RA, Bers DM. (1994) Relaxation in rabbit and rat cardiac cells: species-dependent differences in cellular mechanisms. Journal of Physiology. 15 (2):279-93
Bendall JK, Alison C, Cave AC et al. (2002) NADPH oxidade in angiotensin II induced cardiac hypertrophy in mice. Circulation Research. 105: 293-296
Berne RB, Levy MN. (2000) Tratado De Fisiologia Humana. 4 Ed. RJ. Guanabara Koogan
Bers DM. (1991) Ca2+ regulation in cardiac muscle. Medicine and Science in Sports and Exercise's. 23 (10):1157-1162
Bers DM. (2001) Excitation-contraction coupling and cardiac contractile force. 2 Ed. Kluwer Academic Publisher
Bers DM. (2002) Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 10 (6868):198-205
64
Bers DM. (2008) Calcium cycling and signalling in cardiac myocytes. Annual Review of Physiology. 70: 23-49
Bouchard RA, Clark RB, Giles WR. (1993) Role of sodium-calcium exchange in activation of contraction in rat ventricle. Journal of Physiology. 472:391-413
Brener Z, Andrade ZA, Barral-Netto M. (2000) Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. Editora Guanabara-Koogan, 2 Ed
Budni P, Pedrosa RC, Garlet TR et al.(2012) Carvedilol attenuates oxidative stress in chronic chagasic cardiomyopathy. Arquivo Brasileiro de Cardiolgia. 98 (3):218-24
Bunchorntavakul C, Reddy KR. (2013) Review article: herbal and dietary supplement hepatotoxicity. Aliment Pharmacology Therapy. 37 (1):3-17
Burgoyne JR, Mongue-Din H, Eaton P et al. (2012) Redox signaling in cardiac physiology and pathology. Circulation Research. 28 (8):1091-106
Cardarelli M, Serino G, Campanella L et al. (1997) Antimitotic effects of usnic acid on different biological systems. Cellular Molecular Life Science. 53:667–672
Carvalho LS, Camargos ER, Almeida CT et al. (2006) Vitamin E deficiency enhances pathology in acute Trypanosoma cruziinfected rats. Transactions of the royal society of tropical medicine and hygiene. 100:1025-1031
Capettini LSA. (2009) El estrés oxidativo en la fisiopatología de las enfermedades pulmonares. In: Maria da Gloria Rodrigues Machado. (Org.). Bases de la Fisioterapia Respiratoria - Terapia Intensiva y Reabilitación. São Paulo. Guanabara Koogan, v. 43
Cave AC, Brewer AC, Narayanapanicker A et al. (2006) NADPH oxidases in cardiovascular health and disease. Antioxidant and Redox Signaling. 8 (5-6):691-728
Cerqueira FM, Laurindo FRM, Kowaltowski AJ. (2011) Mild Mitochondrial Uncoupling and Calorie Restriction Increase Fasting eNOS, Akt and Mitochondrial Biogenesis. Plos One. 6 (3):18433
Cheng YB, Wei LL, Gu N et al. (2009) Oral acute toxicity of (+)-usnic acid in mice and its cytotoxicity in rat cardiac fibroblasts. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao (Journal of Southern Medical University). 29 (8):1749-51.
65
Cherednichenko G, Zima AV, Feng W et al. (2004) NADH oxidase activity of rat cardiac sarcoplasmic reticulum regulates calcium-induced calcium release. Circulation Research. 5;94 (4):478-86
Clark JM, Lambertsen CJ. (1971) Pulmonary oxygen toxicity: a review. Pharmacological Reviews. 23 (2):37-133.
Cocchietto M, Skert N, Nimis PL et al. (2002) A review on usnic acid, an interesting natural compound. Naturwissenschaften. 89 (4):137-46.
Conover MA, Mierzwa R, King A et al. (1992) Usnic acid amide, a phytotoxin and antifungal agent from Cercosporidium henningsii. Phytochemistry 31, 2999–3001.
Crystal RG (1991) Oxidants and respiratory tract epithelial injury: pathogenesis and strategies for therapeutic intervention. American Journal of Medicine. 91 (3C):39-44
Cunha FM, Caldeira da Silva CC, Cerqueira FM, et al. (2011) Mild Mitochondrial Uncoupling as a Therapeutic Strategy Current Drug Targets. European Journal of Immunology. 12:783-789
Da Silva Santos NP, Nascimento SC, Wanderley MS et al. (2006) Nanoencapsulation of usnic acid: An attempt to improve antitumour activity and reduce hepatotoxicity. European Journal of Pharmacology Biopharmaceutical. 64 (2):154-60
De Carvalho EA, Andrade PP, Silva NH et al. (2005) Effect of usnic acid from the lichen Cladonia substellata on Trypanosoma cruzi in vitro: an ultrastructural study. Micron. 36 (2):155-161.
De Souza EL, De Barros JC, De Oliveira CE et al. (2010) Influence of Origanum vulgare L. essential oil on enterotoxin production, membrane permeability and surface characteristics of Staphylococcus aureus. International Journal Food Microbiology. 137:308–311
De Souza MM, Andrade SG, Barbosa AA et al. (1996) Trypanosoma cruzi strains and antonomic nervous stem pathology in experimental Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 91:217-224
Diel F, Horr B, Borck H et al. (1999) Pyrethroids and piperonyl-butoxide affect human T-lymphocytes in vitro. Toxicology Letters. 107:65-74
Dos Santos PV Roffê E, Santiago HC et al. (2001) Prevalence of CD8(+)alpha beta T cells in Trypanosoma cruzi-elicited myocarditis is associated with acquisition of CD6L(LOW)LFA-1(HIGH)VLA-4(HIGH) activation phenotype and expression of IFN-
66
gamma-inducible adhesion and chemoattractant molecules. Microbes and Infection, 3: 971-984
Durazo FA, Lassman C, Han SH et al. (2004) Fulminant liver failure due to usnic acid for weight loss. American Journal of Gastroenterology. 99:950-952
Engel K, Schmidt U, Reuter J et al. (2007) Usnea barbata extract prevents ultraviolet-B induced prostaglandin E2 synthesis and COX-2 expression in HaCaT keratinocytes. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 89: 9–14
Feron O, Balligand JL (2006) Caveolins and the regulation of endothelial nitric oxide synthase in the heart. Cardiovasc Res. 2006 Mar 1;69(4):788-97
Fisher AB (2009) Redox Signaling across cell membrane. Antioxidants and Redox Signalling. 11, 1349-1356
Florea VG, Anand IS (2012) Biomarkers. Heart Failure Clinics. 8(2):207-24
Francolini I, Norris P, Piozzi A et al. (2004) Usnic Acid, a Natural Antimicrobial Agent Able To Inhibit Bacterial Biofilm Formation on Polymer Surfaces. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 48 (11):4360–4365.
Fukai MU (2009) Compartmentalization of redox signaling through NADPH oxidase-derived ROS. Antioxidants and Redox Signaling. 11:1289-1299
Fuster V, Alexander RW, O’Rourke R et al (1998) Hurst’s the heart, 9 Ed. Hardcover
Gazzinelli RT, Oswald IP, Hieny S et al. (1992) The microbicidal activity of interferon-g-treated macrophages against Trypanosoma cruzi involves and L-arginedependent, nitrogen oxide-mediated mechanisms inhabitable by interleukin-10 and transforming grown factor-β. European Journal of Immunology. 22:2501-2056
Gioda CR (2010) Investigação das alterações morfo-funcionais no tecido cardíaco de ratos submetidos a uma dieta deficiente em tiamina. Tese de doutorado. Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Bioquímica. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte – MG.
Griendling KK e FitzGerald GA (2003) Oxidative stress and cardiovascular injury: Part I: basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS. Circulation. 21;108(16):1912-6
67
Gupta VK, Verma S, Gupta S et al. (2012) Membrane-damaging potential of natural L-(-)-usnic acid in Staphylococcus aureus. European Journal Clinical Microbiology Infect Disease. 31(12):3375-83.
Gupta S, Wen JJ, Garg NJ (2009) Oxidative stress in Chagas disease. Interdisciplinary perspective on infectious disease.
Guatimosim S (2001) Molecular identification of a TTX-sensitive Ca(2+) current. American Journal of Cell Physiology. 280 (5):1327-39
Gutierrez FR, Guedes PM, Gazzinelli RT et al. (2009) The role of parasite persistence in pathogenesis of Chagas heart disease. Parasite Immunology. 31, 673-685
Halliwell B e Gutteridge JM (1990) Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Methods in Enzymology. 186:1-85.
Halliwell B. (2000) Lipid peroxidation, antioxidants and cardiovascular disease: how should we move forward? Cardiovascular Research. 18; 47(3):410-8
Han D, Matsumaru K, Rettori D et al. (2004) Usnic acid-induced necrosis of cultured mouse hepatocytes: inhibition of mitochondrial function and oxidative stress. Biochemical Pharmacology 67: 439–451
Hilge M (2012) Ca2+ regulation of ion transport in the Na+/Ca2+ exchanger. Journal of Biology Chemical. 14 (38):31641-9
Hool LC, Corry B (2007) Redox control of calcium channels: from mechanisms to therapeutic opportunities. Antioxid and Redox Signaling. 9(4):409-35
Hsu LM Huang YS, Chang FY et al. (2005) 'Fat burner' herb, usnic acid, induced acute hepatitis in a family. J Gastroenterology Hepatology. 20 (7):1138-1139.
Ingólfsdóttir K (2002) Usnic acid. Phytochemistry 61:729-736
Jones LR, Field LJ (1993) Residues 2-25 of phospholamban are insufficient to inhibit Ca2+ transport ATPase of cardiac sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 268 (16):11486-11488
Jin Y, McEwen ML, Nottingham SA et al. (2004) The Mitochondrial Uncoupling Agent 2,4-Dinitrophenol Improves Mitochondrial Function, Attenuates Oxidative Damage, and
68
Increases White Matter Sparing in the Contused Spinal Cord. Journal of Neurotrauma. 21(10):1396-1404
Joseph A, Lee T, Moland CL et al. (2009) Effect of (+)-usnic acid on mitochondrial functions as measured by mitochondria-specific oligonucleotide microarray in liver of B6C3F1 mice. Mitochondrion 9: 149–158
Ju-qing Jin, Cui-qin Li and Lang-chong He (2008) Down-regulatory Effect of Usnic Acid onNuclear Factor- -dependent Tumor Necrosis Factor- and Inducible Nitric Oxide Synthase Expression in Lipopolysaccharide-stimulated Macrophages RAW 264.7. Phytotherapy. Research. 22: 1605–1609
Katz AM (1992) Physiology of the heart. 2 Ed. 2d.Raven Press
Keith M. (1998) Increased oxidative stress in patients with congestive heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 31(6):1352-6
Kowaltowski AJ Souza-Pinto N, Castilho, RF et al (2009) Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine 47:333-343
Krishna YR, Mittal V, Grewal P, et al. (2011
dietary supplements: A case report and literature review. Can J Gastroenterol. 25(3): 157–160.
Lauton-Santos S (2002) Avaliação de parâmetros da imunidade celular em trabalhadores rurais expostos ocupacionalmente a agrotóxicos em Minas Gerais. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Bioquímica. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte – MG.
Lauton-Santos S et al. (2007) Kinin B1 receptor participates in the control of cardiac function in mice. Life Sciences 81:814-822
Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM (2007) Lehninger: Princípios de Bioquímica, 4a. Edição, Editora Sarvier.
Lehotský J (1999) Membrane ion transport systems during oxidative stress in rodent brain: protective effect of stobadine and other antioxidants. Life Science. 65(18-19):1951-8.
Maçao LB, Wilhelm Filho D, Pedrosa RC et al (2007) Antioxidant therapy attenuates oxidative stress in chronic cardiopathy associated with Chagas' disease. International Journal of Cardiology. 15;123(1):43-9
69
Machado CR, Gomez MV, Machado ABM (1987) Changes in choline cetyltransferase activity of rat tissue during Chagas’ disease. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research. 20: 697-702
Machado CR, Ribeiro AL (1989) Experimental American trypanomiasis in rats: sympathetic denervation, parasitism and inflammatory process. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 84(4):549-56
Mendonça SCS (2009) Efeito do ácido úsnico obtido do líquen cladonia substellata vainio
sobre a contratilidade do átrio esquerdo de cobaia (cavia porcellus). Dissertação de mestrado. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão – SE.
Misquitta CM, Mack DP, Grover AK (1999) Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ (SERCA)-pumps: link to heart beats and calcium waves. Cell Calcium. 25(4):277-90
Moncada C, Repetto Y, Aldunate J et al. (1989) Role of glutathione in the susceptibility of Trypanosoma cruzi to drugs. Comparative Biochemistry and Physiology. 94 (1):87-91
Mosman T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival. Application to proliferation and cytotoxity assay. Journal of Immunology. 65: 55-63
Nelson DP, Kiesow LA (1972) Enthalphy of decomposition of hydrogen peroxide by catalase at 25°C (with molar extinction coefficients of H2O2 solution in the UV). Analytical Biochemistry 49(2): 474-478
Nunes PS, Albuquerque RL Jr, Cavalcante DR et al. (2011) Collagen-Based Films Containing Liposome-Loaded Usnic Acid as Dressing for Dermal Burn Healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011: 761593
Odabasoglu F, Cakir A, Suleyman H et al. (2006) Gastroprotective and antioxidant effects of usnic acid on indomethacin-induced gastric ulcer in rats. Journal of Ethnopharmacology 103(1):59-65
Pramyothin P, Janthasoot W, Pongnimitprasert N et al. (2004) Hepatotoxic effect of (+)usnic acid from Usnea siamensis Wainio in rats, isolated rat hepatocytes and isolated rat liver mitochondria. Journal of Ethnopharmacology 90: 381–387
Oliveira TB, Pedrosa RC, Filho DW (2007) Oxidative stress in chronic cardiopathy associated with Chagas disease. Int J Cardiol. 116(3):357-63
70
Pedrosa RC, De Bem AF, Locatelli C et al. (2001) Time-dependent oxidative stress caused by benznidazole. Redox Rep. 6 (4):265-70
Pizzo P e Pozzan T (2007) Mitochondria-endoplasmic reticulum choreography: structure and signaling dynamics. Trends in Cell Biology. 17(10):511-7
Postan M, Cheever AW, Dvorak JA et al. (1986) A histopathological analysis of the course of myocarditis in C3H/HE mice infected with Trypanosoma cruzi clone sylvio- X10/4. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 80:50-55
Prímola-Gomes TN, Campos LA, Lauton-Santos S et al. (2009) Exercise capacity is related to calcium transients in ventricular cardiomyocytes. Journal of Applied Physiology. 107(2):593-8.
Pryor WA (1986) Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions. Annual Review of Physiology 48:657-67.
Rabelo TK, Zeidán-Chuliá F, Vasques LM et al. (2012) Redox characterization of usnic acid and its cytotoxic effect on human neuron-like cells (SH-SY5Y). Toxicology in Vitro 26: 304–
314
Ramírez G, Valck C, Aguilar L. et al. (2012) Roles of Trypanosoma cruzi calreticulin in parasite-host interactions and in tumor growth. Molecular Immunology. 52 (3-4):133-140
Rancan F, Rosan S, Boehm K, Fernández E et al. (2002) Protection against UVB irradiation by natural filters extracted from lichens. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 68:133-139
Ranković B, Kosanić M, Stanojković T et al. (2012) Biological Activities of Toninia candida and Usnea barbata Together with Their Norstictic Acid and Usnic Acid Constituents. International Journal of Molecular Sciences . 13 (11):14707-22
Rassi AJ, Rassi A, Marcondes RJ. (2012) American trypanosomiasis (Chagas disease). Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2):275-91
Ren Z, Raucci FJ Jr, Browe DM et al. (2008) Regulation of swelling-activated Cl(-) current by angiotensin II signalling and NADPH oxidase in rabbit ventricle. Cardiovascular Research. 77 (1):73-80
Rubin SS, Schenkman S. (2012) Trypanosoma cruzi trans-sialidase as a multifunctional enzyme in Chagas' disease. Cell Microbiology. 14 (10):1522-30
71
Saeftel M, Fleischer B, Hoerauf A. (2001) Stage-dependent role of nitric oxide in control of Trypanosoma cruzi infection. Infection and Immunity. 69 (4):2252-9
Safak B, Ciftci IH, Ozdemir M et al. (2009) In vitro anti-Helicobacter pylori activity of usnic acid. Phytotherapy Research. 23 (7):955-7
Sahu SC, Amankwa-Sakyi M, O'Donnell MW Jr et al. (2012) Effects of usnic acid exposure on human hepatoblastoma HepG2 cells in culture. Journal of Applied Toxicology. 32 (9):722-30
Santos CX, Anilkumar N, Zhang M et al. (2011) Redox signaling in cardiac myocytes. Free Radical Biology and Medicine. 50 (7):777-93
Scanavacca M, Sosa E (1994) Estudo eletrofisiológico na cardiopatia chagásica crônica. Revista da Sociedade de Cardiologia do Estado de São Paulo, 4:168-176
Sharov VG, Todor A, Khanal S et al. (2007) Cyclosporine A attenuates mitochondrial permeability transition and improves mitochondrial respiratory function in cardiomyocytes isolated from dogs with heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (1):150-158
Shen X, Zheng S, Metreveli NS, Epstein PN (2006) Protection of cardiac mitochondria by overexpression of MnSOD reduces diabetic cardiomyopathy. Diabetes. 55 (3):798-805.
Shimoni Y, Hunt D, Chen K et al. (2006) Differential autocrine modulation of atrial and ventricular potassium currents and of oxidative stress in diabetic rats. Heart and Circulatory Physiology: American Journal of Physiology. 290 (5): 1879-1888
Silva CCC, Cerqueira FM, Barbosa LF et al. (2008) Mild mitochondrial uncoupling in mice affects energy metabolism, redox balance and longevity. Aging Cell. 7: 552–560
Sokolov DN, Zarubaev VV, Shtro AA et al. (2012) Anti-viral activity of (-)- and (+)- usnic acids and their derivatives against influenza virus A(H1N1). Bioorg Med Chem Lett. 1 (23):7060-7064.
Talvani A, Teixeira MM. (2011) Inflammation and Chagas Disease: Some Mechanisms and Relevance. In Advances in Parasitology, Vol 6, Elsevier Ltd.
Tsutsui H, Kinugawa S e Matsushima S. (2003) Mitochondrial oxidative stress and dysfunction in myocardial remodeling. Cardiovascular Research. 81:449-456
72
Vyatkina G et al. (2004) Impaired michondrial respiratory chain and bioenergetics during chagasic cardiomyopathy development. Biochimica at Biophysica Acta. 1689:162-173
Vohr HW, Rühl-Fehlert C. (2001) Industry experience in the identification of the immunotoxic potential of agrochemicals. The Science of the Total Environment, 270: 123-133
Wang GY, Bergman MR, Nguyen AP et al. (2006) Cardiac transgenic matrix metalloproteinase-2 expression directly induces impaired contractility. Cardiovascular Research. 15 (3):688-696
Wen JJ, Bhatia V, Popov VL et al. (2006) Phenyl-altert-butyl nitrone reverses mitochondrial decay in acute Chagas’ disease. American Journal of Phatology, 169: 1953-1964
Zhang YH, Dingle L, Hall R et al. (2009) The role of nitric oxide and reactive oxygen species in the positive inotropic response to mechanical stretch in the mammalian myocardium. Biochim Biophys Acta. 1787 (7):811-817
73
9. ANEXOS
74
75
76
