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Biologia molecular
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Fundamentos de Engenharia Genética
Prof. Dr. Eduardo Honda
Porto Velho2008
Dogma Central da Biologia Molecular
O que é Engenharia Genética?É um conjunto de tecnologias que permitem a manipulação (modificação) de material genético in vitro
Também conhecida como Tecnologia do DNA Recombinante
Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes, recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o processo reprodutivo
Clonagem Molecular
Para se estudar um determinado gene que codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá-lo.
Clonagem = fazer várias cópias idênticas
Clonagem de DNA isolar um fragmento específico de DNA do cromossomo, introduzi-lo num vetor capaz de replicá-lo, e fazer milhões de cópias idênticas
Clonagem Molecular
Isolamento de Novos organismos que produzem enzimas de interesse Biotecnológico.
Clonagem Molecular- Isolamento Gênico
Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA.
Isolamento do DNA- PCR
Desnaturação do DNA Fita-Dupla
Isolamento do DNA- PCR
Após vários ciclos...
Amplificação do Fragmento gênico desejado !!!
Isolamento de DNA e Biblioteca de cDNA
As bibliotecas de DNA representam, teoricamente, todo o material genético de um organismo clonado em um vetor
Tipos:
A) Genômica: - clonado diretamente do genoma.
B) cDNA:- feita a partir de mRNA .
Isolamento de DNA- Biblioteca genômica
Extração do DNA Genômico;
Clivagem com enzimas de restrição;
Ligação dos Fragmentos nos vetores;
Transformação Celular;
Replicação do vetor.
Biblioteca de cDNA
- mRNA de um tipo celular específico;
- “primer” de oligo dT e transcriptase reversa;
- DNA Polimerase I e dNTPs;
- Clonagem em um vetor de escolha
Clonagem Molecular- Requerimentos
1) Método para clivar o DNA alvo;2) Método para juntar 2 moléculas de DNA
covalentemente (inserto + vetor)- LIGAÇÃO!3) Célula hospedeira;4) Método para introduzir moléculas de DNA para
dentro da célula hospedeira que as possa duplicar;
5) Método para selecionar moléculas de DNA quimérico ou recombinantes;
6) Métodos para o screening da característica procurada .
Geração de moléculas recombinantes
- Clonagem Molecular -
CLONAGEM
Ligação de extremidades compatíveis
Sítio Múltiplo
de Clonage
m(Polylink
er)
As endonucleases de Restrição
Clonagem Orientada
As “Ferramentas”1) Enzimas
2) Vetores
3) Células hospedeiras
ENZIMAS
Enzimas de RestriçãoSão endonucleases que clivam o DNA em seqüências específicas chamadas sítio de restrição.
Quebram a ligação fosfodiéster
Os sítios de restrição são, geralmente, seqüências palindrômicas (mesma seqüência nos dois sentidos)
Enzymes for DNA manipulation – restriction enzymes
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Enzimas de Restrição
Classes of Restriction Enzymes
Type Icleavage occurs 400-7000 bpfrom recognition site
Type IIcleavage occurs adjacent orwithin recognition site
Type IIIcleavage occurs 25-27 bpfrom recognition site
•Endonucleases sítio-específicas isoladas de procariotos
•Protegem a bactéria do ataque de vírus (fagos)
•Protegem seu próprio DNA metilando-o no sítio de restrição
•Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia Molecular
EcoRI metilase
DNA LigasePromover a união de moléculas de DNA pela formação de uma ligação fosfodiéster entre uma extremidade 3’-OH e outra 5’-PO4.
DNA PolimerasesPolimerizam a molécula de DNA
a partir de uma extremidade 3´-OH e usando uma das fitas do DNA como molde.
Exe: Taq polimerase
Transcriptase reversa
Polimeriza uma fita de DNA a partir de um molde de RNA
Isolada dos retrovírus
Aplicação: síntese de cDNA
VETORES
Os Vetores
São moléculas de DNA que irão propagar o DNA clonado.
Características desejadas: Características desejadas:
•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;
• Marca genética para selecionar a célula Marca genética para selecionar a célula contendo o vetor (resistência a drogas ou marcas contendo o vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);auxotróficas);
•Sítios de clonagem únicos.Sítios de clonagem únicos.
Tipos de vetoresPlasmídios
Bacteriófagos (fagos)
Cosmídios
Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
Vetores especiais para plantas, células de insetos e mamíferos
PlasmídiosMoléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autônoma (ORI);
Têm marcas de seleção para resistência a antibióticos ou complementação auxotrófica.
Sequências de
DNA de um vetor
de expressão de E.
coli
Vetores de expressão
Transformação Bacteriana
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Células podem ser selecionados em placas com antibiótico. Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.
O gene da beta-galactosidase é interrompido quando um fragmento de DNA é clonado. O substrato "X-gal“ fica azul se o gene da beta-gal permanece intacto, isto é a enzima está ativa. As colônias brancas na presença de X-gal significa a presença de DNA recombinante no plasmidio.
Bacteriófagos
Infectam células de E. coli e o DNA se duplica na célula hospedeira.
Ex: Fago
Vetores baseados no fago
Foram retirados 20 Kb do genoma do fago necessários para integração/excisão para serem substituídos por DNA exógeno e formar um genoma de 50 Kb que é empacotado in vitro.
Genomas maiores ou menores não são empacotados.
Ciclo lítico compulsório
Clonando no Fago λ
Cosmídios
• São plasmídios contendo as extremidas “cos” do fago λ
• Capacidade de clonagem: 40 Kb
Cromossomos artificiais
CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Células hospedeirasCaracterísticas:
Permitir a duplicação do vetor;
Permitir a seleção do vetor (sensibilidade a drogas ou auxotrofia);
Não pode representar perigo ao meio ambiente;
Não deve modificar o DNA exógeno;
Podem ser procariotos (E. coli) ou eucariotos (leveduras, células vegetais, cultura de células de insetos e mamíferos).
Métodos de introdução do DNA na célula hospedeira
Transformação com cloreto de cálcio (bactérias);
Transdução (fagos empacotados in vitro);
Transfecção (células de mamíferos);
Eletroporação (leveduras e bactérias);
Biolística ou “bombardeamento” (plantas);
Microinjeção (ovos e oócitos).
O canhão gênico é uma nova forma de transformação celular.
Esta arma usa uma particula de bombardeamento - Biolística
Inserindo genes nas células
Adapted from Human Genetics, Ricki Lewis
Microinjeção
Transformação Bacteriana
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Células podem ser selecionados em placas com antibiótico. Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.
Clonando no Fago λ
Seleção de clones recombinantes
resistência e sensibilidade a antibióticos;
requerimentos nutricionais (auxotrofia);
formação de placas de lise
Identificação de um clone de
interesse
- hibridação com sonda radioativa- anticorpo específico
Screening
Aplicações da Engenharia Genética
Análise da estrutura/função de genes Produção de proteínas de interesse
industrial e terapêutico Engenharia proteica Criação de organismos transgênicos Terapia gênica Diagnóstico molecular (doenças
parasitárias e genéticas) Teste de paternidade / medicina
forense Arqueologia molecular / evolução
Plantas Transgênicas
Animais Transgênicos
Microinjeção de DNA no núcleo Microinjeção de DNA no núcleo de ovo fertilizado de de ovo fertilizado de
camundongo - gene do fator de camundongo - gene do fator de crescimento humanocrescimento humano
Biofármacos Recombinantes
Terapia Gênica
Adição do gene terapêutico
Substituição do gene terapêutico
Uso de vírus