Assemblage des protéines de réservepar coacervation simple(ou désolvatation)D. RENARD - L. LAVENANTURBIA-Équipe APR-INRA Nantes

Institut National de la Recherche Agronomique

Coacervation : séparation d’un système colloïdal en deux phases liquides. Laphase la plus concentrée en colloïdes est la phase coacervée, l’autre phase étant la solution d’équilibre. Terminologie voisine : désolvatation (drawning-out precipitation, salting-out)(Source : IUPAC Compendium of Chemical Technology 2nd Edition 1997) N.B. Dans le cas d’une précipitation, la phase concentrée est solide ou vitreuse.

Contexte biologique de notre étudeVue très partielle du physico-chimiste

Contrôle-qualité dansla sécrétion et le routagedes protéines de réserve

Soluble : diffuse au sein du REet incorporable dans les vésiculesde transport

Mécanismes de rétentionau sein du réticulum

(nécessité d’un domainerépété riche en proline)

BiP Maïs, riz

Blé

Assemblage des protéinesest un processus

concentration-dépendant

A. Vitale, A. Ceriotti. Plant Physiol. 2004 136 pp. 1-7

Lumen RERoutage des protéinessolubles correctement repliées

Cytosol

COPII

Vacuole(PSV)

Vacuole(PSV)

dégradationrapide

Pas de dégradation

Pourquoi s'intéresser à la genèsedes corpuscules protéiques ?Point de vue du physico-chimiste

L’objectif général est l’établissement des relations structures-fonctions dans les organisations supra-moléculaires.

compréhension du “ packing ” de ces protéinesdégager des voies de recherche en ingénierie

supra-moléculaire pour générer des assemblages de biopolymères possédant des propriétés nouvelles

Déficits de connaissances

structure des protéines de réserve des graines : absence de structures cristallines et polymorphisme

intervention d’autres protéines (cargos, chaperones, glycosidases, kinases, ...) dans le repliement et le transport des protéines de réserve

Quels systèmes modèles oubio-mimétiques pour l’étude des phénomènes d’agrégation, de condensation et de micro-compartimentationdes protéines de réserve ?

Système biomimétique : reproduit in vitro les interactions et les mécanismes hiérarchiques d’association entre biopolymères pour conduire à la formation d’édifices supramoléculaires d’ordre et de mobilité déterminés Système modèle : reproduit in vitro les associations des biopolymères conduisant à la formation d’entités supra-moléculaires en ignorant le contexte biologique

Démarche générale de nos travaux

Approche mécanistique des processus d'agrégation oud'assemblage aux différentes échelles d'observation

Échelle moléculaire (UV-Vis, IRTF, DC, fluorescence)Échelle colloïdale (diffusion du rayonnement, cryo-TEM)Échelle microscopique (microscopies optiques)Échelle macroscopique (diagramme de phases,rhéologie)

Approche cinétique des processus d'agrégation oud'assemblage

Moléculairecolloïdale microscopique macroscopique

0.1-500nm ≥ 1µm > 100µm

Systèmes modèlesLes objets d’étude

Protéines de gluten de blé(prolamines)

Pauvre en S Riche en S HMW

Gliadines ω-gliadines γ-gliadines α-gliadines

Gluténines LMW LMW LMW LMW HMWSous-unités type D type C type C type B sous-unités

Classification et nomenclature des protéines de gluten de blé

Schéma d’une séquence de HMW

DomaineN-terminal

DomaineC-terminalDomaine répétitif

SHSHSHSH

SHSH SH SH

LMW : low molecular weightHMW : high molecular weightS : soufreSH : groupement thiol porté par le résidu Cystéine

5-6 COO-/molécule

LMW, γ-gliadines (riche en Pro, Gln) LMW, γ-gliadines (riche en S-S)

6.4% 39.9% 53.7%

Régionsresponsables

de l’assemblage

Kasarda, 1994

Gluténine HMW(domaine répété)

50 x 2 nm

Gliadine10 x 3 nm

Représentation en volume (rayons de van der Waals)de prolamines de blé par modélisation moléculaire

Cystéine 295

Cystéine 43

Cystéine 295

Residue 200

Residue 369(C-terminal)

C(220)-C(240)

C(248)-C(345)

C(212)-C(247)

Gluténine LMW

(A) gluténine LMW entière(B) modèle simplifié de la région encerclée ( Cys 295)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

I/I0

q (nm-1)

L=16; d=3.6 nm2a=22; 2b=3.8 nm

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

I/I0

q (nm-1)

L=16; d=3.6 nm2a=22; 2b=3.8 nm

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

I/I0

q (nm-1)

L=16; d=3.6 nm2a=22; 2b=3.8 nm

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

I/I0

q (nm-1)

L=16; d=3.6 nm2a=22; 2b=3.8 nm

Structure :Cylindre L=16nm, d=3.6nm ouEllipsoïde 2a=22nm, 2b=3.8nm

Polymorphisme :Miscibilité totale ( γ-ω et γ-LMWG) 0.1 1

0.01

0.1

1

10

EtOD/D2O 62/38

I/C (g

-1.c

m2)

q (nm-1)

γ-gliadineω-gliadineω - γ 1:1ω - γ 1:3ω - γ 3:1L=18.5 nm; d=3.5 nm

0.1 1

0.01

0.1

1

10

0.1 1

0.01

0.1

1

10

EtOD/D2O 62/38

I/C (g

-1.c

m2)

q (nm-1)

γ-gliadineω-gliadineω - γ 1:1ω - γ 1:3ω - γ 3:1L=18.5 nm; d=3.5 nm

1. Facteur de forme d’une protéine végétale en solution

1ère étapeLn(qI)=f(q2) —> Rc (rayon de section)avec R=Rc(2)1/2 —> d2ème étapeLn(I)=f(q2) —> Rg (rayon de giration)avec Rg

2=(L2/12)+(R2/2) —> LAvec la connaissance de L et d, calculde l’intensité diffusée

γ-gliadine

Systèmes modèlesApproche expérimentaleRésultats

Approche expérimentale in vitro : principe de la coacervation

Polymère Complexes Coacervats Séparationen bon solvant soluble/insoluble (gouttelettes) de phases

Mauvais solvant temps à l’équilibre

Phase richeen polymère

Phase richeen solvant

Coacervat I

Coacervat II

Coacervat III

Vacuole dansle Coacervat II

Vacuole dansle coacervat I

5µm

Taille minimale de particules au maximum de solubilité du polymère

Fusion des coacervats et vacuolisation

Approche expérimentale in vitro :mauvais solvant et/ou choc osmotique

«Solution»de

Gliadines*(10 mg/mL; 20mL)

EtOH:H2O52:48

1

2

3interneexterne

Mauvais solvantEtOH:H2O 45:55

35:6525:75

Choc osmotiquePEG 35000 ≠ Conc.EtOH:H2O 52:48

Mauvais solvant+ choc osmotique

1 2+

Objectifs : création de particules denses mimant lescorpuscules protéiques – approche cinétique des phénomènes d’agrégation/condensation

200mL* Centrifugation 30min 11000g

% EtOH final45.636.527.5

Approche expérimentale in vitro : mauvais solvant et/ou choc osmotique

Mauvaissolvant

Choc osmotiqueen bonsolvant

Choc osmotiqueen mauvaissolvant

Perte en protéines liée à la séparation de phases

Concentration de la solution de protéines

Concentration et séparation de phases

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

30

40

50

60 45/55 + PEG (15%) 35/65 + PEG (15%) 25/75 + PEG (15%)

48/52 + PEG (5%) + PEG (10%) + PEG (15%)

45/55 EtOH/H2O 35/65 25/75

2

3

1

Cgl

iadi

nes (g

.l-1)

temps (h)

C0

123

Approche expérimentale in vitro : mauvais solvant EtOH:H2O 25:75

Contraste de phases (+) ( )

Contraste interférentiel ( ) Épi-fluorescence ( )

Contraste de phases (-) ( )5µm

5µm

5µm

5µm

Approche expérimentale in vitro : mauvais solvant

t=0 ou condition 2

Condition 1 : t=4HEtOH/H2O 45/55 ou 40/60 Condition 1 :

EtOH/H2O 35/65 ou 25/75

1HΦ≤1µm

4H1≤Φ≤1.5µm

7H1≤Φ<2µm Cinétique de croissance

des particules : processus auto-limitant régi par :•Rapport bon/mauvais solvant•Vitesse d’ajout du mauvaissolvant

•Concentration en protéines

24H1≤Φ<3µm

48H1≤Φ<3µm

5µm

Approche expérimentale in vitro :mauvais solvant mauvais solvantà l’équilibre +choc osmotique

Phase inférieure

Phase supérieure

5µm 1HΦ≤1µm

4H1≤Φ≤2µm

7H1≤Φ<5µm

7HFusion-vacuolisation

24H1≤Φ<5µm

30H1≤Φ<5µm

ConclusionApproche de la coacervation / biologie :•Mauvais solvant / irréaliste (C ∼ 0.3mM)•Mauvais solvant+PEG / réaliste (C ∼ 1.7mM)

PerspectivesPrise en compte des conditions biologiquespH (pHcyt ∼ 7,2), ions calcium ([Ca++]libre ∼ 10µM à 1mM), co-solutés C en protéines dans le réticulum (C∼1mM)

Prise en compte du confinementInteractions avec les membranes du réticulum (∼1-10µm2/µm3)Composition membrane(thèse GDR Amélie Banc)

Merci pour votre attention…