Atlante libro sintesi

ATLANTE DI QUADRI PROTEICI ELETTROFORETICI ED IMMUNOFISSATIVI DI SIERO PROTEINE, PROTEINE URINARIE E CRIOGLOBULINEDott. Andrea Ciapini

AT L A N T E E L E T T R O F O R E T I C O

IElettroforesi

Da tanti anni, forse da troppi, la passione per lo studio delle proteine plasmatiche ricorre costantemente nei miei interessi professionali.

Dei metodi di separazione delle proteine in campo elettroforetico, dei tamponi, dei supporti, dei coloranti, del grado di risoluzione, della focalizza-zione, della sensibilità, della precisione ed accuratezza si discute da decenni.

Talvolta in un tentativo esasperato di “perfezione” si sono volute attribu-ire a questi metodi delle potenzialità a loro estranee per limiti costitutivi; ma rimane il fatto che come affermato da Robert F. Ritchie (Clin Chem Lab Med 2001, 39(11) 1045-1053):

“Serum proteins have a unique feature that few test have: they are interrelated. In other words, an effect on one will change others.

Serum proteins analysis is, in fact, one multi-use test, not a series of independent test.

As a result, measuring only one protein, e.g. haptoglobin to identify hemolysis, decreases diagnostic ability tremendously.”

Ne deriva che per utilizzare completamente le potenzialità diagnostiche offerte dalla analisi delle plasmaproteine è indispensabile una stretta collabo-razione fra il laboratorista ed il clinico e che ambedue abbiano una sufficien-te conoscenza dei campi reciproci di interesse.

Nostra intenzione è quella di sensibilizzare il laboratorista alla comples-sità interpretativa dovuta alle numerose interazioni ed alle possibili sovrappo-sizione di disordini; alla semiologia proteica che impedisce, tranne rare ec-cezioni, di trarre sicure deduzioni diagnostiche senza il contributo del clinico.

Allo stesso tempo, quest’ultimo, dovrebbe rendersi conto delle potenzia-lità, ma anche dei limiti e delle possibili cause di errore, che presentano le metodologie di studio utilizzate.

Certo è che neppure si possa essere così semplicistici da attribuire, allo studio delle proteine separate in elettroforesi, il solo compito di rilevare la pre-senza di componenti monoclonali !

Da questi presupposti nasce la architettura del presente atlante, che vuo-le semplicemente sottolineare, per mezzo di immagini e brevi commenti, la potenzialità della elettroforesi che se “interpretata visivamente”, al pari dei reperti radiografici e cardiografici, dà al laboratorista la occasione di fornire al clinico utili ragguagli sugli equilibri proteici dei pazienti senza voler preva-ricare il compito del clinico stesso.

Quanto affermato, precedentemente, rientra nell’ottica delle raccoman-dazioni dell’ Istituto di Medicina (1992) che afferma come linee guida:

“Ogni tipo di documento avente come obiettivo quello di indicare ai Clinici quali opzioni diagnostico-terapeutiche debbano essere adottate in specifiche circostanze cliniche“

Anche il commento allegato, per una refertazione esaustiva, a una sepa-razione elettroforetica possiede pari dignità rispetto ad altri referti facendo parte della Medicina di Laboratorio; così come indicato dalla:

PREFAZIONE

IIElettroforesi

“Il Laboratorio Medico (o Clinico) è il Laboratorio per l’esame biologico, microbiologico, immunologico, chimico, immunoematologico, ematologico, biofisico, citologico, anatomo-patologico ed altro di materiali derivati dal corpo umano al fine di fornire informazioni per la diagnosi, prevenzione e trattamento di malattie oppure per la valutazione della salute di esseri umani “ “…e che può fornire un servizio di consultazione comprendente tutti gli aspetti delle ricerche di laboratorio, incluso l’interpretazione dei risultati e il suggerimento di appropriati approfondimenti diagnostici “ IInntteerrnnaattiioonnaall SSttaannddaarrdd IISSOO 1155118899::22000033((EE)) ppuunnttoo 33..88 Inoltre: “Il laboratorio, oltre che la responsabilità di accurate risposte, ha quella di assicurarsi quanto più possibile che esse siano interpretate ed applicate nel miglior interesse del paziente. “ “Azioni specialistiche nella selezione ed interpretazione dei test fanno parte del servizio del Laboratorio. “ C6.3 Annex C Ethics in laboratory medicine International Standard ISO 15189:2003(E) Queste definizioni dell’ “International Standard ISO” sostentano la definizione di appropriatezza dell’esame elettroforetico : “appropriato è il test in cui il risultato fornisce una risposta al quesito clinico e mette in grado di prendere una decisione o intraprendere un’azione “ CP Price 2000 “appropriato è tutto ciò che può essere benefico per il paziente” “in una medicina sempre più complessa, occorre evitare che alcuni pazienti non ottengano l’intervento di cui hanno bisogno ed altri abbiamo l’intervento di cui non necessitano” RH Brook 1994 La elettroforesi delle siero-urine proteine è un test che ha come finalità : 1) Valutazione semiquantitativa 2) Valutazione qualitativa 3) Valutazione delle monoclonalità (la più appropriata delle tre finalità)

“Il Laboratorio Medico (o Clinico) è il Laboratorio per l’esame biologico, microbiologico, immunologico, chimico, immunoematologico, ematologico, biofisico, citologico, anatomo-patologico ed altro di materiali derivati dal cor-po umano al fine di fornire informazioni per la diagnosi, prevenzione e trat-tamento di malattie oppure per la valutazione della salute di esseri umani “

“…e che può fornire un servizio di consultazione comprendente tutti gli aspetti delle ricerche di laboratorio, incluso l’interpretazione dei risultati e il suggerimento di appropriati approfondimenti diagnostici “

International Standard ISO 15189:2003(E) punto 3.8Inoltre:“Il laboratorio, oltre che la responsabilità di accurate risposte, ha quel-

la di assicurarsi quanto più possibile che esse siano interpretate ed applica-te nel miglior interesse del paziente. “

“Azioni specialistiche nella selezione ed interpretazione dei test fanno parte del servizio del Laboratorio. “

C6.3 Annex C Ethics in laboratory medicine International Standard ISO 15189:2003(E) Queste definizioni dell’ “International Standard ISO” sostentano la defi-

nizione di appropriatezza dell’esame elettroforetico : “appropriato è il test in cui il risultato fornisce una risposta al quesito cli-

nico e mette in grado di prendere una decisione o intraprendere un’azione “CP Price 2000“appropriato è tutto ciò che può essere benefico per il paziente”“in una medicina sempre più complessa, occorre evitare che alcuni pa-

zienti non ottengano l’intervento di cui hanno bisogno ed altri abbiamo l’in-tervento di cui non necessitano”

RH Brook 1994La elettroforesi delle siero-urine proteine è un test che ha come finalità :1) Valutazione semiquantitativa

2) Valutazione qualitativa3) Valutazione delle monoclonalità (la più appropriata delle tre finalità)A. Burlina 1992Molti lettori troveranno inopportuna la definizione di “Elettroforesi Semi-

quantitativa”, ritenendo di doversi affidare esclusivamente ai dosaggi Nefelo-metrici/Turbidimetrici per valutare la concentrazione delle proteine specifiche.

Costoro hanno perfettamente ragione!Quello che gli autori intendono per “Elettroforesi Semiquantitativa” nien-

te altro è se non la considerazione che un “buon sistema elettroforetico, auto-matizzato e sotto controllo statistico”

possa fornire, nel tempo, dati confrontabili ed omogenei statisticamente; questa situazione consentirà di accettare, con alto grado di probabilità stati-stica, i dati elettroforetici ponderali come indicativi di valori normali, aumen-tati o diminuiti.

Ai metodi specifici il compito del calcolo della “vera” ponderalità.Quanto espresso viene, ulteriormente sottolineato dai seguenti sottoca-

pitoli:a) Sistema elettroforetico, “automatizzato e sotto controllo statistico”:

Appropriatezza: adatto e convenienteAppropriatezza: adatto e conveniente

appropriate is the test able to give a replay to a

Appropriatezza: adatto e convenienteAppropriatezza: adatto e conveniente

….appropriate is the test able to give a replay to aclinical problem and permit to keep a decision or toundertake an actionundertake an action.CP Price 2000CP Price 2000

Test

Quesito clinico

Referto

Risposta al problema

Risultato esaustivo

Efficacia diagnosticaRisposta al problema Efficacia diagnostica

IIIElettroforesi

Il significato della efficacia diagnosticaIl significato della efficacia diagnosticaIl significato della efficacia diagnosticaIl significato della efficacia diagnostica

Patologia EsitoPatologianota Cura

EsitopositivoMalattia ? Diagnosi

EBLMEBLM EBMEBMD. Giavarina 2004D. Giavarina 2004

Le finalità della efficacia diagnostica in Le finalità della efficacia diagnostica in ETFETFETFETF

Ri d ll

Quantitative :condizioni etero\omozigoti

Valutazioni quantitative

Ricerca delle monoclonalità

a carico diAlb.\AAT\Trf\

C3\Hpt.C3\Hpt.

ValutazioniQ lit ti

AA BurlinaBurlina 19921992

qualitativeQualitative :modificazioni

chimico-fisiche a caricodi A. A. BurlinaBurlina 19921992di

C3\Hpt-Hb\C.M.

EBLM e sua attuazioneEBLM e sua attuazioneEBLM e sua attuazioneEBLM e sua attuazione

La pratica dell’ EBLM richiede la integrazione della esperienza clinica individuale con la miglioreesperienza clinica individuale con la migliore

evidenza laboratoristica derivata da ricerche sistematiche.ricerche sistematiche.

Gold standardglobale

Gold standard personale

Gold standardindipendente

Gold standardseparatopersonale indipendente separato

GoldGold standard personalestandard personaleGoldGold standard personalestandard personale

G ld t d dGold standardglobale



Gold standardseparato

Accrescimento conoscitivo individuale:formazione continuaformazione continua.

IVElettroforesi

GoldGold standard indipendentestandard indipendenteGoldGold standard indipendentestandard indipendente

Gold standardglobale



Gold standardseparatop p p

Mirato in prima istanza alla migliore evidenza possibile.Esempio:Esempio:

La esecuzione delle proteine urinarie deve passare per il supporto agarosio e per un colorante sensibile.supporto agarosio e per un colorante sensibile.

GoldGold standard separatostandard separato

Gold standardglobaleglobale

Gold standard Gold standard Gold standardpersonale indipendente separato

Atteggiamento avulso da preconcetti ed incentrato sulla completa collaborazione tra tecnici e medici di laboratorio sì da rispondere allecollaborazione tra tecnici e medici di laboratorio sì da rispondere alle seguenti domande:

a) Il test è accurato e riproducibile?Sarà eseguito ed interpretato in modo corretto?g p

b) Quale è la predittività pre-test?c) La probabilità post-test modificherà la gestionedella malattia ?d) La significatività della risposta e del refertosarà valutata positivamente dal medico?

Come deve essere attuato il controllo diCome deve essere attuato il controllo diCome deve essere attuato il controllo di Come deve essere attuato il controllo di qualità in ETF ?qualità in ETF ?

• Piccole e semplici cose per grandi p p grisultati !

Il controllo di qualitàIl controllo di qualitàqq

I valori di riferimentodevono essere ricercati da ciascun

laboratorio e per la propria l i ff tpopolazione afferente.

I valori di riferimento del produttoreI valori di riferimento del produttoreversus laboratorioversus laboratorioversus laboratorioversus laboratorio

A EPA EP Produttore XProduttore X Produttore XProduttore X V l i d lV l i d lAree EPAree EP Produttore XProduttore XDensitometro A Densitometro A

valori in %valori in %

Produttore XProduttore XDensitometro B Densitometro B

valori in %valori in %

Valori del Valori del laboratorio in laboratorio in

%%%%n = 7700n = 7700

AlbuminaAlbumina 56 / 61 / 6656 / 61 / 66 60 / 65 5 / 7160 / 65 5 / 71 56 / 61 / 6656 / 61 / 66AlbuminaAlbumina 56 / 61 / 66 56 / 61 / 66 60 / 65.5 / 71 60 / 65.5 / 71 56 / 61 / 66 56 / 61 / 66

GammaGamma 10 / 14 / 18 10 / 14 / 18 8.5 / 12.2 / 168.5 / 12.2 / 16 11 / 15.5 / 2011 / 15.5 / 20

Annotazioni sui valori di riferimento : I densitometri A e B vengono realizzatiAnnotazioni sui valori di riferimento : I densitometri A e B vengono realizzati dallo stesso produttore ed ambedue gli strumenti leggono lo stesso supporto in agarosio.Risulta agevole considerare, alla luce dei valori espressi dal produttore al confronto con

i àquelli elaborati in laboratorio, la necessità per ogni laboratorio di stimare i propri valori di riferimento.

VElettroforesi

Il controllo di qualitàIl controllo di qualitàqq

La precisione:C ll ilControllo mensile

sullo stesso campione ripetutosullo stesso campione ripetutoalmeno 21 volte.

Il test di Il test di TonksTonks suggerisce il suggerisce il maxmax valore di valore di CV%CV% t il l i d tit il l i d tiCV%CV% entro il quale i dati permangono entro il quale i dati permangono

significativi.significativi.

AlbuminaAlbumina CV % Max = 2CV % Max = 2Alfa 1Alfa 1 CV % Max = 6CV % Max = 6Alfa 2Alfa 2 CV % Max = 5CV % Max = 5Alfa 2Alfa 2 CV % Max = 5CV % Max = 5Beta 1Beta 1 CV % Max = 4CV % Max = 4Beta 2Beta 2 CV % Max = 4CV % Max = 4GammaGamma CV % Max = 6CV % Max = 6

Tonks DB: Clin Chem 9:217 1963

Il significato diagnostico di un testIl significato diagnostico di un testIl significato diagnostico di un testIl significato diagnostico di un test

Fig. 1 = Test ideale o patognomonico, con sensibilità e specificità li i d l 00% di i lclinica del 100% e con potenza diagnostica assoluta.

Fig. 2 = Test inutile con sensibilità e specificità clinica pari al 50% ( come gettare una moneta)Fig. 3 = Test usuale, che presenta una certa zona di sovrapposizione, la sensibilità e la specificità clinica è intermedia e così la potenza diagnostica.g

Fig. 1 = Test ideale o patognomonico, con sensibilità e specificità clinica del 100% e con potenza diagnostica assoluta.

Fig. 2 = Test inutile con sensibilità e specificità clinica pari al 50% ( come gettare una moneta)

Fig. 3 = Test usuale, che presenta una certa zona di sovrapposizione, la sensibilità e la specificità clinica è intermedia e così la potenza diagnostica.

Funzione del test di Funzione del test di TonksTonks

A = soggetti saniB = soggetti malatiC = sovrapposizione delle codeppdelle due zone precedenti e la suaampiezza delimita il settore 2, che comprende i falsi positivi e i falsicomprende i falsi positivi e i falsinegativi.

L’utilizzo sistematico, settimanale, del test di Tonks contrae e mantiene sotto controllo la zona C.mantiene sotto controllo la zona C.

Percentuale di errori cliniciPercentuale di errori cliniciapplicando il test diapplicando il test di AclandAcland Lipton suiLipton suiapplicando il test di applicando il test di AclandAcland Lipton sui Lipton sui

dati di dati di TonksTonks

Albumina: Tonks Max.= 2%

Albumina: Range normalità = 56-66 %gUn valore di 54% quante

probabilità possiedep pdi diventare normale per errore di riproducibilità ?Probabilità = 1.5 %

VIElettroforesi

Percentuale di errori cliniciPercentuale di errori clinicili d il t t dili d il t t di A l dA l d Li t iLi t iapplicando il test di applicando il test di AclandAcland Lipton sui Lipton sui

dati di dati di TonksTonksGamma: Tonks Max.= 6 %

Gamma: Range normalità = 11-20 %

Un valore di 13% quante probabilità possiede di diventare anormaleUn valore di 13% quante probabilità possiede di diventare anormale per errore di riproducibilità ?

Probabilità = 5 %

C l i i i d ti diC l i i i d ti di T kT kConclusioni sui dati di Conclusioni sui dati di TonksTonks

Alb iAlb i CV % M = 2CV % M = 2AlbuminaAlbumina CV % Max = 2CV % Max = 2Alfa 1Alfa 1 CV % Max = 6CV % Max = 6 Ogni riduzione dei valori

di Tonks porterà ad unaAlfa 2Alfa 2 CV % Max = 5CV % Max = 5Beta 1Beta 1 CV % Max = 4CV % Max = 4

di Tonks porterà ad una minore probabilità che il

dato possa passare da %%Beta 2Beta 2 CV % Max = 4CV % Max = 4GG CV % M 6CV % M 6

Normale a Patologico e Viceversa:

di di iti tGammaGamma CV % Max = 6CV % Max = 6 vedi diapositiva seguente.

Percentuale di errori cliniciPercentuale di errori clinicili d il t t dili d il t t di A l dA l d Li t d tiLi t d tiapplicando il test di applicando il test di AclandAcland Lipton su dati Lipton su dati

più bassi di più bassi di TonksTonks

Gamma: R li à 11 20 %Range normalità = 11-20 %

Un valore di 13% quante probabilità possiede di diventare l di i d ibili à ?anormale per errore di riproducibilità ?

Gamma Tonks = 4 % Probabilità = 2.5 %

b) I dati elettroforetici come indicativi significativamente di normalità, au-mento, diminuzione• Materiali e metodi:• selezione di 20 sieri per l’allineamento delle albumine ETF a quelle

nefelometriche• 12 sieri con IgA policlonali con concentrazioni comprese tra 100 e 600

mg/dl• 100 sieri (età tra 18 e 75 anni, quadri normali e con varie patologie,

55 donne e 45 uomini) • dosaggio proteine totali con metodo al biureto e bianco campione.• nefelometro Behring per il dosaggio delle proteine specifiche dei 100 sieri• sistema per elettroforesi Microgel in supporto agarosio e colorante

Acid Blu• Ispezione visiva (2 operatori esperti) e valutazione proteine con agget-

tivazioni corrispondenti a numeri da 1 a 5.• Test Kolmogorov-Smirnov e test del parallelismo per lo studio delle po-

polazioni di dati elettroforetici (aggettivazioni tradotte in numero da 1 a 5) e nefelometrici (g/L).

• Nei grafici le curve verdi sono relativa ai dati elettroforetici mentre quelle rosse sono relative ai dati nefelometrici.

VIIElettroforesi

Dinamica ETF fino a 3.5 g/L

Test di parallelismo positivo F calcolato < 3,96 F statistico

Livello di significatività >0.05 Popolazioni con stessa distribuzione

Albumine ETF allineate con Nef.Dinamica ETF fino a 49 g/L



Dinamica ETF fino a 49 g/L


Test di parallelismo positivo

F calcolato <3,96F statistico








Livello di significatività >0.05Popolazioni con stessa distribuzione


























VIIIElettroforesi














Dinamica ETF fino a 26 g/L La differenza media tra i valori trovati con i due metodi per le immunoglobuline oscilla tra 2 e 3 g/L in meno per la Elettroforesi. Questa differenza è da imputare a due fattori: 1) La diversa affinità tra anticorpi e colore per le classi Ig (affermazione ovvia da non commentare vista la stechiometria tra colorante e amminoacidi). 2) La percentuale di IgA, elettroforetiche, che non vengono computate perché migrano sotto il C3 e la Tf. Per il punto numero 2 è stato eseguito uno studio per mezzo della Spline Cubica (equazione di terzo grado) applicata ai punti grafici che disegnano la zona gamma. Poiché la Spline Cubica è una equazione di regressione polinomiale è stato possibile richiedere, in base alla pendenza della curva gamma verso il C3 e la Tf, la tendenza a regredire fino alla linea di base del grafico se il punto di zero fosse stato il minimo tra C3 e gamma e poi tra Tf e gamma. Il primo grafico dimostra come una percentuale di Ig migrino sotto il C3 e fino all’inizio della Tf.



Dinamica ETF fino a 26 g/L




La differenza media tra i valori trovati con i due metodi per le immuno-globuline oscilla tra 2 e 3 g/L in meno per la Elettroforesi.

Questa differenza è da imputare a due fattori:1) La diversa affinità tra anticorpi e colore per le classi Ig (affermazione

ovvia da non commentare vista la stechiometria tra colorante e amminoa-cidi).

2) La percentuale di IgA, elettroforetiche, che non vengono computate perché migrano sotto il C3 e la Tf.

Per il punto numero 2 è stato eseguito uno studio per mezzo della Spline Cubica (equazione di terzo grado) applicata ai punti grafici che disegnano la zona gamma.

Poiché la Spline Cubica è una equazione di regressione polinomiale è stato possibile richiedere, in base alla pendenza della curva gamma verso il C3 e la Tf, la tendenza a regredire fino alla linea di base del grafico se il punto di zero fosse stato il minimo tra C3 e gamma e poi tra Tf e gamma.

Il primo grafico dimostra come una percentuale di Ig migrino sotto il C3 e fino all’inizio della Tf.

IXElettroforesi

Il secondo grafico dimostra come il campione ipogammaglobulinemico debba essere riconsiderato alla luce della ampia percentuale di Ig che migra-no sotto il C3 e ben oltre il minimo densitometrico.

Il terzo grafico dimostra come una cospicua percentuale di Ig migrino sotto C3 e Tf.

L’utilizzo della Spline Cubica ha permesso di stilare la seguente tabella di recupero di Ig non computate dal densitometro a causa dell’errata posizione del minimo posto a fondo valle.

Tenore di IgA in mg/dl

Quota totale non com-putata dal densitometro

in mg/dl

Quota non computa-ta sotto C3 in mg/dl

Quota non computa-ta sotto Tf in mg/dl

600 184 99 85500 136 73 63400 108 58 50300 80 43 37200 50 27 23100 20 11 9

I dati suesposti dimostrano come un sistema elettroforetico “sotto control-lo” (automatizzato e in regime di statistica) possa erogare dati semiquantita-tivi atti a determinare una correlazione congruente con i dati nefelometrici.

Questo significa che un tale “sistema sotto controllo” possa essere un ot-timo indicatore per la definizione di proteine specifiche normali, aumentate o diminuite lasciando alla nefelometria/turbidimetria il compito della conferma e del “vero” dosaggio ponderale.

Affinché possano realizzarsi le seguenti tre “Valutazioni” 1) Valutazione semiquantitativa:condizioni etero\omozigoti a carico di Alb.\AAT\Trf\C3\Hpt.2) Valutazione qualitativamodificazioni chimico-fisiche a carico di C3\Hpt-Hb\C.M.3) Valutazione delle monoclonalità (la più appropriata delle tre finalità)(Burlina 1992) risulta fondamentale che ogni laboratorio esegua una re-

visione del proprio sistema Elettroforetico alla luce delle raccomandazioni espresse nel contesto della Evidence Based Medicine (EBM) e della Evidence Based Laboratory Medicine (EBLM):

Evidence Based Medicine (EBM) :

XElettroforesi

“L’uso coscenzioso, esplicito e giudizioso della migliore evidenza cor-rente nel prendere decisioni relativamente alla cura del paziente”.

Questa definizione di Sackett et al. comprende specificamente anche il laboratorio in quanto parte integrante del processo decisionale del medico.

La EBM è stata definita, anche, come un processo di aggiornamento personale, per tutta la vita.

Da questa descrizione deriva che la medicina è un campo in continua scoperta, evoluzione e cambiamento, per cui è importante assicurarsi che la pratica sia basata sulla migliore evidenza disponibile e che ci sia la opportu-nità di adottare nuove procedure per le quali sia stato dimostrato il beneficio.

Evidence Based Laboratory Medicine (EBLM):La pratica dell’ EBLM richiede la integrazione della esperienza clinica

individuale con la migliore evidenza laboratoristica derivata da ricerche sistematiche.

Evidence Based Laboratory Medicine (EBLM) e Gold Standard:Introdurre i principi della Evidence Based Medicine in laboratorio, si-

gnifica attivare un continuo processo di identificazione di quei tests che da una parte potranno offrire la più alta efficienza ed affidabilità diagnostica (Gold Standard) e, dall’ altra, potranno provocare minori rischi e meno di-sagi per il paziente nonché un risparmio di lavoro, tempo e danaro.

Gold StandardIl concetto di “Gold standard” è un concetto in continuo divenire che

non può e non deve conoscere la fase Entalpica.E’ un concetto di continua ricerca della “migliore verità (metodo) dispo-

nibile” per una mirata ed efficiente opera di sostegno ai veri fruitori finali di tale azione: i pazienti !

L’attuale Gold Standard nel campo Elettroforetico è rappresentato dal supporto Agarosio.

Chi attesta questo (alcuni organismi e convegni in ordine cronologico):1. College of American Pathologists Arch. Pathol. Lab. Med. Vol. 123

pag. 126 February 19992. 36° Congresso Nazionale SIBioC Padova 2004

3. XV° Edizione de “ Le Proteine dal Laboratorio alla Clinica” CEFAR 20064. Am J Clin Pathol 2008; 129:451-458 “Performance Comparison of

Capillary and Agarose Gel Electrophoresis for the Identification and Charac-terization of Monoclonal Immunoglobulins”

5. Clin Chem Lab Med 2009; 47: 1021-1022 2009Se la metanalisi è una “ integrazione strutturata e sistematica di infor-

mazioni derivate da differenti studi su un dato problema… la procedura analitica per le siero-urine proteine, su agarosio, è probabilmente in grado di realizzare obiettivi utili al clinico al fine di migliorare l’ approccio diagno-stico e/o l’ intervento terapeutico.

L’utilizzo del miglior metodo disponibile non esaurisce il compito del la-boratorio.

L’approccio ai metodi elettroforetici, essendo un procedimento diagno-stico, deve considerare una fase descrittiva ed una interpretativae:

a) la ispezione visiva del quadro proteico (fase descrittiva redatta in termini molecolari con indicazione di assen-

za e di presenza di proteina sovrannumeraria, aumento o riduzione più aggettivo, delle singole proteine specifiche; alla fase descrittiva, il laborato-rio, deve intraprendere la identificazione di C.M. e la ricerca della proteina di B.J.; inoltre il laboratorio, può procedere alla quantificazione di proteine specifiche per avallare la osservazione visiva)

b) la fase di “semeiotica elettroforetica”(fase interpretativa redatta in relazione a quadri fisiopatologici ed as-

sociazioni cliniche;auspicabile la acquisizione di notizie cliniche.c) la refertazione esaustivaa) la ispezione visiva del quadro proteicometodologia formidabile per identificare modificazioni proteiche, singole

od di assieme, rispetto al quadro fisiologico:Guidelines for Clinical and Laboratory Evaluation of Patients with Mon-

oclonal GammopathiesDavid F. Keren, MD; Raymond Alexanian, MD; James A. Goeken, MD;

Peter D. Gorevic, MD; Robert A Kyle, MD; Russell H. Tomar, MD

XIElettroforesi

(Arch Pathol Lab Med. 1999;123:106–107)“Serum and urine electrophoresis ……..the gel should be examined directly by the interpreter.”Nelle figure seguenti è possibile osservare la caducità della lettura den-

sitometrica senza l’intervento della interpretazione visiva:

“Serum and urine electrophoresis ……..

the gel should be examined directly by the interpreter.”

Nelle figure seguenti è possibile osservare la caducità della lettura densitometrica senza l’intervento della interpretazione visiva:

La piccola banda omogenea in ETF (freccia) non viene rilevata dalla lettura densitometrica.

La migrazione ETF mette in evidenza due bande omogenee delle quali la più catodica risulta non esistente nel grafico (Frecce) b) la fase di “semeiotica elettroforetica” che fornisce, attraverso ad “archetipi cognitivi”, conclusioni sullo stato dell’ assetto proteico.

La piccola banda omogenea in ETF (freccia) non viene rilevata dalla let-tura densitometrica.

“Serum and urine electrophoresis ……..

the gel should be examined directly by the interpreter.”

Nelle figure seguenti è possibile osservare la caducità della lettura densitometrica senza l’intervento della interpretazione visiva:

La piccola banda omogenea in ETF (freccia) non viene rilevata dalla lettura densitometrica.

La migrazione ETF mette in evidenza due bande omogenee delle quali la più catodica risulta non esistente nel grafico (Frecce) b) la fase di “semeiotica elettroforetica” che fornisce, attraverso ad “archetipi cognitivi”, conclusioni sullo stato dell’ assetto proteico.

La migrazione ETF mette in evidenza due bande omogenee delle quali la più catodica risulta non esistente nel grafico (Frecce)

b) la fase di “semeiotica elettroforetica”che fornisce, attraverso ad “archetipi cognitivi”, conclusioni sullo stato

dell’ assetto proteico.

Linee guida: associazioni cliniche

Prealbumina NefrosiAlbumina Inesistente

Alfa 1 antitripsina Effetto estrogenico, infiammazione, necrosi, eteroplasia, epatopatie

Alfa 2 macroglobulina

Nefrosi, apatopatie, diabete, III tri.grav., infanzia, senilità

Aptoglobina Necrosi, eteroplasia, infiammazioneTransferrina Anemia siderop., epatite, gravi.

C3 Ostruzio, biliare, infiammazione non recente

Gammaglobuline Cirrosi epatica e biliare, etilismo, infezioni croniche, epatiti croniche, malattie autoimmuni

Linee guida: associazioni cliniche

Prealbumina Infiammazioni, eteroplasie, epatopatie

Albumina Epatopatie, nefropatie, infiammazione chachessie, enteropat. disperdenti, eteroplasie

Alfa 1 antitripsina Difetto geneticoAlfa 2

macroglobulinaFibrinolisi, artrite reumatoide, eclampsia

Spesso priva di significato

Aptoglobina Difetto congenito, epatopatie Emolisi intravascolare, eritropoiesi insuff.

Transferrina Epatopatie, nefropatie, infezioni cronicheC3 Malattie autoimmuni, epatopatie

Gammaglobuline Immunodeficenze congenite/acquisite infanziac) la refertazione esaustivain grado di presentare al clinico una risposta esauriente, al quesito clini-

co, per poter intraprendere i passi opportuni per l’azione sul paziente.

XIIElettroforesi

A tale riguardo è necessario che il referto suggerisca degli outcome; que-sto sia che la esecuzione del test serva una sola (1) volta sia che il test debba essere ripetuto in un follow-up (2):

Da Price CP, modificato.

Necessità clinica

tes

Decisione/Azione

Intervent

Outcom

A Necessità clinica

test

Decisione/Azione

Intervento

Outcome

1

Necessità clinica

testIntervento

Outcome

B Necessità clinica

testIntervento

Outcome

2

Da Price CP, modificato.

Necessità clinica

tes

Decisione/Azione

Intervent

Outcom

A Necessità clinica

test

Decisione/Azione

Intervento

Outcome

1

Necessità clinica

testIntervento

Outcome

B Necessità clinica

testIntervento

Outcome

2

Da Price CP, modificato. Il Gold Standard GlobaleIn laboratorio si accettano diversi tipi di evidenza:

• i dati delle performances analitiche.• i dati del controllo di qualità interno ed esterno.• i dati relativi alla specificità e sensibilità dei test.

Raramente, però, si ha la conoscenza della evidenza che l’ uso di un test di laboratorio possa, per un dato paziente o per un gruppo di pazienti, modificare l’ atteggiamento clinico rispetto la diagnosi o la terapia.

Per questo motivo il laboratorio deve:• fornire omogeneità ai risultati• migliorare la efficacia dei metodi• fornire dati su nuove possibili metodologie

Il processo diagnostico si articola su quattro principali modelli di riferimento:Compito del laboratorio1) Identificazione analitica del quadro Compito del medico1) Riconoscimento del quadro2) Ragionamento fisiopatologico3) Diagnosi probabilisticaTutto questo deve avvenire nel completo rispetto delle singole competenze

sì che si realizzi il concetto di globalità del Gold Standard:a) personale: Accrescimento conoscitivo individuale e formazione continuab) indipendente : Mirato in prima istanza alla migliore evidenza possibile.c) separato : Atteggiamento avulso da preconcetti ed incentrato sulla

completa collaborazione tra tecnici e medici di laboratorio sì da rispondere alle seguenti domande:

a) Il test è accurato e riproducibile?Sarà eseguito ed interpretato in modo corretto?b) Quale è la predittività pre-test?c) La probabilità post-test modificherà la gestione della malattia ?d) La significatività della risposta e del referto sarà valutata positiva-

mente dal medico?La preparazione di questo testo atlante ha per scopo essenziale quello di

fornire al lettore un evidente ed esauriente materiale iconografico delle sin-gole proteine specifiche e quadri immunofissativi, evidenziabili con metodo elettroforetico su supporto in agarosio.

A. Ciapini

ATLANTE ICONOGRAFICODEI PATTERN SIEROPROTEICI

ED URINARI IN GEL DI AGAROSIO

La rappresentazione grafica di una migrazione elettroforetica e la posi-zione delle proteine specifiche.

Quadro proteico urinario su aga-rosio e colorante violetto acidoPosizione delle singole proteine plasmaticheSeparazione per carica elettrica netta

Le proteine specifiche sieriche più frequenti ed identificabili alla ispezione visiva

QUADRI SIEROPROTEICIDI SINGOLE PROTEINE

SPECIFICHE E METABOLITICOMIGRANTI

PROTEINAPre-albumina/Transtiretina

7Elettroforesi

La molecola pre-albuminica legata alla Triiodio Tironina

TassonomiaEucariotiBatteri

OrganismiHomo SapiensHelix pomatiaGallus gallusStreptococcusBrassica napusFinegoldia magna

Significato clinico: con il suo alto contenuto di triptofano, la breve emivita (2 giorni), la bassa concentrazione, la prealbumina è un fine e veloce indicatore di reazione infiammatoria, denutrizione (congiuntamente con PCR), diminuzione del parenchima epatico. Diverse varianti genetiche, delle oltre 50 identificate, sono amiloidogeniche.

▲ terapia con corticosteroidi, utilizzo di steroidi anabolizzanti, malattia di Hodgkin, alcolismo, acromegalia

▼ APR, epatopatia, nefropatie, malnutrizione, amiloidosi ereditaria, iperestro-genismo, tireotossicosi, somministrazione endovenosa di liquidi

8Elettroforesi

Tracciato n. 21


ID 12008

preAι Aι α1 α2 β1 β2 γ

I coloranti normalmente in uso come: Acid blu, amido nero e rosso Ponceau S manife-stano un basso indice di affinità per questa proteina.Un eccellente densitometro riesce a mettere in evidenza anche le piccole quantità di Pre-albumina che si legano ai suddetti coloranti anionici.Questo è forse l’unico caso in qui lo strumento può sostituire la osservazione visiva della ETF.

preAι Aι α1 α2 β1 β2 γ


9Elettroforesi

Tracciato n. 3

preAι Aι α1 α2 β1 β2 γ ID 23009


10Elettroforesi

ID 30010

L’utilizzo di coloranti con maggior indice di affinità, per esempio il violetto acido, consente di mettere in evidenza la transti-retina.

ID 30011

Campione con Transtiretina normale Campione con Transtiretina diminuita

PROTEINAAlbumina

11Elettroforesi

TassonomiaEucariotiBatteri

OrganismiHomo SapiensHelix pomatiaGallus gallusStreptococcusBrassica napusFinegoldia magna

Significato clinico: storicamente indicatore generale dello stato proteico dell’or-ganismo, la sua attendibilità è compromessa per:• lunga emivita (19 giorni)• diminuita sintesi durante la maggior parte dei processi infiammatoriAd oggi: valore prognostico, in particolare nei pazienti cronici

▲ emoconcentrazione

▼ APR, epatopatia, sindrome nefrosica, malnutrizione, gravidanza, neonati prematuri, analbuminemia genetica

PROTEINAAlbumina

12Elettroforesi

Tracciato n. 9Tracciato n. 8

Aι α1 α2 β1 β2 γ Aι α1 α2 β1 β2 γ ID 45012

A sinistra soggetto con riduzione della AlbuminaA destra campione con Albumina normale

PROTEINAAlbumina

13Elettroforesi



Ipoalbuminemia da clinostatismo. Campione a sinistra: Pazienti ospedalizzati e costretti a letto presentano ipoalbumine per ridistribuzione della albumina negli spazi extravascolari.

PROTEINA

14Elettroforesi

Albumina, condizione analbuminemica

Aι α1 α2 β1 γ ID 00311

Tracciato n. 12

PROTEINAAlbumina

15Elettroforesi


A destra campione con albumina che veicola farmaci


PROTEINAAlbumina

16Elettroforesi


Aι α1 α2 β1 γ Aι α1 α2 β1 β2 γ

A sinistra l’unico evento che determina un aumento della Albumina : la disidra-tazione

ID 80016

PROTEINAAlbumina

17Elettroforesi

Tracciato n. 9 Tracciato n. 10

Aι α1 α2 β1 γ Aι α1 α2 β1 γ

A sinistra un esempio di sovraccarico della funzione di trasporto della Albumina con comparsa di Albumina “veloce” per allargamento anodico causato da pre-senza di bilirubina (campione itterico).Inoltre si nota in zona beta-anodica un piccolo “arco”costituito da bilirubina.

ID 70017

PROTEINAAlbumina

18Elettroforesi


Aι α1 α2 β1 β2 γ Aι α1 α2 β1 β2 γ

A destra campione con alloalbuminemia fast eterozigote (trasmissione autoso-mica codominante).

ID 60018

PROTEINAAlbumina

19Elettroforesi



A destra campione con alloalbuminemia slow omozigote (trasmissione autoso-mica codominante).

ID 50019

PROTEINAAlbumina

20

ID 004520

Elettroforesi



A sinistra campione con alloalbuminemia slow eterozigote (trasmissione autoso-mica codominante).

ID 76020

PROTEINAAlbumina

21Elettroforesi



bisalbuminemia(sempre fast) da pancreatite accertata o utilizzo di farmaci.

PROTEINAAlbumina

22Elettroforesi


Aι α1 α2 β1 γ Aι α1 α2 β1 β2 γ ID 22022

bisalbuminemia (sempre fast) da farmaci.

PROTEINAAlfa lipoproteina (APO A)

23Elettroforesi

TassonomiaEucariotiBatteriVirusArchea

OrganismiHomo SapiensMus musculusBos taurusRattus norvegicusEscherichia coliGallus gallusTorpedo californica

L’elettroforesi delle lipoproteine è un metodo semplice, utile per lo studio delle dislipidemie.La loro differenziazione in funzione della mobilità elettroforetica è alla base della classificazione di Fredrickson. Alfa lipoproteine o HDL (High Density Lipoproteins): sono la frazione più veloce. Rappresentano la parte maggiore delle lipoproteine e migrano nella posizione compresa tra Albumina e alfa 1antitripsina

115Elettroforesi

Dopo stimolazione Ag si assiste ad una rapida espansione del clone;questa è accompagnata da un cam-biamento morfologico e da un piccolo linfocita si giunge ad una pla-smacellula matura dotata di apparato del Golgi e reticolo endoplasmatico.Durante le successive divisioni cellulari la regione V viene espressa con costanza, mentre la regione H scifta da D vs M vs G vs A.

Da Monoclonal Gammopaties Aguzzi/Bienveniu/Jones/Whicher

LE COMPONENTI MONOCLONALI

La loro posizione nella migrazione ETF

116Elettroforesi

Lo studio è stato condotto su 1654 campioni con presenza di CM.Nella zona gamma, come si può osservare, migra l’88% delle CM.

A. Ciapini; Le proteine dal laboratorio alla Clinica; Desenzano del Garda 13-14 Gennaio 2006


La loro frequenza percentuale in relazione alla posizione assunta

nella migrazione ETF

117Elettroforesi

ID 00117

Aι α1 α2 β1 β2 γ


Tracciato n. 7

Tracciato n. 8

Nel campione di sinistra la zona alfa 1 è in posizione maggiormente anodica rispetto alla omologa proteina del campione di destra.

La IFE mostra la presenza di una componente monoclonale di tipo lambda libera.


La zona Alfa 1

118Elettroforesi

Tracciato n. 18


Campione a sinistra normaleCampione a destra con presenza di CM IgA K in zona anodica alfa 2.

ID 00118

Tracciato n. 19



La zona Alfa 2

119Elettroforesi

Campione a sinistra normaleCampione a destra con presenza di CM IgA λ in interzona alfa 2 - transferrina.

ID 00119




La zona Alfa 2

120Elettroforesi

Campione a destra con aumento alfa 2 e diminuzione di aptoglobinaCampione a sinistra con presenza di CM IgA K in interzona alfa 2 - transferrina.

ID 00120

Tracciato n. 9


Tracciato n. 8



La zona Alfa 2

121Elettroforesi

Campione destro normaleCampione sinistro con presenza di banda omogenea ETF (IgA ʎ) in posizione centrale Alfa2 - Transferrina




La zona GammaInter Alfa 2 -Transferrina

122Elettroforesi



Campione a destra normale con assenza di anomalie riferibili a presenza di bande omogenee.Campione a sinistra con zona transferrinica più lenta e presenza di banda omo-genea, riferibile a lambda libere monoclonali, nell’interspazio Tf-C3. Riduzione della albumina, C3 e ipogammaglobulinemia.

ID 00122


La zona Transferrinica

123Elettroforesi



Campione a destra con transferrina aumentata ma con assenza di anomalie riferibili a presenza di bande omogenee.Campione a sinistra con zona transferrinica allargata anodicamente con profilo morfologico sfumato per presenza di catene leggere libere monoclonali λ.

ID 00123



124Elettroforesi



Campione a sinistra con presenza di Gc (componente gruppo specifica)Campione a destra con transferrina aumentata e colorazione intensa, posizione più catodica per presenza di componente Monoclonale IgA K con simile carica elettrica netta.

ID 00124



125Elettroforesi



Campione a sinistra normaleCampione a destra con transferrina allargata e sfumata sul margine catodico per presenza di catene leggere libere monoclonali di tipo K.

ID 00125


La zona (Gamma) Inter Transferrina-C3

126Elettroforesi


Campione sinistro normaleCampione destro con presenza di banda omogenea ETF (IgA K) in posizione anodica rispetto al C3 che è stato spostato fisicamente e retromigrato, nel verso catodico, per ingombro sterico legato alla presenza della CM.

ID 00126




127Elettroforesi



Campione sinistro normaleCampione destro con presenza di banda omogenea ETF (IgA λ) in posizione anodica rispetto al C3 che compare debolmente sul lato rivolto al catodo e simultanea presenza di Beta 2 lipoproteina addossataalla CM lato anodico.

ID 00127



128Elettroforesi



Campione sinistro normaleCampione destro con presenza di banda omogenea ETF (IgA λ) in posizione anodica rispetto al C3 che compare ridotto, sfumato e asimmetrico-anodico

ID 00128


La zona C3

LE IMMUNOFISSAZIONI

195Elettroforesi

ATLANTE immunofissazioni sieriche

negative

SPE IgG IgA IgM κ λ ID 200195


Quadri IFE negativi per presenza di CM

196Elettroforesi

ATLANTEimmunofissazioni sieriche

negative



Quadri negativi per presenza di CM.La IFE di sinistra mostra una riduzione del-la eterogeneità policlonale per la classe G e sottoclasse I. Normali le classi A e M.La IFE di destra mostra una media riduzio-ne delle policlonalità G (ancora nell’ambi-to di riferimento) e spinta delle A.

197Elettroforesi

ATLANTE

campioni sierici diversi




Presenza di 1 CM di classe IgG e tipo K di media entità.Policlonalità assenti.

Presenza di 1 CM di classe IgG e tipo λ media entità.Policlonalità assenti.

Presenza di 1 CM di classe IgG e tipo λ di grande entità.Policlonalità depresse.

immunofissazioni sieriche:classe G

Elettroforesi 198

Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K;la catodica di piccola concentrazione, mentre la anodica, in posizione transferrinica, ha una concentrazione media.


ATLANTEimmunofissazioni sieriche:

classe G

199Elettroforesi


classe G




Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K.discreta conservazione delle policlonali G e assenza delle A e M.

Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K.bassa conservazione delle policlonali G.

Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K.buona conservazione delle policlonali.

campioni sierici diversi

200Elettroforesi


classe G




Presenza CM di classe IgG e tipo λ. Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo K.Forte deplezione delle policlonali.

Presenza di 1 piccolissima CM di classe IgG e tipo λ.La alta concentrazione delle K policlonali può trarre in inganno nella attribuzione del tipo di catena leggera.

campioni diversi

Elettroforesi 201

Presenza di 2 CM di classe IgG e tipo lambda;la catodica di piccola concentrazione, mentre la anodica ha una concen-trazione inferiore.Notare la forte riduzione della eterogeneità policlonale dell’immunofis-sato IgA (più anodico rispetto alla CM anodica), che simula una banda compatibile con una morfologia “monoclonale“.



classe G

Elettroforesi 202


classe A


classe A

Il campione presenta una CM di classe A e tipo λ.Notare la diversa reattività dell’antisiero (affinità e avidità) nei confronti della classe e del tipo.



Presenza di 3 CM di classe IgA e tipo lambda, si nota in posizione catodica gamma la presenza di una CM di tipo lambda confermata con antisiero anti catene leggere libere (Bence Jones positiva). Per la classe A è utile disaggregare il campione e verificare il numero di cloni secernenti.

Elettroforesi 203

Il campione presenta 2 CM in posizione anodica gamma - C3 di classe IgA e tipo λ;



classe A

ATLANTE immunofissazioni sieriche:

classe M

Il campione presenta 2 CM in posizione centrale gamma di classe IgM e rispettiva-mente di tipo k e λ.


Elettroforesi 204


ATLANTE immunofissazioni sieriche:

classe M

Il campione presenta una CM di classe IgM e tipo K.

287Elettroforesi

APPENDICE SECONDA

IL QUADRO URINARIO ETF E LA CONCENTRAZIONE DEI LIQUIDI BIOLOGICI NELLA PRATICA DEI LABORATORI DI CHIMICA CLINICA.

Appendice seconda

Prima pagina il Titolo: ok quello esistente

Inserire questa diciture e figura

a) Le proteine urinarie in elettroforesi b) La concentrazione dei liquidi biologici

Seconda pagina

Titolo: L’apparato renale

Il glomerulo

Il tubulo

Il glomerulo

Il tubulo

a) Le proteine urinarie in elettroforesi

b) La concentrazione dei liquidi biologici

L’apparato renale Il glomerulo Il tubulo

288Elettroforesi

Concentrare o non concentrare? E se si, come? Questo è il problema!

INTRODUZIONELa rilevanza dello studio della proteinuria è dimostrata dalla grande mole di

letteratura esistente sull’argomento.L’associazione della proteinuria con anorma-lità del rene è stata chiaramente dimostrata da Richard Bright circa 150 anni fa.

Il ruolo del rene nella conservazione e nel metabolismo delle plasmapro-teine è stato più volte studiato in passato, ma è negli ultimi due decenni che l’argomento è stato oggetto di numerosi studi.

L’interesse per lo studio delle proteinurie è derivato dalla frequenza di comparsa di questo segno presente in quasi tutte le malattie renali, dallo svilup-po dei metodi biochimici per lo studio qualitativo delle proteine urinarie e da una conoscenza più precisa dei processi fisiologici di filtrazione glomerulare e riassorbimento tubulare delle proteine in condizioni normali e patologiche.

Riteniamo utile ricordare che la presenza di proteinuria non implica neces-sariamente l’esistenza di una patologia renale (anche i soggetti normali presen-tano una proteinuria “fisiologica”) e che sono invece gli studi elettroforetici qua-lificati a definire una proteinuria come “patologica”, evidenziando la presenza nelle urine di proteine di origine plasmatica che in condizioni normali non su-perano la barriera glomerulare; di proteine presenti solo qualora il tubulo non svolga più la propria funzione di riassorbimento; di proteine plasmatiche ab-normi che passano nelle urine; di proteine secrete dal rene e dalle vie urinarie.

L’elettroforesi delle proteine urinarie che Tidstrom, per primo, eseguì su carta nel 1963, ha fatto in seguito notevoli progressi per l’impiego di nuovi substrati che la tecnologia ha fornito al laboratorista: dalla carta si è passati al gel d’amido, all’agar, all’acetato di cellulosa, all’acrilamide, ed all’ agaro-sio, infine con il metodo capillare.

Nella tabella 1 viene riportata la storia delle principali tecniche elettro-foretiche

Tabella 1

Principali tecniche EP impiegate in clinica, per l’ analisi del quadro proteico dei vari liquidi biologici

Substrato Ricercatore Anno

Carta da filtro

KonigCremer e Tiselius

DurrumGrassmanWunderly*

19371950

1950-19551950-1954

1954

Gel di agarGordon

Grabar e WilliamsWieme

19491953

1956-1959

289Elettroforesi

Gel di amido Smithies 1955

Acetato di cellulosa Kohn 1957

Gel di poliacrilamideRaymond e Weintraub

Davis e Ornstein19591964

Gel di acrilamide- agarosio Uriel 1966

Gel di agarosioLaurell

Johansson19651972

Capillare 2001

Nel soggetto normale l’eliminazione giornaliera urinaria di proteine si aggira intorno ai 150 mg.

Nella Tabella 2 sono elencate le principali proteine dell’urina normale.

Tabella 2

Proteinuria totale 24 ore = 130 mg ( 80 \ 240 )

PROTEINE DI ORIGINE PLASMATICA circa 60 \ 70 %

Albumina circa 15 mg \ 24 ore ( 2.0 - 30.0 )

Ceruloplasmina

Alfa 1 glicoproteina acida

Alfa 1 antitripsina

Alfa 1 microproteina

Emopessina

Transferrina

Aptoglobina

Beta 2 microglobulina

Immunoglobuline

Proteina legante il retinolo

Enzimi

PROTEINE DI ORIGINE RENALE circa 40 \ 30 %

Uromucoide circa 50 mg \ 24 ore

Urochinasi

IgA secretorie

Enzimi tubulari

Le proteine di origine plasmatica costituiscono il 60 % 70 % e di queste circa 15 mg sono attribuibili alla albumina, mentre altre proteine o polipep-tidi sono presenti in quantità minime o in tracce; basti pensare che con tecni-che ultrasensibili come l’elettroforesi bidimensionale si evidenziano 500/600 spots.

La proteina di produzione endogena renale prevalente nell’urina è l’uro-mucoide o proteina di Tamm-Horsfall. Si tratta di una proteina ad elevatissimo PM (7.000.000 D) ma con possibilità di aggregati che possono raggiungere 23.000.000 o più.

E` una proteina polimerica ad alto contenuto glicidico (30%), i cui mo-nomeri hanno PM di 80.000 D, con P.I. di 3,5; è la matrice essenziale dei cilindri e sembra essere secreta nelle urine a livello di ansa di Henle e di tubulo contorto distale.

Non si conosce il suo significato biologico, si ipotizza che abbia un ruolo antibatterico ed antivirale.

L’urochinasi, con la sua capacità di lisare la fibrina potrebbe avere un ruolo nel rimuovere coaguli a livello capillare, o, secondo altri AA quello di agire enzimaticamente sui cilindri.

290Elettroforesi

Le IgA ritrovate nelle urine, che ammontano a circa 1 mg/24 h, sono di tipo dimerico secretorio, uguale a quelle presenti in altre secrezioni; la componente secretoria sarebbe sintetizzata dai tubuli; la funzione è di tipo anticorpale.

La quantità e la composizione in proteine delle urine dipendono dal bi-lancio fra il passaggio transglomerulare e il riassorbimento tubulare.

Se si considera che il rene riceve giornalmente circa 25 kg di proteine, di cui solo qualche grammo attraversa la barriera glomerulare, per poi andare incontro ad un riassorbimento tubulare di circa il 90%, si comprende l’estrema efficienza del nefrone nel controllare questo aspetto dell’omeostasi proteica.

Per inquadrare clinicamente le proteinurie è necessario considerare i meccanismi fisiopatologici che le determinano e che si svolgono a livello glo-merulare e tubulare.

Anatomia, funzione e idrodinamica renaleLa anatomia La funzione

291Elettroforesi

La idrodinamica fisiologicaIl nefrone è composto da due parti: il glomerulo e il tubulo

La funzione glomerulareQuattro fattori principali intervengono nel determinismo del filtraggio

glomerulare delle proteine:1) La permeabilità selettiva: peso molecolare e forma2) La presenza di strutture anioniche con funzione di repulsa elettro-

statica3) La concentrazione plasmatica4) Le condizioni emodinamiche localiNumero di Reynolds = d . v . ρ / η

La funzione tubulareI meccanismi di riassorbimento:Tutte le proteine con peso molecolare inferiore a 40.00 D non incontrano,

quasi, difficoltà nell’essere filtrate a livello glomerulare e sono riassorbite per oltre il 90% nel tubulo prossimale.

292Elettroforesi

Mentre i peptidi vengono scissi dagli enzimi dell’orletto a spazzola ad aminoacidi che poi possono essere assorbiti tramite carrier Na+- dipendenti, le proteine vengono assorbite nel lume delle vescicole e scisse negli eteroliso-somi mediante fusione con lisosomi primari.

I prodotti di scissione vengono riportati all’organismo attraverso la mem-brana basolaterale. I residui non digeribili vengono secreti nel lume

per esocitosi, con contemporanea secrezione di enzimi lisosomiali.Il metabolismo e catabolismo del tubulo:

Le finalità dello studio del quadro proteico Elettroforetico urinario1) Ricerca delle C.M.2) Osservazioni “semi-quantitativa” delle differenti zone per inquadrare

il danno renale e classificare la proteinuria ed indirizzare ad analisi di II livello.

La fase pre-analitica: il contenitore e la sua importanzaPiano sperimentaleRaccolta di 15 urine ( sodio azide 0.1 %) con proteinuria micromoleco-

lare. Dosaggio K e L per via nefelometrica. Valori tra 23 e 765 mg/L.Urine miscelate e suddivise in due aliquote. Una aliquota in vetro ed una

in plastica non per alimenti. Tempo conservazione 24 ore.I risultati

IF BJ positive IF BJ negative

Vetro 15 0Plastica 13 2

Valutazione NefelometricaUrina conservata in vetro m

g/L

Valutazione NefelometricaUrina conservata in plastica

mg/L

Urina neg. 1 37 Circa 5Urina neg. 2 39 Circa 2

La fase pre-analitica: la raccolta delle urine

Per la ricerca e classificazione della proteinuria:raccogliere la seconda minzione del mattino (G.P. Merlini)A conferma di quanto affermato è stata condotto uno studio su portatori

di proteinuria plasmatica da over-flow BJ, onde valutare la massima escre-zione di catene leggere libere monoclonali presente nelle urine raccolte con temporizzazione:

293Elettroforesi

Ciapini, M. Tani, B. MilanesiIl Patologo Clinico 3/2006

Per la ricerca, classificazione e valutazione della massa proteica escreta raccogliere le urine delle 24/ore con sodio azide 0.1 %:

Long term outcome of MGUS:R. A. Kyle and S. V. Rajkumar British Journal of Haematology, 134, 573-

589 2006“A 24h urine specimen should be collected so that the amount of M pro-

tein can be measured.This provides a measure of the patient’ s tumor mass and is usefull in

monitoring the course of the desease. “

Aspetti cliniciDal punto di vista semeiologico, la proteinuria può essere:

• Transitoria • Intermittente• Persistente

Proteinuria TransitoriaConsiste nel reperto occasionale di una proteinuria con valori patologici,

solitamente moderata, che non si ripete nel tempo in successivi controlli ed ha un carattere di tipologia benigna.

Con il termine di proteinuria funzionale si intende la proteinuria che, indi-pendentemente da stati patologici renali, si accompagna a diverse condizioni cliniche caratterizzate da stati febbrili, ad esercizio fisico intenso e protratto, a condizioni di stress fisico ed emozionale come gli interventi chirurgici o la esposizione al freddo.

Questa proteinuria è definita di tipo transitorio e si risolve assieme al re-cupero della condizione fisica che, alterandosi, ne è stata la origine.

Proteinurie IntermittentiTali proteinurie sono caratterizzate, come indica la loro definizione, dalla

comparsa di proteine patologiche in tempi episodici e con intervalli in cui la proteinuria rientra nel range dei valori fisiologici.

Queste proteinurie possono avere decorso del tutto casuale ed irregolare, oppure presentare una periodicità regolare come nella proteinuria di tipo ortostatico che, accanto a valori normali nei campioni di origine mattutina, seguenti il periodo di riposo in clinostatismo, presenta valori patologici nei campioni serotini, dopo la comune attività ortostatica.

Le proteinurie intermittenti sono del tipo glomerulare e, benché di con-sueto quantitativamente modeste, meritano attenzione perché possono essere indici di una incipiente sofferenza renale.

294Elettroforesi

Data la entità spesso moderata di queste proteinurie torna utile dire e fare presente la esigenza di una buona qualità analitica dei metodi di determina-zione, sia per la fase di screening che per quella del dosaggio, soprattutto per quanto riguarda la sensibilità analitica e la limitazione della imprecisione, onde evitare false positività riconducibili ad eccessiva variabilità analitica.

L’accertamento di una proteinuria intermittente obbliga il medico curante ad approfondire le indagini per poter dirimere il potenziale dubbio di una lesione renale che, come abbiamo affermato, può esserne la causa.

L a tipologia della proteinuria intermittente è sovente appannaggio della età infantile ed adolescente dove risulta fondamentale escludere la possibilità di infezioni streptococciche silenti.

Proteinurie persistentiLe proteinurie persistenti possono essere distinte nelle forme prerenali,

renali e post renali.Le proteinurie prerenali sono le proteinurie da ‘ overflow ‘, le quali non

sono espressione di malattia renale, bensì proteine fisiologicamente filtrate dal glomerulo che presenti nel plasma in concentrazione aumentata per svariate evenienze patologiche, eccedono la normale soglia di riassorbimento tubulare.

Espressione paradigmatica di questo tipo di proteinuria è la proteinuria di Bence Jones.

Le proteinurie renali sono quelle già descritte nella classificazione ezio-patogenetica, ovvero: glomerulari, tubulari e miste.

Le proteinurie postrenali sono dovute a lesioni, che spesso fanno riferi-mento alla natura infiammatoria, dei tessuti delle vie renali come: pelvi rena-le, uretere, vescica, prostata ed organi genitali.

Talvolta queste proteinurie hanno una composizione che ne consente la identificazione per la presenza di specifiche proteine come quella della pre-senza di enzimi o della proteina di Tamm-Horsfall.

Metodi di studio delle proteinurieI metodi di studio delle proteinurie possono essere distinti in metodi quan-

titativi (Tabella 3) e qualitativi (Tabella 4).

Tabella 3: METODI QUANTITATIVI Tabella 4: METODI QUALITATIVI

Dosaggio della proteinuria totale Elettroforesi:

Su acetato di cellulosa

Dosaggio di singole proteine specifiche: Su gel di agarosio

Albumina Su gel poliacrilamide

Transferrina Su gel di poliacrilamide SDS (SDS PAGE)

Immunoglobuline IgG Su agarosio SDS Hydragel Protei-nuria

Beta 2 microglobulina Elettroforesi bidimensionale

Alfa 1 microglobulina Capillare

Proteina legante il retinolo Cromatografia:

Su colonna di Sephadex

Determinazione delle CLEARANCE proteiche HPLC

Enzimuria: Immunofissazione

Alanina aminopeptidasi ( AAP )

N Acetil glucosaminidasi ( NAG )

295Elettroforesi

Aspetti tecniciMetodi di determinazione della proteinuria totale Le tecniche maggiormente attendibili risultano quelle di Bradford\SDS ed

al Pirogallolo.Le strisce rivelatrici per urine consentono in modo approssimativo di se-

guire l’ andamento di perdita di albumina e non danno risultati soddisfacenti nel monitoraggio delle altre proteine; infine sono legate strettamente alla in-terpretazione dell’ operatore.

Per quanto attiene alla ricerca di catene leggere libere e delle micropro-teine, sia le tecniche nefelometriche che quelle citate dimostrano i loro limiti vuoi per i bassi pesi molecolari in gioco vuoi per le basse concentrazioni dei livelli di normalità ( microproteine ), vuoi infine per la difficoltà di correlare le risposte dei calibratori sulle proteine ricercate.

Inquadramento del tipo di proteinuria: Metodi QualitativiLa tecnica maggiormente impiegata è quella elettroforetica.Il vero parametro limitante questa tecnica è rappresentato dal grado di

sensibilità da dover raggiungere.Due sono le possibili soluzioni al problema:

Aumento della massa molecolare proteica per mezzo di:1) Concentrazione 2) Depositi multipli con riduzione della risoluzione3) Tecniche immunofissative

Aumento della sensibiltà del marcatore di rivelazione per mezzo di:1) Coloranti ad alta sensibilità2) Sistemi immunoenzimaticiIl livello di sensibilità raggiungibile con tali sistemi oscilla tra 1 e 15 mg\l.Le tecniche consigliate sono la elettroforetica con ampio potere risolutivo,

quella in poliacrilamide in gradiente di concentrazione e quella in agarosio con pretrattamento del campione con SDS.

Se la tecnica utilizzata è quella elettroforetica con ampio potere riso-lutivo, aumento di massa e colorante sensibile è possibile superare lo sco-glio della evidenziazione delle microproteine che oltre ad essere presenti in quantità modeste hanno, anche, la prerogativa di migrare sotto a quelle a peso molecolare maggiore, specie nelle proteinurie di tipo misto; in queste situazioni metodologiche è possibile avere quadri di proteinurie come quelli della fig. 1:

Figura 1

296Elettroforesi

L’utilizzo dell’agarosio SDS, in cui la separazione è unicamente appan-naggio del PM della proteina, consente una interpretazione facile ed eviden-te: figg. 2/3/4

Figura 2

Figura 3Proteine tubulari

297Elettroforesi

Figura 4Proteine Glomerulari

Unico neo nell’impiego di questo metodo di separazione delle proteine è legato alla sua impossibilità di distinguere tra proteine monoclonali e po-liclonali; questo perché le proteine della stessa specie hanno lo stesso peso molecolare e migrano in una banda omogenea.

La sensibilità di questo metodo raggiunge normalmente i 5 mg/L.Classificazione patogenetica delle proteinurieLa complessità dei meccanismi che stanno alla base del determinismo

della proteinuria si riflette nella complessità del processo diagnostico interpre-tativo dei quadri proteinurici che si riscontrano nella pratica clinica.

Sulla base della probabile origine delle proteine urinarie sono state pro-poste varie classificazioni fra le quali riportiamo quella proposta da Boylan: tabella 5

Tabella 5

1) Proteinurie di derivazione plasmatica a) Renali Glomerulari b) Renali Tubulari c) Pre renali

2) Proteinurie di derivazione tissutale a) Nefrogenetiche

3) Proteinurie post renali

Una prima distinzione è basata sulla origine delle proteine riscontrate a livello urinario e prevede tre grosse categorie:

Figura 5

298Elettroforesi

In modo maggiormente esaustivo proponiamo un’altra classificazione patogenetica delle proteinurie:

Tabella 6 e fig. 6/7:

CLASSIFICAZIONE PATOGENETICA DELLE PROTEINURIE

1) PROTEINURIE PLASMATICHE

a) Renali Glomerulari

TIPO Proteinuria Glomeru-lare selettiva

Proteinuria Glomeru-lare

non selettiva

CAUSE

Alterazioni di cari-ca della membrana

basale per perdita di cariche negative

Alterazioni di struttura della barriera glome-rulare per aumento

e\o ingrandimento dei pori

CLASSI PROTEICHEAlbumina

Transferrina

Albumina Transferrina

Immunoglobuline

PESI MOLECOLARI 68.000 \ 77.000 D 68.000 \ 500.000 D

ESEMPI DI PATOLOGIECORRELATE

Minimal change Ne-fropatia

Sclerosi glomerulare focale

Glomerulo nefrite membranosa

Glomerulonefrite proli-ferativa

Diabete avanzatoAmiloidosi

Figura 6

Campione 7 = proteinuria fisiologica con presenza di albumina e tran-sferrina

Campione 6 = proteinuria glomerulare selettiva con presenza di albumi-na e transferrina aumentate

381Elettroforesi

APPENDICE SESTALa proteina di Bence Jones

a) I suoi rapporti con la funzionalità renaleb) Le linee guida della SIBioCc) La BJ e le contrastografie

Il ruolo dei nefroni Corticali e Iuxtamidollari

382Elettroforesi

La proteinuria di Bence Jones: linee guida e contrastografie

La storia:Anche se FLC “immunoglobuline” sono sinonimo di proteine di Bence

Jones, la storia avrebbe potuto essere più generosa con gli altri ricercatori coinvolti nella loro scoperta.

“Venerdì scorso, ottobre 1845, il dottor William MacIntyre, medico dell’Ospedale Occidentale St. Marylebone, St. Marylebone, Londra, ha la-sciato le sue stanze in Harley Street. Era stato chiamato per vedere il signor Thomas Alexander McBean, di 45 anni, fruttivendolo di tutto rispetto, che aveva forti dolori ossei e fratture. Era stato sotto la cura del suo medico di medicina generale, il dottor Thomas Watson, per diversi mesi. Dopo un esame del paziente, William MacIntyre osservò la presenza di edema. Con-siderando la possibilità di nefrosi, testò l’urina per il suo contenuto di albumi-na. Con grande meraviglia egli verificò che riscaldando l’urina la proteina albuminosa precipitava e si ridiscioglieva a 75 °C “

Sia il Dr MacIntyre e Dr Watson inviano i campioni di urina al patologo chimico all’Hospital St.George e all’attenzione del Dr Bence. Una nota ac-compagna l’urina inviata dal Dr Watson:

.. “Caro Dott. Bence Jones, Il tubo contiene urina di altissimo peso spe-cifico: quando bollito diventa molto opaco in materia di aggiunta di acido nitrico, è effervescente, assume una colorazione rossastra, e diventa abba-stanza chiaro, ma quando si raffredda si assume la consistenza e aspetto che si vede. Riscaldare reliquifies. Che cosa è? “

Nei due mesi seguenti, il paziente è diventato emaciato, debole, ed è stato tormentato dal dolore. Egli morì il 1 ° gennaio 1846, nel pieno posses-so delle sue facoltà mentali.

Il Dr MacIntyre successivamente pubblicò (1850), post-mortem del pa-ziente, sia l’esame che la descrizione delle urine inviate al Dr Bence.

Purtroppo per lui, Henry Bence Jones aveva già pubblicato i risultati degli accertamenti urinari del paziente in due articoli di autore unico, uno dei quali su The Lancet, nel 1847. Egli considerava la proteina di essere un

“deutoxide idratato di albume”. Il suo commento a seguire: “Non ho bisogno di osservazione sulla importanza di cercare per questo

ossido di albume in altri casi di ossium mollities”. La reputazione di Bence Jones è stato garantita ai posteri, mentre i contri-

buti dei suoi colleghi sono stati consegnati alle note a piè di storia. Per tutti può sembrare un’ingiustizia nei confronti del suo collega, Wil-

liam MacIntyre, ma Henry Bence Jones realizzò molto altro nella sua carriera. Ha pubblicato oltre 40 articoli ed è diventato ricco e famoso per i suoi

studi sulla sua pratica clinica, didattica e osservazioni originali; ricevette una borsa di studio della Royal Society, alla tenera età di 33 anni. Florence Nightingale, una volta lo ha descritto come “il chimico medico migliore di Londra.” Sorprendentemente, non vi era alcuna menzione della proteina di Bence Jones nel suo necrologio e l’eponimo (e il trattino in suo nome) non è stato utilizzato fino alla sua morte.

383Elettroforesi

Definizione:La proteina di Bence Jones è una proteina appartenente alla classe delle

globuline. Il suo peso molecolare è di 20 kDa.

È di fatto la catena leggera di un anticorpo, distaccata dalla catena pe-sante. Le catene leggere chiamate “proteina di Bence Jones” sono diverse dal-le catene leggere “usuali” che i linfociti B del corpo normalmente producono:

• le Bence Jones sono libere e monoclonali, mentre le normali catene legge-re sono legate alla catena pesante corrispondente a formare l’anticorpo.

• le Bence Jones sono monoclonali, cioè tutte geneticamente uguali, mentre le normali catene leggere sono policlonali, ovvero tutte con delle sottili differenze tra loro.La proteina di Bence Jones può essere rilevata nel sangue, nelle urine od

in ambedue i liquidi biologici dello stesso paziente:Svariate patologie rare possono avere come sintomo la produzione di

proteine di Bence Jones; tra esse va menzionata la macroglobulinemia di

384Elettroforesi

Waldenström; tra le altre, si riscontrano proteine di Bence Jones nel sangue o nelle urine di pazienti con mieloma multiplo, l’insufficienza renale, l’anemia.

Le Bence Jones possono venire prodotte dalle plasmacellule neopla-stiche.

Possono essere di tipo kappa o lambda. Le catene leggere possono esse-re sia frammenti immunoglobulinici sia immunoglobuline omogenee. Possono essere trovate nell’urina per le loro dimensioni piccole, in seguito ad una facile clearance renale.

In altri termini la proteina di Bence Jones può essere definita come Com-ponente Monoclonale, ovvero

“Clone di Linfociti B in espansione”

Cristallo della proteina di Bence Jones in cristallografia a raggi X.

Il rene e la proteina di Bence Jones:

Una delle funzioni primarie del rene è eliminare dal sangue, riversandole nelle urine, sostanze non necessarie e trattenere le sostanze necessarie.

La formazione dell’urina deriva da tre processi:

1) Filtrazione glomerulare

2) Riassorbimento tubulare

3) Secrezione tubulare

La quantità di qualsiasi sostanza presente nell’urina (carico escreto) è il

risultato del seguente algoritmo:

Ora se consideriamo il peso molecolare di una Proteina di Bence Jones,

dobbiamo considerare che il glomerulo

385Elettroforesi

non sia in grado di fermarla poiché è normale reperto la presenza di Albumina nelle urine (P.M. 55.000 D), in lievi quantità.

A questo punto interviene la funzione tubulare:

che provvede alla funzione di riassorbimento, dei soluti, che si suddivide in meccanismi attivi e passivi:

L’acqua viene riassorbita per osmosi.

Trasporto attivi:

Primario = se accoppiato direttamente ad una fonte di energia (idrolisi di ATP) pompa ATPasi Na + / K+.

Secondario = se accoppiato indirettamente ad una fonte di energia.

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